Nghiên cứu, xác định đồng thời hàm lượng vitamin a, d2, d3 trong một số thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

Vì vậy việc phân tích hàm lượng vitamin A, D trong thực phẩm là cần thiết, vừa để xây dựng một quy trình định lượng đồng thờivitamin trong thực phẩm, vừa để góp phần xây dựng bảng thành

NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG

NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG

Người hướng dẫn khoa học:

TS MAI THỊ THANH HUYỀN

NGHỆ AN - 2015

Luận văn được thực hiện tại các phòng thí nghiệm chuyên đề - Khoa Hóa, Trung tâm Kiểm định An toàn Thực Phẩm và Môi trường, Trường Đại học Vinh

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến:

 TS Mai Thị Thanh Huyền - Bộ môn Hóa Phân tích, Trường Đại học Vinh đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn:

 PGS.TS Nguyễn Khắc Nghĩa, PGS.TS Trần Đình Thắng, TS Đinh Thị Trường Giang - Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên tôi trong quá trình làm luận văn

 ThS Chu Thị Thanh Lâm - Phòng thí nghiệm Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình làm thí nghiệm

Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô, Cán bộ bộ môn Hóa Hữu cơ, Hóa Phân tích - Khoa Hóa, Phòng Đào tạo Sau Đại học, các bạn đồng nghiệp, học viên cao học, sinh viên, gia đình và người thân đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Nghệ An, tháng 10 năm 2015

Tác giả

Nguyễn Thị Mai Hương

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

MỞ ĐẦU 1

1 L do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Vitamin D 3

1.1.1 Giới thiệu, c u tạo, phân loại và tên gọi 3

1.1.2 Nguồn cung c p vitamin D cho cơ thể 7

1.2 Vitamin A 10

1.2.1 Giới thiệu 10

1.2.2 Vai trò của vitamin A 12

1.2.3 Nguồn cung c p vitamin A cho cơ thể 14

1.3 Các phương pháp xác định vitamin A và D 14

1.3.1 Phương pháp thử nghiệm sinh học 14

1.3.2 Phương pháp quang ph 15

1.3.3 Các phương pháp x t nghiệm miễn dịch 16

1.3.4 Phương pháp sắc k lỏng hiệu năng cao (HPLC) 18

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 27

2.1 Hóa ch t, thiết bị và dụng cụ 27

2.1.1 Hóa ch t 27

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 27

2.2 Thu thập và bảo quản mẫu 28

2.3 Xử l mẫu 28

2.6 Chuẩn bị máy trước khi tiến hành phân tích 30

2.7 Khảo sát ph h p thụ tia UV của vitamin A, D2, D3 trong dung dịch 30

2.8 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần pha động 30

2.9 Phương pháp khảo sát đánh giá 30

2.9.1 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn định lượng của phương pháp 30

2.9.2 Giới hạn phát hiện (LOD) 31

2.9.3 Giới hạn định lượng (LOQ) 32

2.9.4 Xác định độ lặp lại (repeatability) 33

2.9.5 Xác định độ thu hồi 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Các thông số khảo sát 35

3.3 Khảo sát các điều kiện phân tích trên HPLC 35

3.3.1 Khảo sát ph h p thụ tia UV của vitamin D2, D3, A trong dung dịch 35

3.3.2 Lựa chọn cột phân tích cho máy HPLC 36

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thành phần pha động 37

3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng 41

3.3.5 Kết quả khảo sát phương pháp đo lập phương pháp chạy chuẩn vitamin A, D2, D3 42

3.4 Xây dựng đường chuẩn của vitamin 42

3.5 Khảo sát độ lặp lại của máy 46

3.6 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp 47

3.7 Xác định hiệu su t thu hồi 49

3.8 Kết quả phân tích một số mẫu thực phẩm 50

KẾT LUẬN 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 58

25(OH)D : 25-hydroxyl vitamin D

25(OH)D2 : 25-hydroxyl vitamin D2

25(OH)D3 : 25-hydroxyl vitamin D3

IT : Bẫy ion ( Ion trap)

IS : Ch t nội chuẩn(internal standard)

LC : Sắc kí lỏng (Liquid chromatography)

MeOH : Metanol

MS : Ph khối (Mass spectrometry)

MTBE : Methyl-tert-butyl ether

SPE : chiết pha rắn (Solid Phase Extraction)

UPLC : Sắc k lỏng hiệu năng cao

UV : Tia tử ngoại

DAD : Đầu dò mảng diot

RMSE : Độ lệch khởi động (root mean square error)

THF : Tetra hydro furan

ACN : Aceton nitril

LOD : Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ : Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

Hình 1.1 Khái quát về c u trúc và sự chuyển hóa các dạng vitamin D 4

Hình 2.1 Quy trình xử l mẫu 29

Hình 3.1 Ph h p thụ UV-VIS của vitamin D2 36

Hình 3.2 Sắc k đồ của vitamin A, D2, D3 ở tốc độ dòng 0,3 ml/phút cột C8 36

Hình 3.3 Sắc k đồ của vitamin A, D2, D3 ở tốc độ dòng 0,5ml/phút cột C18 37

Hình 3.4 Sắc k đồ các vitamin khi thay đ i tỷ lệ MeOH:THF 38

Hình 3.5 Sắc k đồ các vitamin khi thay đ i tỷ lệ MeOH:MTBE 39

Hình 3.6 Sắc k đồ các vitamin khi thay đ i tỷ lệ MeOH:ACN 40

Hình 3.7 Sắc k đồ của các vitamin ở các tốc độ dòng khác nhau 41

Hình 3.8 Peak của các nồng độ vitamin D2, D3, A trong đường chuẩn xếp chồng lên nhau 44

Hình 3.9 Đường chuẩn vitamin A 44

Hình 3.10 Đường chuẩn vitamin D2 45

Hình 3.11 Đường chuẩn vitamin D3 45

Hình 3.12 Sắc đồ mẫu cà rốt 51

Hình 3.13 Sắc đồ mẫu gan bò 51

Hình 3.14 Sắc đồ mẫu gan cá Tra 51

Hình 3.15 Sắc đồ mẫu gan gà 52

Hình 3.16 Sắc đồ mẫu n m sò 52

Hình 3.17 Sắc đồ mẫu n m đông cô 52

Hình 3.18 Sắc đồ mẫu n m đùi gà 53

Hình 3.19 Sắc đồ mẫu n m Linh chi 53

Hình 3.20 Sắc đồ mẫu gan lợn 53

Bảng 1.1 Nhu cầu vitamin D m i ngày của các lứa tu i 10

Bảng 3.1 Thời gian lưu - diện tích peak của các vitamin khi thay đ i tỷ lệ MeOH:THF 37

Bảng 3.2 Thời gian lưu - diện tích peak của các vitamin khi thay đ i tỷ lệ MeOH:MTBE 39

Bảng 3.3 Thời gian lưu - diện tích peak của các vitamin khi thay đ i tỷ lệ MeOH:ACN 40

Bảng 3.4 Sắc k đồ của vitamin D2 ở dòng 1 ml/phút (a) và 0,5 ml/phút (b) 42

Bảng 3.5 Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vitA 43

Bảng 3.6 Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vit D2 43

Bảng 3.7 Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chuẩn của vit D3 43

Bảng 3.8 Độ lặp lại của máy HPLC 46

Bảng 3.9 LOD, LOQ của vitamin A 47

Bảng 3.10 LOD, LOQ của vitamin D2 48

Bảng 3.11 LOD, LOQ của vitamin D3 48

Bảng 3.12 Kết quả xác định hiệu xu t thu hồi đối với các vitamin 49

Bảng 3.13 T ng hợp các điều kiện phân tích vitamin A, D2, D3 50

Bảng 3.14 Kết quả phân tích một số mẫu thực phẩm 50

MỞ ĐẦU

1 L o chọn tài

Vitamin là một ch t không sinh năng lượng nhưng nó không thể thiếu trong sự sống của con người Vitamin đóng vai trò là ch t xúc tác trong các phản ứng sinh hóa, từ quá trình trao đ i ch t, đến xây dựng hệ thống miễn dịch trong cơ thể M i loại vi ch t có những công dụng riêng và đều chứa trong nguồn thực phẩm hàng ngày Vitamin giúp chuyển hóa tối đa ch t dinh dưỡng thành năng lượng sống cho cơ thể, tăng cường sức đề kháng, bảo vệ cơ thể.Cơ thể con người cần 13 loại vitamin: A, C, D, E, K và 8 loại vitamin thuộc nhóm B nhưng cơ thể con người chỉ t ng hợp được vitamin D khi có ánh sáng mặt trời Chính vì vậy cơ thể l y vitamin từ nguồn bên ngoài là chủ yếu, có thể l y vitamin từ thức ăn, đồ uống chứa nhiều vitamin như các lại rau, củ, trái cây…

Vitamin D và vitamin A là hai vitamin thuộc nhóm vitamin tan trong dầu Vitamin A r t cần thiết cho thị giác, cho sự tăng trưởng, sự phát triển và duy trì của biểu mô Vitamin A có nhiều trong gan, thận động vật, các chế phẩm từ sữa, trứng và dầu gan cá Thiếu vitamin A gây hiện tượng tăng sừng

da, khô mắt, quáng gà lúc xẩm tối.Vitamin Dcó chức năng sinh học là duy trì nồng độ canxi và phốt pho bình thường trong huyết tương bằng cách tăng hiệu quả h p thụ các ch t khoáng từ khẩu phần ăn ở ruột non và tăng huy động canxi, phốt pho từ xương và máu Vitamin D có nhiều trong gan cá, bơ, sữa, trứng, n m… Thiếu vitamin D sẽ gây còi xương ở trẻ em, yếu cơ Vitamin cần thiết cho cơ thể nhưng thừa vitamin cũng có thể gây nên những

v n đề nghiêm trọng Trái với nhóm các vitamin tan trong nước khi thừa đều thải ra theo đường nước tiểu thì các vitamin tan trong dầu được dự trữ ở gan với các mức độ khác nhau Với một lượng vitamin A, D quá cao có thể gây

ngộ độc cho cơ thể Nếu thừa vitamin A trong thời gian dài gây đau xương khớp, rụng tóc, môi khô nứt nẻ, chán ăn, gan lách to Còn khi dùng với liều cao D2, D3 hàng nghìn lần liều phòng có thể gây ngộ độc Các triệu chứng hay gặp là k m ăn, buồn nôn, nóng, tiểu nhiều, ngừng lớn, xanh xao, đôi khi gây

co giật khó thở

Với những đặc điểm trên, kiểm soát và b sung hàm lượng vitamin phù hợp là r t quan trọng, nh t là khi trên thị trường ngày càng xu t hiện nhiều loại thực phẩm chế biến sẵn có b sung vitamin A và D Vì vậy việc phân tích hàm lượng vitamin A, D trong thực phẩm là cần thiết, vừa để xây dựng một quy trình định lượng đồng thờivitamin trong thực phẩm, vừa để góp phần xây dựng bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm địa phương.Có nhiều phương pháp, kĩ thuật đánh giá hàm lượng vitamin A, D2, D3 trong thực phẩm, trong

đó phương pháp sắc k lỏng hiệu năng cao cho ph p phân tích với độ nhạy và

độ chọn lọc cao Vì vậy chúng tôi đã chọn đề tài “NGHIÊN CỨU, XÁC

TH C PH M NG PHƯ NG PHÁP S C L NG HI U N NG CAO (HPLC)”

2 Mục ích nghiên cứu

Xây dựng được phương pháp xác định đồng thời hàm lượng vitamin A,

D2, D3 trên máy HPLC

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Thiết lập được phương pháp phân tích đảm bảo độ chính xác, độ hội

tụ, độ nhạy cao, xác định được LOD và LOQ của phương pháp

- Áp dụng phương pháp để khảo sát, xác định hàm lượng vitamin A,

D2, D3trong một số thực phẩm

4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

- Hàm lượng vitamin A, D2, D3 trong một số thực phẩm gan, cà rốt và n m

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Vitamin D

1.1.1 Gi i thiệu, c u tạo, ph n oại và tên gọi

Vitamin D là tinh thể không màu không mùi không vị, không tan trong nước mà tan trong ch t b o và các dung môi hữu cơ Nó được phát hiện ra năm 1922, được phân lập năm 1932, tìm được c u trúc năm 1936, và đến năm

1959 được t ng hợp nhân tạo Thuật ngữ vitamin D dùng để chỉ một nhóm sterol có c u trúc tương tự nhau, có khả năng làm tăng h p thụ canxi và photphat trong cơ thể chống bệnh còi xương ở trẻ và loãng xương hay xốp xương ở người già Nhóm ch t này gồm từ D2 đến D7 song quan trọng nh t là

D2 (ergocalciferol được t ng hợp từ ergosterol có nhiều trong n m và men bia), D3(cholecalferol có trong thịt, cá, gan, trứng, sữa được t ng hợp từ 7-dehydrocholeterol ở dưới da nhờ ánh sáng tia từ ngoại) Trong cơ chế sinh học, đặc tính và vai trò của chúng khá giống nhau Trong cơ thể vitamin D chuyển hoá ở gan và thận tạo ra ch t chuyển hoá có đặc tính là 1,25 -dihydroxycholecalciferol nhờ enzim deoxylase

Vitamin D có vai trò quan trọng trong quá trình tạo xương và răng nhờ

có tác dụng chuyển hoá và tăng h p thu canxi và phot pho ở ruột Bên cạnh

đó, canxi cũng cần thiết cho hoạt động của tim, cơ bắp và hệ thần kinh, đồng thời tham gia vào quá trình đông máu Ở trẻ nhỏ vitamin D tham gia vào quá trình canxi hoá sụn nên r t cần thiết cho sự phát triển xương ở trẻ Trẻ em bị thiếu vitamin D dẫn đến còi xương, lùn, xương bị dị dạng, răng không đều bị

dị hình, ở người lớn nêu thiếu vitamin D sẽ dẫn đến loãng xương Cung c p

đủ lượng vitamin D m i ngày làm giảm nguy cơ mắc bệnh cao huyết áp và một số bệnh ung thư, vì vitamin D điều hoà lượng canxi trong máu ức chế tế bào ung thư, đặc biệt là ung thư gan và ung thư đại trực tràng Bà mẹ mang

thai nếu thiếu vitamin D dẫn đên con sinh ra còi xương, khuyết tật, nh t là 3 tháng đầu thai kì, sẽ là t n thương não không thể phục hồi

Hình 1.1 hái quát về cấu trúc và sự chuyển hóa các dạng vitamin D

Các biểu hiện cho th y trẻ bị thiếu vitamin D: thần kinh bị kích thích, ngủ không yên gi c, hay tỉnh gi c, qu y khóc, và rõ ràng nh t là ở trẻ dưới 3 tháng tu i), hay bị mồ hôi trộm cả khi trời lạnh, bị co giật nếu sốt cao, có thể khó thở Nếu tình trạng thiếu vitamin D trầm trọng sẽ gây biến đ i cơ, biến dạng xương, sẽ ảnh hưởng đến chiều cao tầm vóc của trẻ sau này và khó có thể phục hồi Vì vậy, các mẹ cần cung c p đủ lượng vitamin D m i ngày cho trẻ để trẻ phát triển bình thường với tầm vóc cao to khoẻ mạnh

Thiếu vitamin D làm giảm hàm lượng serotonin trong não, ảnh hưởng đến tinh thần của con người Serotonin là một loại hoocmon được gọi là

“hoocmon hạnh phúc”, suy giảm lượng hoocmon này khiến tâm trạng con người b t n, dễ buồn chán, cáu bẳn, không kiểm soát được hành động và suy nghĩ, nếu thiếu hụt một cách trẩm trọng sẽ dẫn đến trầm cảm Nguyên nhân chính dẫn đến thiếu hụt lượng vitamin D trong cơ thể là ít tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, dù cho có chế độ ăn đầy đủ và đều đặn

Vitamin D đã được hoạt hoá duy nh t ảnh hưởng đến 2000 gen, đặc biệt là tăng cường hệ miễn dịch Vì vậy, thiếu vitamin D trong cơ thể gây ra các chứng bệnh nan y như:

1 Bệnh cúm: ở trẻ nếu thiếu hụt vitamin D sẽ làm giảm khả năng miễn dịch và dễ nhiễm bệnh ở đường hô h p

2 Suy nhược cơ bắp: theo nghiên cứu, có những người khoẻ mạnh mà

cơ bắp yếu đó là do thiếu hụt vitamin D

3 Bệnh vảy nến: những người ít tiếp xúc với ánh nắng mặt trời khả năng mắc bệnh là r t cao

4 Bệnh thận mãn tính: do cơ thể thiếu hụt trầm trọng lượng vitamin D làm tăng nguy cơ mắc bệnh thận

5 Đái tháo đường: Theo nghiên cứu, cung c p đủ lượng vitamin D cho trẻ thì làm giảm 80% nguy cơ mắc bệnh đái tháo đường typ 1

6 Bệnh hen suyễn: Cung c p đầy đủ lượng 1200 IU/ngày cho trẻ làm giảm rõ rệt nguy cơ mắc bệnh hen học đường

7 Bệnh nha chu: những người bị bệnh về nướu mãn tính đau nhức và chảy máu nướu nên b sung thêm lượng vitamin D để cơ thể sản xu t đủ defensins và cathelicidin Đây là các hợp ch t chứa các vi sinh vật giúp làm giảm vi khuẩn gây bệnh trong miệng

8 Bệnh tim mạch: Thiếu hụt vitamin D trong cơ thể gây suy tim sung huyết, nguyên nhân dẫn đến căn bệnh tim tiềm ẩn

Theo các nghiên cứu đã đưa ra hàm lượng vitamin D thường được chuẩn đoán bằng cách đo nồng độ hợp ch t 25-hydroxyvitamin D là một tiền

ch t của 1,25-dihydroxyvitamin D trong máu Một báo cáo năm 2008 đã chia thành 4 loại :

 Hơi thiếu 50-100nmol/l (20-40ng/ml) (1nmol/l = 0.4 ng/ml)

 Thiếu nhẹ 25-50nmol/l (10-20ng/ml)

 Thiếu trung bình 12.5-25.0 nmol/l (5-10ng/ml)

 Thiếu nghiêm trọng <12.5 nmol/l (<5ng/ml)

Theo nghiên cứu hàm lượng cần thiết 25(OH)D trong máu cần thiết để tránh bệnh còi xương ở trẻ và loãng xương ở người già là 15ng/ml Lượng cần thiết để tối ưu hoá sự h p thu canxi ở ruột là 34ng/ml Gần đây đã phát hiện

ra rằng hàm lượng trung bình 29-38 ng/ml có thể làm giảm đáng kể nguy cơ mắc bệnh ung thư về nội tạng và trên 33ng/ml sẽ làm giảm 50% tỷ lệ mắc ung thư trực tràng và ở mức 52 ng/ml làm giảm 50% nguy cơ ung thư vú

Tuy nhiên, bên cạnh các ưu điểm vượt trội của nó nếu quá lạm dụng

và cung c p quá nhiều cho cơ thể cũng sẽ dẫn đến hậu quả khá nghiêm trọng

Đó là làm tăng hàm lượng canxi quá mức trong máu, tăng canxi niệu làm đau nhức xương khớp, tăng huyết áp, tạo sỏi thận, đau mỏi, suy nhược, đau đầu mệt mỏi, giòn xương

Giải pháp ngăn ngừa thiếu hụt vitamin D

Nguồn cung c p vitamin D cho cơ thể gồm : ánh sáng mặt trời (phơi nắng 20 phút/ ngày) và từ thuốc b Bên cạnh đó có khoảng 10% hàm lượng vitamin D c p cho cơ thể m i ngày được l y từ bữa ăn Các thực phẩm giàu vitamin D như : trứng, cá, gan, sữa, n m, các thực phẩm có b sung vitamin D Lượng vitamin D cần thiết b sung theo khuyến cáo của Viện Dược phẩm Mỹ là 200- 600IU/ngày Nhưng thực tế, m i cơ thể cần một lượng khác nhau tuỳ theo thể trạng, độ tu i của m i người Có một số trường hợp lên đến 2000-4000IU/ngày

1.1.2 Nguồn cung c p vitamin D cho cơ thể

Có 3 con đường mà cơ thể h p thụ được vitamin D: qua da, bằng ăn uống và bằng thuốc b sung

Theo truyền thống, nguồn vitamin D con người bắt đầu từ da, không phải bắt nguồn từ miệng Sự t ng hợp vitamin D của da xảy r t nhanh chóng và mạnh mẽ, quá trình t ng hợp diễn ra dễ dàng chỉ sau một vài phút được tiếp xúc với ánh nắng mặt trời Tiếp xúc với ánh nắng mặt trời chứ không phải chế độ ăn uống là nguồn cung c p chính vitamin D cho cơ thể cho dự trữ và tuần hoàn, có thể xem đây là một chức năng của phần bề mặt

da hở Nguồn cung c p vitamin D qua da giúp cung c p 80-85% nhu cầu vitamin D của cơ thể Dưới tác dụng của tia cực tím các tiền ch t vitamin D

có ở tuyến bã và lớp Malpighi của biểu bì sẽ được chuyển thành vitamin D Nếu được phơi nắng đầy đủ, sau 3 giờ, 1cm2

da có thể sản xu t ra 18UI vitamin D3

Ví dụ khi người có làn da được tắm nắng vào mùa h (toàn thân, liều tối thiểu UVB), m i cơ thể sản xu t 20.000 IU vitamin D trong <30 phút

Để đạt được điều này tương đương với con người sẽ phải uống 200 ly sữa (100 IU/8 oz thủy tinh) hoặc dùng 50 viên vitamin t ng hợp tiêu chuẩn (400 IU/viên) trong một lần

Nguồn cung c p tự nhiên vitamin D khác là qua thức ăn Vitamin D có trong nguồn thực phẩm từ động vật (D3) và thực vật (D2), có nhiều trong các thực phẩm như dầu gan cá thu, dầu dừa, lòng đỏ trứng, sữa động vật

Những thực phẩm chứa nhi u Vitamin D:

Gan n u chín:

Có lẽ nhiều người không biết rằng, gan là có một nguồn cung c p vitamin D tuyệt vời cho cơ thể Mặc dù t t các loại thực phẩm như gan bò, gan gà và gan bê đều có chứa một hàm lượng lớn vitamin D, nhưng gan bê có hàm lượng vitamin D cao nh t trong số đó Gan bê không những hữu ích cho

sự phát triển xương mà còn giúp cho làn da, mái tóc khỏe mạnh và thúc đẩy

tái tạo tế bào

Sữa:

Sữa được xem là một trong những nguồn cung c p vitamin D tốt

nh t Một ly sữa có chứa r t nhiều ch t dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể Ngoài ra, sữa không những r t b dưỡng cho trẻ em mà còn có tác dụng tốt với sức khỏe của người lớn Các nhà nghiên cứu chỉ ra rằng vitamin D có trong sữa có khả năng chống lão hóa, do đó hãy thêm sữa vào thực đơn

hằng ngày của bạn

Lòng ỏ trứng:

Trứng là một thực phẩm giàu vitamin D, đặc biệt là phần lòng đỏ trứng Lòng đỏ trứng có khả năng điều hòa hệ thần kinh, hệ tim mạch và não Hơn nữa, trứng còn làm giảm nguy cơ bị đục thủy tinh thể cũng như kích thích tóc

mọc nhanh hơn

Cá hồi:

Cá hồi cũng là những nguồn cung c p vitamin D r t lớn Thực tế, cá hồi là một trong những nguồn vitamin D tự nhiên và các axít b o thiết yếu

r t hiếm có Loại cá này giúp cải thiện các chức năng của não bộ và bảo vệ

hệ thần kinh Nó hoạt động như một ch t chống trầm cảm và do đó h trợ trong việc giúp não thư giãn, tăng hiệu quả hoạt động của não và cải thiện trí nhớ

Dầu gan cá:

Dầu gan cá tuyết được biết đến rộng rãi như là một nguồn cung c p một lượng lớn vitamin D Loại dầu cá này có khả năng cải thiện tình trạng của tim

và hệ tim mạch Hơn nữa, nó h trợ trong việc tăng cường các hoạt động của

cơ bắp và độ đàn hồi của mạch máu Các nghiên cứu đã cho th y dầu gan cá giúp làm giảm lượng cholesterol cao trong máu và làm loãng máu, do đó giảm nguy cơ tắc nghẽn động mạch

Cá mòi óng hộp

Mặc dù cả cá mòi tươi và đóng hộp đều được ưa chuộng nhưng cá mòi đóng hộp được cho rằng có lợi hơn cho sức khỏe Ngoài các ch t dinh dưỡng khác, cá mòi đóng hộp r t giàu vitamin D, do đó giúp cải thiện sức khỏe của xương và sức khỏe tim mạch Hơn nữa, loại thực phẩm này còn được biết đến như một phương pháp điều trị viêm nhiễm hiệu quả và kiểm soát mức đường trong cơ thể

Pho mát

Pho mát là một trong những sản phẩm làm từ sữa r t giàu vitamin D Lượng vitamin D này sẽ giúp h p thụ lượng canxi cao từ phô mai, qua đó tăng cường độ chắc khỏe của xương và ngăn ngừa chứng loãng xương hiệu quả Hơn nữa, sự có mặt của vitamin D trong pho mát r t hữu ích cho việc tăng cường sức khỏe răng miệng và tránh sâu răng Điều này r t hữu ích trong việc ngăn ngừa sự hao mòn men răng

Cá trích

Cá trích là một trong những nguồn giàu chiết xu t vitamin D Với hơn

952 IU vitamin D chỉ trong một ch n cá trích, loại cá giàu dinh dưỡng này là một thực phẩm thiết yếu trong chế độ ăn uống khỏe mạnh Đặc biệt là cá trích Đại Tây Dương có lợi hơn nhiều so với cá ở Thái Bình Dương Mọi cách chế biến cá trích đều không làm giảm đi lượng vitamin D cung c p cho cơ thể

N m

Dữ liệu về thành phần thực phẩm hiện nay cho th y n m là một nguồn cung c p vitamin D tốt ngoài các nguồn từ động vật như trứng, sữa, thịt, cá v.v và vitanmin D được bảo toàn tốt trong quá trình n u ăn 16

Các báo cáo về n m của một số nước trên thế giới cho th y hàm lượng vitamin D trong n m tự nhiên ở trong khoảng 2 - 40 µg/100g, có thể đáp ứng

đủ nhu cầu vitamin D trong một ngày của cơ thể người và thay thế nguồn vitamin D từ các sản phẩm từ động vật, đặc biệt đối với người ăn chay [20]

Lượng vitamin D cơ thể cần m i ngày phụ thuộc vào tu i của m i người Trung bình lượng khuyến cáo hàng ngày từ t chức Food and Nutrition Board cho các lứa tu i khác nhau được liệt kê dưới đây đơn vị quốc tế (IU) bảng 1.1

ng 1.1 Nhu c u vita in D i ngày c a các a tu i 12

Khuyến cáo-tối đa

Liều lượng ( g) Khuyến cáo-tối đa

Retinyl acetat C22H32O2 (2E, 4E, 6E, 8E) 3 - 7 - dimethyl - 9 - (2 - 6 -

6 - trimethyl - 1 - cyclohexen - 1 - yl) - 2,4,6,8 - nona tetraen - 1 - yl acetat

Retinyl propionate C23H34O2 (2E, 4E, 6E, 8E) 3 - 7 - dimethyl - 9 - (2 - 6 - 6

- trimethyl - 1 - cyclohexen - 1 - yl) - 2,4,6,8 - nona tetraen - 1 - yl propionat

Retinyl palmitat (C35H47O2 )(2E, 4E, 6E, 8E) 3 - 7 - dimethyl - 9 - (2 -

6 - 6 - trimethyl - 1 - cyclohexen - 1 - yl) - 2,4,6,8 - nona tetraen - 1 - yl propionat

Vitamin A có tính ch t hóa học sau:

- Không tan trong nước, tan tốt trong các dung môi của lipit, ete, ethanol…

- Bền trong điều kiện yếm khí, bền với acid và kiềm ở nhiệt độ không quá cao

- Dễ bị oxy hóa bởi oxy không khí, ánh sáng làm tăng quá trình oxy hóa vitamin A

- Dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase thì retinol chuyển sang dạng retinal

- Phản ứng với SbCl3 cho phức ch t màu xanh

- Phản ứng với H2SO4 cho phức ch t màu nâu

1.2.2 Vai trò của vitamin A

Vitamin A có vai trò quan trọng trong sự phát triển của phôi thai, hình thành cơ quan trong quá trình phát triển của thai nhi, chức năng miễn dịch bình thường, và phát triển của mắt và thị lực

Vitamin A có các chức năng :

- Bảo vệ c u trúc của da trong toàn bộ cơ thể

- Yểm trợ thị giác trong quá trình phân biệt vùng sáng và vùng tối

- Xúc tác sự phóng thích tố sinh dục và hưng ph n quá trình thụ thai

- Phát triển sự tăng trưởng của nhau và bào thai

- Hưng ph n quá trình kiến tạo tủy xương

- Ức chế độc ch t sinh ung thư và gây xơ cứng tế bào

Vitamin A là một vi ch t có vai trò đặc biệt quan trọng với cơ thể, gồm

4 vai trò chính :

- Trên mắt: vitamin A có vai trò tạo sắc tố võng mạc giúp mắt nhìn được trong điều kiện thiếu ánh sáng, nếu thiếu vitamin A sẽ giảm khả năng nhìn trong bóng tối hay còn gọi là mắc bệnh quáng gà, nếu không điều trị sẽ dẫn tới mù lòa

- Trên da và niêm mạc: vitamin A giúp tăng tiết ch t nhày và ức chế sự sừng hóa Nếu thiếu vitamin A sẽ làm giảm bài tiết ch t nhày và tăng sự sừng hóa khiến cho mắt bị khô da bị khô, nứt nẻ và sần sùi

- Trên xương : cùng với vitamin D, vitamin A có vai trò giúp cho sự phát triển xương và tham gia vào quá trình phát triển cơ thể, đặc biệt ở trẻ em Nếu thiếu vitamin A trẻ em sẽ còi xương, chậm lớn

- Trên hệ miễn dịch : vitamin A giúp tăng t ng hợp các protein miễn dịch nâng, cao sức đề kháng của cơ thể do có tác dụng chống oxy hóa Khi thiếu vitamin A cơ thể dễ bị mắc các bệnh nhiễm khuẩn và t n thương ở đường hô h p, tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục Dễ nhạy cảm với tác nhân gây ung thư

Mới đây người ta còn phát hiện vitamin A còn có khả năng làm tăng sức đề kháng với các bệnh nhiễm khuẩn, uốn ván, lao sởi, phòng ngừa ung thư…

Thiếu vitamin A dẫn đến nguy cơ chậm lớn và ngừng phát triển, sừng hóa các màng nhầy ( ở niệu đạo, phế nang, đường tiêu hóa, ) đặc biệt là sừng hóa ở giác mạc gây mù lòa Nếu thừa vitamin A sẽ gây đau bụng, buồn nôn,

bơ phờ, chậm chạp, phù gai thị, thóp phồng, vài ngày tiếp theo da bong toàn thân rồi hồi phục dần khi đã ngừng thuốc Nó có thể gây buồn nôn, vàng da,

dị ứng, biếng ăn, nôn mửa, nhìn mờ, đau đầu, t n thương cơ và bụng, uể oải

và thay đ i tính tình Ngộ độc mãn có thể xảy ra sau khi uống 40.000 đơn vị hoặc hơn m i ngày, dùng thời gian dài gây đau xương khớp, rụng tóc, môi khô nứt nẻ, chán ăn, gan lách to Trong các trường hợp kinh niên, rụng tóc, khô màng nhầy, sốt, m t ngủ, mệt mỏi, giảm cân, gãy xương, thiếu máu và tiêu chảy có thể là các triệu chứng hàng đầu gắn liền với ngộ độc ít nghiêm trọng Các triệu chứng ngộ độc nói trên chỉ xảy ra với dạng tạo thành trước (retinoit) của vitamin A (chẳng hạn từ gan), còn các dạng caretonoit (như β-carotene trong cà rốt) không gây các triệu chứng như vậy

1.2.3 Nguồn cung c p vitamin A cho cơ thể

Vitamin A trong thực phẩm có nguồn gốc động vật dưới dạng retinol, còn thức ăn có nguồn gốc thực vật ở dưới dạng caroten (tiền vitamin A)

Retinol (các nguồn động vật): cá tuyết và cá bơn, dầu gan, thịt bò, bê, thịt

cừu và thịt gà, gan, bơ, phô mai, trứng, sữa, cá thu, thịt bò, cá mòi đóng hộp

Beta-Carotene (pro-vitamin A, các nguồn thực vật): cải xoăn, cà rốt

thường xuyên, rau mùi tây, rau bina, khoai lang, mơ khô, cải xoong, cải xanh, xoài, cà chua, bắp cải, đậu Hà Lan đông lạnh

1.3 Các phương pháp xác ịnh vitamin A và D

1.3.1 Phương pháp thử nghiệm sinh học

Phương pháp chính thức đầu tiên để xác định vitamin D là phương pháp thử nghiệm sinh học, trong đó hoạt tính sinh học của vitamin D được xác định bằng khả năng của nó ngăn ngừa hoặc cải thiện các triệu chứng thiếu hụt vitamin D trong cơ thể [16]

Bằng cách đo khả năng hoạt động chống còi xương, bằng thử nghiệm trên loài chuột (kiểm tra điểm vôi hóa hoặc kiểm tra chữa bệnh còi xương) đã

từ lâu được sử dụng để xác định vitamin D trong thực phẩm hoặc các dược phẩm Chuột còi xương được cho ăn bằng thức ăn có chứa một lượng khác nhau của vitamin D đã được thiết lập theo các định mức tiêu chuẩn Sau bảy ngày, xương của những con chuột được xử l bằng dung dịch nitrat bạc Lượng canxi mới được chuyển vào xương được biểu hiện thành vết tối trên ảnh chụp Thang tiêu chuẩn được thiết lập bằng cách xây dựng mối liên hệ giữa các vùng tối trên xương với lượng vitamin D trong chế độ ăn uống (cho

gà con mới sinh thức ăn b sung có chứa hàm lượng khác nhau của vitamin D) Hàm lượng vitamin D trong mẫu sau đó được xác định bằng cách so sánh với khu vực mờ tối của ch t chuẩn, từ đó xác định tỷ lệ tro xương sau ba tuần với m i chế độ ăn uống

Các sinh trắc nghiệm này có thể phát hiện vitamin D ở nồng độ r t

th p Ví dụ, kiểm tra trên dòng chuột có thể phát hiện hàm lượng th p tới 12

ng vitamin D Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp là không phân biệt giữa các dạng khác nhau của vitamin D, đòi hỏi thời gian chuẩn bị lâu dài, độ tin cậy th p so với các phương pháp khác

Phương pháp thử nghiệm sinh học với vitamin A là đã tiến hành cho chuột ăn thực phẩm đã bị rút hết ch t b o bằng h n hợp ete-rượu (1909) Với thí nghiệm này, Step đã đưa ra nhận x t rằng: trong thực phẩm có các yếu tố hòa tan trong ch t b o cần thiết cho hoạt động sống của cơ thể gọi là yếu tố A, sau này gọi là vitamin nhóm A

Từ lâu người ta cho rằng vitamin A chỉ tồn tại chủ yếu trong các sản phẩm động vật như gan cá, mỡ bò, trứng… Mãi đến năm 1920 Osborn, Mendel và một số tác giả khác phát hiện th y có các hợp ch t tương tự ở thực vật Sau đó tới Eiler (1929), Mur (1930) đã đưa ra kiến cho rằng các hợp

ch t tương tự đó, các Caroten chính là tiền thân của Vitamin A hay gọi là provitamin A Năm 1828-1931 nhà bác học Thụy Sỹ Paul Karrer đã dùng phương pháp sắc k để phân chia và phát hiện ra c u trúc của Vitamin A và Caroten Năm 1950 nhiều nhà hóa học trong đó có Karrer đã t ng hợp thành công ch t β-Caroten là một trong số 3 dạng phân quan trọng của Caroten

1.3.2 Phương pháp quang phổ

Ph hồng ngoại đã được sử dụng để phân tích định lượng của vitamin

D Trong các pha rắn, vitamin D2 có thể được phân biệt với vitamin D3 dựa vào đỉnh ph vitamin D2 tại 907 cm-1.Ph FTIR đặc trưng của tinh thể vitamin

D2 và D3 cũng đã được mô tả Vitamin D có thể được định lượng bằng cách

đo sự h p thụ tia cực tím tối đa ở 264 nm Hạn chế của phương pháp này là các hợp ch t h p thụ tia cực tím khác trong mẫu đo sẽ can thiệp vào kết quả định lượng vitamin D [17]

Phương pháp so màu cũng được sử dụng rộng rãi nh t để phân tích các vitamin A trước khi phương pháp HPLC ra đời Phương pháp này dùng để phân tích ch t t ng hợp và thực phẩm dựa trên sự hình thành một phức ch t màu xanh giữa triclorua antimon hoặc trifluoroacetic acid với retinol trong chloroform, được đo ở 620 nm Phương pháp này được sử dụng trên toàn thế giới nhưng dần được thay thế bằng phương pháp HPLC Vì phương pháp so màu có nhược điểm: thiếu đặc trưng, màu sắc không n định đòi hỏi phải nhanh chóng và thời gian đo lường phải phù hợp, và sử dụng các thuốc thử ăn mòn và gây ung thư, các bước khảo nghiệm phải được kiểm soát cẩn thận

1.3.3 Các phương pháp x t nghiệm miễn ịch

Năm 2013 Wendy L Arneson và cộng sự 24 đã đề cập đến các phương pháp hiện tại được dùng rộng rãi để đánh giá hàm lượng vitamin D trong lâm sàng bằng cách đo lượng 25(OH)D và các dạng chuyển hóa hydroxyl vitamin D khác trong huyết thanh người Trong bài báo này tác giả có đánh giá về các phương pháp thường dùng ph biến nh t để định lượng vitamin D đó là phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA), phương pháp LC-MS/MS và phương pháp HPLC Tác giả đã mô tả khá đầy đủ về quy trình thực hiện phương pháp x t nghiệm miễn dịch và nêu ra một số phương pháp x t nghiệm miễn dịch để định lượng vitamin D được FDA ch p thuận hiện có gồm phương pháp x t nghiệm miễn dịch quang hóa học (ECLIA), phương pháp RIA

Phương pháp miễn dịch enzyme cũng được sử dụng để phân tích vitamin D Vitamin D cho liên kết với protein đồng nh t, từ đó đo lường hàm lượng thực t ng cộng 25(OH)D Các t hợp liên kết protein - vitamin D có thể nhận diện vitamin D2 và D3 và cũng xác nhận hàm lượng t ng cộng 25-hydroxy D một cách chính xác

Lena Jafri và nhóm cộng sự 20 đã so sánh ba phương pháp miễn dịch phóng xạ (RIA) với HPLC và phương pháp miễn dịch quang hóa học

(ECLIA) trong việc định lượng 25(OH)D trong huyết thanh người Trong nghiên cứu này, đối với phương pháp RIA: sử dụng một ống phóng xạ gama

đa năng Genesys ghi lại sự phát xạ của các phân tử Giới hạn phát hiện dưới của thử nghiệm là 1,5 ng/ml, giới hạn phát hiện trên là 100 ng/mL và CV của thử nghiệm là 11% Đối với phương pháp HPLC sử dụng hệ thống HPLC Perkin Elmer series 200 để phân tích các 25(OH)D huyết thanh, với cột 5 μm C-18 (4,6 150 mm, Supelco) và một đầu dò mảng diode L y 0,5ml mẫu huyết thanh thêm vào 25μl etanol sau khi votex và ủ trong vòng mười phút ở nhiệt độ phòng thì thêm tiếp 500μl metanol và isopropanol (90:10, v/v) và tiếp tục votex mười lăm giây Dung dịch thu được thêm vào 1,5 mL n-hexane

và tiếp tục votex trong 1 phút và ly tâm trong ba phút Lớp hexane được cho bay hơi đến khô dưới dòng khí nitơ Các mẫu được pha trong 100 ml metanol

và đem phân tích tại tốc độ dòng chảy 1,75 ml/phút với pha động nước (85:15, v/v) bằng đầu dò UV ở 265nm Giới hạn phát hiện là 3 ng/ml trong khi khoảng tuyến tính tiêu chuẩn là 25-100 ng/ml Với phương pháp ECLIA sử dụng máy phân tích x t nghiệm miễn dịch Roche (Roche Modular E170), bộ kit thương mại dựa trên phương pháp ECLIA từ Roche Giới hạn phát hiện dưới của thử nghiệm là 4,0 ng/ml, giới hạn phát hiện trên là 100 ng/ml và độ chính xác của thử nghiệm là CV = 9,9% Hàm lượng trung bình 25(OH)D với HPLC so với RIA là 50,1 nmol/l ( khoảng tuyến tính là 17,7-199,4 nmol/l) và 51,1 nmol/l (12,5-187,2 nmol/l), trong khi nồng độ 25(OH)D trung bình với RIA so với ECLIA là 32,4 nmol/l (9,98-199,7 nmol/l) và 29,9 nmol/l (4,9-214,6 nmol/l) Dữ liệu so sánh cho HPLC so với RIA cho th y RIA = -1.13 1.01 (HPLC) (RMSE = 11,2 nmol/l) và cho RIA so với ECLIA thì ECLIA = 3.21 0.9 (RIA) (RMSE=9.6 nmol/l) Kết quả cho th y có mối tương quan có thể ch p nhận được giữa HPLC và RIA cũng như RIA và ECLIA trong định lượng 25(OH)D

Metanol-1.3.4 Phương pháp sắc k ỏng hiệu năng cao HPLC

Phương pháp sắc k lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã được sử dụng rộng rãi để xác định các vitamin tan trong ch t b o từ giữa những năm 1970 và đã được thông qua như là phương pháp chính thức nhờ khả năng phát hiện, tính chọn lọc cao Thiết bị sử dụng để phân tích vitamin D trong thực phẩm là máy sắc k lỏng hiệu năng cao sử dụng hệ thống tách sắc k gh p nối các đầu dò

UV, đầu dò mảng đi ốt (DAD) và đầu dò khối ph (MS)

Hiệp hội hóa học phân tích tiêu chuẩn (AOAC) đã xác nhận các phương pháp hóa học sau để phân tích vitamin D trong thực phẩm

Phương pháp AOAC 980.26: vitamin D trong các chế phẩm vitamin

t ng hợp

Phương pháp AOAC 981.17: vitamin D trong sữa tăng cường và sữa bột Phương pháp AOAC 982.29: vitamin D trong thực phẩm, các loại bột

h n hợp và thức ăn chăn nuôi

Phương pháp AOAC 992.26: vitamin D3 trong sữa công thức pha sẵn dành cho trẻ em

Phương pháp AOAC 995.05: vitamin D trong sữa công thức cho trẻ sơ sinh và các sản phẩm đường ruột (cho ăn bằng ống)

Phương pháp AOAC 2002.05: Cholecalciferol (vitamin D3 ) trong thực phẩm được lựa chọn (sữa tăng cường, sữa công thức cho trẻ sơ sinh, cháo, bơ thực vật, dầu ăn và dầu cá)

Các phương pháp trên về nguyên tắc đều tương tự nhau, m i phương pháp đều thông qua 4 giai đoạn chính:

Xà phòng hóa mẫu

Chiết mẫu để tách các vitamin D ra khỏi các nền mẫu thực phẩm Làm sạch, tách các vitamin D khỏi các thành phần khác trong thực phẩm Định lượng bằng HPLC với đầu dò UV

Các phương pháp trên khác nhau bởi việc lựa chọn ch t nội chuẩn, dung môi chiết (heptan, hexane, pentane hoặc ether dầu hỏa ), các phương pháp làm sạch (các cột nhôm, cyano, cột pha đảo hoặc silica, pha rắn ), sự lựa chọn của cột phân tích (Partisil, pha đảo hoặc silic) và bước sóng UV để phát hiện (254 hoặc 265 nm.)

Phương pháp HPLC đầu tiên được giới thiệu để xác định vitamin D là phương pháp ngoại chuẩn [22], sau đó được giới thiệu phương pháp nội chuẩn Tuy nhiên những nghiên cứu này chỉ xác định được vitamin D3 và vitamin D2 mà không bao gồm dạng chuyển hóa 25(OH)D

Tác giả Anders S và cộng sự 11 đã nghiên cứu xác định vitamin

D3trong sữa bột, sữa công thức, dầu ăn, margarine và dầu cá bằng phương pháp HPLC Phương pháp phân tích dựa trên phương pháp đề xu t của AOAC 2002.05 Mẫu phân tích được thêm ch t nội chuẩn là vitamin D2 sau

đó xà phòng hóa bằng KOH, etanol có b sung thêm ch t chống oxi hóa butylated hydroxytoluene (BHT) Chiết mẫu thu được bằng cyclohexan và n-heptan (1:1) và làm sạch bằng cột silica Dịch chiết được đem đo mẫu ở máy HPLC đầu dò UV ở bước sóng 265nm,cột cho phân tích định lượng LC-C18, 250x 4,6 mm, dp = 5μm (Vydac 201 TP 54, hoặc tương đương) với cột bảo vệ C18, 4.0x4,0 mm, dp = 5μm (LiChroCART 4-4, hoặc tương đương) Sử dụng

hệ pha động 1: 0.5% isopropanol và 2% methyl-tert-butyl ether (MTBE) trong cyclohexane:n-heptan; trộn 5 ml isopropanol và 20 mL MTBE với 1L cyclohexane:n-heptan (1 1); pha động 2: isopropanol+n-heptan (20 + 80) Pha loãng 200 ml isopropanol thành 1 lít với n-heptan; Pha động 3: Metanol axetonitril (20 80) Pha loãng 200 ml metanol thành 1 lít với acetonitrile Hàm lượng vitamin D3 trong các mẫu nghiên cứu từ 0,4 - 12 µg/100g.Sự thu hồi từ các mẫu với vitamin D3 được thêm chuẩn thay đ i 93-102% Giá trị độ lệch chuẩn tương đối (RSDr) cho kết quả ch p nhận thay đ i

từ 2,2% (dầu cá) và 7,4% (dầu ăn), 6,8% (bơ thực vật)

Jette Jakobsen và cộng sự 16 đã xác định hàm lượng t ng vitamin D trong thịt bao gồm vitamin D3 và 25-hydroxyvitamin D3, được định lượng bằng phương pháp HPLC sau khi thủy phân bằng kiềm, chiết pha rắn và bán chuẩn bị HPLC Một hệ thống bán chuẩn bị HPLC gồm bộ điều khiển 600 và bơm, một máy làm lạnh 717 PLUS mẫu tự động và một detector h p thụ bước sóng 2487

Detector DAD được sử dụng ở khoảng 220-320nm và việc định lượng được hiện

ở bước sóng 265nm Vitamin D2 được sử dụng giống như ch t nội chuẩn đối vớivitamin D3 cũng như là đối với 25(OH) D3 Nghiên cứu này là một phương pháp phân tích có thể được sử dụng cho việc đánh giá các loại vitamin D khác nhau, đóng góp thông tin mới vào bảng thành phần thực phẩm

Markus Herrmann và cộng sự đã phát triển một phương pháp x t nghiệm sắc k lỏng khối ph song song (LC-MS) sử dụng hệ thống khối ph API 5000 kết hợp với một nguồn bức xạ ion hóa, tách sắc k sử dụng cột sắc

k pha đảo Supelco C8 (Supelcosil LC-8, 3.3cm x 3mm, kích thước hạt 3μm) được sử dụng cột bảo vệ Phenomenex C8 (4 2,0 mm) để định lượng 25(OH)D2 và 25(OH) D3 trong huyết thanh 19 Phương pháp mới này được đánh giá kết quả cùng với hai phương pháp sử dụng rộng rãi để x t nghiệm miễn dịch RIAvà ECLIA Kết quả cho th y phương pháp LC-MS định lượng chính xác 25(OH)D phù hợp với ph p phân tích bằng RIA còn đối với phương pháp ECLIA thì cho th y có sự sai lệch

Một phương pháp định lượng đơn giản vitamin D được Lone Hym ller

và cộng sự công bố năm 2011 18 Mẫu huyết tương hoặc huyết sau khi xà phòng hóa và chiết xu t được tách bằng cột sắc k lỏng pha đảo C30 (250mm 4.6mm ID) với cỡ hạt 5,0μm và cột bảo vệ C30 (10mm 4.0mm ID) với cỡ hạt 5,0μm Nhiệt độ cho cả hai cột là 500C, thể tích tiêm mẫu là 50 μl Chương trình gradient rửa giải được thực hiện tại tốc độ dòng chảy 1,0 ml/phút với MeOH (85%) và EtOH trong 55 phút Trong 12 phút đầu tiên 5%

EtOH được bơm qua cột và sau đó là tỉ lệ EtOH được tăng lên đến 40% trong

ba phút Mười bảy phút sau đó số lượng EtOH được tăng lên đến 90% trong thời gian 3 phút và được duy trì liên tục trong 10 phút để làm sạch các cột Gradient được đưa trở lại thiết lập ban đầu trong 5 phút và 5 phút sau đó các mẫu tiếp theo có thể được tiêm Các peak thu được nằm trong khoảng 25 phút đầu tiên Giới hạn phát hiện g p ba lần so với tín hiệunhiễu nền đã được xác định đến 0,14 ng/ml huyết tương và giới hạn định lượng g p mười lần tín hiệu nhiễu nền đến 0,45 ng/ml huyết tương Phương pháp này được sử dụng để xác định thành phần vitamin D và ch t chuyển hóa của nó trong huyết tương của sáu loài khác nhau với: bò, lợn, gia cầm, chồn, ngựa, và con người Ở gia súc hiệu su t thu hồi đạt 86,6 và 101,0%, sai khác trong ngày từ 0,9 đến 5,9%, và sai khác giữa các ngày là 0,2 đến 1,7% Tuy nhiên, tùy thuộc vào loại và số lượng mẫu mà phần tỉ lệ sai số là khác nhau

Wiraj J Jasinghe và cộng sự đã đưa ra kết luận từ việc phơi nắng cho

n m để tăng hàm lượng vitamin D 25] N m tươi (Lentinula edodes), n m Sò (Pleurotus ostreatus), n m Mỡ (n m nút) (Agaricus bisporus), và n m Bào ngư (Pleurotus cystidus) được chiếu xạ 1 giờ với tia cực tím A (UVA; bước

sóng 315-400 nm), tia cực tím B (UVB; bước sóng 290-315 nm), và tia cực tím-C (UVC; bước sóng 190-290 nm) Mẫu bột n m khô đông lạnh (0,5g) được cân chính xác vào bình đáy tròn 250 ml và trộn với 4ml dung dịch natri ascorbate (17,5 g natri ascorbate trong 100 ml dung dịch NaOH 1 M), 50ml etanol (95%), và 10ml dung dịch kali hydroxit 50% Mẫu được xà phòng hóa trong điều kiện đun hồi lưu ở 80 °C trong 1 giờ, sau đó nó đã nhanh chóng làm lạnh đến nhiệt độ phòng và chuyển vào phễu tách H n hợp này lần đầu tiên được chiết xu t với 15ml nước de-ion, sau đó là 15ml etanol và sau đó chiết ba lần với n-pentan có thể tích lần lượt là 50, 50 và 20ml Toàn bộ phần hữu cơ được rửa ba lần với 50 ml dung dịch KOH 3% trong etanol 5% và sau

đó rửa lần cuối với nước de-ion cho đến khi trung hòa Các phần dịch chiết

hữu cơ được chuyển vào bình đáy tròn, cô quay ở 40°C, và ngay lập tức tái hòa tan trong 5ml etanol Sau đó mẫu được đi qua một bộ lọc 0,45μm 20 μl của mẫu lọc được tiêm vào hệ thống HPLC đầu dò UV và tách rửa nhờ cột C18 pha đảo với pha động là ACN:MeOH (5:25) và tốc độ dòng chảy 2,3 ml/phút Quá trình chuyển đ i của ergosterol thành vitamin D2 dưới UVA, UVB và UVC đã có sự khác biệt đáng kể Hàm lượng vitamin D2 cao nh t (184 ± 5.71 μg/g DM) được quan sát th y trong n m Sò chiếu tia UVB ở nhiệt

độ 35 0C và độ ẩm khoảng 80% Mặt khác, theo cùng điều kiện chiếu xạ, hàm lượng vitamin D2 th p nh t (22,9 ± 2,68 μg/g DM) đã được quan sát th y trong n m mỡ Ngoài ra cường độ của bức xạ tia cực tím và liều chiếu xạ được áp dụng, cũng góp phần vào sự chuyển đ i của ergosterol trong n m thành vitamin D2 Ngay cả trong điều kiện bình thường, 5g n m đông cô tươi được chiếu trong 15 phút với tia UVA, hoặc UVB là thừa đủ để có được các liều cung c p được đề nghị của vitamin D cho người lớn (10 μg /ngày)

Năm 2010 Sundar R.K và cộng sự đã công bố một công trình khoa học về hàm lượng vitamin D2 trong n m mỡ (Agaricus bisporus) sau khi tiếp xúc với tia

cực tímbằnghệ thống HPLC-MS sử dụng cột Gemini 5μm C18 với pha động methanol:acetonitrile (25:75, v/v), tốc độ dòng 0.2 ml/min 21 Hàm lượng vitamin D2 trong n m tăng tương ứng với số lượng các xung ánh sáng tia cực tím Không có sự khác biệt thành phần vitamin D2 trong n m từ các giỏ 200g và 500g theo các xung ánh sáng N m lớp trên cùng có hàm lượng vitamin D2 cao hơn so với lớp dưới cùng của một giỏ còn n m thái lát (dày khoảng 5 mm) sau khi chiếu

xạ có hàm lượng vitamin D2 cao hơn n m thái lát thông thường Như vậy, sử dụng các xung cực tím cung c p một phương pháp có hiệu quả cao để tăng nồng độ vitamin D2 trong n m mỡ A Bisporus

Xiuping Xue và các cộng sự [26] đã đưa ra phương pháp xác định đồng thời 5 vitamin tan trong dầu menadione, retinyl acetate, cholecalciferol, α-tocopherol và α-tocopherol acetate trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp

sắc k lỏng hiệu năng cao sau khi chiết pha rắn Mẫu nghiên cứu sau khi cho dung dịch NH3 0,2% vào đem siêu âm trong bể ở 400 - 500C trong vòng 20 -

30 phút Sau đó đem chiết bằng ethanol Dung dịch sau khi chiết được làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bóng tối Sau khi thêm một lượng thích hợp ethanol vào thì đem li tâm 10 phút sau đó đem đi chiết pha rắn sử dụng cột Oasis HLB Đầu tiên, cột Oasis HLB được hoạt hóa bởi 1ml dung dịch methanol, tiếp theo là 1ml nước đề ion Sau đó 1ml dung dịch cần chiết được

đi qua cột Oasis HLB với tốc độ dòng là 1ml/phút Sau khi rửa giải bằng 1ml dung dịch methanol 5% thì mẫu được hòa tan bằng 1ml ethanol và được đem

đi phân tích trên máy HPLC Shimadzu đầu dò UV ở bước sóng 230 và 265nm

sử dụng cột Atlantis dC18 (4,6mm × 150mm; 5µm) (Waters Crop, Dublin, Ireland) Pha động là MeOH:H2O tỉ lệ 98:2 với tốc độ dòng 1ml/phút Phương pháp có độ nhạy và độ chọn lọc cao Phương pháp này có giới hạn phát hiện (LOD) trong khoảng 0,075 - 1,26µg/ml và có giới hạn định lượng (LOQ) trong khoảng 0,25 - 4,2 µg/ml

C Genestar và các cộng sự [13] đã đưa ra phương pháp để xác định Vitamin A trong chế dược phẩm mà không cần xà phòng hóa bằng phương pháp sắc k lỏng hiệu năng cao sử dụng cột pha đảo (Nova-Pack C18, 4 µm, 60Å) với pha động aceto-nitrile-tetrahydrofuran-nước (55: 37: 8) và tốc độ dòng 1,5 ml/phút Xử l mẫu bao gồm quá trình chiết su t hàm lượng retinol acetate từ dạng viên nang hoặc viên n n với methanol Chiết tách đạt được bằng cách khu y mạnh trong 2 - 2,30h ở nhiệt độ phòng Phương pháp này được đo ở bước sóng từ 240 - 360 nm và ở bước sóng 325nm chiết tách được vitamin A acetat tối ưu, không làm thay đ i dung môi là cần thiết đưa mẫu trong hệ thống sắc k Phương pháp này là phù hợp để định lượng thường xuyên vitamin A

Sữa bò được coi là một nguồn dinh dưỡng cung c p vitamin A, E và carotene Tim Plozza và cộng sự [23] đã xác định đồng thời các vitamin trong

b-sữa bò bằng phương pháp sử dụng sắc l lỏng hiệu năng cao gắn với khối ph (HPLC-MSn) Các hợp ch t này được tách với cột C18-A Polaris và pha động nước-methanol và mức được xác định bằng cách sử dụng những mảnh vỡ

MS2 (vitamin A, m/z 213 và m/z 199, vitamin E m/z 165 và b - carotene m/z 413) HPLC-MSn được hoạt động ở chế độ ion dương APCI Phương pháp này đã được chứng minh bằng cách sử dụng các nghiên cứu lặp lại và so sánh với kiểm chứng trước đó lỏng hiệu su t cao sắc k UV/vis (HPLC-UV/Vis)

và huỳnh quang (Fl-HPLC) quy trình được sử dụng trong phòng thí nghiệm

Hệ thống đo khuếch đại tương tự như nhau cho HPLC-MSn

, HPLC-UV /Vis

và HPLC-Fl, ví dụ: vitamin A 45lg/100 ml, HPLC-MSn ± 8%, HPLC-UV/Vis

± 9%; vitamin E 150 lg/100 ml, HPLC-MSn ± 11%, HPLC-Fl ± 9%; carotene 12 lg/100 ml, HPLC-MSn ± 18%, HPLC-UV/Vis ± 21% L y 10ml sữa bò được trộn lẫn với 0,5g axit ascorbic, 40ml ethanol và 10ml kiềm và nước (1:1) được khu y tan trong 30 phút Sau đó cho thêm 50ml nước, 10ml ethanol và 50ml dung dịch hexan (chứa ch t chống oxi hóa butylated hydroxy toluen 1,5mg/100ml) Khu y mạnh trong 2 phút, để lắng và chiết Sau đó cho thêm 20ml dung dịch hexan (chứa ch t chống oxi hóa BHT 1,5 mg/100ml) Sau khi chiết, rửa giải ba lần với 100ml nước,sau đó cho thêm hexan đến 100ml l y 10ml dung dịch hexan cho vào ống thủy tinh và làm khô dưới dòng khí nitơ ở nhiệt độ phòng Cặn thu được đem hòa tan trong 1ml methanol và được lọc bằng Teflon, cho mẫu vào ba vial đem đi phân tích trên máy HPLC-MSn, HPLC-UV/Vis và HPLC-Fl HPLC-MSn sử dụng cột C18 -

b-A Polaris, pha động methanol - nước với tốc độ dòng 0,2 ml/phút

Các phân tích được thực hiện với một hệ thống dung môi bậc bốn nước

2695 với một bộ tự động làm mát ở 40C và buồng cột làm nóng ở 300

C (Waters, Milford, MA, USA) trong cặp gắn kết của một đầu dò huỳnh quang Shimadzu RF-10Axl (a-tocopherol Ex 295 nm Em 330 nm) và một đầu dò

mảng photodiode Waters 996 (t t cả trans-retinol 320 nm) Phương pháp đo mẫu này sử dụng cột C18 Bondclone (Phenomenex, Syd-ney, Australia) được trang bị với một cột bảo vệ C18 Phân tích All trans-retinol and α-tocopherol

có pha động gồm nước: methanol (5:95), tốc độ dòng 1 ml/phút Phân tích β- Carotene sử dụng pha động có tỉ lệ (75:20:5) của acetonitrile: amoni acetat (50mM pha trong MeOH ) : diclometan (cho thêm 0,05% trietyl amin và 0,1% ch t chống oxi hóa BHT) với tốc độ dòng 2ml/phút

Tháng 9/ 2008 Vitamin A (retinol) được xác định bằng pp sắc k lỏng hiệu su t cao với UV-phát hiện sau khi xà phòng hóa và chiết tách bởi Dennis Eriksen [14] Phương pháp này đặc biệt hữu dụng đối với thuốc viên có chứa một lượng lớn các β - carotene và các sản phẩm có chứa một lượng nhỏ vitamin A Nồng độ tối thiểu của mẫu: khoảng 0,3mg vitamin A/g L y khoảng 0,3g mẫu cho vào bình nón, thêm 10ml natri ascorbate 2%, 30ml dung dịch chống oxi hóa BHT 0,1% và 3ml dung dịch KOH (17M) Cho bình vào siêu âm 30 phút Sau đó thêm 30ml natri sulphate 3% và 100ml ether đến lúc chiết tách 100ml ether Tiếp tục quá trình chiết Phương pháp này sử dụng máy HPLC Shimadzu cột C18, pha động là Heptan : 1-propanol (99:1) với tốc

độ dòng 2ml/phút, đo độ h p phụ ở các bước sóng 310, 325 và 334nm theo như SOP QAM - 10101 Thời gian chạy mẫu là 12 phút, phát hiện vitamin A

ở phút thứ 7

Gabriela Klaczkow và cộng sự 15 sử dụng phương pháp sắc k lỏng hiệu năng cao HPLC với detecter tại 265nm, để xác định đồng thời vitamin A,

E, D3 trong nhiều chế dược phẩm và cho kết quả chính xác

Phân tích định lượng đa vitamin trong chế dược phẩm vẫn còn một thách thức lớn cho các nhà hóa học phân tích Khó khăn chính là bản ch t có hoạt tính cao của vitamin và cô lập, định lượng của m i thành phần từ nhiều chế phẩm (1,2) số chế phẩm multivitamin chứa các vitamin tan trong ch t

béo: A, D3 và E với nhau.Phần lớn các công trình của HPLC đề xu t phương pháp nghiên cứu phân b cho các vitamin tan trong ch t b o với các ứng dụng việc xác định liên tiếp của vitamin độc lập Để chuẩn bị dược phẩm với sự khác biệt r t lớn về nồng độ vitamin cá nhân, vitamin D3 thường được xác định trên các cột silicate riêng biệt

Nhiều doanh nghiệp đã áp dụng gán đồng thời vitamin A, D3 và E dựa trên số liệu thu được với việc sử dụng các h n hợp mô hình, ví dụ như công ty Merck trong ứng dụng số 960.048 đề xu t xác định đồng thời các vitamin nói trên vào LiChroCART-RP-18 cột Nồng độ của những người ba vitamin là như nhau và bằng 0.2mg / ml Trong các chế dược phẩm bằng nhau và hơn nữa, số lượng r t lớn của vitamin A, D3 và E không hiện diện để cho ph p việc chuẩn bị chiết xu t với nồng độ cuối là 0,2 mg/ml

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

2.1 Hóa ch t, thi t ị và ụng cụ

2.1.1 Hóa ch t

Metanol ( loại dùng cho HPLC của Merk)

n-hexan (loại dùng cho HPLC)

+ Tetra hidro furan (THF)(loại dùng cho HPLC)

+ Methyl tert-butylethe (MTBE) (Tây Ban Nha)

Dietyl ete (PA của Trung Quốc )

Ch t chuẩn vitamin A, D2, D3 100mg của Supelco

+ Axetonitril (Merck)

+ Etanol 960( Trung Quốc)

+ Axit ascobic (Merk)

+ KOH, NaOH (82%)

Nước c t đề ion

T t cả các hóa ch t còn lại đều thuộc loại tinh khiết phân tích

2.1.2 Thi t ị và ụng cụ

Hệ thống HPLC Agilent 1100 Series với đầu dò UV

Cột dùng cho phân tích LiChrospher 100 RP-18(5μm) 250-4mm Agilent (cột C18), LiChrospher 100 RP-8(5μm) 250-4mm Agilent (cột C8)

Máy quang ph UV - Vis: Agilent 8453

Máy c t quay chân không: IKA®

RV10 digital + Máy siêu âm: Ultrasonic LC 60H

Máy nghiền thực phẩm

Máy Vortex IKA- made in USA

Cân phân tích độ chính xác 10-5

g