phân tích các chỉ tiêu sinh lí hóa
DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM
Thiết bị, dụng cụ cân đong
Thiết bị, dụng cụ để lấy một lượng chính xác Cần lưu ý đến độ chính xác của thiết bị trước khi sử dụng
Sử dụng cân điện tử:
- Cân ký điện tử (tối đa 2÷3 kg, độ chính xác 0,5g)
- Cân 2 số lẻ (tối đa 200 g, độ chính xác 0,01 g)
- Cân 4 số lẻ (tối đa 200 g, độ chính xác 0,0001 g)
Khi thực hiện các phép phân tích, độ chính xác là yếu tố quan trọng cần được chú ý Đối với việc cân mẫu với độ chính xác 95% và sai số 5%, cần sử dụng lượng mẫu lớn hơn 0,20 g Đối với các hóa chất phân tích chính xác hoặc dung dịch chuẩn, độ chính xác chấp nhận thường là 1%.
Sử dụng các thiết bị đong chính xác:
- Bình định mức 500 mL, 200 mL, 100 mL, 50 mL, 25 mL
- Pipet thủy tinh: loại 5, 10, 20 mL, độ chính xác 0,1 mL; loại 1mL và 2mL sử dụng đúng thể tích (chú ý loại pipet 1 vạch và 2 vạch)
- Micropipet: loại 0 - 5 mL, độ chớnh xỏc 0,1 mL; loại 0 - 1000 àL, độ chớnh xỏc 5 àL; loại 0 – 100 àL, độ chớnh xỏc 1 àL
Khi sử dụng thiết bị lấy mẫu, cần chú ý đến khoảng hoạt động để đảm bảo độ chính xác Pipet thích hợp cho việc lấy mẫu lớn hơn 1 mL, trong khi micropipet 0 – 1000 µL nên được sử dụng cho mẫu dưới 1 mL Đối với mẫu dưới 100 µL, cần sử dụng loại 0 – 100 µL, nhưng phải đảm bảo sai số mẫu lớn hơn 1 µL để có kết quả chính xác.
Dụng cụ chứa, đựng
Phân biệt theo loại nguyên liệu:
- Thủy tinh, sứ: sử dụng cho hầu hết loại hóa chất (erlen, becher, …)
- Inox: hạn chế acid, kiềm với nồng độ cao (thau, muỗng, ….)
- Kim loại nói chung: hạn chế acid, kiềm kể cả với nồng độ thấp và các chất oxy hóa mạnh
- Nhựa: hạn chế acid, kiềm và dung môi hữu cơ ăn mòn (ly, thau, rỗ, …)
Quản lý thiết bị, dụng cụ trước và sau khi làm việc
Trước khi làm việc, cần đảm bảo độ sạch của thiết bị, dụng cụ sử dụng:
- Chứa nguyên liệu: dụng cụ cần làm sạch bằng nước máy
- Chứa hóa chất: dụng cụ làm sạch bằng nước cất hoặc hóa chất cần chứa đựng
- Chứa vật rắn thì dụng cụ cần phải khô (sấy, phơi nắng)
Sau khi làm việc cần rửa thiết bị:
- Rửa bằng nước: vật chất chứa đựng có khả năng tan trong nước tốt Ví dụ: đường, các loại muối trung tính
- Rửa bằng xà bông: vật chất chứa đựng có khả năng tan trong nước kém Ví dụ: dầu ăn, mỡ, một số loại chất kết tủa
- Rửa bằng dung môi; rửa bằng hóa chất (nâng cao).
HÓA CHẤT THÍ NGHIỆM
Đơn vị và pha chế hóa chất
2.1.1 Đơn vị tỷ lệ hoặc phần trăm
Để pha chế chính xác, cần xác định đúng lượng chất trong hai phần vật chất sử dụng Việc chú ý đến đơn vị sử dụng là rất quan trọng trong quá trình này.
- w/v = weight/volume hay khối lượng trên thể tích Ví dụ: dung dịch muối 18% w/v được hiểu là dung dịch 180 g muối pha trong 1 lít nước Cân
180 g muối, đong 1 L nước và pha muối với nước để có dung dịch cần thiết
- w/w = weight/weight hay khối lượng trên khối lượng Ví dụ: dung dịch muối 18% w/v được hiểu là dung dịch 180 g muối pha trong 1 kg nước Cân
180 g muối, 1 kg nước và pha muối với nước để có dung dịch cần thiết
Tỷ lệ v/v (thể tích trên thể tích) là cách diễn đạt dung môi, ví dụ như trong trường hợp dung môi nước và cồn với tỷ lệ 1:1 v/v Điều này có nghĩa là trong hỗn hợp này có 1 L nước và 1 L cồn, nhưng tổng thể tích của dung môi sẽ nhỏ hơn 2 L do hiện tượng co rút khi trộn lẫn.
- g/L = gram trên một lít (pha khối lượng g đến 1 L)
- ppm: part per milion hay phần triệu, tương ứng 1 g trên 1 triệu g, hiểu rộng là 1 mg/1kg, 1mg/L nước hay 1mL/L
Để tính toán lượng naringin trong nguyên liệu, trước tiên cần xác định phần trăm chất khô có trong nguyên liệu Ví dụ, với 100g trà có độ ẩm 10%, lượng chất khô sẽ là 90g (100g - 10% độ ẩm) Từ đó, lượng naringin có trong 90g chất khô được tính là 90mg (100mg% x 90g).
- Đơn vị % thông thường, hiểu là % trên tổng khối lượng Ví dụ dung dịch muối 21% là dung dịch 21 g muối trên 89 g nước
2.1.2 Đơn vị nồng độ mol (M) và nồng độ đương lượng (N)
Thường gặp khi pha các hóa chất và chuẩn độ Đơn vị 1 M = 1 mol/L:
Để pha dung dịch CuSO4 0,1 M, cần sử dụng 0,1 mol CuSO4 cho 1L dung dịch Do đó, trong 100 mL dung dịch CuSO4 0,1 M sẽ chứa 0,01 mol CuSO4 Vì chỉ có CuSO4.5H2O sẵn có, nên cần dùng 0,01 mol CuSO4.5H2O, tương ứng với khối lượng 2,4969 g Sử dụng cân phân tích với độ chính xác 2 số lẻ để cân 2,50 g CuSO4.5H2O, sau đó hòa tan trong nước.
Quy tình pha chế hóa chất
100 mL, tráng dụng cụ và đổ nước tráng sang ống đong sau đó định mức lên vạch 100 mL, đậy nắp lắp đều, ta có dung dịch cần pha
- Công thức thường gặp khi pha cùng loại hóa chất: C1V1 = C2.V2 Đơn vị 1 N = 1 đương lượng/L:
- Nồng đương lượng được hiểu tương đương nồng độ mol với công thức n.CN = CM; và điểm khác nhau dung nhất là hằng số n hay hằng số đương lượng
Để xác định chính xác giá trị n, cần hiểu rõ bản chất của phản ứng Thông thường, n được tính dựa trên hóa trị, số lượng ion H+ và OH- trong các phản ứng trao đổi, hoặc sự chênh lệch điện tích trong các phản ứng oxy hóa.
NaOH có một nhóm OH, vì vậy n = 1, dẫn đến dung dịch NaOH 1N tương đương với dung dịch NaOH 1M BaSO4 là sản phẩm của phản ứng trao đổi, với Ba có hóa trị 2, nên n = 2 Đối với KMnO4, trong phản ứng oxy hóa khử, nếu sản phẩm là MnO2, mangan bị khử từ +7 xuống +4, chênh lệch số oxy hóa là 3, tức n = 3; ngược lại, nếu sản phẩm là K2MnO4, mangan bị khử từ +7 xuống +6, chênh lệch số oxy hóa là 1, tức n = 1 Do đó, dung dịch KMnO4 0,03N trong trường hợp (1) sẽ tương đương với dung dịch KMnO4 0,01M, còn trong trường hợp (2) là dung dịch KMnO4 0,03M.
- Công thức thường gặp khi hai chất phản ứng được xác định với nồng độ đương lượng: CN1V1 = CN2.V2 Ví dụ: 1 L NaOH 0,1 N phản ứng hết với
200 mL H2SO4 có nồng độ (1 x 0,1)/0,2 = 0,5 N
2.2 Quy trình pha chế hóa chất
Hóa chất cần được pha chế theo đúng thứ tự Thứ tự được thể hiện rõ trong cách tiến hành theo thứ tự trước sau
Để pha loãng H2SO4, trước tiên cần chuẩn bị một cốc chứa 5 mL nước Sau đó, dùng pipet hoặc dụng cụ đo thủy tinh để lấy chính xác 1 mL H2SO4 đậm đặc và từ từ cho vào cốc nước Tiếp theo, chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100 mL, tráng cốc và đổ nước tráng vào bình, sau đó định mức đến vạch Lưu ý không nên đổ 5 mL nước vào 1 mL H2SO4 đậm đặc.
2.2.2 An toàn pha chế Đối với các hóa chất độc cần đeo găng tay Đối với các hóa chất bay hơi cần đeo khẩu trang Hóa chất độc và bay hơi cần được pha chế trong tủ hút Chuẩn bị sẵn các chất trung hòa ngay cạnh khi pha chế hóa chất để phòng trường hợp rủi ro
Khi pha H2SO4 từ dung dịch đậm đặc, cần thực hiện trong tủ hút và đeo bao tay để đảm bảo an toàn Ngoài ra, nên chuẩn bị nước cất sẵn để pha loãng H2SO4 trong trường hợp bị đổ ra ngoài và nhanh chóng lau sạch bằng khăn.
Loại thải hóa chất
Hóa chất độc hại với môi trường hầu như không được sử dụng trong ngành, và nếu có, cần được chứa trong chai thủy tinh và chuyển đến nơi xử lý hóa chất an toàn Đối với hóa chất không độc, quy trình phân biệt và xử lý sẽ khác biệt.
- Tan trong nước và không có khả năng gây tủa
- Không trong nước và hoặc tan nhưng có khả năng gây tủa.
PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU VẬT LÝ
Xác định khối lượng
Khối lượng mẫu được xác định bằng cân phân tích
Chú ý đến khối lượng mẫu và độ chính xác
Chú ý đến độ sạch của nguyên liệu trước khi xác định khối lượng
Do phép đo đơn giản nên thường được lặp lại nhiều lần, ít nhất 15 lần
Xác định kích thước
Xác định được kích thước cơ bản:
- Hình khối chữ nhật cần 3 cạnh, hình khối vuông cần 1 cạnh, hình cầu cầu đường kính
- Hình trụ tròn cần đường kính và chiều cao
- Các vật dẹt như bánh phồng tôm, bánh tráng cần chiều dày
- Các vật gần tròn cần kích thước ba chiều: dài, rộng và cao
Do phép đo đơn giản nên thường được lặp lại nhiều lần, ít nhất 15 lần
Thước kẹp cơ mang lại độ chính xác cao hơn so với thước kẹp điện tử, với độ chính xác thường đạt 0,02 mm Điều này làm cho thước kẹp cơ trở thành lựa chọn phổ biến trong nhiều ứng dụng đo lường Ví dụ về cách đọc số có thể tham khảo trong Hình 3.1.
Thước kẹp cơ có độ chính xác 4 chữ số, được định dạng (a,abb) cm Nó có hai dãy số: dãy trên giúp đọc phần (a,a) cm và dãy dưới cho số phần (0,0bb) cm Để đọc hai số đầu, ta dựa vào dãy số trên và vạch số 0 của thước dưới Ví dụ, nếu vạch số 0 của thước dưới nằm giữa 0,7 và 0,8 cm, ta có (a,a = 0,7) Để đọc hai số đuôi, ta sử dụng dãy số ở dưới và tìm vạch trùng khớp với vạch trên Ví dụ, nếu vạch trùng đọc ở phần dưới là (0,0bb = 0,098) cm, kết quả tổng hợp sẽ là a,abb cm = 0,798 cm = 7,98 mm.
Xác định thể tích
3.3.1 Đo thể tích trực tiếp Đối với chất lỏng, đo bằng ống đong Đối với chất rắn có hình dạng chuẩn (hình cầu, hình hộp chữ nhật, …) xác định dựa trên kích thước cơ bản
3.3.2 Phương pháp thay thế thể tích (Choi and Okos, 2002)
Vật rắn có hình dạng không chuẩn có thể xác định thể tích bằng phương pháp thay thế, như đã nêu bởi Choi và Okos (2002) Để thực hiện, đặt vật cần xác định thể tích vào cốc thủy tinh 1000mL, sau đó đổ mè hoặc nước vào cốc cho đến khi đạt vạch quy định, đảm bảo không để lại khoảng trống Cuối cùng, lấy vật ra và đo thể tích của mè hoặc nước đã sử dụng (Vm).
Thể tích của vật = 1000mL - Vm
Xác định khối lượng riêng
3.4.1 Xác định trực tiếp Đối với chất lỏng:
- Xác định trực tiếp bằng phù kế
Để xác định khối lượng riêng của dung dịch, sử dụng bình định mức có ống mao dẫn để đo thể tích chính xác với sai số nhỏ Đầu tiên, rửa sạch và sấy khô bình định mức, sau đó cân để xác định khối lượng ban đầu Tiếp theo, cho dung dịch cần đo vào bình, đậy nắp và để dung dịch thừa chảy ra ngoài qua ống mao dẫn Sau khi lau sạch ống mao dẫn, cân lại bình để tính toán khối lượng dung dịch chính xác, từ đó xác định khối lượng riêng của dung dịch.
3.4.2 Khối lượng riêng biểu kiến (cho mẫu rắn có cấu trúc rỗng và rời rạc) (Dashpande et al , 1993) a) Nguyên tắc
Khối lượng riêng biểu kiến ρb được tính bằng tỷ lệ khối lượng mẫu so với tổng thể tích, bao gồm cả thể tích của hợp chất và phần rỗng bên trong nguyên liệu.
Dashpande và cộng sự (1993) đề xuất phương pháp xác định dựa trên tỷ lệ giữa khối lượng nguyên liệu (g) và thể tích chuẩn (mL) của dụng cụ đo Cần lưu ý rằng số liệu từ ba lần cân phải không có sự khác biệt đáng kể.
Sử dụng dụng cụ đo thể tích hình trụ chuẩn (V 0 mL, Ấn Độ)
Để xác định khối lượng mẫu, đầu tiên cần cân khối lượng của dụng cụ đo (Mo, g) Sau đó, đổ đầy mẫu vào dụng cụ đo, gạt bằng mặt và cân để xác định khối lượng tương ứng (M1, g) Khối lượng mẫu tương ứng với thể tích 100 mL sẽ được tính bằng công thức M = (M1 - Mo) g.
Khối lượng riêng biểu kiến của mẫu:
Chú ý, phép đo cần lặp lại nhiều lần để đảm bảo không có sự khác biệt đáng kể về khối lượng (ít nhất 15 lần)
3.4.3 Xác định khối lượng riêng thực theo thành phần nguyên liệu (Sahin and Sumnu, 2006)
Khối lượng riêng thực có thể được xác định thông qua phương pháp mô phỏng dựa trên thành phần hóa học của thực phẩm Việc này bao gồm việc xác định khối lượng riêng (KLR) của từng thành phần, đồng thời tính đến nguyên tắc bảo toàn khối lượng và thể tích.
Với: ρ i : Khối lượng riêng của thành phần thứ i (kg/m 3 )
X v i : tỷ lệ thể tích của thành phần thứ i
X w i : tỷ lệ khối lượng của thành phần thứ i n : số thành phần trong hỗn hợp
Trong phương pháp này, nhiệt độ là tham số chi phối sự thay đổi khối lượng riêng thực của thực phẩm
Khối lượng riêng từng thành phần được xác định theo phương trình mô phỏng của Choi and Okos (1986, trích dẫn bởi Sahin and Sumnu, 2006)
T T tro lipid protein CHO water
(Điều kiện nhiệt độ : -40C đến 150C)
Phương pháp đo màu (Morris et al., 1986)
Màu sắc được xác định bằng máy đo màu Huter Ultrascan Sphere Spectro Colorimeter, trong đó mẫu được xay nhuyễn và cho vào nắp trắng Mỗi lần đo, mẫu được kiểm tra ở 3 vị trí khác nhau, và các giá trị L*, a*, b* được đo theo phương pháp của Morris et al (1986) Kết quả màu sắc sẽ được thể hiện dựa trên các giá trị này.
Xác định màu của nguyên liệu dựa vào hệ thống màu L*, a*, b*:
- L*: biểu thị màu từ đen đến trắng
- a*: có giá trị từ -a đến +a biểu thị màu từ xanh lá cây đến màu đỏ
- b*: có giá trị từ -b đến +b biểu thị màu từ xanh da trời đến màu vàng
Hình 3.1: Biểu đồ màu (Lab chart)
Xử lý số liệu theo xác định độ chênh lệch màu ΔE:
Trong đó: L, a, b là giá trị L*, a*, b* của mẫu cần so sánh
L0, a0, b0 là giá trị L*, a*, b* của mẫu được so sánh (đối chứng)
Xử lý số liệu theo xác định độ trắng màu WI (whiteness index):
Xác định cấu trúc
Tùy thuộc vào mẫu và dạng cấu trúc muốn xác định mà xác định dạng mẫu theo hình thái hợp lý
- Đối với mẫu chả cá, mẫu được định dạng hình trụ 22x13 mm
- Đối với mẫu lạp xưởng, mẫu được định dạng hình trụ 22x10 mm
- Đối với mẫu fruitbar, mẫu dạng hình khối chữ nhật 20x20x10 mm
3.6.2 Đo độ bền gel (Seki et al., 1990 trích dẫn bởi Jiang et al., 2000)
Mẫu được đo cấu trúc với các thông số cụ thể: đầu đo hình cầu có đường kính 5 mm, tốc độ đầu đo 1 mm/s và quãng đường đo 10 mm Lực phá vỡ cùng quãng đường được ghi nhận tại đỉnh tác động đầu tiên Độ bền gel được định nghĩa là sản phẩm của lực phá vỡ (gf) và quãng đường đi được (mm), được tính bằng công thức: Độ bền gel (gf.mm) = Lực phá vỡ (gf) x Quãng đường đi được (mm).
Mẫu dược được điều chỉnh với đầu đo hình trụ có đường kính từ 2 đến 5 mm và tốc độ đo 1 mm/s Lực đàn hồi được xác định bằng cách tác động lực nén lên mẫu trong khoảng đường đi 4 mm Kết quả thu được là giá trị trung bình cộng của ba lần đo cho mỗi mẫu.
Các số liệu đo được tử máy đo cấu trúc Rheotex được xử lý theo công thức Young:
Trong đó: ΔE: độ đàn hồi (gf/mm 2 )
A: diện tích đầu đo (mm 2 )
L: đoạn đường đầu đo di chuyển xuyên qua mẫu (4 mm)
3.6.4 Phương pháp đo độ giòn Độ giòn: là (lực, khoảng cách) làm cho vật liệu vỡ khi biến dạng nhỏ
Máy đo lực phá vỡ được trang bị đầu đo hình trụ có đường kính nhỏ hơn hoặc bằng 2 mm và tốc độ đo 1 mm/s Giá trị lực (F) và quãng đường (D) được ghi nhận chính xác tại thời điểm mẫu bị phá vỡ, với kết quả là trung bình cộng của ba lần đo cho mỗi mẫu.
Ghi nhận kết quả là độ giòn tính theo công thức tính: Độ giòn = 1/Fd Với F: (lực) kết quả đo được (kg)
3.6.5 Lực cắt và lực phá vỡ
Máy đo cấu trúc Rheotex hoạt động với tốc độ di chuyển của đầu đo từ 1mm/s đến 60% chiều cao mẫu Thiết bị này sử dụng lưỡi dao để đo lực cắt và đầu bi để xác định lực phá vỡ, dựa trên lực tác động tại đỉnh đầu tiên của sản phẩm (Van Vliet, 1999).
3.7 Phương pháp xác định độ bền gel (gel tinh bột) a) Nguyên tắc
Tiến hành gelatin hóa bột bằng phương pháp thủy phân trong dung dịch kiềm loãng, sau đó làm lạnh và đo độ chảy dài của gel Đo chiều dài gel (mm) từ đáy ống đến bề mặt trên của gel và đánh giá theo thang điểm IRRI (1988).
+ Cõn chớnh xỏc 100 mg bột (kớch thước nhỏ hơn 150 àm) vào ống nghiệm cỡ 13x100 mm
Cho 0,2mL dung dịch ethanol 95% có chứa 0,03 thymol xanh vào ống nghiệm và lắc đều Dung dịch ethanol 95% giúp ngăn ngừa sự vón cục của bột ở nhiệt độ hóa hồ, trong khi thymol xanh tạo màu cho bột hồ, hỗ trợ việc đọc kết quả dễ dàng hơn.
+ Thêm tiếp 2 mL dung dịch KOH 0,2N và trộn đều trên máy lắc ống nghiệm
+ Làm nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút và sau đó làm lạnh trong nước đá 20 phút để quá trình tạo gel đạt tốt
+ Sau khi làm lạnh, đặt các ống nghiệm trên mặt phẳng nằm ngang có chia vạch 1 mm
Sau khi đọc độ dài gel trong 30 phút và 60 phút, kết quả được thu nhận bằng cách đo khoảng cách từ đáy ống nghiệm tới đầu nhọn của bề mặt gel Giá trị đo được là trung bình cộng của ba lần phân tích song song Dựa vào độ dài trung bình của gel, chúng ta có thể phân loại độ bền gel của bột theo bảng phân loại đã được xác định.
Bảng 3.1: Độ bền gel theo thang điểm IRRI (1988) Độ bền gel Chiều dài gel (mm) Độ bền gel mềm 61 -100 Độ bền gel trung bình 41 - 60 Độ bền gel cứng 26 - 40
PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN NGUYÊN LIỆU
Xác định ẩm bằng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi (phương pháp AOAC 950.46)
Dùng nhiệt làm bay hơi nước trong sản phẩm, cân khối lượng sản phẩm trước và sau khi sấy, từ đó tính ra % ẩm của sản phẩm
Sấy khô cốc sứ đến khi đạt khối lượng không đổi bằng cách cân cốc, cho vào 3÷5 g mẫu, và sấy ở nhiệt độ 100 - 105 °C trong 6 giờ Sau đó, để cốc vào bình hút ẩm cho nguội trước khi cân khối lượng Tiếp tục sấy và cân cho đến khi khối lượng ổn định Lưu ý rằng mỗi lần cân mẫu cần sử dụng bình hút ẩm để tránh mẫu bị hút ẩm trở lại.
Kết quả được tính theo công thức:
X: % ẩm có trong 100g thực phẩm
G: Khối lượng của cốc không mẫu (g)
G1: Khối lượng của cốc và mẫu trước khi sấy (g)
G2: Khối lượng của cốc và mẫu sau khi sấy (g)
Phương pháp xác định hàm lượng tro (phương pháp NMKL số 23-1991)
Phương pháp xác định phần trăm tro trong thực phẩm dựa vào khả năng tách các chất hữu cơ dễ cháy khỏi các chất vô cơ không cháy khi nung ở nhiệt độ cao Quá trình này bao gồm việc nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ ở nhiệt độ từ 550 đến 600 độ C Sau khi hoàn tất, phần còn lại được cân để tính toán phần trăm tro có trong thực phẩm.
Nung chén sứ đã rửa sạch ở nhiệt độ 550 - 600 °C đến khi trọng lượng không đổi, sau đó để nguội trong bình hút ẩm và cân chính xác đến 0,0001g Tiếp theo, cho khoảng 5g mẫu thử vào chén sứ và cân tất cả với độ chính xác tương tự Sau đó, đưa tất cả vào lò nung và nâng nhiệt độ từ từ đến 550 - 600 °C Nung cho đến khi đạt được tro trắng, tức là đã loại bỏ hoàn toàn các chất hữu cơ, thường mất khoảng 6 giờ.
Sau 7 giờ, nếu còn tro đen, cần lấy ra để nguội, sau đó thêm vài giọt H2O2 hoặc HNO3 đậm đặc và nung lại cho đến khi đạt được tro trắng Sau khi nguội, cho vào bình hút ẩm và cân với độ chính xác tương tự Tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 30 phút, rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân cho đến khi đạt được trọng lượng không đổi.
Hàm lượng tro theo % được tính theo công thức
G1: Khối lượng chén và mẫu trước khi nung (g)
G2: Khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g)
Định lượng protein tổng số bằng phương pháp Kjeldahl (phương pháp NMKL số 6-2003)
Nitơ trong cơ thể và mô được phân loại thành nitơ tổng số, bao gồm nitơ protein và nitơ phi protein Nitơ protein là thành phần của amino acid trong protein, trong khi nitơ phi protein không nằm trong cấu trúc protein và bao gồm các hợp chất như muối vô cơ, acid nitric, amino acid tự do, peptide, urea, dẫn xuất của urea, alkaloid, cùng với các base purine và pyrimidine.
Nitơ tổng số bao gồm hai thành phần chính: nitơ protein và nitơ phi protein Để tính đạm tổng số hay protein tổng số, ta nhân nitơ tổng số với hệ số chuyển đổi, phụ thuộc vào hàm lượng nitơ trong protein Thông thường, nitơ chiếm khoảng 16% trong protein, do đó hệ số chuyển đổi phổ biến được sử dụng là 6,25 (100/16).
4.3.2 Nguyên tắc a) Vô cơ hóa mẫu
Mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao với sự có mặt của chất xúc tác Quá trình vô cơ hóa diễn ra qua các phản ứng sau đây.
Oxy được hình thành thông qua quá trình oxy hóa các nguyên tố khác Khi các phân tử chứa nitơ phản ứng với H2SO4, chúng tạo ra NH3 Chẳng hạn, protein bị thủy phân thành acid amin, trong đó carbon và hydro của acid amin tạo ra CO2 và H2O, trong khi nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 NH3 này kết hợp với H2SO4 dư để tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.
Các nguyên tố P, K, Ca, Mg, chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO, MgO, b) Chưng cất đạm Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH
(NH4)2SO4 + 2 NaOH = Na2SO4 +H2O + 2NH3↑
NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng, bình hứng chứa H2SO4 0,1N
2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dư c) Chuẩn độ H 2 SO 4 dư
Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0,1N
H2SO4 dư + NaOH → Na2SO4 + H2O
Để tiến hành phân tích định lượng Nitơ bằng phương pháp Kjeldahl, cần chuẩn bị các dụng cụ như bình phá mẫu, bếp đun, bộ chưng cất Kjeldahl bao gồm bình cất đạm (bình Kjeldahl), ống dẫn khí, ống sinh hàn, bình hứng (becher 250 mL), bình thủy tinh, pipet 20 mL, pipet 10 mL và erlen 250 mL.
Hóa chất: H2SO4 đậm đặc, NaOH 40%, H2SO4 0,1N chuẩn, NaOH 0,1N chuẩn, chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3:1).d Tiến hành
Thuốc thử Tashiro: cân 200 mg metyl đỏ (3.3) và 100 mg metylen xanh, hòa tan trong 200 ml etanol 96 %
4.3.4 Cách tiến hành a) Vô cơ hóa mẫu
- Cân 100 mg mẫu đã sấy khô tuyệt đối cho vào bình tam giác, cho tiếp
Khi thêm 5 mL H2SO4 đậm đặc vào hỗn hợp, màu nâu đen sẽ xuất hiện do nguyên liệu bị oxy hóa Tiếp theo, cho thêm 200 mg chất xúc tác vào, lắc nhẹ và đậy kín trong khoảng 3 phút Sau đó, đặt bình tam giác lên bếp đun và dùng phễu thủy tinh để đậy miệng bình.
Trong giai đoạn này, cần thực hiện trong tủ Hotte để đảm bảo an toàn Đặt bình hơi nghiêng trên bếp để tránh hóa chất bắn ra ngoài khi sôi mạnh Sau khi hóa chất đã sôi, giữ nhiệt độ bếp ở mức vừa phải để ngăn chặn hóa chất trào ra và đảm bảo không bị bay mất ammoniac.
Trong quá trình đun, cần theo dõi sự thay đổi màu sắc của dung dịch trong bình Khi dung dịch gần như trong suốt, nhẹ nhàng lắc bình để đưa các phân tử chưa bị oxy hóa vào dung dịch Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch hoàn toàn trong suốt Sau đó, để nguội bình và chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 mL, sử dụng nước cất vô đạm để rửa lại bình và định mức đến vạch.
Chuyển 50 mL dung dịch từ bình định mức vào bình cất đạm đã có sẵn 50 mL nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro, lúc này dung dịch sẽ có màu tím hồng Tiếp theo, thêm vào bình 20 mL NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ; nếu chưa đạt màu xanh lá mạ, có thể thêm thêm 5 mL NaOH 40%.
Tiến hành lắp đặt hệ thống cất đạm và cho vào bình hứng 20 mL H2SO4 0,1N cùng với 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch màu tím hồng) Đảm bảo đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn và bật công tắc cất đạm Kiểm tra xem hơi thoát ra từ đầu ống sinh hàn có làm xanh giấy quỳ hay không; nếu không, cần thêm NaOH 40%.
Sau khi cất đạm trong 20-25 phút, kiểm tra sự tạo ra NH4OH bằng giấy quỳ tại đầu ống sinh hàn Nếu giấy quỳ không chuyển sang màu xanh, quá trình cất đạm đã thành công Sau đó, ngưng cất và chờ hệ thống nguội trước khi tháo rời và rửa sạch.
Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch chuyển từ màu tím hồng sang màu xanh lá mạ Ghi nhận thể tích NaOH 0,1N đã sử dụng trong quá trình chuẩn độ.
Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo công thức:
Trong đó: V1: số mL H2SO4 cho vào bình hứng
V2: số mL NaOH 0,1N đã chuẩn độ a: số miligam nguyên liệu
1,42: hệ số, cứ 1 mL H2SO4 dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42 mg nitơ
Protein tổng số = Nitơ tổng số x hệ số chuyển đổi (6,25).
Xác định hàm lượng chất béo tự do theo phương pháp Soxhllet (phương pháp
Sử dụng dung môi nóng để hòa tan hoàn toàn chất béo tự do có trong thực phẩm Sau khi loại bỏ hết dung môi, tiến hành cân lượng chất béo còn lại để tính toán hàm lượng lipid trong 100 g thực phẩm.
Cân khoảng 5g mẫu đã nghiền nhỏ và sấy khô đến khối lượng không đổi Đặt mẫu vào túi giấy lọc đã sấy khô và cân, sau đó dùng miếng bông hút ẩm thấm ether để lau sạch cốc, rồi cho miếng bông vào túi cùng với mẫu Cuối cùng, cho túi mẫu vào ống chiết Soxhlet.
Cho ether vào 2/3 bình cầu và cho nước lạnh chảy qua ống sinh hàn Đun sôi cách thủy trong khoảng 8 đến 12 giờ để chiết hết chất béo Trong thời gian này, dung môi cần tràn từ ống chiết về bình chứa từ 5 đến 6 lần, nhưng không quá 8 đến 10 lần Để kiểm tra xem dung môi đã hết hay chưa, lấy vài giọt dung môi từ ống nhỏ lên mặt kính đồng hồ; nếu không có vết loang trên bề mặt, quá trình chiết đã hoàn tất.
Khi ether chảy hết xuống bình, nhấc ống giấy ra khỏi ống chiết và cất lấy bớt ether lên ống chiết của máy cất
4.4.3 Tính kết quả a) Phương pháp trực tiếp
Rút bình để loại bỏ hoàn toàn ether ở nhiệt độ thường, sau đó cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 100°C đến 105°C trong 1 giờ 30 phút để đuổi hết ether Sau khi sấy, để bình nguội trong môi trường hút ẩm trong 30 phút rồi tiến hành cân.
Lượng lipid trong 100 g chất khô thực phẩm (%cbk) = [(P – P0) x 100]/m Trong đó: P: Khối lượng bình sau sấy (g)
P0: Khối bình ban dầu (trước khi trích béo) (g) m: Khối lượng mẫu (5 g hoặc xấp xỉ) b) Phương pháp gián tiếp
Lấy túi mẫu ra khỏi bình chiết, cho bay hơi hết dung môi, sấy khô đến trọng lượng không đổi và cân
Lượng lipid trong 100 g chất khô thực phẩm (%cbk) = [(G – G0) x 100]/G
Trong đó: G0: Khối lượng mẫu sau sấy (g)
G: Khối mẫu ban đầu (trước khi trích béo, 5 g hoặc xấp xỉ) c) Tính toán theo căn bản ước
Lượng lipid trong 100 g thực phẩm (%) = (% lipid_cbk)x((100-w)/100) Trong đó: w là độ ẩm mẫu (%)
Xác định hàm lượng carbonhydrate (FAO food and nutrition paper 77)
Tính toán gián tiếp thông qua hàm lượng nước, protein, lipid, cồn và tro Hàm lượng carbonhydrate (%) tổng được tính theo công thức:
% carbonhydrate = 100 – (%protein + %lipid + %nước + %tro + % cồn)
PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU HÓA LÝ
Xác định độ hoạt động của nước
Độ hoạt động của nước (aw) được xác định dựa trên phần trăm cân bằng ẩm (% RH) Để đo aw, mẫu sản phẩm được đặt trong bình kín, nơi một thiết bị cảm biến sẽ đo độ ẩm tương đối của không khí phía trên thực phẩm Ở nhiệt độ 25°C, sau một thời gian, độ ẩm tương đối sẽ đạt giá trị ổn định khi có sự cân bằng giữa không khí và thực phẩm Kết quả đo được thể hiện dưới dạng % RH, tương ứng với giá trị aw từ 0 đến 1.
Xác định khả năng giữ nước bằng cách đo lượng nước thoát ra
Cân khoảng 0,3÷0,4 g mẫu và đặt giữa giấy parafilm cùng giấy lọc đã xác định khả năng hấp thu nước Tiếp theo, mẫu được đặt giữa 2 tấm kính kích thước 200 x 200 x 7 mm và nén bằng quả cân 1 kg trong 10 phút Sử dụng bút chì để đánh dấu đường biên của mẫu và vết nước loang trên giấy lọc Cuối cùng, diện tích của mẫu và vết nước loang được xác định bằng thước planemeter, ghi nhận kết quả tính bằng cm².
Khả năng giữ nước của mẫu được xác định theo công thức:
WHC (%) = (Lượng nước tự do có trong mẫu – lượng nước bị tách ra khỏi mẫu)/ Lượng nước tự do có trong mẫu
Với lượng nước bị tách ra:
Trong công thức tính toán, b đại diện cho diện tích vết nước loang trên giấy lọc tính bằng cm², a là diện tích mẫu bị ép cũng tính bằng cm², và m là khối lượng mẫu tính bằng gram Đặc biệt, giá trị 0,0064 cho biết lượng nước có trong 1 cm² của giấy lọc tương đương với 0,0064 g nước.
Hình 5.1: Xác định khả năng giữ nước bằng planemeter
phân tích các chỉ tiêu vi sinh
Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí (TCVN 4884:2005)
6.1.1 Nguyên tắc Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng thích hợp từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở quan sát mỗi khuẩn lạc được hình thành từ
1 tế bào vi sinh vật duy nhất Đếm số khuẩn lạc sau 24 ÷ 48 giờ ủ 32 ÷ 37ºC
Chuẩn bị môi trường: Môi trường nuôi cấy là môi trường Plate Count Agar (PCA) Môi trường sau khi pha loãng (23,5 g môi trường định mức tới
1000 mL trong nước cất) được tiệt trùng 121ºC trong 30 phút rồi để nguội đến nhiệt độ khoảng 45ºC
Chuẩn bị mẫu và cách thức pha loãng: Chọn lấy 4 ÷ 8 điểm trên mẫu, cắt nhỏ và trộn đều Sử dụng ben, kéo riêng biệt cho từng mẫu
Cân 10 g mẫu và cho vào bình tam giác 250 mL đã được vô trùng Tiếp theo, bổ sung 90 mL nước cất để đạt được nồng độ pha loãng 1/10 (10^-1) Để đồng nhất mẫu, lắc đều trong 1 phút, và dung dịch thu được được gọi là dung dịch mẫu.
Để pha loãng mẫu, lấy 1 mL dung dịch mẫu có nồng độ 1/10 (10^-1) và cho vào ống nghiệm chứa 9 mL nước muối sinh lý đã được tiệt trùng ở 121ºC trong 15 phút Kết quả thu được là dung dịch pha loãng với nồng độ 1/100 (10^-2).
Để thực hiện quá trình pha loãng, lấy 1 mL dung dịch mẫu với nồng độ 1/100 (10^-2) cho vào ống nghiệm chứa 9 mL nước muối sinh lý đã được tiệt trùng ở 121ºC trong 15 phút, ta thu được dung dịch pha loãng với nồng độ 1/1000 (10^-3) Tiếp tục quy trình tương tự, ta sẽ pha dung dịch với nồng độ 1/100000 (10^-5) và dung dịch với nồng độ 1/1000000 (10^-6).
- Mỗi mẫu cấy từ 2 ÷ 3 độ pha loãng
- Mỗi độ pha loãng cấy 1 ÷ 3 đĩa
- Rót vào mỗi đĩa khoảng 7 ÷ 10 mL thạch dinh dưỡng, để nguội đến khoảng 40-50⁰C (cầm không thấy quá nóng)
- Dùng pipette vô trùng lấy 1 mL mẫu đã pha loãng cho vào giữa đĩa Petri
- Xoay đĩa theo hình số 8 hay theo chiều xuôi và ngược của chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 5 ÷ 8 lần
- Đĩa được đặt nằm ngang cho đông tự nhiên Môi trường sau khi đã đông lật úp đĩa để vào tủ ủ ở 37ºC
Sau 24 đến 48 giờ ủ, hãy đọc kết quả trên những đĩa có số khuẩn lạc từ 15 đến 300 theo tiêu chuẩn TCVN Khuẩn lạc của vi khuẩn hiếu khí thường có hình dạng tròn, lồi, màu trắng đục và đường kính lớn hơn 0,5 mm.
Khi khuẩn lạc phát triển nhiều và đồng đều trên thạch, bạn có thể chia đĩa thành 2, 4, 6 hoặc 8 phần bằng nhau để đếm và nhân kết quả Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1 gram mẫu được tính dựa trên 2 độ pha loãng liên tiếp theo công thức: d n.
Trong bài viết này, chúng ta sẽ xem xét công thức tính tổng số khuẩn lạc, trong đó C là tổng số khuẩn lạc được đếm ở hai độ pha loãng liên tiếp Các biến n1 và n2 lần lượt đại diện cho số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ nhất và thứ hai, trong khi d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng đầu tiên.
Kết quả tính được biểu thị theo công thức: a x 10 n (CFU/g) với a là số thập phân tương ứng từ 1,0 đến 9,9 và n là số mũ phù hợp cơ số 10.
MỘT SỐ CHỈ TIÊU NGUYÊN LIỆU ĐỘNG VẬT
Xác định hàm lượng muối (Phương pháp Mohr, TCVN 4330:1986)
Áp dụng phản ứng: NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3
Khi cho dung dịch chuẩn AgNO3 vào dung dịch trung tính chứa NaCl, phản ứng xảy ra dẫn đến sự kết hợp của NaCl với AgNO3 Sự xuất hiện của một giọt AgNO3 thừa sẽ phản ứng với K2CrO4, chất chỉ thị màu, tạo ra Ag2CrO4 có màu đỏ gạch.
2 AgNO3 + K2CrO4 Ag2CrO4 + NaNO3
Từ lượng AgNO3 ta có thể tính ra hàm lượng NaCl trong 100 g thực phẩm
7.1.2 Tiến hành a) Chuẩn bị mẫu
Mẫu lỏng: lấy N mL pha loãng, kết quả tính ra NaCl g/L
Mẫu rắn: cắt nhỏ hay xay nhỏ, lắc với nước nóng khoảng 1 đến 2 giờ, lọc và chuẩn độ, kết quả tính ra NaCl g/L
Thực phẩm khó chiết xuất: nung thành tro trắng, hòa tan trong nước cất và chuẩn độ
Trong trường hợp những dung dịch đục khử tạp chất bằng dung dịch chì axetate kiềm, lọc và chuẩn độ trên dịch lọc b) Định lượng
Sau khi đã chuẩn bị mẫu thử, cho vào bình định mức với nước cất gần đủ
100 mL Kiểm tra xem dung dịch có trung tính hay không, nếu không phải trung hòa, sau đó cho nước cất vào đủ 100 mL
Lấy 10 mL mẫu cho vào bình tam giác với 3 giọt K2CrO4 (10% trong nước trung tính) chuẩn độ từ từ dung dịch AgNO3 0,1 N cho đến khi xuất hiện màu đỏ gạch bền vững
Hàm lượng muối ăn NaCl theo %, tính bằng công thức:
V: Số mL AgNO3 0,1 N đã sử dụng để chuẩn độ mẫu thử
P: khối lượng mẫu thử, tính bằng gam
0,00585 g: Hệ số g NaCl tương đương với 1 mL AgNO3 0,1 N n: Tỷ lệ pha loãng (n)
Xác định hàm lượng đạm hòa tan theo phương pháp Biuret (AOAC Offical
Để pha thuốc thử biuret, hòa tan 1,5g đồng sulfate và 6g natri kali tartrate trong 500 mL nước cất, sau đó thêm 300 mL dung dịch NaOH 10% Tiếp tục bổ sung nước cất cho đến khi đạt 1 L thuốc thử, và bảo quản trong chai nhựa PE Cần loại bỏ thuốc thử khi thấy xuất hiện màu đen hoặc màu đỏ (theo phương pháp AOAC Official Method 960.04).
7.2.2 Phân tích nồng độ protein
Lấy mẫu và phân tích hàm lượng protein bằng máy quang phổ hấp thu ở độ dài sóng 546 nm với dung dịch biuret Đối với dịch sữa đậm đặc, cần pha loãng 50 lần trước khi tiến hành phản ứng với dung dịch thuốc thử biuret.
Lấy 4 mL mẫu pha loãng và thêm 16 mL dung dịch biuret trộn đều Sau
Trong quá trình đo độ hấp thu, mẫu dung dịch cần được pha loãng để đảm bảo chỉ số hấp thu nằm trong khoảng từ 0 đến 0.8, với hàm lượng protein từ 0 đến 9 mg/ml Để thực hiện thí nghiệm, mẫu đối chứng được chuẩn bị bằng cách sử dụng 4 mL nước cất kết hợp với 16 mL dung dịch khác.
Trong nghiên cứu nồng độ protein hòa tan, chúng tôi đã đo 9 nồng độ dịch protein từ nguyên liệu đậu nành, dao động từ 0 đến 9 mg/ml, bằng hai phương pháp Kjeldahl và đo độ hấp thu ánh sáng (A) qua máy quang phổ tại bước sóng 546nm Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua đường hồi quy của 9 điểm (đã loại trừ mẫu đối chứng), từ đó tính toán độ dốc (s) của đường hồi quy thẳng.
Hình 7.1: Phương trình đường chuẩn Biuret
Hàm lượng đạm hòa tan (mg/mL) = Độ lệch quang/0,2826
(Lưu ý: kết quả đo chỉ chính xác trong phạm vi đường chuẩn, trong các trường hợp cần xác định hàm lượng protein với phương pháp khác).
Xác định chỉ số peroxide (TCVN 6127:2010)
Chỉ số peroxide là số gam iod được giải phóng ra bởi peroxide có trong
Khi 100 g mẫu chất béo tiếp xúc với không khí, các acid béo, đặc biệt là acid béo không no, dễ dàng bị oxy hóa một phần, dẫn đến sự hình thành các peroxide và hiện tượng mỡ ôi Chỉ số peroxide được xác định dựa trên các phản ứng hóa học liên quan.
Lượng iod giải phóng ra được chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3:
Acid acetic (CH3COOH) đậm đặc, cloroform (CHCl3), dung dịch KI bão hòa (14 g KI/10 mL nước cất), dung dịch Na2S2O3 0,01 N, dung dịch hồ tinh bột 1%
Lấy hai bình tam giác 250 mL Cho vào bình 1 (bình chứa mẫu thí nghiệm) 10 g mẫu đã được nghiền nhỏ, bình 2 (bình kiểm tra) 10 mL nước cất
Cho thêm vào mỗi bình 30 mL hỗn hợp dung dịch acid acetic-cloroform
Trộn 2 mL dung dịch KI với 1 mL dung dịch khác, sau đó đậy nắp và lắc đều trong 1 phút Tiếp theo, thêm 30 mL nước cất vào mỗi bình và tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3.
Chuẩn bị dung dịch 0,01 N và thêm vào cho đến khi dung dịch không còn màu vàng Tiếp theo, cho 5 mL chỉ thị hồ tinh bột vào mỗi bình và tiến hành chuẩn độ iod bằng dung dịch Na2S2O3 0,01 N cho đến khi dung dịch chuyển sang màu trong.
Chỉ số peroxide được tính theo công thức:
V: số mL Na2S2O3 0,01 N dùng chuẩn độ bình chứa mẫu thí nghiệm B: số mL Na2S2O3 0,01 N dùng chuẩn độ bình kiểm tra
N: nồng độ đương lượng của dung dịch chuẩn độ
W: khối lượng mẫu, tính bằng gam (g)
Xác định hàm lượng nitơ anomiac (TCVN 3706 – 90)
Sử dụng kiềm nhẹ để tách amoniac khỏi mẫu thử, sau đó chưng cất vào dung dịch axit sunfuric Hàm lượng amoniac được tính dựa trên lượng axit dư khi chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyt 0,1N.
Dụng cụ: máy cất đạm; bình định mức, dung tích 250, 1000 ml; bình nón, dung tích 250ml; cốc thủy tinh, dung tích 100ml; buret 25ml; pipet 10,
20, 50ml; giấy lọc; giấy đo pH;
Hóa chất: axit sunfuric (H2SO4), dung dịch 0,1N; natri hydroxyt (NaOH), dung dịch 0,1N; magie oxyt (MgO), dung dịch 5% (có dạng đục như sữa)
Chất chỉ thị hỗn hợp (thuốc thử Tashiro): 200 mg đỏ metyl và 100mg xanh metyl hòa tan trong 200ml etanol (C2H5OH) 96%; phenolphtalein, dung dịch 1% trong etanol 60%
Cân từ 10 đến 15 gram mẫu thử vào cốc thủy tinh 100ml, sau đó hòa tan mẫu bằng nước cất và chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 250ml Tiếp theo, thêm nước cất đến khoảng 200ml, lắc đều trong 1 phút, để yên 5 phút và lặp lại quá trình này 3 lần Cuối cùng, thêm nước cất đến vạch mức, lắc đều và tiến hành lọc.
Để tiến hành thí nghiệm, lấy chính xác 200ml dung dịch axit sunfuric 0,1N cho vào bình nón 250ml và thêm 5 giọt chỉ thị hỗn hợp Sau đó, đặt bình vào đầu dưới ống sinh hàn của máy cất đạm, đảm bảo đầu ống sinh hàn ngập hoàn toàn trong dung dịch.
Sử dụng pipet để lấy chính xác 50ml dịch lọc mẫu thử và cho vào bình cất của máy cất đạm Tiếp theo, thêm 20ml nước cất, 5 giọt phenolphthalein 1%, và cho dung dịch magie oxyt 5% vào cho đến khi dung dịch trong bình chuyển sang màu hồng Rửa sạch phễu bằng nước cất để loại bỏ dung dịch magie oxyt, sau đó khóa máy lại để tránh mất amoniac, giữ lại một ít nước cất trong phễu Cuối cùng, đảm bảo có một lớp nước cất cao 1,5 - 2 cm trên phễu để kiểm tra độ kín của máy, đồng thời ghi lại toàn bộ lượng nước cất đã thêm vào bình cất để xác định lượng nước cất cần thiết khi chuẩn độ mẫu trắng.
Cho nước lạnh chảy qua ống sinh hàn và duy trì trong 30 phút kể từ khi dung dịch bắt đầu sôi Hạ bình hứng để ống sinh hàn lên khỏi mặt nước, sau đó thu thập nước ngưng từ đầu ống sinh hàn Kiểm tra nước ngưng bằng giấy pH; nếu không có phản ứng kiềm thì quá trình đã thành công.
Dùng natri hydroxyt 0,1N chuẩn độ lượng axit dư trong bình hứng cho tới khi dung dịch chuyển từ màu tím sang xanh lá mạ
Tiến hành xác định mẫu trắng với các lượng hóa chất, nước cất với các bước thí nghiệm như trên, không có mẫu thử
Hàm lượng nitơ amoniac (N-NH3) tính bằng phần trăm, theo công thức:
V1 – Thể tích dung dịch natri hydroxyt 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu trắng, tính bằng ml;
V2 – Thể tích dung dịch natri hydroxyt 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ mẫu thử, tính bằng ml; m – Khối lượng mẫu thử, tính bằng g;
250 - Thể tích dịch pha loãng mẫu thử, tính bằng ml;
50 – Thể tích dịch lọc đã pha loãng lấy xác định, tính bằng ml;
100 – Hệ số tính ra phần trăm Đối với nước mắm hoặc một số mẫu lỏng, mẫu thử được pha loãng 20 lần, lấy 50ml dịch pha loãng xác định
Hàm lượng nitơ amoniac (X9) tính bằng phần trăm theo công thức:
20 – Độ pha loãng của nước mắm;
Các ký hiệu khác như đã ghi ở trên.
MỘT SỐ CHỈ TIÊU NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT
Phương pháp xác định hàm lượng đường (Phạm Văn Sổ và Bùi Thị Như Thuận, 1991)
Dựa vào phản ứng của đường nghịch đảo khử đồng trong dung dịch
Fehling thành oxit đồng 1 (Cu2O) có màu đỏ gạch
Hóa chất: NaOH 30%, 10%, 0,1N; Pb(CH3COO)2 30%; Na2SO4 bão hòa
30%; xanh metylen 1% trong nước; fehling A (CuSO4 tinh thể 69,28 g, nước cất đến 1000 mL dung dịch); fehling B (kalinatritartrate 346 g, NaOH
100 g và nước cất đến 000 mL); phenolphtalein 1% trong cồn
+ Cân 5 g mẫu cần phân tích
Trung hòa với NaOH với nồng độ giảm dần từ 30%, 10%, 1 N (dùng phenolphtalein làm chất chỉ thị màu) Sau đó cho dung dịch này vào bình định mức 100ml
Khử tạp chất bằng cách sử dụng 7 mL Pb(CH3COO)2 và để yên trong 5 phút Khi xuất hiện một lớp chất lỏng trong suốt trên lớp cặn, quá trình khử tạp chất đã hoàn tất.
Để loại bỏ Pb(CH3COO)2, thêm 18-20 mL Na2SO4 hoặc Na2HPO4 vào dung dịch, lắc đều và để kết tủa lắng xuống Nếu có kết tủa từ Na2HPO4 với chì acetate thừa, để yên trong 10 phút; với Natri sunphat, nếu lớp nước bên trên bị đục, cần để lâu đến 24 giờ Kiểm tra sự có mặt của chì acetate thừa bằng cách nhỏ cẩn thận vài giọt dinatri phosphat hoặc Natri sunphat; nếu không thấy đục, coi như đã loại bỏ hoàn toàn chì acetate Cuối cùng, thêm nước cất vào dung dịch để đạt thể tích 100 mL.
Lọc, pha loãng khi sử dụng Tuỳ hàm luợng đường trong thực phẩm mà ta có HSPL khác nhau.Ví dụ: hàm lượng đường 60% cân 1 gam pha loãng 2÷3 lần
Cho 5 mL Fehling A và 5 mL Fehling B vào becher, sau đó thêm 15 mL dịch lọc Đun nóng trên bếp và tiến hành chuẩn độ bằng cách nhỏ từng giọt 1 mL dung dịch đường cho đến khi màu đỏ gạch xuất hiện mà không còn ánh xanh Để kiểm tra lại, nhỏ một giọt xanh metylen vào dung dịch đang sôi; nếu màu xanh biến mất và trở lại màu đỏ gạch, ghi lại kết quả và tra bảng tính để xác định hàm lượng đường.
Bảng 8.1: Bảng tra hàm lượng đường nghịch chuyển mL dung dịch đường đã sử dụng
Lượng đường nghịch chuyển mg/100 mL mL dung dịch đường đã sử dụng
Lượng đường nghịch chuyển mg/100 mL mL dung dịch đường đã sử dụng
Lượng đường nghịch chuyển mg/100 mL mL dung dịch đường đã sử dụng
Lượng đường nghịch chuyển mg/100 mL
Phương pháp xác định độ acid toàn phần (Phạm Văn Số và Bùi Thị Như Thuận, 1991)
Dùng dung dịch kiềm chuẩn NaOH hoặc KOH để trung hòa hết lượng acid có trong thực phẩm
Để tiến hành mẫu rắn, cân chính xác 10 g thực phẩm và nghiền nhỏ Sau đó, lắc với nước trung tính trong vòng 1 giờ Tiếp theo, thêm đủ 50 ml nước trung tính, lọc lấy dịch trong và sử dụng 25 ml nước trong để định lượng.
Hàm lượng đường = Số tra bảng*HSPL*100
Mẫu lỏng cần được lấy V mL và thực hiện định lượng thẳng Đối với thực phẩm có màu sẫm, nên pha loãng bằng nước trung tính hoặc cồn trung tính để dễ dàng xác định điểm chuyển màu.
Cho mẫu thử vào bình nón tam giác 25 mL dịch thử + 5 giọt dung dịch phenolphtalein
Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1 N từ buret xuống cho đến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền vững
8.2.4 Tính kết quả Độ acid toàn phần tính theo phần trăm được tính bằng công thức:
X = K*n*(50/25)*(100/P) Trong đó: n: Số mL NaOH sử dụng để chuẩn độ 25 mL dung dịch thử
P: Khối lượng mẫu thử, tính bằng gam K: Hệ số loại acid
Hệ số acid được sử dụng đối với acid cirtric: K = 0,0064
Với sữa và các thực phẩm lên men lactic, K = 0,009
Phương pháp phân tích hàm lượng vitamin C (phương pháp Muri)
Vitamin C có hai dạng đồng phân quang học là D và L, trong đó dạng D không có hoạt tính sinh học Việc định lượng vitamin C được thực hiện dựa trên tính khử của nó đối với thuốc thử 2,6 diclophenol – indophenol Khi acid ascorbic trong dung dịch chiết từ nguyên liệu phản ứng với dạng oxy hóa của thuốc thử này, màu xanh sẽ bị khử thành dung dịch không màu Tại điểm cân bằng, khi tất cả acid ascorbic đã phản ứng, thuốc thử dư sẽ có màu hồng trong dung dịch.
Cân 5 gam mẫu có chứa acid ascorbic đã được thái nhỏ, chuyển sang cối sứ với 20 mL HCl 1%, chắt lấy dịch ngâm giữ lại trong cốc, đem phần thịt nghiền mịn, xong chuyển sang bình định mức 100 mL cùng với dung dịch HCl 1% vừa mới chiết ra Rửa cối và tráng dụng cụ nhiều lần (3 lần), mỗi lần một ít acid oxalic 1% và cũng dồn vào bình định mức Dùng acid oxalic 1% để đưa thể tích lên vạch 100mL Lắc kỹ, để yên 10 phút rồi lọc qua giấy lọc khô
Để tiến hành thí nghiệm mẫu đối chứng, chuẩn bị 8 mL acid oxalic 1% và 2 mL HCl 1% cho vào bình tam giác 100 ml Sử dụng microburet với dung dịch 2,6 diclophenol – indophenol 0,001N để thực hiện quá trình chuẩn độ cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây.
Chuẩn độ mẫu thật: Dùng pipet hút 10 mL dịch lọc chứa vitamin C, cho vào bình tam giác dung tích 100 mL, tiến hành chuẩn độ như mẫu đối chứng
Trong đó: a là số mL trung bình khi chuẩn mẫu thật b là số mL trung bình khi chuẩn mẫu đối chứng
0,088 là số mg acid ascorbic tương đương với 1mL dung dịch chuẩn 2,6 diclophenol – indophenol 0,001N
V là thể tích dịch chiết ban đầu v là thể tích dung dịch chiết lấy để định chuẩn m: khối lượng mẫu vật cân lúc đầu (g)
PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC
Định tính một số thành phần có hoạt tính sinh học
9.1.1 Định tính tannin a) Thuốc thử
- Chuẩn bị 100 mL dung dịch FeCl3 5% (w/v): Hòa tan 5 g FeCl3 vào nước, cho vào bình định mức 100 mL, bổ sung nước đến vạch định mức
Để chuẩn bị 100 mL dung dịch gelatin mặn 1% trong dung dịch NaCl 10% (w/v), bạn cần cân 10 g NaCl và hòa tan vào nước Sau đó, từ từ bổ sung 1 g gelatin vào dung dịch, khuấy đều cho đến khi gelatin tan hoàn toàn Cuối cùng, chuyển dung dịch vào bình định mức 100 mL và thêm nước đến vạch.
Để chuẩn bị 100 mL dung dịch chì acetate 10% (w/v), hòa tan 11,52 g Pb(CH3COO)2.3H2O trong nước, sau đó cho vào bình định mức 100 mL và bổ sung nước đến vạch định mức.
Mẫu dịch chiết được chia thành 3 phần, mỗi phần 4 mL để kiểm tra bằng
Để kiểm tra sự hiện diện của tannin, hòa tan 3 giọt dung dịch FeCl3 5% vào khoảng 4 mL dịch chiết Nếu màu sắc sản phẩm chuyển từ xanh đen sang xanh olive, điều này chứng tỏ có sự tồn tại của tannin.
- Kiểm tra bằng gelatin mặn: lấy 4 mL dịch chiết (phần thứ 2), cho vào
15 giọt gelatin mặn, nếu có xuất hiện kết tủa bông trắng thì chứng minh có sự tồn tại của tannin
Để kiểm tra sự hiện diện của tannin, hòa tan 4 giọt chì acetate 10% vào 4 mL dung dịch Nếu xuất hiện kết tủa màu, điều này chứng minh có sự tồn tại của tannin.
Sự hiện diện của tannin có hàm lượng cao khi cả 3 phương pháp xác định đều cho kết quả dương tính
9.1.2 Định tính flavonoid a) Thuốc thử
Để chuẩn bị 100 mL dung dịch NaOH 10% (w/v), hòa tan 10 g NaOH rắn vào nước cho đến khi tan hoàn toàn Sau đó, cho dung dịch vào bình định mức 100 mL và thêm nước cất cho đến vạch định mức.
Chuẩn bị 100 mL dung dịch FeCl3 1% (w/v): Hòa tan 1 g FeCl3 vào nước, cho vào bình định mức 100 mL, bổ sung nước đến vạch định mức b) Cách thực hiện
Mẫu dịch chiết được chia thành 2 phần, kiểm tra bằng 2 phương pháp
Để kiểm tra sự hiện diện của flavonoid, cho 3 mL dịch chiết vào ống nghiệm và thêm 2 mL dung dịch NaOH 10% Nếu xuất hiện màu vàng và khi thêm HCl 10% thì màu trở thành không màu, điều này chứng tỏ mẫu dịch chiết có chứa flavonoid.
Kiểm tra bằng FeCl3 1%: 3 mL dung dịch nhỏ thêm 3 giọt FeCl3 1% vào nếu xuất hiện màu xanh đen chứng tỏ sự có mặt của flavonoid
9.1.3 Định tính anthraquinone a) Thuốc thử
Amoni 10% (đã được nhà sản xuất chuẩn bị sẵn ở nồng độ tương ứng) b) Cách thực hiện
Lấy 2 mL mẫu cho vào ống nghiệm với 5 mL chloroform; lắc mạnh trong 5 phút Hỗn hợp này sẽ được lọc sau đó thêm vào dung dịch amoni (NH4OH) 10% có khối lượng bằng khối lượng dịch lọc, nếu có một màu đỏ hoặc tím hồng trong lớp nước cho thấy sự hiện diện của anthraquinone tự do
9.1.4 Định tính alkaloid a) Thuốc thử
- Dragendorff: Bi(NO3)3 trung hoà (20g), HNO3 đđ (30g), KI (68g), H2O
- Bouchardat: I2 (2,5g), KI (5g), H2O (100 mL) b) Cách thực hiện
Cho 1 mL dịch mẫu vào ống nghiệm, nghiêng ống và nhỏ từ từ từng giọt thuốc thử cho đến khi đạt 1 mL Sau đó, lắc đều và để yên để quan sát kết quả.
+ Thuốc thử Dragendorff: cho kết tủa vàng cam đến đỏ là dương tính, có sự hiện diện của alkaloid
+ Thuốc thử Bouchardat: cho kết tủa màu nâu hoặc vàng đậm là dương tính
Để kiểm tra sự hiện diện của saponin, lấy 2 mL mẫu và cho vào ống nghiệm chứa khoảng 10 mL nước cất Lắc mạnh trong 30 giây, sau đó để yên trong 30 phút và quan sát Nếu xuất hiện bọt, điều này chứng tỏ có sự hiện diện của saponin.
Để kiểm tra sự hiện diện của saponin, hãy cho 3 giọt máu động vật vào dịch chiết bằng ống tiêm Sau đó, nhẹ nhàng đảo ngược ống mà không lắc và để yên trong 15 phút Sự lắng xuống của các tế bào máu đỏ sẽ cho thấy có mặt của saponin.
Xác định hàm lượng polyphenol tổng (TPC)
Dựa trên nguyên tắc phản ứng oxy hóa khử, acid gallic được sử dụng làm chất chuẩn, trong khi thuốc thử Folin-Ciocalteu đóng vai trò là chất oxy hóa, làm giảm hàm lượng polyphenol do oxy hóa nhóm hydroxy phenolic, tạo ra màu xanh lam với độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 738 nm do sự hình thành các ion superoxide Hàm lượng polyphenol tổng (TPC) được xác định thông qua phương pháp so màu.
(1) Chuẩn bị thuốc thử, hóa chất
Để pha dung dịch 100 mL Folin-Ciaucalteu 10%, hòa tan 10 g Folin-Ciaucalteu vào khoảng 70 mL nước cất cho đến khi tan hoàn toàn Sau đó, chuyển dung dịch vào bình định mức 100 mL và thêm nước cất đến vạch định mức Lưu trữ dung dịch ở nhiệt độ 4°C và sử dụng trong ngày.
- Pha 500 mL Na2CO3 20%: Hòa tan 100g Na2CO3 vào 400 mL nước, khuấy đều đến khi tan hoàn toàn Bảo quản ở nhiệt độ phòng (đến 1 tháng)
- Pha 100 mL dung dịch acid gallic 100 ppm: Cân (0,110 ± 0,001) g acid gallic ngậm một phân tử nước (M = 188,14) cho vào bình định mức một vạch
100 mL Hòa tan trong nước, pha loãng đến vạch và trộn Sử dụng trong ngày
(2) Chuẩn bị đường chuẩn acid gallic theo Bảng PL 1.1
Từ giá trị mật độ quang đo được, vẽ đồ thị biểu diễn sự thay đổi mật độ quang A (Hàm y) theo nồng độ acid gallic (hàm x) có dạng y = ax + b
(3) Xác định hàm lượng polyphenol tổng trong dịch chiết khảo sát: Cho 0,1 mL dịch chiết phản ứng với 1,5 mL FC 10%, để yên 5 phút và thêm 4 mL
Na2CO3 20% được pha loãng đến 10 mL bằng nước cất Hỗn hợp cần được giữ trong bóng tối trong 30 phút trước khi đo độ hấp thu tại bước sóng 738 nm, và ghi lại giá trị Amẫu.
- Thay giá trị Amẫu vừa đo được vào giá trị y trong phương trình đường chuẩn y = ax + b, suy ra x = Cx (ppm)
- Tính hàm lượng polyphenol tổng số có trong 100 g bột vỏ chuối xiêm ban đầu theo công thức
Cx : nồng độ TPC trong mẫu đo, xác định từ đường chuẩn (ppm)
Vđo: thể tích ống đo (10 mL)
Vđm: thể tích dịch chiết polyphenol thu được (Vđm, mL)
Vhút: thể tích dịch định mức hút vào ống nghiệm (0,1 mL) m: khối lượng bột vỏ chuối xiêm sử dụng để trích ly (g)
Bảng 9.1: Phương pháp dựng đường chuẩn acid gallic
FC (mL) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 Lắc đều, để yên 5 phút
Na 2 CO 3 (mL) 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 Nước cất (mL) 4,5 4,4 4,3 4,2 4,1 4 3,9 3,8 3,7 3,6 3,5
Lắc đều và ủ ở điều kiện bóng tối, nhiệt độ phòng trong 30 phút Đo quang ở bước sóng 738 nm
Hình 9.1: Đồ thị tương quan của nồng độ acid gallic và độ hấp thu
9.2.3 Tính toán kết quả Đối với mẫu cao chiết, hàm lượng polyohenol được tính như sau:
Vcao: Thể tích cao chiết sử dụng để pha loãng, tạo dung dịch đo (mL)
Vđm2: Thể tích dịch chiết được pha loãng từ thể tích Vcao (mL)
Trường hợp tính hàm lượng polyphenol tổng trong cao chiết theo khối lượng:
C Khi đó mcao: Khối lượng cao chiết sử dụng để pha loãng, tạo dung dịch đo (g)
Xác định hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất sinh học
Phương pháp xác định gốc tự do TEAC sử dụng chất chuẩn DPPH (2,2 –Diphenyl–1–picrylhydrazyl) và Trolox Gốc tự do tại vị trí nguyên tử nitơ trong DPPH phản ứng với hợp chất có khả năng cho nguyên tử hydro, làm giảm màu tím của dung dịch DPPH sang màu vàng nhạt Hàm lượng DPPH còn lại sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu ở bước sóng 517 nm.
4 mL DPPH 0,1 mM phản ứng với 0,1 mL dịch chiết, hỗn hợp được định mức đến 5 mL bằng cồn, để yên khoảng 30 phút và đo độ hấp thu ở bước sóng
517 nm Hiệu chỉnh và xây dựng đường chuẩn bằng Trolox và TEAC được tớnh theo àmol Trolox/g chất khụ (CK) (Chmelovỏ et al., 2015)
Trong đó: Cx : nồng độ TPC trong ống (ppm)
Vđo: thể tích ống đo (mL)
Vđm: thể tích định mức (mL)
Vhút: thể tích dịch định mức hút vào ống nghiệm (mL)
M = 250,29: phân tử lượng của Trolox m: khối lượng mẫu ban đầu (g)
Bảng PL1.2 Phương pháp dựng đường chuẩn theo Trolox
Lắc đều và ủ ở điều kiện bóng tối, nhiệt độ phòng trong 30 phút Đo quang ở bước sóng 517 nm
Hình PL1.2 Đồ thị đường chuẩn của AC theo Trolox
Phân tích flavonoid tổng qua phản ứng với aluminium chloride (Madal et al.,2013)
Phương pháp xác định dựa trên việc đo độ hấp thu ánh sáng của dung dịch phức giữa chất cần xác định và thuốc thử, trong môi trường thích hợp Đối với flavonoid, khi tạo phức với aluminum chloride (AlCl3), chúng sẽ tạo màu vàng và được đo độ hấp thu ở bước sóng 415 nm.
Hút 1 mL dịch trích vào ống nghiệm, cho thêm 3 mL methanol, 0,2mL aluminum chloride (10%), 0,2 mL sodium acetate 1M và 5,8 mL nước cất Giữ ở nhiệt độ phòng 30 phút và đo độ hấp thu của hỗn hợp phản ứng ở 415 nm Hàm lượng flavonoid được thể hiện qua trên miligram đương lượng QE trên mỗi gram chất khô phân tích
Hàm lượng flavonoid tổng (TFC) được tính toán dựa vào đường cong chuẩn của quercetin pha loãng trong ethanon, với phương trình y = 0,0054x + 0,0026 và hệ số xác định R² = 0,9995 Kết quả được biểu thị dưới dạng miligam quercetin tương đương trên mỗi gram chất khô (DM).
TFC: hàm lượng flavonoid tổng (mg QE/g CKNL)
A: độ hấp thu của các mẫu thử nghiệm
DF: yếu tố pha loãng (DF = 10)
V: thể tích dịch trích thu được (L) m: khối lượng mẫu trích ly (g)
W: phần trăm ẩm của mẫu vật liệu (%)
Phương pháp xác định hàm lượng naringin (Davis, 1947)
Dựa vào mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch theo định luật Lambert – Beer
: hệ số hấp thu phân tử
C: Nồng độ dung dịch (mol/l)
L: Chiều dài đường chuyền ánh sáng (cm)
Phương trình này chỉ đúng với tia sáng đơn sắc
Trong phân tích định lượng bằng phương pháp trắc quang, cần chọn một bước sóng cụ thể và chiều dài cuvet cố định để thiết lập mối quan hệ giữa độ hấp thụ quang A và nồng độ C.
Phương pháp phân tích hàm lượng naringin dựa trên phản ứng tạo màu vàng đặc trưng với Ethylene glycol trong môi trường kiềm Màu vàng thu được có độ đậm nhạt khác nhau tùy thuộc vào hàm lượng naringin trong mẫu Để xác định hàm lượng naringin, sử dụng máy đo quang phổ UV - VIS theo phương pháp Davis (1947).
Dựa vào giá trị độ hấp thu đo được cùng với phương trinh đường chuẩn, ta xác định được hàm lượng naringin trong dung dịch mẫu
Cân 3g sản phẩm nghiền nhuyễn vào cốc thủy tinh 50ml, sau đó thêm 42ml cồn 80 độ Mẫu được chiết tách ở nhiệt độ 70 độ C trong 1 giờ, rồi lọc qua giấy lọc để thu hồi dịch chiết.
Lấy 0,1ml dịch lọc cho vào bình định mức 10ml, thêm 0,1ml dung dịch NaOH 4N và định mức bằng ethylen glycol đến vạch Để hỗn hợp yên 15 phút để hình thành màu vàng, sau đó cho vào cuvet để đo màu Mật độ quang được đọc tại bước sóng 420nm bằng máy đo quang phổ.
Chuẩn bị mẫu trắng: Lấy 0,1ml nước cất, thêm 0,1ml NaOH 4N, định mức bằng ethylen glycol đến vạch
Hàm lượng naringin được xác định dựa vào đường chuẩn naringin