Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên PSA lên hạt nano sắt từ nhằm chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt

Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên PSA lên hạt nano sắt từ nhằm chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt Ung thư tuyến tiền liệt là ung thư có tỷ lệ tử vong cao thứ 2 ở nam giới.Tuy nhiên, nếu được phát hiện kịp thời thì cơ hội điều trị thành công cao.PSA là chất chỉ thị quan trọng trong chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt.

TRƯỜNG ĐẠI BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG

KHOA HÓA NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

−−−−−−

ĐỀ TÀI Nghiên cứu cố định kháng thể

kháng kháng nguyên PSA lên

ĐẶT VẤN ĐỀ

• Ung thư tuyến tiền liệt là ung thư có tỷ lệ tử vong cao thứ 2 ở nam giới

• Tuy nhiên, nếu được phát hiện kịp thời thì cơ hội điều trị thành công cao

• PSA là chất chỉ thị quan trọng trong chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt

• ELISA là kỹ thuật phổ biến được dùng để định lượng PSA

MÔ HÌNH THIẾT BỊ

(a) Cố định kháng thể thứ nhất đặc hiệu PSA lên đế sinh học

(b) Phủ mẫu máu chứa PSA, kháng nguyên sẽ bị kháng thể bắt giữ

(c) Thêm kháng thể thứ hai đã được gắn trên MNPs

(d) Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên sẽ được giữ lại sau những lần rửa

(e) Dựa vào thiết bị đo lượng sắt từ, xác định lượng sắt từ từ đó suy ra nồng

độ kháng nguyên trong mẫu cần đo

Hoạt hóa bề mặt bằng APTES – GA

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

• Liệu có kháng thể gắn lên hạt sắt từ không?

• Liệu kháng thể có còn hoạt tính không?

?

HOẠT HÓA BỀ MẶT MNPs

THỬ NGHIỆM GẮN STREPTAVIDIN, ĐO BẰNG

PHƯƠNG PHÁP UV-VIS

Kiểm tra độ tin cậy của phương pháp

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.000

0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400

1.600

f(x) = 3.44x - 0.01 R² = 1

THỬ NGHIỆM GẮN STREPTAVIDIN, ĐO BẰNG

Thu dịch hút

Giá trị OD của dịch rửa cao hơn so với dịch ban đầu, delta OD âm => ở dịch rửa

có các tạp chất protein khác ngoài streptavidin

Stop solution TMB

OD

450 nm

THỬ NGHIỆM GẮN STREPTAVIDIN- HRP, ĐO BẰNG PHƯƠNG PHÁP

DỰA TRÊN SỰ THAY ĐỔI MÀU CỦA CƠ CHÁT TMB

THỬ NGHIỆM GẮN STREPTAVIDIN, ĐO BẰNG PHƯƠNG

PHÁP DỰA TRÊN SỰ THAY ĐỔI MÀU CỦA CƠ CHÁT TMB

Mẫu Mẫu đối chứng (MNPs-

Streptavidin-HRP, t o = 100 0 C, 5 phút)

Mẫu thử nghiệm (MNPs- Streptavidin-HRP)

KHÁNG THỂ CÓ GẮN LÊN MNPs?

Stop solution TMB

OD

450 nm

Giá trị OD tăng dần khi lượng kháng thể tăng dần

KHÁNG THỂ CÓ HOẠT TÍNH?

Giá trị OD biến thiên nhưng không tuyến tính với nồng độ kháng nguyên Vì:

• Lượng kháng thể đưa vào không đủ để bắt giữ kháng nguyên

• Mất kháng thể trong quá trình rửa

KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ TỐI ƯU CỦA KHÁNG THỂ

Nồng độ

KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ TỐI ƯU CỦA KHÁNG THỂ

- Có 2 trường hợp có thể xảy ra:

• Kháng thể gắn lên hạt nano sắt từ một phần đã bị mất hoạt tính

• Kháng thể gắn lên hạt nano không nhiều

Y Y Y

Stop solution TMB

KHẢO SÁT LƯỢNG KHÁNG THỂ CỐ ĐỊNH LÊN

MNPs

0 0.5 1 1.5 2

2.5

Lượng kháng thể còn hoạt tính Lượng đã kháng thể gắn lên MNPs Kháng thể tự do

• Tối ưu hóa quy trình sử dụng APTES- GA

• Thử nghiệm phương pháp hoạt hóa bề mặt mới

THỬ NGHIỆM GẮN STREPTAVIDIN, ĐO BẰNG

PHƯƠNG PHÁP UV-VIS

Kết quả: Các giá trị thu được đều âm (delta OD của dịch rửa và dịch hút cao hơn dịch ban đầu đưa vào) chứng tỏ trong dịch rửa có các protein khác ngoài streptavidin làm cho kết quả không chính xác.

Mẫu Streptavidin ban

đầu Streptavidin dịch rửa

Stop solution TMB + H2O2

OD 450 nm

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG “BẮT CHƯỚC” ENZYME

PEROXYDASE CỦA MNPs

f(x) = 0.06x + 0.07 R² = 0.98

XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG THỂ DỰA VÀO KHẢ NĂNG

“BẮT CHƯỚC” ENZYME PEROXYDASE CỦA MNPs

Stop solution TMB + H2O2

CÔNG THỨC CÁC CHẤT SỬ DỤNG TRONG BÀI

APTES: (3-Aminopropyl) triethoxysilane

GLUTARALDEHYDE :

SMCC: 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexanecarboxylic

acid N-hydroxysuccinimide ester

CÔNG THỨC CÁC CHẤT SỬ DỤNG TRONG BÀI

NI-NTA: Nickel nitrilotriacetic

Axit Nitrilotriacetic:

CÔNG THỨC CÁC CHẤT SỬ DỤNG TRONG BÀI

CÁC PHƯƠNG PHÁP GẮN KẾT KHÁNG THỂ LIÊN KẾT VỚI MNPs THEO XING - Y

CÁC PHƯƠNG PHÁP GẮN KẾT KHÁNG THỂ LIÊN KẾT VỚI MNPs THEO XING - Y