Khảo sát khả năng ức chế trực khuẩn mủ xanh và tụ cầu vàng của bacillus subtilis

Thêm vào đó, công tác chống nhiễm khuẩn trong các bệnh viện không thực sự tốt giúp cho các đối tượng này tồn tại được trong điều kiện cực đoan và ngày càng độc hơn với cái tên “vi trùng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN MẠNH HÙNG

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TRỰC KHUẨN MỦ XANH VÀ TỤ CẦU VÀNG

CỦA BACILLUS SUBTILIS

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH: 604280

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 09 NĂM 2012

CHƯƠNG 1 – MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 2

1.3 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tế 2

CHƯƠNG 2 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 CÁC ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT 3

2.1.1 Pseudomonas aeruginosa 3

2.1.2 Staphylococcus aureus 4

2.1.3 Bacillus subtilis 5

2.2 TÍNH CHẤT GÂY BỆNH, XÉT NGHIỆM CẬN LÂM SÀNG VÀ ĐIỀU TRỊ NHIỄM KHUẨN DO TRỰC KHUẨN MỦ XANH VÀ TỤ CẦU VÀNG 6

2.2.1 Nhiễm khuẩn mủ xanh do Pseudomonas aeruginosa 6

2.2.1.1 Tính chất gây bệnh 6

2.2.1.2 Xét nghiệm cận lâm sàng 7

2.2.1.3 Điều trị nhiễm khuẩn mủ xanh 7

2.2.2 Nhiễm khuẩn mủ vàng do Staphylococcus aureus 8

2.2.2.1 Tính chất gây bệnh 8

2.2.2.2 Xét nghiệm cận lâm sàng 8

2.2.2.3 Điều trị nhiễm khuẩn mủ vàng 8

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ NHIỄM KHUẨN 9

2.3.1 Điều trị bằng kháng sinh 9

2.3.1.1 Phân loại thuốc kháng sinh 10

2.3.1.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn 11

2.3.2 Điều trị bằng vaccine và huyết thanh 12

2.3.2.1 Vaccine 12

2.3.2.2 Auto-vaccine 13

2.3.2.3 Huyết thanh (kháng huyết thanh) 14

2.3.3 Phương pháp dùng vi sinh vật ức chế 14

2.3.3.1 Tác động kháng khuẩn 14

2.3.3.2 Tác động miễn dịch 15

2.3.3.3 Tác động đến vi khuẩn đường ruột 15

MỤC LỤC

2.3.3.4 Tác động khả năng hấp thụ thức ăn 15

2.3.3.5 Tác động lên biểu mô 15

2.4 TÍNH CHẤT ƯU VIỆT CỦA BACILLUS SUBTILIS 16

2.4.1 Khả năng ức chế cạnh tranh 16

2.4.2 Khả năng tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn 18

2.4.2.1 Lantibiotic 19

2.4.2.2 Lipopeptide 20

2.4.2.3 Các hợp chất kháng khuẩn khác 21

2.5 NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ HƯỚNG CỦA ĐỀ TÀI 22

CHƯƠNG 3 – NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24

3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.3 ĐỊA ĐIỂM VÀ TRANG THIẾT BỊ PHỤC VỤ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU 24

3.3.1 Địa điểm thực hiện đề tài nghiên cứu 24

3.3.2 Trang thiết bị phục vụ công tác nghiên cứu 24

3.4 THIẾT KẾ THỰC NGHIỆM NỘI DUNG 1 25

3.4.1 Chuẩn bị giống gốc thuần chủng 26

3.4.2 Hoạt hóa, tăng sinh khảo sát đặc điểm sinh lý và lưu giữ các chủng giống 26

3.4.3 Thử nghiệm khả năng ức chế 26

3.4.4 Xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình ức chế 27

3.4.4.1 Tỷ lệ đối kháng 27

3.4.4.2 Lựa chọn thời điểm thích hợp để kết thúc quá trình ức chế 28

3.4.4.3 Xác định pH tối ưu 28

3.4.4.4 Xác định nhiệt độ tối ưu 28

3.5 THIẾT KẾ THỰC NGHIỆM NỘI DUNG 2 29

3.5.1 Thu thập và tăng sinh mẫu 29

3.5.2.1 Thu thập mẫu 29

3.5.2.1 Tăng sinh mẫu 29

3.5.2 Thử kháng sinh đồ bằng phương pháp đĩa kháng sinh 30

3.5.3 Thử nghiệm khả năng ức chế trực khuẩn mủ xanh và tụ cầu vàng 30

3.5.3.1 Chuẩn bị đĩa giấy lọc tẩm Bacillus subtilis 30

3.5.3.2 Thử nghiệm ức chế trên bệnh phẩm 30

CHƯƠNG 4 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31

4.1 ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ CỦA CÁC CHỦNG GIỐNG NGHIÊN CỨU 31

4.1.1 Bacillus subtilis BK 1 (Ký hiệu BS1) 31

4.1.2 Bacillus subtilis BK 2 (Ký hiệu BS2) 33

4.1.3 Bacillus subtilis BK 3 (Ký hiệu BS3) 34

4.1.4 Bacillus subtilis VTCC 254 (Ký hiệu BS4) 35

4.1.5 Bacillus subtilis AS 162 (Ký hiệu BS5) 36

4.1.6 Staphylococcus aureus HV 1 (Ký hiệu SA1) 37

4.1.7 Pseudomonas aeruginosa BD 1 (Ký hiệu PA1) 38

4.2 TUYỂN CHỌN CHỦNG BACCILUS SUBTILIS TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH ỨC CHẾ 39

4.2.1 Ức chế tụ cầu vàng 39

4.2.2 Ức chế trực khuẩn mủ xanh 40

4.2.3 Đối tượng được tuyển chọn 41

4.3 CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH ỨC CHẾ TỤ CẦU VÀNG 42

4.3.1 Xác định tỷ lệ đối kháng BS4:SA1 42

4.3.2 Xác định thời điểm kết thúc quá trình ức chế 43

4.3.3 Xác định pH tối ưu cho quá trình ức chế tụ cầu vàng 44

4.3.4 Xác định nhiệt độ tối ưu cho quá trình ức chế tụ cầu vàng 45

4.3.5 Nhận xét chung về các điều kiện tối ưu ức chế tụ cầu vàng 46

4.4 CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH ỨC CHẾ TRỰC KHUẨN MỦ XANH 47

4.4.1 Xác định tỷ lệ đối kháng BS4:PA1 47

4.4.2 Xác định thời điểm kết thúc quá trình ức chế trực khuẩn mủ xanh 48

4.4.3 Xác định pH tối ưu cho quá trình ức chế trực khuẩn mủ xanh 49

4.4.4 Xác định nhiệt độ tối ưu cho quá trình ức chế trực khuẩn mủ xanh 50

4.4.5 Nhận xét chung về các điều kiện thích hợp ức chế trực khuẩn mủ xanh 51

4.5 KẾT QUẢ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ THỬ NGHIỆM ỨC CHẾ 52

4.5.1 Kết quả kháng sinh đồ và thử nghiệm ức chế tụ cầu vàng 52

4.5.2 Kết quả kháng sinh đồ và thử nghiệm ức chế trực khuẩn mủ xanh 53

4.5.3 Nhận xét về kết quả kháng sinh đồ và thử nghiệm ức chế 55

CHƯƠNG 5 – KẾT LUẬN 56

5.1 NHỮNG KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 56

5.2 NHỮNG MẶT HẠN CHẾ VÀ ĐỀ NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO vii

PHỤ LỤC 1 x

PHỤ LỤC 2 xviii

PHỤ LỤC 3 xxiii

Bảng 2.1 Các hợp chất kháng khuẩn được tổng hợp bằng Ribosome [24] 19

Bảng 2.2 Các hợp chất kháng khuẩn không được tổng hợp bằng Ribosome [15] 20

Bảng 2.3 Các hợp chất kháng khuẩn khác [20] 21

Bảng 4.1 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của 5 chủng B subtilis đối với tụ cầu vàng 39 Bảng 4.2 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của 5 chủng B subtilis đối với trực khuẩn mủ xanh 40

Bảng 4.3 Tỷ lệ đối kháng BS4:SA1 42

Bảng 4.4 Thời gian ức chế tụ cầu vàng 44

Bảng 4.5 pH ức chế tụ cầu vàng 45

Bảng 4.6 Nhiệt độ ức chế tụ cầu vàng 46

Bảng 4.7 Tỷ lệ đối kháng BS4:PA1 48

Bảng 4.8 Thời gian ức chế trực khuẩn mủ xanh 49

Bảng 4.9 pH ức chế trực khuẩn mủ xanh 49

Bảng 4.10 Nhiệt độ ức chế trực khuẩn mủ xanh 50

Bảng 4.11 Kết quả kháng sinh đồ và thử nghiệm ức chế tụ cầu vàng 52

Bảng 4.12 Kết quả kháng sinh đồ và thử nghiệm ức chế trực khuẩn mủ xanh 54

Hình 2.1 Hình ảnh vi thể Pseudomonas aeruginosa [29] 3

Hình 2.2 Hình ảnh vi thể Staphylococcus aureus [30] 4

Hình 2.3 Hình ảnh vi thể Bacillus subtilis [28] 5

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.4 Probiotic cạnh tranh vị trí bám trên nhu mô ruột với các đối tượng vi sinh vật

gây bệnh [13] 15

Hình 2.5 Màng sinh học của B subtilis NCBI 3610 (trái), B subtilis 168 (phải) 17

Hình 2.6 Sự hình thành nội bào tử của tế bào Bacillus subtilis [21] 18

Hình 3.1 Sơ đồ thực nghiệm nội dung 1 25

Hình 3.2 Sơ đồ thiết kế thực nghiệm nội dung 2 29

Hình 4.1 B subtilis BK 1: (1) vi thể , (2) đại thể, (3) canh khuẩn 31

Hình 4.2 Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis BK 1 32

Hình 4.3 B subtilis BK 2: (1) vi thể , (2) đại thể, (3) canh khuẩn 33

Hình 4.4 Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis BK 2 33

Hình 4.5 B subtilis BK 3: (1) vi thể , (2) đại thể, (3) canh khuẩn 34

Hình 4.6 Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis BK 3 34

Hình 4.7 B subtilis VTCC 254: (1) vi thể , (2) đại thể, (3) canh khuẩn 35

Hình 4.8 Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis VTCC 254 35

Hình 4.9 B subtilis AS 162: (1) vi thể , (2) đại thể, (3) canh khuẩn 36

Hình 4.10 Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis AS 162 36

Hình 4.11 Staphylococcus aureus HV 1: (1) vi thể , (2) đại thể, (3) canh khuẩn 37

Hình 4.12 Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng S aureus HV 1 37

Hình 4.13 Pseudomonas aeruginosa BD 1: (1) vi thể , (2) đại thể, (3) canh khuẩn 38

Hình 4.14 Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng P aeruginosa BD 1 38

Hình 4.15 Đường kính vòng vô khuẩn của 5 chủng B subtilis đối với tụ cầu vàng 40

Hình 4.16 Đường kính vòng vô khuẩn của 5 chủng B subtilis đối với vi khuẩn mủ xanh 41

Hình 4.17 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đối kháng BS4:SA1 42

Hình 4.18 Đồ thị biểu diễn thời gian ức chế tụ cầu vàng 43

Hình 4.19 Đồ thị biểu diễn pH ức chế tụ cầu vàng 44

Hình 4.20 Đồ thị biểu diễn nhiệt độ ức chế tụ cầu vàng 45

Hình 4.21 Một số hình ảnh ức chế tụ cầu vàng 46

Hình 4.22 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đối kháng BS4:PA1 47

Hình 4.23 Đồ thị biểu diễn thời gian ức chế trực khuẩn mủ xanh 48

Hình 4.24 Đồ thị biểu diễn pH ức chế trực khuẩn mủ xanh 49

Hình 4.25 Đồ thị biểu diễn nhiệt độ ức chế trực khuẩn mủ xanh 49

Hình 4.26 Một số hình ảnh ức chế trực khuẩn mủ xanh 51

Hình 4.27 Đồ thị biểu diễn kết quả kháng sinh đồ và thử nghiệm ức chế tụ cầu vàng 53

Hình 4.28 Đồ thị biểu diễn kết quả kháng sinh đồ và thử nghiệm ức chế trực khuẩn mủ xanh 54

Hình 4.29 Đĩa kháng sinh đồ và thử nghiệm ức chế: (1) tụ cầu vàng, (2) trực khuẩn mủ xanh 55

CFU/ml : đơn vị tế bào vi sinh vật trong 1 ml

BS1 : ký hiệu chủng Bacillus subtilis BK 1

BS2 : ký hiệu chủng Bacillus subtilis BK 2

BS3 : ký hiệu chủng Bacillus subtilis BK 3

BS4 : ký hiệu chủng Bacillus subtilis VTCC 254

BS5 : ký hiệu chủng Bacillus subtilis AS 162

SA1 : ký hiệu chủng Staphylococcus aureus HV 1

PA1 : ký hiệu chủng Pseudomonas aeruginosa BD 1

MRSA : Methicillin – resistant Staphylococcus aureus

MSSA : Methicillin – sensitive Staphylococcus aureus

CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 1 – MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa, rất thuận lợi cho các đối tượng vi sinh vật gây bệnh tồn tại, phát triển Mặt khác, việc kiểm soát nhiễm khuẩn ở Việt Nam khá lỏng lẻo, chưa đồng bộ cộng với tập quán sử dụng kháng sinh thiếu hiểu biết của người dân đã tạo

ra những chủng vi khuẩn đột biến, đa kháng thuốc Trong đó, hai điển hình vi sinh vật đa

kháng thuốc nguy hiểm nhất hiện nay là trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)

và tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) Hai chủng vi khuẩn này tuy không có bào tử

nhưng có khả năng tồn tại và thích ứng rất cao với điều kiện khắc nghiệt của môi trường

Do đó, việc sử dụng kháng sinh phổ kháng khuẩn rộng thiếu kiểm soát làm cho chúng biến chủng và có khả năng đề kháng với hầu hết các kháng sinh họ β–lactamins và Cephalosporins thế hệ I và II Thêm vào đó, công tác chống nhiễm khuẩn trong các bệnh viện không thực sự tốt giúp cho các đối tượng này tồn tại được trong điều kiện cực đoan

và ngày càng độc hơn với cái tên “vi trùng bệnh viện”; là nỗi ám ảnh của các bệnh nhân

có thời gian điều trị nội trú dài trên một tháng

Việc điều trị nhiễm trùng mủ xanh và tụ cầu vàng rất khó khăn và tốn kém Hầu hết

bệnh nhân có kết quả xét nghiệm dương tính với Pseudomonas aeruginosa đều được điều

trị tích cực bằng kết hợp giữa một kháng sinh họ Penicillin và một kháng sinh họ

Aminoglycoside Đối với tụ cầu vàng kháng Methicillin (Methicillin resistant Staphylococcus aureus, gọi tắt là MRSA) thì trị liệu bằng Vancomycin liều cao ngay từ

đầu là lựa chọn cần thiết Tuy nhiên, việc điều trị không phải lúc nào cũng thành công Một số trường hợp bệnh nhân tử vong do ba nguyên nhân sau: thứ nhất, việc điều trị không tích cực ngay từ đầu làm cho vi khuẩn biến dị đa kháng thuốc; thứ hai, đường xâm nhập của vi khuẩn (nhiễm trùng máu hay viêm màng não); thứ ba, sức đề kháng của bệnh nhân yếu dẫn đến nhiễm trùng cơ hội

Ở nguyên nhân thứ nhất, vi khuẩn có thể biến dị thành nhiều hơn một type tồn tại song song và truyền khả năng kháng thuốc qua lại lẫn nhau dẫn đến việc điều trị đi vào bế tắc

và tính mạng bệnh nhân bị đe dọa

Ngoài phương pháp điều trị bệnh nhiễm bằng các chất kháng sinh, có một phương pháp khác ứng dụng vi sinh vật ức chế cạnh tranh lẫn nhau để loại bỏ đối tượng vi sinh vật gây bệnh Trong điều kiện nhất định, vi sinh vật muốn tồn tại và phát triển phải có cơ chế ức chế (sản xuất các chất kháng khuẩn, chất nhày, các sản phẩm trao đổi chất bậc hai) và cơ chế lấn át (cạnh tranh vị trí bám, khả năng tăng trưởng, khả năng chuyển hóa và hấp thụ chất dinh dưỡng) đối với các đối tượng vi sinh vật khác Các nghiên cứu cơ bản về lý thuyết ức chế cạnh tranh giữa các vi sinh vật đã tạo tiền đề cho đề tài này

Trong luận văn, chúng tôi chỉ dừng lại ở giai đoạn “Khảo sát khả năng ức chế trực

khuẩn mủ xanh và tụ cầu vàng của Bacillus subtilis”, làm tiền đề khả năng ứng dụng

phương pháp điều trị này vào lâm sàng

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Có hai mục tiêu chính:

- Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có hoạt lực ức chế trực khuẩn mủ xanh và tụ cầu

vàng trong điều kiện tối ưu invitro Từ đó lựa chọn được chủng có ưu thế nhất

- Bước đầu thử nghiệm trên bệnh phẩm và thu thập số liệu

1.3 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

- Áp dụng lý thuyết vi sinh vật ức chế vi sinh vật trong điều kiện nhất định để khảo sát khả năng ức chế hai đối tượng gây bệnh cho người là trực khuẩn mủ xanh và tụ cầu vàng

của Bacillus subtilis

- Xác định được các điều kiện tối ưu cho quá trình ức chế

- Dự đoán được tính khả thi của quá trình ức chế và tiền thử nghiệm cận lâm sàng

1.3.2 Ý nghĩa thực tế

Đề tài có quy mô nhỏ về nhân lực và điều kiện thực nghiệm; tuy nhiên phạm vi ứng

dụng của đề tài là rất lớn (không đề cập đến ứng dụng probiotic của Bacillus subtilis):

- Mở ra hướng điều trị bệnh nhiễm không dùng kháng sinh đã bị bỏ ngỏ từ thập niên

1950 đến nay

- Khả năng ứng dụng vào các sản phẩm y tế: băng gạc (medical gauze) có tẩm các sản

phẩm trao đổi chất của Bacillus subtilis trong điều trị vết thương ngoài da, điều trị mụn

CHƯƠNG 2 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 CÁC ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT

Pseudomonas aeruginosa gây bệnh cho người là những trực khuẩn Gram âm, thường

sống ở những nơi ẩm ướt như đất, nước, cây cối, … kể cả trong bệnh viện Trên cơ thể người, vi khuẩn này thường sống ở vùng da ẩm, một số cộng sinh ở đường tiêu hóa (được phân lập trong khoảng 1/10 phân người bình thường) Ngoài ra, còn được tìm thấy trong các dung dịch nhỏ mắt, mỹ phẩm, dung dịch Phenol loãng, Benzalkinium chloride, xà bông nước Hexachlorophene, kem, nước cắm hoa, bồn tắm, máy hút ẩm, máy thông khí, các vật dụng bằng vải ở bệnh viện, trong các túi máu, huyết tương nhiễm khuẩn ở ngân hàng máu, … [29]

2.1.1.1 Đặc điểm hình thái

Pseudomonas aeruginosa là những trực khuẩn Gram âm, thẳng hay hơi cong; có khả

năng di động nhờ một hay hai tiên mao ở một đầu Kích thước 0,6x2,0 μm; tuy nhiên, hình dạng và kích thước của vi khuẩn có thể thay đổi trong lứa cấy già [27]

2.1.1.2 Đặc điểm nuôi cấy

Pseudomonas aeruginosa mọc dễ trên các môi trường thông thường, hiếu khí tuyệt đối

Lứa cấy tỏa ra mùi thơm nhẹ giống như mùi nho khô, tăng trưởng tốt ở 35-420C

Trên môi trường đặc, khóm vi khuẩn mọc dẹt hay hơi lồi, biên không đều, có khuynh hướng mọc tràn, đặc biệt trên thạch dinh dưỡng hay Trypticase soy agar Trên thạch máu,

đa số cho tiêu huyết Bêta Trên thạch MC hay EMB, khóm vi khuẩn không màu do không lên men Lactose Trong môi trường lỏng, vi khuẩn mọc làm đục và tạo một lớp váng mỏng trên bề mặt môi trường

Pseudomonas aeruginosa có thể tiết ra bốn loại sắc tố là: Pyocyanin (màu xanh lá cây

không phát huỳnh quang), Pyoverdin (màu xanh lá cây phát huỳnh quang dưới tia cực tím, còn gọi là Flourescent), Pyorubin (màu đỏ sẫm) và Pyomelanine (màu nâu đen) Trong đó, Pyocyanin là màu sắc đặc trưng của vi khuẩn, có khả năng khuếch tán vào môi trường làm cho môi trường có màu xanh lục

2.1.1.3 Tính chất sinh hóa

- Không có khả năng lên men các loại đường: Glucose (-), Lactose (-), Sucrose (-), Maltose (-), Mannitol (-) Chỉ có khả năng oxy hóa đường Glucose

- Nitrate (+), Citrate (+), Urease (+), Indol (-) Di động (+)

- Oxidase (+), Catalase (+): đây là 2 tính chất sinh hóa quan trọng xác định vi khuẩn mủ xanh [11]

Staphylococcus aureus được phân lập từ mủ ung nhọt do Robert Koch phát hiện năm

1878 Đến năm 1884, Louis Pasteur và F Rosenbach nghiên cứu tỉ mỉ và phân loại S aureus thuộc hàng Eubacteriales, họ Micrococcaceae, dòng Staphylococcus S aureus có

thể tồn tại trong không khí, bụi từ 50-100 ngày… Do đó, chúng là vi trùng bệnh viện rất thường gặp trong bông, gạc bẩn, khăn trải giường, ngay cả trên các mặt bằng và thiết bị y

tế nếu không được vệ sinh và khử trùng kỹ càng Chúng lây lan và thường khu trú trong nang lông của người và động vật, chúng chịu được nhiệt độ rất cực đoan từ 0-700C, pH 3-

8 Gặp điều kiện thuận lợi, chúng gây ổ mủ gây viêm nang lông, áp-xe da, … [30]

2.1.2.1 Đặc điểm hình thái

Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dương có dạng hình cầu, đường kính 1,0-1,5

μm, sắp xếp không có thứ tự nhất định, thường tụ lại thành từng đám giống chùm nho S aureus không di động, không có bào tử, một số chủng có vỏ capsule

2.1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy

Staphylococcus aureus mọc dễ dàng trên hầu hết các loại môi trường, trong điều kiện

hiếu khí, vi hiếu khí và kỵ khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp nhất là 370C và pH = 7,2-7,4

Trên môi trường đặc, S.aureus mọc thành khóm màu vàng Trên thạch máu, S aureus

mọc khóm trơn, lồi, đường kính 1-4 mm và gây tan máu

2.1.2.3 Tính chất sinh hóa

- Lên men đường: Glucose (+), Sucrose (+), Lactose (+), Maltose (+), Mannitol (+)

- Catalase (+), Coagulase (+), Ornithine decarboxylase (-), Urease (-) [11]

Năm 1835, Christian Gottfried Ehrenberg phát hiện ra vi khuẩn này và gọi là Vibrio subtilis; đến năm 1872, Ferdinand Cohn chính thức đặt tên vi khuẩn này là Bacillus subtilis Năm 1949-1950, Kenry Albot đã phân lập được chủng thuần Trong những năm

thập niên 1950, được ứng dụng trong dược phẩm nhờ khả năng kích thích miễn dịch và tiêu hóa [28]

2.1.3.1 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis thuộc họ Bacillaceae là trực khuẩn gram dương, hình dạng có 2 đầu

tròn; có khả năng sản sinh bào tử trong điều kiện môi trường cực đoan

2.1.3.2 Đặc điểm nuôi cấy

Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí tùy tiện (trước đây Bacillus subtilis được xếp vào

loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc) và có nhiều đặc tính ưu việt, đặc biệt là khả năng chịu nhiệt tốt, có thể tồn tại ở dạng bào tử ở nhiệt độ 520C Bacillus subtilis có thể tồn tại trong

Pseudomonas aeruginosa gây nhiễm trùng sinh mủ có màu xanh ở nhiều nơi trong cơ

thể như: lỗ tai, mắt, vết thương, vết bỏng, đường tiểu, đường hô hấp, dịch não tủy và máu,

… Từ ổ nhiễm khuẩn đầu tiên, vi khuẩn có thể lan tràn vào các mô sâu Pseudomonas aeruginosa gây bệnh bằng cách tiết nhiều loại men như: Hemolysin, Lipase,

Deoxyribosenuclase, … và độc tố như: độc tố ruột, nội độc tố Chúng chỉ gây bệnh khi gặp các điều kiện sau:

- Sức đề kháng của cơ thể suy giảm

- Niêm mạc và da bị tổn thương

- Sử dụng Corticoid lâu ngày

- Sử dụng các thiết bị y khoa bị nhiễm bẩn trong các thao tác: gây mê, thông tiểu, rút dịch não tủy, mở khí quản, chích thuốc, nhổ răng, …

- Hóa trị, xạ trị làm giảm miễn dịch của cơ thể tạo điều kiện cho nhiễm trùng cơ hội

- Lạm dụng kháng sinh tiêu diệt các vi khuẩn cộng sinh trong đường ruột

Ngày nay, Pseudomonas aeruginosa được xem là tác nhân gây nhiễm trùng ở những

bệnh nhân nằm viện lâu ngày (bệnh nhiễm khuẩn ở bệnh viện mắc phải) Nhiễm khuẩn do

Pseudomonas aeruginosa ngày càng trầm trọng và khó chữa do sự kháng thuốc rất mạnh

của vi khuẩn này đối với nhiều lọai kháng sinh [34]

2.2.1.2 Xét nghiệm cận lâm sàng

Chẩn đoán nhiễm trùng do Pseudomonas aeruginosa, cần tiến hành 4 bước xét nghiệm:

- Lấy mẫu bệnh phẩm: tùy theo bệnh hay vị trí vết thương, bệnh phẩm có thể là: mủ, vết bỏng, đàm, máu, dịch não tùy, nước tiểu, …

- Nhuộm Gram: trực khuẩn Gram âm

- Nuôi cấy: phân lập trên các môi trường: BA, MC, EMB Khảo sát đặc tính lứa cấy sau

ủ 24 giờ, ở 370C: khóm điển hình màu xanh lục, bờ không đều và mọc lan ra, có mùi nho khô

- Làm các test sinh hóa để định danh vi khuẩn: Oxidase (+), KIA (+), Citrate (+), Urease (+), Glucose (-)

Ngoài 4 bước trên, thử kháng sinh đồ là cần thiết hỗ trợ điều trị nhiễm khuẩn mủ xanh [7]

2.2.1.3 Điều trị nhiễm khuẩn mủ xanh

Việc điều trị cần hết sức cẩn trọng ngay từ đầu vì vi khuẩn này có khả năng kháng thuốc rất nhanh và mạnh Phương pháp phối hợp kháng sinh là cần thiết; thường phối hợp một loại kháng sinh thuộc họ Penicillin (Piperacillin/Tazobactam, Ticarcillin, Carbenicillin) với một loại kháng sinh thộc họ Aminoglycoside (Gentamycin, Tobramycine, Amikacin) Ngoài ra, có thể dùng các Cephalosporins thế hệ mới như: Ceftazidime, Ceftriaxone, Imipenem/Cilastatin hoặc một loại kháng sinh thuộc họ Quinolone là Ciprofloxacin [23]

2.2.2 Nhiễm khuẩn mủ vàng do Staphylococcus aureus

2.2.2.1 Tính chất gây bệnh

Tụ cầu khuẩn xâm nhập vào cơ thể người qua da và niêm mạc bằng giọt nước bọt và bụi trong không khí Khoảng 40-50% người có tụ cầu vàng cộng sinh ở mũi Khả năng gây

bệnh của S aureus là sản xuất các chất ngoại bào và tính chất lấn át của vi khuẩn

Dạng sang thương ban đầu thường là nhọt hay những áp-xe khu trú Sự xâm nhập của S aureus vào nang lông làm da bị hoại tử Coagulase được tiết ra làm đông sợi huyết tương,

tạo một vách bao quanh sang thương và giới hạn quá trình tiến triển của sang thương Vách được củng cố bởi tế bào viêm và cuối cùng là mô sợi Sau đó phần giữa sẽ hóa lỏng

do bị hoại tử, còn gọi là sự nung mủ Nếu vách bị phá vỡ trước khi sang thương hóa mủ sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn lan đi nhanh hơn, bệnh sẽ tiến triển nặng, đặc biệt là mụn nhọt

ở mặt Từ ổ nhiễm, vi khuẩn có thể thâm nhập theo đường bạch huyết vào máu gây nhiễm trùng huyết Hay vi khuẩn theo đường bạch huyết đi đến và khu trú tại các cơ quan gây viêm phổi, viêm cơ tim, viêm thận, viêm màng não, viêm khớp xương, … [31]

2.2.2.2 Xét nghiệm cận lâm sàng

Chẩn đoán nhiễm trùng do Staphylococcus aureus theo các bước sau:

- Lấy mẫu bệnh phẩm: vết mủ, vết thương, abcès da …

- Nhuộm Gram: cầu khuẩn Gram dương

- Nuôi cấy: phân lập trên các môi trường: BA, MC Khảo sát đặc tính lứa cấy sau ủ 24 giờ, ở 370C: trên môi trường MC, S aureus không mọc được; còn trên môi trường BA, S aureus mọc được và có hiện tượng tiêu huyết Bêta

- Làm các test sinh hóa để định danh vi khuẩn: Catalase (+), Coagulase (+), Glucose (+), Mannitol (+), Urease (+), Ornithine decarboxylase (-) [7]

2.2.2.3 Điều trị nhiễm khuẩn mủ vàng

Điều trị chủ yếu là sử dụng kháng sinh Tuy nhiên, S aureus có khả năng đề kháng

kháng sinh rất mạnh, đặc biệt đối với nhóm Penicillin Vì vậy việc điều trị cần tham khảo kết quả kháng sinh đồ mới có kết quả Đối với áp-xe và những sang thương kín có mủ, điều cần thiết nhất là phải dẫn lưu mủ, bởi vì thuốc kháng sinh không thể tác dụng vào phần giữa mủ được Phòng bệnh chủ yếu là giữ vệ sinh chung, đảm bảo vô trùng [8]

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ NHIỄM KHUẨN

Trong cuộc sống, con người và vi sinh vật luôn luôn tiếp xúc với nhau và trong một hoàn cảnh nhất định, vi sinh vật thâm nhập vào cơ thể ký chủ thông qua niêm mạc biểu

mô (niêm mạc hô hấp, tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục) hoặc vết thương, tổn thương ở da, niêm mạc, … Chúng tăng sinh tạo ổ nhiễm ở biểu mô hay qua đường bạch huyết vào máu, gây nhiễm khuẩn huyết Từ đó, vi khuẩn có thể lan tràn khắp cơ thể hay định vị tại một cơ quan thích hợp để phát triển Trong cơ thể ký chủ, vi sinh vật tiết ra các độc tố (nội độc tố hay ngoại độc tố) là các sản phẩm trao đổi chất bậc hai của chúng để tăng trưởng và phát triển

Cơ thể có cơ chế kháng cự không đặc hiệu (hàng rào sinh lý ngã vào, các loại thực bào, phản ứng viêm và hiện tượng sốt) và cơ chế kháng cự đặc hiệu (phản ứng miễn dịch) Việc điều trị nhiễm khuẩn chính là loại bỏ tác nhân gây bệnh (kháng nguyên) Không đề cập đến các phương pháp vật lý như: thông hút ổ nhiễm, ôxy cao áp, … chúng tôi chỉ bàn luận về việc điều trị bệnh nhiễm bằng các phương pháp hóa học, sinh học hay các phương pháp phối hợp nội khoa Thứ nhất, sử dụng các loại kháng sinh gây độc cũng như ức chế

vi khuẩn gây bệnh Thứ hai, sử dụng vaccine hay kháng huyết thanh tạo miễn dịch cho cơ thể chống lại tác nhân gây bệnh Thứ ba, sử dụng các vi khuẩn có lợi tạo cơ chế lấn át, cạnh tranh dinh dưỡng để tiêu diệt vi sinh vật gây hại [5]

2.3.1 Điều trị bằng kháng sinh

Kháng sinh là các hợp chất hóa học có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn hay ngăn chặn vi khuẩn nhân lên với liều lượng rất nhỏ Các hợp chất này là dẫn xuất của các phân tử xây dựng tế bào vi khuẩn Chúng có tác dụng ức chế cạnh tranh làm cho vi khuẩn không tổng hợp được những nguyên liệu ần thiết để xây dựng tế bào, từ đó bị chết đi

Kháng sinh có 3 nguồn gốc khác nhau:

- Kháng sinh tự nhiên: là những chất do vi sinh vật tiết ra

- Kháng sinh tổng hợp: là những hóa chất do con người tổng hợp nên

- Kháng sinh bán tổng hợp: là những chất do vi sinh vật tiết ra, được xử lý làm thay đổi cấu trúc hóa học sao cho phù hợp với yêu cầu sử dụng

Kháng sinh có tác dụng đặc hiệu, có tác động lên 1 loại hay 1 nhóm vi khuẩn nhất định

Do đó, thuốc kháng sinh không có cùng hoạt tính đối với nhiều loại vi khuẩn khác nhau Trong đó, kháng sinh có hoạt phổ hẹp chỉ có hoạt tính đối với 1 số ít vi khuẩn Ngược lại kháng sinh có hoạt phổ rộng có hoạt tính với nhiều loại vi khuẩn

2.3.1.1 Phân loại thuốc kháng sinh

Tùy vào cơ chế tác động lên tế bào vi khuẩn gây bệnh mà kháng sinh được chia thành 7

họ và 1 số nhóm đặc hiệu:

- Họ Nitromidazole (Metronidazole, Tinidazole, Secnidazole) có tác dụng ức chế cạnh tranh chất chuyển hóa PABA cần thiết của vi khuẩn Metronidazole có tác dụng rất tốt đối với vi khuẩn kị khí; nhưng cũng như Clindamycin cần phải kết hợp thêm với một Cephalosporins III hay một Fluoroquinolon

- Họ β-lactamins gồm 2 nhóm: Penicillins và Cephalosporins, có tác dụng ức chế sự tổng hợp vách tế bào vi khuẩn Các Penicillin cổ điển đến nay đã bị vi khuẩn kháng lại khá nhiều Hiện nay Penicillin kết hợp với các dược chất khác như: Clavulanic acid (Augmentin), Sulbatam (Unasyn), Tazobactam (Tazocin),… có khả năng vô hiệu hoá được men β-lactamase của vi khuẩn Nhóm Cephalosporins là nhóm lớn nhất và được phát triển nhiều nhất qua 4 thế hệ Nhược điểm lớn của nhóm Cephalosporins là ở mọi thế

hệ đều không có tác dụng đối với Enterococci

+ Cephalosporins I (Cephalotine, Cephalexine, Cephazoline, Cephaloridine): tác dụng diệt khuẩn tốt đối với cầu khuẩn, kém hơn đối với trực khuẩn, đặc biệt là trực khuẩn Gram âm

+ Cephalosporins II (Cephamanol, Cefoxitine, Cefmetaxol): có tác dụng khá tốt đối với cầu khuẩn và cả trực khuẩn

+ Cephalosporins III (Cefotaxime, Cefoperazone, Ceftriaxone, Ceftazidime): có phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng diệt khuẩn tốt đối với trực khuẩn, đặc biệt là trực khuẩn Gram âm

+ Cephalosporins IV(Cefepim, Cefditoren, Cefpirome): đây là kháng sinh mới nhất có phổ rộng, tác dụng rất tốt đối với trực khuẩn Gram âm tương đương với Carbapenem

- Họ Cyclines (Tetracycline, Doxycyline, Metacycline) có tác dụng gắn vào tiểu đơn vị 30s của Ribosomes ngăn chặn sự tổng hợp Protein, kềm hãm sự phát triển của vi khuẩn Hiện nay, Cyclines đã bị kháng lại rất nhiều nên từ năm 1990 đến nay ít được sử dụng trong ngoại khoa

- Họ Aminoglycosides (Streptomycin, Gentamycin, Amikacin, Kanamycin) có tác dụng gắn vào tiểu đơn vị 30s của Ribosome vi khuẩn, diệt khuẩn khá tốt đối với nhiều trực khuẩn Gram âm, ít có tác dụng đối với cầu khuẩn Gram dương, nhưng khi phối hợp với

nhóm Penicillin hay Vancomycin thì lại có tác dụng đáng kể đối với Enterococci Trên

lâm sàng khi sử dụng Aminoglycosides cần thận trọng vì nồng độ tác dụng và nồng độ độc của thuốc rất gần nhau đặc biệt là đối với chức năng thận và thính giác

- Họ Phenicols (Chloramphenicol, Thiamphenicol) có tác dụng gắn vào tiểu đơn vị 50s của Ribosome vi khuẩn, kềm hãm sự phát triển của vi khuẩn, độc tính khá cao nên hiện nay rất ít được sử dụng trên lâm sàng

- Họ Macrolides (Erythromycin, Azithromycin, Clarithromycin, Spiramycin) cũng có

tác dụng gắn vào tiểu đơn vị 50s của Ribosome, kềm hãm sự phát triển của vi khuẩn và diệt khuẩn ở liều cao Hiện nay, trên lâm sàng các Macrolides đã bị kháng khá nhiều nên các kháng sinh mới như Clarythromycin và Azithromycin có phổ kháng khuẩn rộng hơn, cho tác dụng tốt ở dạng viên uống, được sử dụng ngày càng nhiều hơn

- Họ Glycopeptides (Vancomycin, Ristocetin) có tác dụng gắn vào màng bào tương vi khuẩn, gây rối loạn thẩm thấu làm phá vỡ tế bào Trong nhóm này có Vancomycin có tác

dụng rất tốt đối với cầu khuẩn Gram dương, đặc biệt là Staphyloccus aureus kháng Methicillin và Enterococci

- Các nhóm đặc hiệu: các Mitrofurans, nhóm Quinolones (Ofloxaxin, Norfloxacin, Ciprofloxacin và Pefloxacin), Novobiocin, Fusidic acid, thuốc chống lao (Rifampicin kết hợp với Ethambutol và Isoniazid), thuốc chống nấm, thuốc kháng virus [11]

2.3.1.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

Khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gồm 2 loại: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc thu được Kháng thuốc tự nhiên là sự kháng thuốc của những vi khuẩn không nằm

trong phổ tác dụng của một kháng sinh nào đó Ví dụ: vi khuẩn lao (Mycobacterium

tuberculosis) không bị tác động bởi Penicillin Sự kháng thuốc tự nhiên là biểu hiện của

genotype nên nó bền vững và di truyền được Kháng thuốc thu được là sự kháng thuốc của những vi khuẩn nằm trong phổ tác dụng của kháng sinh nhưng đã trở nên kháng lại kháng

sinh đó Ví dụ: Vi khuẩn tụ cầu vàng (S aureus) kháng lại Methicillin

Vi khuẩn thu được khả năng đề kháng kháng sinh là do 4 cơ chế sau:

- Vi khuẩn sản xuất enzyme phá hủy hoạt tính thuốc Ví dụ: vi khuẩn sản xuất lactamase thủy phân các kháng sinh thuộc họ β-lactamins

β Vi khuẩn giảm tính thấm của thành tế bào làm cho thuốc bị giữ lại trên bề mặt tế bào, nhờ đó tránh được sự tác động của thuốc

- Vi khuẩn tăng tổng hợp các chất chuyển hóa hay thay đổi đường biến dưỡng để cạnh tranh và làm mất tác dụng của thuốc

- Vi khuẩn thay đổi cấu trúc vị trí điểm gắn của thuốc trên thành tế bào hay thay đổi cấu trúc protein của ribosome làm cho thuốc không thể tác động lên tế bào của chúng

Khả năng đề kháng kháng sinh thu được là do những thay đổi thích nghi để tồn tại của vi khuẩn Đây là những biến đổi phenotype nên không bền vững và không duy truyền được Tuy nhiên, vi khuẩn có khả năng truyền yếu tố kháng R (Resistant posibility) nhờ plasmid mang những gen kháng kháng sinh từ vi khuẩn nọ sang vi khuẩn kia cùng loài hay loài khác thân cận thông qua con đường tiếp hợp hay tải nạp Khả năng di truyền yếu tố R tạo

ra 1 quần thể vi sinh vật gây bệnh đa kháng thuốc rất nguy hiểm, nên cần có những biện pháp phòng chống kháng kháng sinh chéo trong điều trị lâm sàng như: tuân thủ điều trị theo kháng sinh đồ, phối hợp kháng sinh điều trị đúng nồng độ và duy trì đủ thời gian, dùng kháng sinh liều cao ngay từ đầu, kiểm soát nghiêm ngặt khâu phòng chống nhiễm khuẩn bệnh viện [11]

2.3.2 Điều trị bằng vaccine và huyết thanh

- Vaccine sống: được điều chế từ vi sinh vật còn sống nhưng đã bị cải biến cho yếu đi hoặc giảm tối đa độc lực của chúng Ví dụ: vaccine dịch hạch BCG, vaccine bại liệt Sabin

- Vaccine chết: được điều chế từ vi sinh vật đã bị giết chết bằng phương pháp hóa lý thích hợp mà vẫn còn nguyên vẹn cấu trúc kháng nguyên Ví dụ: vaccine tả, thương hàn

- Vaccine vô độc tố: ngoại độc tố (exotoxin) của vi sinh vật được điều chế thành vô độc

tố (anatoxin) bằng hóa chất hay xử lý nhiệt, không còn độc hại nhưng vẫn giữ nguyên vẹn cấu trúc kháng nguyên Ví dụ: vaccine vô độc tố bạch hầu, uốn ván

- Vaccine phối hợp: là loại vaccine gồm nhiều loại vi sinh vật khác nhau để tạo miễn dịch cho cùng lúc nhiểu loại bệnh khác nhau Ví dụ: vaccine DTC giúp phòng ngừa bệnh bạch hầu, uốn ván, ho gà [17]

2.3.2.2 Auto-vaccine

Auto-vaccine là phương pháp điều trị nhiễm khuẩn thông qua miễn dịch không đặc hiệu

có được từ một vi sinh vật tương cận (không gây hại, được phân lập từ chính cơ thể bệnh nhân) với chủng vi sinh vật gây bệnh Auto-vaccine thường áp dụng trong điều trị các bệnh viêm nhiễm cơ hội mắc phải mãn tính mà các phương pháp điều trị thông thường như dùng kháng sinh và kháng huyết thanh không có kết quả Những năm đầu thế kỷ 20, khi thuốc kháng sinh còn chưa được ứng dụng rộng rãi thì phương pháp auto-vaccine đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi như là 1 liệu pháp giúp tăng cường miễn dịch, giúp

cơ thể tăng sức đề kháng chống lại tác nhân gây bệnh

Năm 1998, nhóm nghiên cứu của Zaluga tiến hành phân lập Propionibacterium acnes từ

da bệnh nhân điều chế thành auto-vaccine sử dụng cho chính bệnh nhân đó Kết quả

47.6% bệnh nhân có thay đổi miễn dịch tích cực thông qua nồng độ kháng thể kháng P acnes cao trong máu Từ năm 1995-1997, Symbio Vaccin GmbH (Herborn, Đức) phân lập các chủng E coli thô từ chính đường tiêu hóa của 78 bệnh nhân Các chủng E coli này

được xử lý nhiệt ở 700C trong vòng 2 giờ và được tiêm cho từng bệnh nhân với nồng độ

từ 3x103-3x106 CFU/ml Sau 4-6 tuần, các bệnh nhân được kiểm tra miễn dịch thông qua nồng độ kháng nguyên protein, nồng độ kháng thể và cytokines Kết quả nghiên cứu cho thấy auto-vaccine giúp tạo ra 3 loại cytokines quan trọng tạo ra miễn dịch không đặc hiệu cho cơ thể chống lại các tác nhân vi khuẩn Gram âm [19]

2.3.2.3 Huyết thanh (kháng huyết thanh)

Huyết thanh hay đúng hơn là kháng huyết thanh là lọai kháng thể trong huyết thanh của động vật được làm miễn dịch hay trong huyết thanh của người bình phục sau một bệnh nhiễm nào đó, dùng để điều trị một bệnh nhiễm tương ứng

Huyết thanh trị liệu đưa vào cơ thể một loại kháng thể đặc hiệu sẵn có, chống lại tác nhân gây bệnh Huyết thanh tạo cho cơ thể miễn dịch thụ động nhân tạo tức khắc, để điều trị cấp thời một bệnh nhiễm khuẩn Miễn dịch này không bền vì kháng thể sẽ bị đào thải trong vòng 10-15 ngày

Người ta dùng huyết thanh trị liệu để điều trị cấp cứu những trường hợp bị nhiễm khuẩn hay ngộ độc cấp Trong huyết thanh trị liệu phải dùng liều cao ngay từ đầu Nếu có phản ứng mẫn cảm (kích ngất hóa mẫn, hiện tượng Arthus hay các phản ứng chậm như nóng, sốt, phù nề, sưng khớp, nổi hạch, …) xảy ra thì tùy vào điều kiện bệnh nhân cũng như tiên lượng về mức độ trầm trọng của bệnh nhiễm mà quyết định có sử dụng kháng huyết thanh hay không

Có 3 loại huyết thanh: huyết thanh ngựa được tạo miễn dịch rồi tinh chế, huyết thanh người bình phục sau nhiễm và Gamma globulin

Ta có thể dùng kháng huyết thanh song song với vaccine để tạo ngay một miễn dịch sau

đó để khi huyết thanh hết tác dụng thì vaccine bắt đầu tạo ra miễn dịch cho cơ thể [11]

2.3.3 Phương pháp dùng vi sinh vật ức chế

Trong điều kiện nhất định, vi sinh vật muốn tồn tại và phát triển phải có cơ chế ức chế (sản xuất các chất kháng khuẩn, chất nhày, các sản phẩm trao đổi chất bậc hai) và cơ chế lấn át (cạnh tranh vị trí bám, khả năng tăng trưởng, khả năng chuyển hóa và hấp thụ chất dinh dưỡng) đối với các đối tượng vi sinh vật khác [26]

- Cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh [16]

2.3.3.2 Tác động miễn dịch

- Probiotic như là phương tiện phân phát các phân tử kháng viêm cho đường ruột

- Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm

- Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng

- Kháng nguyên của Probiotic kích thích tế bào niêm mạc ruột sản sinh kháng thể

2.3.3.3 Tác động đến vi khuẩn đường ruột

- Probiotic giúp tạo sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái đường ruột Điều này phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giống vi khuẩn

- Vi khuẩn Probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột

2.3.3.4 Tác động khả năng hấp thụ thức ăn

Tăng lượng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hóa: chúng tham gia vào sự trao đổi chất dinh dưỡng như các carbohydrate, protein, lipid và khoáng

2.3.3.5 Tác động lên biểu mô

- Đẩy mạnh sự liên kết chặt của những tế bào biểu mô

- Giảm việc kích thích bài tiết và những hậu quả do bị viêm của sự lây nhiễm vi khuẩn

- Đẩy mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy

Hình 2.4 Probiotic cạnh tranh vị trí bám trên nhu mô ruột với các đối tượng vi sinh vật

2.4 TÍNH CHẤT ƯU VIỆT CỦA BACILLUS SUBTILIS

Bacillus subtilis là đối tượng vi sinh vật được tập trung nghiên cứu và ứng dụng nhiều

nhất từ những năm 1950 đến nay bởi những đặc tính ưu việt của chúng đối với con người

Thứ nhất, là chủng vi khuẩn có bào tử, Bacillus subtilis có khả năng tồn tại rất cao trong

các điều kiện cực đoan như: pH < 5, t0 > 400C, môi trường nghèo dinh dưỡng [3] Thứ hai, khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh giúp chúng dễ dàng cạnh tranh vị trí bám vào cơ chất; từ đó cạnh tranh dinh dưỡng với các đối tượng vi sinh vật khác Thứ ba, quan trọng nhất là khả năng sản sinh các chất hợp chất kháng khuẩn tự nhiên, giúp tiêu diệt hay kìm hãm sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ

2.4.1 Khả năng ức chế cạnh tranh

Khả năng tồn tại của Bacillus subtilis thể hiện thông qua sự phân bố rất đa dạng trên sinh

quyển; ta có có thể phân lập chúng từ môi trường nước hay trên cạn Bào tử của chúng bay trong không khí theo gió và phán tán khắp mọi nơi, nhưng chúng không bao giờ nảy mầm trong không khí

B subtilis có thể sinh trưởng ở rễ cây Rudrappa T và cộng sự (2007) đã quan sát hiện tượng này trên cây bắp cải giống Ả Rập (Arabidopsis thaliana), thêm vào đó B subtilis lại

còn được tìm thấy nhiều hơn hết ở rễ của nhiều loài cây so với các vi khuẩn sinh bào tử

trong đất nào khác [22] B subtilis thực sự có tác dụng làm giảm khả năng mắc bệnh của

cây nhờ khả năng cảm ứng kích thích hệ thống miễn dịch của cây Với nghiên cứu trên

cây đậu và cà chua năm 2007 Ongena và cộng sự chứng minh B subtilis có khả năng sinh

nhiều Surfactin và Fengycin làm tăng cường khả năng phòng vệ của cây [77] Có bằng

chứng cho rằng B subtilis có khả năng thúc đẩy sự phát triển của thực vật nhờ vào 3 lý

do Một là, B subtilis cạnh tranh với vi sinh vật gây hại cho cây Hai là, B subtilis hoạt hóa hệ thống phòng ngự của thực vật Ba là, B subtilis tạo thêm các chất dinh dưỡng cho

cây từ trong đất như Phốtpho và Nitơ (F.M Cazorla và cộng sự, 2007) [14]

Từ đó, B subtilis cũng hiện diện luôn cả trong đường tiêu hóa của động vật ăn cỏ Nhờ

sự hiện diện của B subtilis trong đường ruột, các động vật này được kích hoạt hệ thống miễn dịch B subtilis cũng đóng vai trò là Probiotic trong đường ruột nhằm di trì sự cân

bằng và trạng thái khỏe mạnh của đường ruột

Trong môi trường nước, B subtilis hiện diện rộng rãi trong môi trường đại dương nhờ

vào sự hiện diện trong đường ruột của các động vật biển

Ngoài cấu tạo cơ bản gồm: màng tế bào, thành tế bào, tế bào chất, thể nhân; các thành

phần cấu tạo đặc biệt giúp cho Bacillus subtilis có ưu thế cạnh tranh hơn so với các đối

tượng vi sinh vật khác:

- Lớp capsule: cấu trúc ngoài cùng bao lấy tế bào vi khuẩn là các Polysaccharide

và/hoặc Polypeptide, có độ nhớt cao Chính lớp nhày này giúp tế bào sống sót qua giai đoạn thiếu nước, dự trữ chất dinh dưỡng, hấp thu các Ion giúp cân bằng điện giải từ môi trường, liên kết thành màng sinh học (biofilm) giúp ngăn chặn kẻ thù [5]

Hình 2.5 Màng sinh học của B subtilis NCBI 3610 (trái), B subtilis 168 (phải)

Thước đo 1cm [21]

- Roi: tế bào Bacillus subtilis có nhiều roi bố trí xung quanh tế bào, giúp tế bào di

chuyển để tìm kiếm thức ăn hay tránh xa các yếu tố bất lợi như ánh sáng, nhiệt độ, hóa chất, từ trường Cấu tạo của một roi gồm ba phần: sợi roi dài 10-20µm đường kính khoảng 13nm, bao hình móc và thể gốc

- Bào tử: là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hoá học cơ bản như

ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và có thêm một số thành phần mới Phía ngoài của nguyên sinh chất được bao bọc bởi nhiều lớp màng Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng rất mỏng nhưng không thấm nước, cấu tạo chủ yếu là Lipoprotein Dưới lớp màng là vỏ, vỏ bào tử có nhiều lớp, bề mặt của các lớp này xù xì, thành phần hoá học là Protein và có sự tham gia của Keratin đây là những lớp

có khả năng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà tan trong nước, chúng có tác dụng tăng cường khả năng bảo vệ bào tử trước các điều kiện bất lợi

Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm

Hình 2.6 Sự hình thành nội bào tử của tế bào Bacillus subtilis [21]

2.4.2 Khả năng tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn

Việc tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm được sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ đó Việc tổng hợp các chất kháng khuẩn là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho khả năng sống sót cao cho chủng vi sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên, nhất là đối với các loài có bào tử

Cho đến nay người ta đã phát hiện ra Bacillus subtilis có thể sản sinh ra rất nhiều hợp

chất kháng khuẩn, với nhiều cấu trúc khác nhau, nhưng không phải dòng nào cũng có khả

năng tổng hợp tất cả số hợp chất đó Nhìn chung, các hợp chất kháng khuẩn của Bacillus subtilis đa phần là các Peptide; trong đó, một phần là được tổng hợp bằng Ribosome (các

Lantibiotic) và phần còn lại thì không được tổng hợp bằng Ribosome nhưng bằng hệ xúc tác Enzyme phức tạp (các Lipopeptide) Ngoài ra, chúng còn có khả năng tổng hợp một số hợp chất kháng khuẩn khác như: Polyketide, Aminosugar và Phospholipid [25]

2.4.2.1 Lantibiotic

Là các hợp chất kháng khuẩn có chứa Lanthionine Sự hình thành Lanthionine diễn ra ở giai đoạn tái tạo chuỗi Peptide sau quá trình tổng hợp bằng Ribosome

Bảng 2.1 Các hợp chất kháng khuẩn được tổng hợp bằng Ribosome [24]

Subtilin: là chuỗi 32 axit amin có tên gọi

Pentacyclic Lantibiotic có cấu trúc giống

như Nisin Chúng tác động lên màng

menbrane của vi khuẩn Gram dương

Ericin S và Ericin A: Có cấu tạo như hình

vẽ và cũng tác động lên vi khuẩn Gram

dương như Sutilin

Mersaxitin: chúng tác động lên thành tế

bào của vi khuẩn Chúng có thể tiêu diệt

được Staphylococcus aureus kháng

Methicillin

Sublancin: cấu tạo phân tử của loại này

ngoài cầu β–MethylLanthionine chúng

còn có 2 cầu Disulphide Chúng tác động

lên màng tế bào vi khuẩn Gram dương

Subtilosin: Chúng kháng lại nhiều vi

khuẩn Gram dương kể cả Listeria Chúng

tác động lên màng menbrane

2.4.2.2 Lipopeptide

Các loại này bao gồm: Surfactin, Iturin, Bacillomycin, Mycosubtilin, Fengycin, Corynebactin Chúng được tổng hợp bằng phức hợp Enzyme phức tạp, có khả năng kháng được nấm và nhiều loại vi khuẩn

Bảng 2.2 Các hợp chất kháng khuẩn không được tổng hợp bằng Ribosome [15]

2.4.2.3 Các hợp chất kháng khuẩn khác

Nằm trong số này gồm có các Polyketide, các Difficidin… Đặc biệt, Amicoumacin có

khả năng kháng Helicobacter pylori gây bệnh loét dạ dày

Bảng 2.3 Các hợp chất kháng khuẩn khác [20]

2.5 NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ HƯỚNG CỦA ĐỀ TÀI

Việc điều trị nhiễm khuẩn mủ xanh và tụ cầu vàng chủ yếu là dùng kháng sinh nên các nghiên cứu tập trung vào việc lựa chọn loại kháng sinh, liều lượng và đường dùng kháng sinh (đường uống, đường xông mũi xoang, tiêm truyền tĩnh mạch hay tiêm bắp) cũng như nghiên cứu phác đồ điều trị cho hai loại nhiễm trùng kể trên Năm 2009, Samer Qarad thuộc Đại học Arkansas (Mỹ) đã nghiên cứu tổng hợp phác đồ điều trị cho nhiễm khuẩn

Pseudomonas aeruginosa khá hoàn chỉnh [23] Từ tháng 9/2003 đến tháng 1/2005, nhóm

tác giả Phạm Hùng Vân có nghiên cứu về khả năng đề kháng kháng sinh của 235 chủng vi

khuẩn Staphylococcus aureus phân lập từ 7 bệnh viện ở Đà Nẵng, Cần Thơ và Thành phố

Hồ Chí Minh Kết quả chỉ ra rằng S aureus kháng methicillin (MRSA) có tỷ lệ đề kháng

các kháng sinh cao hơn rất rõ rệt so với vi khuẩn nhạy cảm methicillin (MSSA) Nghiên

cứu cũng ghi nhận Vancomycin là kháng sinh đặc trị vi khuẩn S aureus, vẫn còn 100%

nhạy cảm [8]

Việc phát triển và thử nghiệm lâm sàng các loại kháng sinh thế hệ mới vẫn diễn ra liên tục để khắc phục tình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh Năm 2005, Phạm Xuân Khiêm thử nghiệm sử dụng kháng sinh liều cao Fosfomycin (IV) (Fosmicin – Meiji Seika Kaisha) liều cao 6g/ngày kết hợp với Amikacin (IM) 3g/ngày trong điều trị viêm đa xoang do trực khuẩn mủ xanh [10] Cũng trong năm 2005, nghiên cứu của Phạm Hùng Vân và cộng sự đã đưa Linezolide (một kháng sinh tổng hợp mới thuộc lớp Oxazolidinones) vào thử nghiệm cận lâm sàng Kết quả là ngoài Vancomycin để điều trị

các trường hợp nhiễm trùng do S aureus kháng methicillin, Linezolide là một lựa chọn

đáng tin cậy [8]

Tuy nhiên, P aeruginosa và S aureus là hai chủng vi khuẩn đa kháng thuốc (có khả

năng đề kháng chéo) cực kỳ nguy hiểm Việc điều trị hai đối tượng trên bằng kháng sinh không phải lúc nào cũng cho kết quả tốt, đặc biệt là những trường hợp nhiễm trùng cấp tính như viêm màng não hay nhiễm trùng máu Vì vậy, các hướng điều trị khác như:

vaccine, kháng huyết thanh, các sản phẩm trao đổi chất có tác dụng ức chế vi khuẩn gây bệnh (Bacteriocin) vẫn liên tục được nghiên cứu và ứng dụng

Năm 2003, Hoàng Ngọc Hiển và cộng sự nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo vaccine trực khuẩn mủ xanh quy mô phòng thí nghiệm và bước đầu đánh giá chất lượng vaccine trên động vật [2] Tuy nhiên đề tài được đăng trên Tạp chí Y học này chưa thể đưa vào ứng dụng thực tế do vaccine được chế tạo không mang tính đại diện, chỉ có tác dụng trên

1 số type nhất định in vitro Cũng trong năm 2003, tác giả Kiều Chí Thành, điều chế thành công huyết thanh đa giá kháng trực khuẩn mủ xanh từ ngựa và bước đầu thử nghiệm trên chuột [4] Kết quả được đăng trên Tạp chí Y học Việt Nam số 9/2003

Một hướng khác là sử dụng Bacillus subtilis như là một lợi khuẩn để cạnh tranh và ức

chế các đối tượng vi sinh vật gây bệnh Tiên phong về hướng nghiên cứu này ở Việt Nam

là Bác sĩ Phạm Ngọc Thạch; người đã sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis và bảo quản

trong các ống am-pun từ năm 1947 Trong thời kỳ chưa có kháng sinh, chế phẩm này được ứng dụng rất nhiều trong y học đặc biệt trong điều trị viêm ruột [9] Năm 2005, Đỗ Thị Hồng Tươi và cộng sự đã tiến hành khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây viêm mũi xoang tại Tp HCM và bước đầu thử nghiệm tác dụng của thuốc nhỏ

Bacillus subtilis trên bệnh nhân tình nguyện [1]

Ở lĩnh vực protein - enzyme, năm 2006 Charles E Shelburne và cộng sự thuộc trường Đại học Michigan đã nghiên cứu phổ kháng khuẩn của Subtilosin A (một loại kháng sinh

quan trọng do Bacillus subtilis sản xuất) Nghiên cứu này thử nghiệm và cho kết quả ức

chế tốt (MIC<100mg/l) đối với nhiều chủng vi khuẩn Gram dương và Gram âm, bao gồm

cả vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí như: E faecalis OGX-1, L monocytogenes ATCC 19115,

P gingivalis ATCC 33277, K rhizophila ATCC 9341, Enterobacter aerogenes ATCC

13408, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Shigella sonnei ATCC 25931, Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, S gordonii Challis ATCC

49818 và Staphylococcus aureus ATCC 6538 [12]

Theo đuổi phương pháp vi sinh vật ức chế vi sinh vật trong điều trị nhiễm khuẩn; chúng

tôi khảo sát khả năng ức chế trực khuẩn mủ xanh và tụ cầu vàng của Bacillus subtilis Trong điều kiện nhất định, chúng tôi tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả năng ức

chế hai đối tượng gây bệnh trên xác định các điều kiện tối ưu in vitro Từ đó, thử nghiệm cận lâm sàng quá trình ức chế để định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo

CHƯƠNG 3 – NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Đề tài mang tính chất thực nghiệm vi sinh truyền thống, chia thành hai nội dung chính:

- Nội dung 1: Tuyển chọn giống Bacillus subtilis có khả năng ức chế trực khuẩn mủ

xanh và tụ cầu vàng Xác định được chủng giống tốt nhất và tính chất cũng như các điều kiện tối ưu của quá trình ức chế

- Nội dung 2: Dựa trên các điều kiện tối ưu, tiến hành thử nghiệm cận lâm sàng để xác định độ tin cậy của đề tài nghiên cứu

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp thực nghiệm vi sinh truyền thống (thể hiện ở phần phụ lục)

- Phương pháp khảo sát và thu thập dữ liệu

- Phương pháp thống kê xử lý dữ liệu

3.3 ĐỊA ĐIỂM VÀ TRANG THIẾT BỊ PHỤC VỤ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

3.3.1 Địa điểm thực hiện đề tài nghiên cứu

Theo yêu cầu của nội dung nghiên cứu, đề tài được thực hiện tại hai nơi:

- Nội dung 1: thí nghiệm cơ bản được thực hiện tại Phòng 102B1, Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa Tp HCM, địa chỉ số 268 Lý Thường Kiệt, Phường 10, Quận 10, Tp.HCM

- Nội dung 2: thí nghiệm cận lâm sàng được thực hiện tại Phòng vi sinh, Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bình Dân, địa chỉ số 371 Điện Biên Phủ, Phường 4, Quận 3, Tp HCM

3.3.2 Trang thiết bị phục vụ công tác nghiên cứu

Trang thiết bị cần thiết được phòng thí nghiệm hỗ trợ, bao gồm:

- Tủ cấy vô trùng, tủ hấp vô trùng, tủ ủ, tủ sấy, tủ lạnh, …

- Máy so màu, máy lắc, máy đo pH, cân điện tử

- Kính hiển vi, các lọai hóa chất, thuốc nhuộm,

- Vật dụng thủy tinh: ống nghiệm, ống đong, chai thủy tinh, đĩa petri… và các vật dụng cần thiết khác

3.4 THIẾT KẾ THỰC NGHIỆM NỘI DUNG 1

Hình 3.1 Sơ đồ thực nghiệm nội dung 1

Sinh khối B subtilis (2)

Ly tâm tách riêng các pha

Dịch ngoại bào (3)

Huyền phù B subtilis (1)

Tăng sinh

Khảo sát sơ bộ tính đối kháng (1), (2), (3)

Dự đoán kết quả(1), (2) hay (3)

Tối ưu hóa kết quả trên:

3.4.1 Chuẩn bị giống gốc thuần chủng

- Thu thập 5 giống Bacillus subtilis thuần chủng có nguồn gốc từ: Trường Đại học Bách

Khoa Tp HCM, Trung tâm lưu giữ giống vi sinh vật chuẩn với các tiêu chí: tính lấn át,

cạnh tranh cao; bao gồm: Bacillus subtilis BK 1, Bacillus subtilis BK 2, Bacillus subtilis

BK 3, Bacillus subtilis VTCC 254, Bacillus subtilis AS 162 Các chủng giống này được

ký hiệu lần lượt là: BS1, BS2, BS3, BS4, BS5

- Phân lập 1 chủng giống Pseudomonas aeruginosa BD 1(ký hiệu PA1) có nguồn gốc

từ bệnh phẩm tại Bệnh viện Bình Dân Tp HCM và 1 chủng giống Methicillin resistant Staphylococcus aureus HV 1 (ký hiệu SA1) có nguồn gốc từ bệnh phẩm tại Bệnh viện

Hùng Vương Tp HCM

3.4.2 Hoạt hóa, tăng sinh khảo sát đặc điểm sinh lý và lưu giữ các chủng giống

- Các giống thuần thu thập được được hoạt hóa bằng chế độ chiếu UV 2 giây

- Tiến hành khảo sát hình thái vi thể, hình thái đại thể của các chủng giống

- Các đối tượng vi sinh vật được tăng sinh trên môi trường Nutrient broth (NB), ủ 12-18 giờ, 370C Xác định mật độ dựa trên đường chuẩn mối quan hệ giữa mật độ vi khuẩn và

độ đục môi trường

- Giống thuần chủng được cấy sang ống thạch nghiêng Nutrient agar (NA), ủ 24 giờ ở

370C Tiếp theo, giống được bảo quản ở 5-70C, cấy chuyền giữ giống mỗi 30 ngày [6]

3.4.3 Thử nghiệm khả năng ức chế

Huyền phù tế bào Bacillus subtilis sau 20-24 giờ tăng sinh đạt mật độ khoảng

1.5-2.0x1011 CFU/ml được chia thành 3 phần:

- Một phần: huyền phù tế bào Bacillus subtilis: nghiệm thức (1)

- Hai phần: ly tâm dịch huyền phù ở 4000 vòng/phút, 10 phút:

3.4.3.1 Ly tâm tách riêng các pha

Sau ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, pha rắn và pha lỏng được tách riêng:

- Pha rắn: sinh khối tế bào Bacillus subtilis: nghiệm thức (2)

- Pha lỏng: dịch ngoại bào: nghiệm thức (3)

3.4.3.2 Thử nghiệm khả năng ức chế

- Sử dụng các đĩa NA đã cấy mủ xanh và mủ vàng, đục 5 lỗ tạo các giếng xét nghiệm

- Thực hiện 3 nghiệm thức, với 5 chủng giống Bacillus subtilis trên 2 đối tượng vi sinh

vật gây bệnh Mỗi nghiệm thức thực hiện 3 lần

- Đo đường kính vòng vô khuẩn có 90 kết quả

3.4.3.3 Dự đoán kết quả

Từ 90 kết quả, ta kết luận được 2 vấn đề sau:

- Chủng giống Bacillus subtilis ức chế P aeruginosa hoặc/và S aureus tốt nhất

- Thành phần ức chế 2 đối tượng gây bệnh trên là: (1) huyền phù nuôi cấy Bacillus subtilis, (2) sinh khối Bacillus subtilis hay (3) dịch ngoại bào

3.4.4 Xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình ức chế

Sử dụng các kết quả của thí nghiệm 3.4.3, ta tiến hành thử nghiệm tối ưu hóa các điều kiện ức chế mủ xanh và mủ vàng, bao gồm: tỷ lệ đối kháng, thời điểm kết thúc, pH, t0

Khả năng ức chế trực khuẩn mủ xanh và tụ cầu vàng của Bacillus subtilis được đánh giá thông qua tỷ lệ % tế bào Bacillus subtilis trên tổng số tế bào sau quá trình ức chế

3.4.4.1 Tỷ lệ đối kháng

Theo đường cong sinh trưởng (phụ lục 1) thì sau 18-24 giờ nuôi cấy thì cả 3 đối tượng nghiên cứu đều ở trạng thái cân bằng; cụ thể BS4 đạt mật độ 1.6x1011 CFU/ml, PA1 = 1.0x1011 CFU/ml, SA1 = 1.67x1011 CFU/ml Qua 1 số thí nghiệm khảo sát bước đầu, chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ đối kháng với các nghiệm thức dưới đây:

- Tiến hành 4 nghiệm thức với tỷ lệ B subtilis:S aureus tương ứng là : 3:1, 2:1, 1:1, 1:2

Thử nghiệm ức chế cạnh tranh bằng cách nuôi cấy cả 2 đối tượng vi sinh vật trong chai thủy tinh chứa môi trường NB, ủ 24 giờ ở 370C Sau đó, pha loãng dịch nuôi cấy đến 10-

10, tiến hành trải đĩa môi trường NA, ủ 24 giờ ở 370C

- Tiến hành đồng thời 4 nghiệm thức với tỷ lệ B subtilis:P aeruginosa tương ứng là:

25:1, 30:1, 35:1, 40:1 Thử nghiệm ức chế cạnh tranh bằng cách nuôi cấy cả 2 đối tượng

vi sinh vật trong ống nghiệm chứa môi trường NB, ủ 24 giờ ở 370C Sau đó, pha loãng dịch nuôi cấy đến 10-12, tiến hành trải đĩa môi trường NA, ủ 24 giờ ở 370C

Quan sát đại thể, đếm và so sánh số lượng khuẩn lạc của từng đối tượng vi sinh vật Ghi nhận kết quả Độ lặp thí nghiệm 3 lần Như vậy từ 24 kết quả, xác định được tỷ lệ đối kháng tối ưu để ức chế 2 đối tượng vi khuẩn

3.4.4.2 Lựa chọn thời điểm thích hợp để kết thúc quá trình ức chế

Từ kết quả thí nghiệm 3.4.4.1, ta tiến hành khảo sát thời gian thích hợp cho quá trình ức chế, phục vụ cho các thí nghiệm sau Khảo sát thời gian của quá trình ức chế bằng cách nuôi cấy cả 2 đối tượng vi sinh vật trong chai thủy tinh chứa môi trường NB, ủ ở 370C Lấy mẫu vào các thời điểm: sau 12 giờ, sau 16 giờ, sau 18 giờ, sau 24 giờ, sau 28 giờ Pha loãng mẫu như thí nghiệm 3.4.4.1, tiến hành trải đĩa môi trường NA, ủ 24 giờ ở 370C Quan sát đại thể, đếm và so sánh số lượng khuẩn lạc của từng đối tượng vi sinh vật Ghi nhận kết quả Độ lặp thí nghiệm 3 lần

Như vậy từ 30 kết quả, xác định được thời gian thích hợp cho quá trình ức chế

3.4.4.3 Xác định pH tối ưu

Từ kết quả 2 thí nghiệm trên, thử nghiệm ức chế cạnh tranh B subtilis:P aeruginosa và

B subtilis:S aureus theo 5 nghiệm thức với nồng độ pH tương ứng: pH = 5.5, pH = 6, pH

= 6.5, pH = 7, pH = 7,5 bằng cách nuôi cấy cả 2 đối tượng vi sinh vật trong chai thủy tinh chứa môi trường NB, ủ 24 giờ ở 370C Sau đó, pha loãng dịch nuôi cấy, tiến hành trải đĩa môi trường NA, ủ 24 giờ ở 370C

Quan sát đại thể, đếm và so sánh số lượng khuẩn lạc của từng đối tượng vi sinh vật Ghi nhận kết quả Độ lặp thí nghiệm 3 lần

Như vậy, với 30 kết quả, chúng tôi xác định được nồng độ pH tối ưu để ức chế 2 đối tượng vi khuẩn

3.4.4.4 Xác định nhiệt độ tối ưu

Từ kết quả 3 thí nghiệm trên, thử nghiệm ức chế cạnh tranh B subtilis:P aeruginosa và

B subtilis:S aureus theo 4 nghiệm thức với nhiệt độ tương ứng: t0 = 320C, t0 = 370C, t0 =

420C, t0 = 450C bằng cách nuôi cấy cả 2 đối tượng vi sinh vật trong chai thủy tinh chứa môi trường NB, ủ 24 giờ Sau đó, pha loãng dịch nuôi cấy, tiến hành trải đĩa môi trường

3.5 THIẾT KẾ THỰC NGHIỆM NỘI DUNG 2

Hình 3.2 Sơ đồ thiết kế thực nghiệm nội dung 2

3.5.1 Thu thập và tăng sinh mẫu

3.5.2.1 Thu thập mẫu

Mẫu Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa được lưu trữ tại Khoa Xét

nghiệm, Bệnh viện Bình Dân trong điều kiện bảo quản lạnh ở -40C

Thu thập mẫu, rã đông tự nhiên

3.5.2.1 Tăng sinh mẫu

Mẫu mủ xanh và mủ vàng đã rã đông được cấy trên canh trường NB để tăng sinh

Ủ 24h, ở 370C cho các xét nghiệm tiếp theo

Pseudomonas aeruginosa

Tăng sinh mẫu Thu thập mẫu

Tăng sinh mẫu

3.5.2 Thử kháng sinh đồ bằng phương pháp đĩa kháng sinh

Mẫu tăng sinh sau 18 giờ được cấy trang trên 2 đĩa MHA

Đặt các đĩa kháng sinh lên các đĩa Petri chứa khuẩn lạc quan tâm, ủ 24h, 370C

Đo đường kính vòng vô khuẩn, tra bảng MICs để xác định độ nhạy của vi khuẩn mủ xanh, vi khuẩn mủ vàng đối với từng loại kháng sinh

Ghi nhận kết quả

3.5.3 Thử nghiệm khả năng ức chế trực khuẩn mủ xanh và tụ cầu vàng

3.5.3.1 Chuẩn bị đĩa giấy lọc tẩm Bacillus subtilis

Chuẩn bị các đĩa giấy lọc đường kính 1cm, sấy khô và hấp khử trùng

Sau 20-24 giờ nuôi cấy, BS4 đạt mật độ 1.6x1011 CFU/ml ta tiến hành cố định lên đĩa giấy lọc bằng phương pháp hấp phụ bề mặt

Các đĩa xét nghiệm này được bảo quản trong hũ thủy tinh vô trùng có nắp đậy

3.5.3.2 Thử nghiệm ức chế trên bệnh phẩm

Sử dụng trên cùng đĩa Petri với thí nghiệm 3.5.2 (xét nghiệm kháng sinh đồ)

Đặt 1 đĩa chế phẩm (tương tự như đặt đĩa kháng sinh)

Quan sát và nhận xét vòng vô khuẩn

Ghi nhận kết quả

CHƯƠNG 4 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1 ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ CỦA CÁC CHỦNG GIỐNG NGHIÊN CỨU

Các giống thuần chủng thu thập được được tiến hành khảo sát:

- Vi thể: nhuộm Gram, quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học (vật kính

dầu x100)

- Đại thể: cấy trên môi trường NA, ủ 370C, 24 giờ, quan sát hình thái khuẩn lạc

- Đặc điểm nuôi cấy trên môi trường lỏng: cấy trên môi trường NB, ủ 370C, 24 giờ, quan

sát dạng tồn tại của sinh khối vi khuẩn trong môi trường lỏng

- Đường cong sinh trưởng: Các chủng giống được khảo sát mối quan hệ giữa mật độ tế

bào và độ đục môi trường Sau đó, tiến hành khảo sát các pha trong chu kỳ sinh trưởng

của từng chủng giống

Đây là những nghiên cứu cơ bản không thể thiếu, phục vụ trực tiếp cho các nghiên cứu

điều kiện ức chế sau này Kết quả khảo sát đặc điểm sinh lý của các chủng giống được thể

hiện dưới đây:

4.1.1 Bacillus subtilis BK 1 (Ký hiệu BS1)

Hình 4.1 B subtilis BK 1: (1) vi thể , (2) đại thể, (3) canh khuẩn

- Hình thái vi thể: Trực khuẩn Gram dương, hình dạng có hai đầu tròn, có bào tử

- Hình thái đại thể: Khuẩn lạc trơn, mọc lan, bờ không đều, màu trắng sữa, có mùi nồng

- Đặc điểm nuôi cấy trên môi trường NB: Mọc dễ trên môi trường lỏng, kết màng và

chìm xuống đáy môi trường

- Đường cong sinh trưởng:

Hình 4.2 Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis BK 1

Cũng tuân theo quy luật sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trên môi trường nuôi

cấy tĩnh [4], đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis BK 1 diễn ra 4 pha như sau:

+ Pha lag: bắt đầu từ thời điểm vi khuẩn được cấy vào môi trường NB, kết thúc tại thời điểm sau 6 giờ nuôi cấy,

+ Pha log: sinh khối tế bào tăng trưởng theo cấp số nhân; bắt đầu từ cuối pha lag đến thời điểm sau 12 giờ nuôi cấy,

+ Pha cân bằng: kéo dài từ thời điểm 14 giờ đến 40 giờ nuôi cấy sinh khối tế bào đạt mật độ cao nhất và ổn định trong khoảng: 2x1011-2,07x1011 CFU/ml,

+ Pha suy vong: từ thời điểm 42 giờ nuôi cấy trở đi, mật độ tế bào giảm dần đánh dấu giai đoạn suy vong của vi khuẩn

4.1.2 Bacillus subtilis BK 2 (Ký hiệu BS2)

Hình 4.3 B subtilis BK 2: (1) vi thể , (2) đại thể, (3) canh khuẩn

- Hình thái vi thể: Trực khuẩn Gram dương, hình dạng có hai đầu tròn, có bào tử

- Hình thái đại thể: Khuẩn lạc trơn, mọc lan, bờ không đều, màu trắng sữa, có mùi nồng

- Đặc điểm nuôi cấy trên môi trường NB: Mọc dễ trên môi trường lỏng, kết màng và

chìm xuống đáy môi trường

- Đường cong sinh trưởng: Pha lag kéo dài trong 6 giờ đầu tiên, pha log kéo dài trong 8

giờ tiếp theo, pha cân bằng bắt đầu từ giờ thứ 14 đến giờ thứ 40, khi đó mật độ tế bào đạt

cao nhất là 1.7x1011 CFU/ml Sau giờ thứ 40 bắt đầu đi vào pha suy vong

Hình 4.4 Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis BK 2