Phân tích hàm lương cyclamate bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp

Một trong những phụ gia đó là chất tạo ngọt cyclamate được dùng trong chế biến thực phẩm và làm chất tạo ngọt để đánh lừa cảm giác thèm đường của bệnh nhân đái tháo đường hoặc bị béo phì

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

LỚP DH18HH

CHỦ ĐỀ BÁO CÁO: PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG CYCLAMATE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

CAO ÁP

Võ Hồng Diệp 18139025

Âu Thị Huyền Diệu 18139028 Nguyễn Minh Anh 18139005 Lại Ngọc Dung 18139030 Nguyễn Châu Anh 18139004

Võ Thị Thanh Kiều 18139077 Nguyễn Thanh Hằng 18139046

Hồ Thị Thùy Linh 18139081

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 6/2020

MỤC LỤC

Phần I : MỞ ĐẦU 1

Phần II : TỔNG QUAN 2

1 Phụ gia thực phẩm là gì? 2

2 Cấu tạo và tính chất của cyclamate 2

3 Ảnh hưởng của cyclamate đối với sức khỏe 3

4 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp 3

5 Thực ngiệm 4

5.1 Thiết bị, dụng cụ 4

5.2 Thuốc thử 5

6 Quy trình phân tích 6

6.1 Lấy mẫu và bảo quản 6

6.2 Chuẩn bị dung dịch chạy HPLC 6

6.3 Xử lý mẫu 6

6.4 Phân tích trên hệ thống HPLC 6

6.5 Nhận biết 7

7 Đánh giá quy trình 7

DANH MỤC HÌNH

1 Chất tạo ngọt cyclamate 1

2 Máy sắc ký hiệu năng cao 1

3 Công thức cấu tạo của cyclamate 2

4 Sơ đồ cấu tạo của bộ phận máy HPLC 4 5

TÀI LIỆU THAM KHẢO

https://tailieu.vn/doc/xac-dinh-cyclamate-trong-cac-loai-thuc-pham-che-bien-bang-phuong-phap-sac-ky-long-hieu-nang-cao-2020356.html?

fbclid=IwAR1nRUfb77zo3zNUfQawf3xMbPLpGCAqxrOIkrcKf9-h3GLnUNiKQ8yk9uk

https://dantri.com.vn/suc-khoe/duong-hoa-hoc-cyclamate-doc-den-dau-1313203714.htm

Phần I : MỞ ĐẦU

- Tình trạng vệ sinh an toàn thực phẩm đang là vấn đề nhức nhối trong xã hội.

Nhiều phụ gia được đưa vào thực phẩm để bảo quản hay cải thiện hương vị

và bề ngoài của chúng Một trong những phụ gia đó là chất tạo ngọt cyclamate được dùng trong chế biến thực phẩm và làm chất tạo ngọt để đánh lừa cảm giác thèm đường của bệnh nhân đái tháo đường hoặc bị béo phì phải

ăn kiêng

- Chất ngọt tổng hợp (hay chất tạo ngọt) là phụ gia thực phẩm, không phải là

đường có nguồn gốc tự nhiên, được sử dụng với mục đích tạo ngọt cho thực phẩm, không sinh năng lượng và chất dinh dưỡng Ngày nay, chúng được sử dụng phổ biến trong công nghệ chế biến và bảo quản thực phẩm Trong đó, người ta thường dùng cyclamate để làm tăng độ ngọt của sản phẩm

Hình 1: Chất tạo ngọt cyclamate

- Phương pháp sắc ký lỏng cao áp là phương pháp hữu hiệu để xác định hàm

lượng cyclamate trong thực phẩm

Hình 2: Máy sắc ký hiệu năng cao

Phần II : TỔNG QUAN

1 Phụ gia thực phẩm là gì?

- Phụ gia thực phẩm là các hóa chất được bổ sung thêm vào thực phẩm để bảo

quản hay cải thiện hương vị và bề ngoài của thực phẩm

- Để tạo thiện cảm, chúng được ghi với các tên gọi: Hương cam, Bột ngọt, Hương chanh tự nhiên, màu thực phẩm Tuy nhiên tên gọi đúng nhất của chúng là hóa chất

2 Cấu tạo và tính chất của cyclamate.

- Cyclamate là muối của Ca hoặc Na của axit cyclamic Nó được điều chế

bằng cách sunfo hóa cyclohexylamine Muối của Ca được gọi là Calcium cyclamate và muối của Na là Sodium cyclamate - thường được thêm vào thực phẩm để tạo độ ngọt

- Công thức phân tử: C6H12NNaO3S

- Công thức cấu tạo:

Hình 3: Công thức cấu tạo của cyclamate

- Tính chất: Dạng tinh thể màu trắng, không mùi Tan nhiều trong nước, hầu

như không tan trong benzene, chloroform ethanol và diethyl ether Ở nồng độ 10% pH: 5.5-7.5: Dung dịch sodium cyclamate bền với nhiệt độ và chỉ bị phân hủy ở nhiệt độ khá cao 280-500oC, ánh sáng không khí trong một khoảng biến đổi rộng của pH

- Công dụng phụ gia Sodium Cyclamate (E952): Chất dùng điều vị, chất tạo

ngọt có độ ngọt gấp 30-50 lần đường cát

- Ứng dụng: tạo ngọt thay thế đường cát trong chế biến kem, nước giải khát,

nước tương, nước mắm, thạch rau câu Ưu điểm: vị ngọt ngon, tròn vị giống đường cát, không có vị đắng, gắt khó chịu

3 Ảnh hưởng của cyclamate đối với sức khỏe.

- Tại Việt Nam, đường cyclamate có thành phần chính là aspartame, một chất

làm ngọt nhân tạo, bị Bộ Y tế cấm sử dụng trong chế biến thực phẩm và khuyến cáo cyclamate có thể là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh nguy hiểm, trong đó có ung thư và tiểu đường.

- Chất cyclamate khi vào cơ thể sẽ được vi khuẩn trong ruột chuyển thành

mono hay dicyclohexylamine, là chất có thể gây ung thư gan, thận, phổi… dị dạng bào thai trên nghiên cứu thực nghiệm ở động vật Hơn nữa, ngay cả ăn nhiều đường mía cũng không tốt cho sức khoẻ, huống gì đường hoá học Khi vào cơ thể, các chất tạo ngọt không sinh năng lượng, không mang lại giá trị dinh dưỡng nào mà còn có thể tích luỹ gây độc cho gan, thận

4 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp.

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (tiếng Anh: High-performance liquid

chromatography; viết tắt HPLC; còn được gọi là Sắc ký lỏng áp suất cao) là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa hỗn hợp mẫu, qua một cột sắc ký Cột sắc ký được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn Mỗi thành phần trong mẫu tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ nên tốc độ dòng của mỗi thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tới sự phân tách các thành phần khi mà chúng chảy ra khỏi cột HPLC đã và đang được sử dụng cho những mục đích sản xuất, nghiên cứu, pháp lý và y dược

Hình 4: Sơ đồ cấu tạo các bộ phận máy HPLC

5 Thực ngiệm.

5.1 Thiết bị, dụng cụ.

- Thiết bị HPLC, gồm các bộ phận sau đây:

+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao, gồm có bơm, bộ bơm mẫu, máy đo quang phổ tử ngoại (UV) (khả năng hoạt động ở bước sóng 314nm, tốt nhất

là detector mảng diot), có máy ghi hoặc máy tích phân cho phép đo chiều cao peak và điện tích peak

+ Cột pha đảo:

● Pha tĩnh của cột pha đảo C18 cỡ hạt 5mm;

● Chiều dài 250mm;

● Đường kính trong 4mm;

● Cột bảo vệ, C18 pha đảo (tùy chọn nhưng thường được khuyến nghị đặc biệt cho tất cả các mẫu dạng rắn)

- Các tiêu chí tính năng đối với các cột phân tích thích hợp là độ phân dải nền

của peak cyclamate

- Khi đo bằng detector mảng diot hoặc khi đo tại bước sóng thứ hai thấy có

nhiễu, thì cần phải chọn điều kiện sắc ký khác để xác định cyclamate:

● Thiết bị siêu âm

● Bộ lọc màng, kích thước lỗ thích hợp, ví dụ: 0,45 mm.

● Bộ lọc, có giá đỡ màng lọc và pha động khử khí và dung dịch ổn định

● Bộ đồng hóa

● Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ ở 600oC

● Máy li tâm, có khả năng tạo gia tốc li tâm nhỏ nhất tại đáy ống là 1400g

● Ống li tâm, tốt nhất là bằng thủy tinh, có dung tích thích hợp, ví dụ: 50ml, có thể đậy kín được

● Phễu chiết, có dung tích thích hợp, ví dụ: 50ml và 100ml

● Giấy lọc gấp nếp, loại nhanh trung bình

● Bộ lọc tách pha (tùy chọn)

5.2 Thuốc thử.

- Các thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích dùng cho phân tích HPLC và nước được sử dụng phải là loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác Khi chuẩn bị các dung dịch, phải tính đến

độ tinh khiết của các thuốc thử

 Natri sulfat

 Dung dịch natri cacbonat

 Dung dịch natri hypoclorit

 Axit sulfuric

 Dung dịch chuẩn natri cyclamate

 Dung dịch Carrez I: Hòa tan trong nước 15g kali hexaxyanoferrat (II) (K4[Fe(CN)6].3H2O) ít nhất 99% phần khối lượng và thêm nước đến 100ml

 Dung dịch Carrez II: Hòa tan trong nước 30g kẽm sulfat (ZnSO4.7H2O)

có độ tinh khiết ít nhất 99,5% phần khối lượng và thêm nước đến 100ml

 Pha động: Trộn 80 phần thể tích metanol theo tỷ lệ 4:1 với 20 phần thể tích nước, lọc qua bộ lọc màng thích hợp, ví dụ: có cỡ lỗ 0,45mm và khử khí 5 phút trong thiết bị siêu âm Tỷ lệ metanol với nước trong pha động

có thể điều chỉnh đôi chút để đạt được kết quả phù hợp với cột được sử dụng, nếu cần

 Xenluloza

6 Quy trình phân tích.

6.1 Lấy mẫu và bảo quản.

- Lấy mẫu ngẫu nhiên trên thị trường thực phẩm và bảo quản mẫu theo quy

định ghi trên nhãn sản phẩm

6.2 Chuẩn bị dung dịch chạy HPLC.

- Dung dịch chuẩn: cân 898,00mg natri cyclymate, chính xác đến 0,10mg, cho

vào bình định mức 200ml và pha loãng bằng nước đến vạch Dùng pipet lấy 0,25ml; 1ml; 2,5ml; 5ml, 10ml, 20ml Dung dịch này cho vào bình định mức100ml và pha loãng đến vạch Nồng độ natri cyclymate của các dung dịch này là 10ppm, 40ppm, 100ppm, 200ppm, 400ppm, 800ppm

- Tạo dẫn xuất: để có được dung dịch mẫu chuẩn, lấy 20ml các dung dịch mẫu

trên cho vào phễu chiết, thêm 1ml axit sunfuaric 50%, 10ml n-heptan và 2,5ml dung dịch natri hypoclorit (1,7% hoạt động), lắc mạnh trong một phút

để tách pha, gạt bỏ lớp nước phía dưới Làm khô nước bằng n-heptan bằng 1g natri sunfat khan và lọc qua giấy lọc thu được dung dịch chuẩn

6.3 Xử lý mẫu.

- Các sản phẩm dạng lỏng và sản phẩm tạo dung dịch trong (ví dụ: nước quả

trong, nước muối dưa chuột đã lọc, kẹo cứng )

- Sản phẩm nửa rắn (ví dụ: sản phẩm sữa, món tráng miệng, cream sấy phun,

nước quả đục, mứt, mứt cam )

- Socola và sản phẩm liên quan

- Chất béo dạng nhũ tương và các sản phẩm chứa nhũ tương (ví dụ:

mayonnaise )

- Các loại mẫu trên được xử lý theo quy trình phân tích TCVN 8472:2010.

6.4 Phân tích trên hệ thống HPLC.

- Điều kiện làm việc: cột pha đảo C18 , cỡ hạt 5µm, chiều dài 250mm, đường kính trong 4mm, detector DAD, bước sóng phát hiện 314nm, tốc độ dòng pha động 1,5 ml/phút, dung môi pha động là MeOH: H2O=90:10, thể tích tiêm 20ml

- Khảo sát khoản tuyến tính và xây dựng đường chuẩn; khoản tuyến tính của

detector được khảo sát qua dung dịch chuẩn cyclymate (đã tạo dẫn xuất) có nồng độ 40, 80, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 2000, 4000ppm, điều kiện sắc

ký như trên Đường chuẩn cyclamate xác định được xây dựng trên cơ sở khảo sát khoảng tuyến tính

- Đánh giá phương pháp qua giới hạn phát hiện, độ lặp lại độ thu hồi.

- Áp dụng quy trình phân tích để xác định hàm lượng cyclamate trong một số

sản phẩm

6.5 Nhận biết.

- Nhận biết cyclamate có trong dung dịch mẫu thử bằng cách so sánh thời gian

lưu của chất phân tích trong dung dịch mẫu với thời gian lưu của chất chuẩn, hoặc bằng cách bơm đồng thời dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử, hoặc bằng cách thêm dung dịch chuẩn vào dung dịch mẫu thử và ghi lại đường hấp thụ trong dải bước sóng có liên quan

- Bơm các thể tích bằng nhau của dung dịch mẫu thử và dung dịch thử chuẩn.

Khoảng thời gian giữa các lần bơm kế tiếp của các dung dịch chuẩn không được nhỏ hơn 15 phút Để giảm thiểu nguy cơ các chất bị rửa giải từ lần bơm trước đó bị lẫn với các thành phần từ các mẫu bơm tiếp sau, thì việc bơm liên tiếp các dung dịch mẫu thử cần được thực hiện tại các khoảng thời gian đủ dài (ví dụ: 30 phút)

- Để ổn định, mỗi ngày trước khi bắt đầu phân tích cần tráng rửa cột bằng

nước trong 10 phút bằng dung dịch ổn định trong 30 phút và tráng lại bằng nước trong 10 phút

7 Đánh giá quy trình.

- Đánh giá quy trình phân tích hàm lượng sodium cyclamate:

- Đánh giá giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):

+ Thử nghiệm trên mẫu trắng: mẫu tương tự mẫu thử nhưng không có cyclamate

+ Thử nghiệm trên mẫu thử: mẫu nhà sản xuất đã khảo sát và công bố

- Xác định độ lặp lại của phương pháp.

- Xác định độ đúng của phương pháp.

Nhận xét:

- Ưu điểm:

+ Nếu sử dụng cyclamate với hàm lượng ít có thể đánh lừa cảm giác thèm ngọt của bệnh nhân tiểu đường

+ Sản xuất thực phẩm cho người ăn kiêng

- Khuyết điểm: Theo nghiên cứu cho thấy chất chuyển hóa của cyclamate trong

cơ thể thành cyclohexylamine có thể gây ung thư

- Hàm lượng cyclamate được cho phép sử dụng: dưới 7mg/kg thể trọng

- Hiện nay ở Châu Á có Nhật và Malaysia cấm sử dụng cyclamate trong thực phẩm, Mỹ, Anh và một số nước khác cũng cấm sử dụng

- Nhưng có khoảng 55 quốc gia khác, cyclamate được phép đưa vào sử dụng

- Nước ta cũng đã cấm sử dụng cyclamate trong một thời gian dài nhưng hiện nay đã được phép đưa vào dùng với liều lượng quy định