Xác định đồng thời ba bufadieolid trong một số mẫu phẩm từ cóc bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (lc ms

LÊ THỊ THU HÀ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI BA BUFADIEOLID TRONG MỘT SỐ MẪU PHẨM TỪ CÓC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐI KHỐI PHỔ HAI LẦN LC –MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGHỆ AN - 2014..

LÊ THỊ THU HÀ

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI BA BUFADIEOLID TRONG MỘT SỐ MẪU PHẨM TỪ CÓC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐI KHỐI PHỔ HAI LẦN

(LC –MS/MS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGHỆ AN - 2014

LÊ THỊ THU HÀ

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI BA BUFADIEOLID TRONG MỘT SỐ MẪU PHẨM TỪ CÓC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐI KHỐI PHỔ HAI LẦN

(LC –MS/MS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60.44.01.18

Người hướng dẫn khoa học:

TS NGUYỄN TRUNG DŨNG

NGHỆ AN - 2014

tại trường Đại học Vinh với sự hướng dẫn của TS Nguyễn Trung Dũng Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS Nguyễn Trung Dũng, Bộ môn Kỹ thuật Môi trường, Khoa Hóa Lý

kỹ thuật, Học viện Kỹ thuật Quân sự đã giao đề tài cũng như hết lòng hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện bản luận văn

PGS.TS Nguyễn Hoa Du và PGS.TS Trần Đình Thắng đã dành nhiều

thời gian đọc và viết nhận xét cho luận văn

Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh Thực phẩm Quốc Gia

đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và hoàn thành đề tài này

Ths Trần Cao Sơn, CN Đỗ Thị Thu Hằng cùng toàn thể các anh chị

trong labo Hóa đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm

Các thầy, cô giảng dạy tại khoa Hóa học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ

môn Hóa Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu trong môi trường khoa học, hiện đại

Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Vinh, tháng 10 năm 2014

Học viên

Lê Thị Thu Hà

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về bufadienolid 3

1.1.1 Giới thiệu chung về họ cóc và độc tố cóc. 3

1.1.2 Cấu tạo và tính chất của bufalin, cinobufagin, resibufogenin 5

1.1.3 Tác dụng và độc tính của các bufadienolid. 7

1.1.4 Ngộ độc do ăn cóc và các sản phẩm chế biến từ cóc 7

1.1.5 Các sản phẩm có nguồn gốc từ cóc 9

1.1.6 Nghiên cứu bufadienolid trong nước 10

1.2 Các phương pháp xác định bufadienolid 11

1.3 Phương pháp LC - MS/MS 24

1.3.1 Nguyên lý hoạt động. 24

1.3.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 25

1.3.3 Khối phổ (Mass Spectrometry - MS) 26

1.4 Phương pháp chiết pha rắn 33

1.5 Đánh giá phương pháp phân tích 35

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 Đối tượng, mục tiêu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 39

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 39

2.1.2 Mục tiêu nghiên cứu 39

2.1.3 Nội dung nghiên cứu thực nghiệm 39

2.1.4 Phương pháp nghiên cứu 40

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 43

3.1 Thiết lập điều kiện phân tích các bufadienolid bằng LC-MS/MS 47

3.1.1 Tối ưu các điều kiện detector khối phổ (MS) 47

3.1.2 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 51

3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 59

3.2.1 Chọn quy trình xử lý mẫu. 59

3.2.2 Khảo sát dung môi chiết 61

3.2.3 Khảo sát thể tích dung môi chiết 64

3.2.4 Khảo sát cột chiết pha rắn 67

3.2.5 Khảo sát dung môi rửa giải. 68

3.2.6 Khảo sát thể tích dung môi rửa giải. 70

3.3 Thẩm định phương pháp 74

3.3.1 Tính đặc hiệu/ chọn lọc. 74

3.3.2 Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn. 76

3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ). 79

3.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi 80

3.4 Phân tích mẫu thực tế 84

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 86

Kết luận 86

Kiến nghị 87

TÀI LIỆU THAM KHẢO 88 PHỤ LỤC

Hình 1.2: Một số sản phẩm có nguồn gốc từ cóc 10

Hình 1.3: Mô hình hệ thống LC - MS/MS 25

Hình 1.4: Kỹ thuật APCI với chế độ bắn phá ion dương 27

Hình 1.5: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI 28

Hình 1.6: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực chập ba 31

Hình 1.7: Các bước của quá trình chiết pha rắn 33

Hình 2.1: Hệ thống máy LC - MS/MS 44

Hình 3.1: Cơ chế phân mảnh của bufalin 49

Hình 3.2: Sắc đồ tổng ion của mẫu chất chuẩn của ba bufadienolid 500 ng/ ml và hai ion của bufalin 51

Hình 3.3: Sắc đồ của ba bufadienolid khi dùng dung môi pha động là acid HCOOH 0,1% 54

Hình 3.4: Sắc đồ của các bufadienolid ở chế độ gradient 1 56

Hình 3.5: Sắc đồ rửa giải các bufadienolid với tốc độ dòng 1 ml/ phút 58

Hình 3.6: Quy trình xử lý mẫu dự kiến 61

Hình 3.7: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất thu hồi các bufadienolid trong mẫu bột cóc 63

Hình 3.8: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất thu hồi các bufadienolid trong mẫu xương cóc 64

Hình 3.9: Ảnh hưởng của thể tích dung môi chiết đến hiệu suất chiết các bufadienolid trong mẫu bột cóc 65

Hình 3.10: Ảnh hưởng của thể tích dung môi chiết đến hiệu suất chiết các bufadienolid trong mẫu xương cóc 66

bufadienolid trong mẫu xương cóc 70

Hình 3.13: Ảnh hưởng của thể tích dung môi rửa giải đến suất thu hồi các bufadienolid trong mẫu bột cóc 71

Hình 3.14: Ảnh hưởng của thể tích dung môi rửa giải đến suất thu hồi các bufadienolid trong mẫu xương cóc 72

Hình3.15: Quy trình xử lý mẫu tối ưu 73

Hình 3.16: Sắc đồ mẫu trắng bột cóc 75

Hình 3.17: Sắc đồ mẫu trắng bột có thêm chuẩn 75

Hình 3.18: Sắc đồ mẫu chuẩn hỗn hợp ba bufadienolid 500 ng /ml 75

Hình 3.19: Đường chuẩn của bufalin trong mẫu bột cóc 76

Hình 3.20: Đường chuẩn của cinobufagin trong mẫu bột cóc 77

Hình 3.21: Đường chuẩn của resibufogenin trong mẫu bột cóc 77

Hình 3.22: Đường chuẩn của bufalin trong mẫu xương cóc 78

Hình 3.23: Đường chuẩn của cinobufagin trong mẫu xương cóc 78

Hình 3.24: Đường chuẩn của resibufogenin trong mẫu xương cóc 78

Hình 3.25: Sắc đồ bufalin tại giới hạn phát hiện LOD 1,25 µg/kg 75

Hình 3.26: Sắc đồ resibufogenin tại giới hạn phát hiện LOD 2,5 µg/kg 80

Hình 3.27: Sắc đồ cinobufagin tại giới hạn định lượng LOQ 5,0 µg/kg 80

Hình 3.28: Sắc đồ resibufogenin tại giới hạn định lượng LOD 10,0 µg/kg 80

Hình 3.29: Sắc đồ mẫu bột cóc và thêm chuẩn 3 bufadienolid tại mức nồng độ 500 µg/kg 82

Hình 3.30: Sắc đồ mẫu xương cóc và thêm chuẩn 3 bufadienolid tại mức nồng độ 500 µg/kg 83

Bảng 1.2: Thống kê các vụ ngộ độc do ăn cóc và các sản phẩm chế biến

từ cóc 8

Bảng 1.3: Các phương pháp xác định nhóm độc tố bufadienolid 12

Bảng 1.4: Đánh giá độ lặp lại của phương pháp theo hội đồng Châu Âu 2002/657/EC 37

Bảng 1.5: Đánh giá độ đúng của phương pháp theo hội đồng Châu Âu 2002/657/EC 38

Bảng 2.1: Thông tin về mẫu nghiên cứu 41

Bảng 3.1: Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh 48

Bảng 3.2: Các thông số tối ưu MS/MS 51

Bảng 3.3: Chương trình chạy gradient 53

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của dung môi pha động đến thời gian lưu và diện tích pic 53

Bảng 3.5: Khảo sát các chương trình chạy gradient 55

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát gradient 56

Bảng 3.7: Khảo sát tốc độ dòng pha động 57

Bảng 3.8: Chương trình gradient tối ưu 58

Bảng 3.9: Khảo sát quy trình xử lý mẫu 60

Bảng 3.10: Khảo sát dung môi chiết với mẫu bột cóc 62

Bảng 3.11: Khảo sát dung môi chiết với mẫu xương cóc 63

Bảng 3.12: Khảo sát thể tích dung môi chiết với mẫu bột cóc 65

Bảng 3.13: Khảo sát thể tích dung môi chiết với mẫu xương cóc 66

Bảng 3.14: Khảo sát cột chiết pha rắn 67

Bảng 3.18: Khảo sát thể tích dung môi rửa giải với mẫu xương cóc 72 Bảng 3.19: Ion mẹ và 2 ion con của các bufadienolid 74 Bảng 3.20: Phương trình đường chuẩn của 3 bufadienolid trên mẫu bột cóc 76 Bảng 3.21: Phương trình đường chuẩn của 3 bufadienolid trên mẫu

xương cóc 77 Bảng 3.22: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các

bufadienolid 79 Bảng 3.23: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các bufadienolid trên mẫu

bột cóc 81 Bảng 3.24: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các bufadienolid trên mẫu

xương cóc 82 Bảng 3.25: Kết quả phân tích các bufadienolid trong các mẫu phẩm làm từ cóc 84

ACN Acetonitrile Acetonitril

AOAC Association of Official Analytical

ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử

GC-MS Gas chromatography mass

spectrometry Sắc ký khí khối phổ

HPLC High performance liquid

chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

NP-HPLC Normal phase high performance

LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

TLC Thin layer chromatography Sắc ký bản mỏng

TOF Time of flight analyser Bộ phân tích thời gian bay

RSD Relative standard devition Độ lệch chuẩn tương đối

SDS Sodium dodecyl sulfate Natri dodecyl sulfat

SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn

LLE Liquid liquid extraction Chiết lỏng lỏng

UFLC Ultra fast liquid chromatography Sắc ký lỏng siêu nhanh

UPLC Ultra performance liquid

chromatography Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

Tuy nhiên, trong số 529 loài cóc có 16 loài chứa chất độc bufotoxin, trong

đó có loài cóc nhà Việt Nam Bufo melanostictus Schneider Độc tố bufotoxin

thường gặp ở các bộ phận da, trứng, gan, ruột và nhựa cóc (ở tuyến sau tai, tuyến trên mắt và các tuyến trên da cóc) Các bufadienolid thường gặp trong độc tố cóc

là bufalin, cinobufagin resibufogenin, bufotalin, 19-hydroxy bufalin và một số hợp chất khác Các bufotoxin này là nguyên nhân chính của phần lớn các vụ ngộ độc do ăn các sản phẩm làm từ cóc [7, 8]

Trên thế giới có rất nhiều phương pháp xác định đồng thời các bufadienolid trong các đối tượng khác nhau như phương pháp như sắc ký bản

mỏng, sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao, sắc ký khí ghép khối phổ và sắc

ký lỏng hiệu năng cao (ghép nối với các detector UV, PDA, MS, MS/MS) Phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần có nhiều ưu điểm như rất chọn lọc, độ nhạy và độ chính xác cao, đặc biệt khi phân tích đồng thời các chất trong nền mẫu sinh học phức tạp Hiện nay, tại Việt Nam chưa có một nghiên cứu nào xác định đồng thời các bufadienolid trong các mẫu phẩm từ cóc Vì vậy,

để góp phần kiểm soát các nguy cơ tiềm ẩn ngộ độc độc tố cóc chúng tôi đã chọn

đề tài: ―Xác định đồng thời ba bufadienolid trong một số mẫu phẩm từ cóc

bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (LC - MS/MS)”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về bufadienolid

1.1.1 Giới thiệu chung về họ cóc và độc tố cóc

Bufadienolid là nhóm các hợp chất steroids 24C chứa vòng pyron tại C-17,

có nguồn gốc từ một số loài động vật và họ thực vật Trong động vật,

bufadienolid được tìm thấy chủ yếu ở cóc (Bufo), đom đóm (Photinus) và rắn (Rhabdophis), trong đó số lượng cao nhất và đa dạng của các chất đã được chứng

minh trong một số loài cóc [8, 17]

Cóc là động vật lưỡng cư, thuộc họ Bufonidae có 529 loài khác nhau, cư

trú ở khắp mọi nơi trên thế giới Trong số 529 loài có 16 loài có chất độc

bufotoxin, trong đó có loài cóc nhà Việt Nam Bufo melanostictus Schneider Độc

tố cóc (bufotoxin) chỉ có ở một số bộ phận cơ thể: nhựa cóc (ở tuyến sau tai, tuyến trên mắt và các tuyến trên da cóc), trong gan và buồng trứng Bufotoxin gồm hơn 40 hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau: bufalin, cinobufagin, resibufogenin, bufagin, bufogenin, bufothionin, epinephrine, norepinephrin, serotonin…Trong đó có những chất được xếp vào nhóm không gây độc bao gồm cholesterol, provitamin D, ergosterol và gamma sitosteral Những chất gây độc được xếp thành 3 nhóm:

- Nhóm 1: Các glycosis có tác dụng lên tim (hay bufadienolid) chủ yếu gồm bufalin, cinobufagin và resibufogenin có tác động trên hệ tim mạch của động vật và con người

- Nhóm 2: Phenethylamines và dẫn xuất Bao gồm các catecholamines như: dopamin, norepinephrin và epinephrin

- Nhóm 3: Tryptamines và dẫn xuất: serotonin, bufotenin, dimethyltryptamin (5-MeO-DMT) chúng có tác dụng tăng huyết áp và gây ảo giác và hưng thần (psychoactive) [13]

5-methoxy-N,N-Hình 1.1: Một số loài cóc có độc trên thế giới

1.1.2 Cấu tạo và tính chất của bufalin, cinobufagin, resibufogenin

Bảng 1.1: Cấu tạo và tính chất hóa lý của bufalin, cinobufagin, resibufogenin

STT Bufadienolid

Công thức phân tử, khối lƣợng phân tử (g/mol) và công thức cấu tạo

Tính chất hóa lý

1

Bufalin (3β,5β)-3,14-Dihydroxybufa- 20,22-dienolide, 5β,20(22)- bufadienolide-3β,14-diol)

- Tan trong methanol, ethanol, dimethylsulfoxid, chloroform [40].

2

Cinobufagin (14,15β-Epoxy-3β,16β- dihydroxy-5β,20(22)- bufadienolide16-acetate, 5β,20(22)-Bufadienolide-3β,16β- diol-14,15β-epoxy 16-acetate )

- Tan trong methanol chloroform, tan một phần trong nước [41]

3

Resibufogenin (3β,5β,15β)-14,15-Epoxy-3- hydroxy-5-bufa-20,22-dienolide)

- Tan trong methanol chloroform, tan một phần trong nước [42]

1.1.3 Tác dụng và độc tính của các bufadienolid

Bufadienolid có tác dụng trên tim giống digoxin [7, 36]: Ức chế kênh Na+

-K+-ATPase (giúp trao đổi giữa K+ ngoài tế bào và Na+ trong tế bào), khi kênh bị

Tác giả Yasuharu Hirai và các cộng sự đã nghiên cứu so sánh hoạt lực của bufadienolid tác dụng trên kênh Na+-K+-ATPase tại tế bào cơ tim của chuột với các glycosis tim khác, kết quả như sau: bufalin > digoxin > digitoxin > telocinobufagin > gamabufotalin > cinobufotalin > cinobufagin > g-strophanthin

> digitoxingenin > resibufogenin [33]

LD50 thực hiện trên chuột tiêm theo đường tĩnh mạch của bufalin, cinobufagin, resibufogenin tương ứng là 0,74 mg/kg, 1,21 mg/kg, 4,25 mg/kg khối lượng cơ thể, rất độc đối với tim gây sung huyết tế bào cơ tim Hiện nay, chưa có quy định về LD50 trên người [40, 41,42]

1.1.4 Ngộ độc do ăn cóc và các sản phẩm chế biến từ cóc

Tính tới ngày 8/ 9/ 2010, toàn quốc ghi nhận 06 vụ ngộ độc do độc tố trong cóc (bufotoxin) xảy ra trên địa bàn 6 tỉnh/ thành phố làm 17 người mắc, 13 người nhập viện và 05 người chết Đặc biệt là vụ ngộ độc dẫn đến 02 cái chết thương tâm tại Đồng Tháp vào ngày 5/ 9/ 2010 do sử dụng trứng cóc [1]

Bảng 1.2: Thống kê các vụ ngộ độc do ăn cóc và các sản phẩm chế biến từ cóc

- Rối loạn tiêu hoá: Bệnh nhân bị chướng bụng, đau bụng trên rốn; kèm theo nôn mửa dữ dội; có thể bị tiêu chảy

- Rối loạn tim mạch: Bệnh nhân hồi hộp, đánh trống ngực, tim đập nhanh; sau đó loạn nhịp tim (ngoại tâm thu thất, cơn nhịp nhanh thất), rung thất, block nhĩ - thất dẫn đến truỵ tim mạch; huyết áp lúc đầu cao sau đó tụt

- Rối loạn tâm thần kinh: Bệnh nhân rối loạn cảm giác (đau như kim chích

ở đầu ngón tay, ngón chân, tê môi ), chóng mặt, ảo giác, vã mồ hôi lạnh, tăng

tiết nước bọt; có thể khó thở, ngừng thở, ngừng tim

- Rối loạn tiểu tiện: Bệnh nhân xuất hiện bí đái, thiểu niệu, vô niệu và nặng

dẫn đến suy thận cấp

- Một số triệu chứng khác: Bệnh nhân xuất hiện bỏng rát, phù nề niêm mạc, mắt nếu bị nhựa cóc bắn dính vào trực tiếp niêm mạc

1.1.5 Các sản phẩm có nguồn gốc từ cóc

- Thuốc dân gian: Nhựa cóc là 1 trong 6 vị của đơn thuốc ―Lục thần

hoàn‖ Dân gian dùng nhựa cóc chữa giảm đau, tán thuỷ, dùng chữa phát bối, đinh độc, yết hầu sưng đau, đau răng Thịt cóc khô dùng với liều 2 – 3g tán bột uống hoặc làm thành thuốc viên, chữa gầy còm, chậm lớn, kém ăn, suy dinh dưỡng [2]

- Thuốc cổ truyền: Sản phẩm mới nhất làm từ cóc dùng để hỗ trợ điều trị

ung thư ở Việt Nam hiện nay là Linh Đan Thiềm ô châu (nguyên liệu là cóc cả

con, được luyện theo phương pháp bí truyền tạo thành linh đan – những viên

ngọc màu đen) của cơ sở Nam Y Đạo Pháp – DS Lương y Đào Kim Long Linh

đan Thiềm ô châu đã được sử dụng kết hợp với các vị thuốc Nam từ nhiều năm nay và cho kết quả rất tốt trong điều trị nhiều bệnh ung thư (ung thư phổi, ung thư gan, ung thư vòm họng, ung thư trực tràng, ung thư tuyến giáp, ung thư vú, ung thư tử cung, các bệnh bạch cầu cấp tính mãn tính dòng L và dòng M, bệnh suy tiểu cầu…)

Chansu là một loại thuốc cổ truyền được sử dụng rộng rãi tại Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ và một số quốc gia Châu Á khác để điều trị các bệnh nhiễm trùng, bệnh thấp khớp, viêm nhiễm, suy tim, loạn nhịp tim và ung thư như gan,

mật, tụy, phổi, ruột kết Chansu được chiết từ nhựa cóc Bufo bufo gargarizans Cantor (rất phổ biến ở Trung Quốc) hoặc Bufo melanosticus Schneider (phổ biến

ở Ấn Độ và Việt Nam) Kết quả nghiên cứu cho thấy có hơn 40 bufadienolid được phát hiện trong loại thuốc cổ truyền này [11, 28]

- Thực phẩm dinh dưỡng: Bột đạm cóc - Viện Dinh Dưỡng, Bột cóc royal

baby - Công ty cổ phần Dược và công nghệ Hóa sinh Hà Nội… sử dụng để chữa bệnh suy dinh dưỡng, còi xương và bổ sung chất dinh dưỡng cho trẻ em

Hình 1.2: Một số sản phẩm có nguồn gốc từ cóc

1.1.6 Nghiên cứu bufadienolid trong nước

Năm 1963 - 1964, tác giả Đào Kim Long đã xác định loài cóc thường thấy

ở Việt Nam là loài Bufo melanostictus, đó là mốc đánh dấu bước phát triển mới

trong nghiên cứu loài cóc nhà Việt Nam, trong thời gian tiếp theo, ông đã tiến hành một số nghiên cứu khác như cơ chế tiết nhựa, tính độc của nhựa cóc trên động vật… Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào về thành thành phần hóa học trong nhựa cóc

Năm 1973, nhóm nghiên cứu do tác giả Phan Quốc Kinh làm chủ đề tài đã

nghiên cứu về thành phần hóa học trong nhựa cóc Việt Nam – Bufo

melanostictus, các tác giả chỉ ra rằng chủ yếu chứa các chất có cấu trúc nhân

sterol Trong báo cáo về các hợp chất nhân sterol năm 1979 ở Thụy Sĩ, các tác giả đã xác định trong nhựa cóc có resibugigenin, bufotalin, 19-hydroxy bufalin

và nhiều bufadienolids khác, trong đó 19-hydroxy bufalin là thành phần chính

Đây là điểm khác biệt so với cóc Trung Quốc – Bufo bufo gargarizans (trong nhựa có chứa cinobufagin là thành phần chính) Như vậy, cóc Việt Nam – Bufo

melanostictus và Trung Quốc Bufo bufo gargarizans là hai loài khác nhau, có

thành phần bufadienolid khác nhau [8, 27]

Trong năm 2009, nhóm nghiên cứu (Phan Quốc Kinh, Hà Huy Kế, Đào Kim Long, Đào Anh Hoàng) đã định tính và định lượng 1 số kim loại nặng: As,

Ba, Bi, Cu, Mn, Pb, Se, Tl, Zn, Hg có trong từng bộ phận của cóc Việt Nam -

Bufo melanostictus bằng phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử

Như vậy, tại Việt Nam chưa có một nghiên cứu nào tiến hành xác định hàm

lượng các độc tố nhóm bufadienolid trong các sản phẩm có nguồn gốc từ cóc

cinobufotalin trong nhựa cóc

- Bản mỏng silicagel 60 GF254

- Pha động: chloroform – aceton (10:3)

- Hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric 10%

- Dung môi: ether dầu hỏa–ethyl acetat–methanol–nước với tỉ lệ:

4:6:4:6 (v/v) và 4:6:5:5 (v/v)

- Tốc độ dòng : 2 ml/ phút HPLC điều chế

- Cột tách: YMC-Pack ODS-A (250 ×

10 mm, 5 μm)

- Tốc độ dòng : 2,5ml/ phút

- Pha động: : Acetonitril - nước (0,3

% CH3COOH) theo chế độ gradient

- Dung môi: n-hexan/ethyl acetat/methanol/nước tỉ lệ 4:6:2:4 v/v, 4:6:2.5:4 v/v và 4:6:3.2:4 v/v

- Tốc độ dòng 1,5ml/phút

- Cột: Agilent ODS C18 (250 mm x 4.6 mm, 5 μm)

- Pha động: Acetonitril - nước (0,3 %

CH3COOH) theo chế độ gradient

- Phương pháp chiết lỏng – lỏng

- Dung môi chiết: cloroform

- Cột mao quản:50µm x 60,5 x 50cm chiều dài hiệu dụng

- Độ thu hồi: 97,25-101,2%

- RSD (%): 1,73 - 3,05%

[20]

- Điều kiện tối ưu: heptan 0,81%

(w/w), SDS 3,31%(w/w), butan-1-ol 6,61%(w/w)

- Dung dịch đệm: 10 mmol/l natri tetraborat trong nước, pH 9,2

- Bước sóng phát hiện: 298nm

GC – MS

Cinobufagin, , reisibufogenin trong thuốc cổ truyền Chansu

- Phương pháp chiết lỏng – lỏng

- Dung môi chiết: methanol

- Cột: HP-5MS 30m x 0,25mm x 0,25µm

resibufogenin ) - Cột tách: Diamonsil C18 (250 mm

x 4,6mm, 5,0µm)

- Pha động: Acetonitril - nước (0,3 %

CH3COOH) theo chế độ gradient

- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút

- Nhiệt độ cột tách: 30oC

- Bước sóng phát hiện: 296 nm

- Độ thu hồi: 98,9 – 102,0%

- RSD (%) < 3%

HPLC – UV

Cinobufagin, reisibufogenin trong thuốc cổ truyền Chansu

- Phương pháp chiết lỏng – lỏng

- Dung môi chiết: methanol

- Cột tách : BosChrom ODS C18 (150×4.6 mm, 5µm)

- Pha động: Đẳng dòng, acetonitril -

H2O chứa CDs ( α-CD, β-CD,

γ-CD, HP-β-γ-CD, hay RM-β-CD) ở các nồng độ khác nhau (40:60, v/v)

HPLC – UV

Cinobufagin và chất chuyển hóa của nó trong nước tiểu và huyết thanh

- Phương pháp chiết lỏng – lỏng

- Dung môi chiết: methanol (MeOH)

- Cột: Alltech Alltima C18 (250 mm x 4.6 mm, 5 µm)

- Pha động: acetonitril - đệm acetate (pH 3,2) (50:50, v/v), chế độ đẳng dòng

HPLC –

PDA

5 bufadienolid trong thuốc cổ truyền Chansu ( trong đó có cinobufagin và resibufogenin )

- Phương pháp chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn

- Dung môi chiết tối ưu: methanol

- Chất nội chuẩn: 3-epi- 16α- hydroxylresibufogenin

- Cột SPE: Extract-CleanTM

- Cột tách: Extened - C18 (250 mm x 4,6mm, 5,0µm)

- Pha động: Acetonitril - nước (0,3 %

CH3COOH) theo chế độ gradient

người

- Chất nội chuẩn: Ethinyl estradiol

- Phương pháp chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn

- Dung môi chiết: Hỗn hợp acid photphoric đậm đặc và chloroform

- Hệ số tương quan tuyến tính R2 = 0,9994

- LOD = 0,4 -0,5ng

- Độ thu hồi: 70,75 -

[37]

- Cột SPE: Oasis®HLB

- Cột tách: Symmetry Shield TM C18 (250 mm x 4.6 mm, 5 µm), tiền cột : Symmetry Shield TM C18 (20 mm x 3,9 mm)

- Pha động: acetonitril - nước (48:52), chế độ đẳng dòng

- Tốc độ dòng :3ml/ phút và 5ml/phút

- Bước sóng phát hiện: 296 nm

- Độ tinh khiết >97% [38]

-MS/MS

Arenobufagin trong huyết tương chuột

- Chất nội chuẩn: telocinobufagin

- Phương pháp chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn (SPE)

- Dung môi chiết: methanol

- Cột tách: XR- ODS II ( 75mm × 2.0mm , 2.1µm )

- Pha động: Acetonitril - nước (0,1%

HCOOH), theo chế độ gradient

3-epi Phương pháp chiết lỏng – lỏng

- Dung môi chiết: ethyl acetat

- Cột tách: Elite Kromasil C18 (150 x 2,1 mm, 3,5µm)

- Pha động: Acetonitril - nước (0,1%

HCOOH) theo chế độ gradient

+

- MS/MS

35 bufadienolid trong thuốc cổ truyền Chansu (trong đó có bufalin,cinobufagin, resibufogenin )

- Phương pháp chiết lỏng – lỏng

- Dung môi chiết: methanol

- Cột tách: Zorbax Eclipse XDB – C18 (250 mm x 4,6mm, 5,0µm)

- Pha động: Acetonitril - nước (0,2%

CH3OOH) theo chế độ gradient

cổ truyền Chansu bằng HPLC/APCI+-MS/MS

- Phương pháp chiết lỏng – lỏng

- Dung môi chiết: methanol

- Cột tách: Zorbax Eclipse XDB - C18 (250 mm x 4,6mm, 5,0µm)

- Pha động: Acetonitril - nước (0,3 % CH3COOH) theo chế độ gradient

- RSD (%) < 1,0%

[23]

LC/ESI+-

MS/MS

Bufalin, cinobufagin, reisibufogenin, bufotalin, arenobufagin trong huyết tương chuột

- Chất nội chuẩn: cadatin

- Phương pháp chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn

- Dung môi chiết: methanol

- Cột SPE: Oasis®HLB

- Cột tách: Alltima C18 (250 mm x 4,6mm, 5,0µm) và tiền cột Altech RP18 (3,9mm x 20mm)

- Pha động: Acetonitril - nước (0,2%

HCOOH) theo chế độ gradient

- Hệ số tương quan tuyến

tính R2 = 0,996

- LOD = 0,15ng/ml

- Độ thu hồi: 84,2 – 88,12%

- RSD (%) < 7,44%

[31]

- Chất nội chuẩn: Diphenhydramin

- Phương pháp chiết lỏng-lỏng

- Dung môi chiết: Ethyl acetat-diethyl ether (4:1)

- Cột tách: UPLCTM BEH C18 (50mm x 2,1mm, 1,7µm)

- Pha động: Acetonitril - nước (0,1%

HCOOH), theo chế độ gradient

Từ bảng 1.3 khi phân tích các bufadienolid bằng các phương pháp khác nhau, chúng tôi rút ra một số nhận xét:

- Phương pháp LC - MS/MS có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, rất chọn lọc và độ chính xác cao Trong các nghiên cứu này các tác giả chủ yếu sử dụng nguồn ion hóa là chế độ ion hóa phun điện tử ion dương (ESI+), cột tách pha đảo C18 (250 mm x 4,6mm, 5,0µm), nhiệt độ cột tách tối ưu là 30o

C Pha động là acetonitril – nước (chứa 0,1 - 0,3% acid formic hoặc acid acetic) với chế

độ đẳng dòng hoặc gradient, tốc độ dòng 0,7 –1,0 ml/phút Quá trình xử lý mẫu

sử dụng phương pháp chiết lỏng – lỏng ( các dung môi thường được sử dụng hexan/ethyl acetat, diethyl ether/ethyl acetat, ethyl acetat, ethanol, methanol/nước, đặc biệt là methanol), chiết pha rắn (cột chiết Oasis®

n-HLB, hoạt hóa cột bằng methanol – nước, rửa cột và rửa giải bằng hỗn hợp methanol nước chứa acid acetic hoặc acid formic) hoặc kết hợp cả 2 kỹ thuật chiết lỏng – lỏng

và chiết pha rắn

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn kết hợp với sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần với chế độ ion hóa phun điện tử ion dương (SPE–LC–ESI+–MS/MS) để xác định đồng thời ba bufadienolid trong các sản phẩm từ cóc

1.3 Phương pháp LC – MS/MS

1.3.1 Nguyên lý hoạt động

Về cơ bản, sắc ký lỏng khối phổ là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là detector khối phổ [3, 24]

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn

và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng – rắn) Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa, Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất

Một sơ đồ tóm tắt mô hình hệ thống LC – MS được trình bày ở hình 1.3

1.3.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

* Pha tĩnh trong HPLC

Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 – 7mm Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thuận (NP – HPLC) và sắc ký pha đảo (RP – HPLC)

- Sắc ký pha thuận: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN ), pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực như: n-hexan, toluen Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay

ít phân cực

- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37, còn pha động phân cực: nước, methanol, acetonitril Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha

Hình 1.3: Mô hình hệ thống LC–ESI–MS/MS

động lại là nước nên rất kinh tế Hệ này được sử dụng để tách và xác định các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực

* Pha động trong HPLC

Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định Có thể chia pha động làm hai loại:

- Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực như methanol, acetonitril Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha liên kết pha đảo

- Pha động có độ phân cực thấp: bao gồm các dung môi ít phân cực như xyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), chlorobutan, toluen

Tuy nhiên, pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi

có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ

Pha động trong LC – MS/MS không chỉ đóng vai trò tách các chất mà còn góp phần vào khả năng ion hoá của chất Chúng cũng có những yêu cầu cao hơn

về độ tinh khiết, hàm lượng các tạp chất Có những loại pha động được sản xuất riêng cho LC – MS/MS [4]

1.3.3 Khối phổ (Mass Spectrometry - MS)

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, bộ phân tích khối và bộ phận phát hiện Trước hết, các mẫu được ion hóa trong

nguồn ion, sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ [24]

a Nguồn ion hóa: Chất phân tích ra khỏi cột sắc ký ở dạng lỏng, khó

khăn lớn nhất ở đây là phải chuyển chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi Theo

kỹ thuật ion hoá của LC/MS, năng lượng của máy trực tiếp tác động vào pha lỏng hoặc rắn để tạo thành ion ở thể hơi Có nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau nhưng hai kỹ thuật hay được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ bao gồm:

 Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí quyển (Atmospheric Presure Chemical Ionization-APCI)

Dòng mẫu ở dạng lỏng thoát ra từ cột HPLC được đi qua một nguồn nhiệt cao để nhanh chóng hóa hơi Sau đó, dòng khí này được ion hóa nhờ một bộ phận phóng điện để tạo thành các ion phân tử

Hình 1.4: Kỹ thuật APCI với chế độ bắn phá ion dương

 Chế độ ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization - ESI)

Kĩ thuật ion hóa phun điện tử bao gồm ba quá trình cơ bản sau:

- Tạo thành các giọt mang điện tích

- Làm giảm kích thước của các hạt, và phân nhỏ các hạt

- Quá trình hình thành pha hơi các ion

Khi dung dịch mẫu ra khỏi cột sắc ký, được đưa vào ống mao quản bằng kim loại Đầu mao quản này được áp điện thế cao (4 - 6 kV) Khi điện tích dư trên đầu mao quản vượt qua sức căng bề mặt của dịch mẫu thì sẽ tạo thành các giọt mang điện tích Tiếp đó các giọt mang điện này được làm giảm kích thước nhờ hai quá trình liên tục xảy ra, đó là sự hóa hơi dung môi nhờ dòng khí N2

được liên tục thổi vào và sự bắn phá của các giọt tích điện cùng dấu Cuối cùng dẫn đến sự hình thành pha hơi của các ion Nhờ lực hút tĩnh điện mà các ion này được dẫn vào bộ phân tích khối phổ qua một cửa sổ rất nhỏ Dung môi và khí trơ

N2 được hút ra ngoài do một dòng khí (Curtain Gas)

Hình 1.5: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI

Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương và ion âm

Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu bắn với chế độ ion dương (+) hoặc ion âm (-) Kiểu bắn phá chế độ ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn

- Loại hình thành ion dương

o Phù hợp nhất cho phân tích các loại chất phân tích có tính bazơ

o Thường hình thành nên ion [M+H]+

o Cũng có thể hình thành ion [M+nH]n+

, [M+Na+]+

- Loại hình thành ion âm

o Thích hợp nhất cho sự phân tích các loại chất phân tích có tính acid

o Hình thành nên ion [M-H]

-, [M-nH]ESI là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao, ESI - MS thích hợp cho cả phân tử có phân tử khối nhỏ (khoảng 100-150 amu) cũng như phân tử khối lớn của các phân tử sinh học, các hợp chất khó bay hơi, không bền nhiệt, phân cực

n-và không phân cực

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật ion hoá phun điện tử (ESI) bắn phá với chế độ ion dương

b Bộ phân tích khối: Bộ phân tích được coi là quả tim của máy khối phổ,

có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt Sau khi đã được ion hoá, các ion được đưa đến bộ phân tích khối nhằm loại bỏ những ion không cần thiết, lựa chọn các ion phân tử, thực hiện bắn pha thêm để thu được các ion con Các kỹ thuật phân tích khối được sử dụng phổ biến là bộ phân tích tứ cực, bộ phân tích bẫy ion, bộ phân tích thời gian bay