Trình bày con đường lan truyền và xâm nhập vào cơ thể thực vật của nấm, vi khuẩn và virus gây hại thực vật? Ưu và nhược điểm của chế phẩm bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ vi sinh vật? Trình bày tiêu chí để sản xuất chế phẩm sinh học. Cho biết những biện pháp có thể sử dụng được để khắc phục những nhược điểm này?
Trang 1ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG BẢO VỆ
THỰC VẬT
Câu 1: Trình bày con đường lan truyền và xâm nhập vào cơ thể thực vật của nấm, vi khuẩn và virus gây hại thực vật?
N m gây b nh h i cây tr ng: ấ ệ ạ ồ có 2 lo i n m th t (fungi) và vi sinh v tạ ấ ậ ậ
gi ng n m (các lo i tác nhân gây b nh số ấ ạ ệ ương mai)=> có đ c đi m hìnhặ ể thái và tính ch t gây b nh cây r t gi ng nhau.ấ ệ ấ ố
C u t o c a n m: ấ ạ ủ ấ
- Là loại vi sinh vật nhân thật (Karyote)
- Tế bào có nhân thật (hạch nhân và màng nhân)
- Tế bào sợi nấm có vách tế bào, nhân; tế bào chất có không bào và các bào quan
- Cấu tạo vách tế bào của nấm và các vi sinh vật giống nấm khác nhau:
Nấm thật: vách tế bào gồm 1 lớp chitin (là các chuỗi N-acetyl-D glucosamine
không phân nhánh), 1 lớp β-1,3-glucan và 1 lớp mannoproteins (glycoprotein chứa đường mannose)
VSV giống nấm (vd các nấm sương mai): vách tế bào không có chitin nhưng
được cấu tạo bởi cellulose và glucan
- Phần lớn nấm có cơ quan sinh trưởng dạng sợi Các sợi nấm đơn (hyphae) tập hợp thành tản nấm (mycelium)
- Sợi nấm có thể đa bào hoặc đơn bào; chỉ trừ một vài loại nấm cổ sinh có dạng nguyên sinh bào plasmodium
- Không có diệp lục, cơ thể dị dưỡng
- Sinh sản tạo ra bào tử
Quá trính xâm nhi m c a n m và vai trò c a ngo i c nh: ễ ủ ấ ủ ạ ả
Quá trình xâm nhiễm của nấm thường bắt đầu từ bào tử Qúa trình xâm nhiễm của bào tử nấm bao gồm:
- Tiếp xúc bề mặt ký chủ
- Bào tử nảy mầm
- Xâm nhập
- Thiết lập quan hệ ký sinh ký chủ
Khi tiếp xúc với bề mặt ký chủ, nếu gặp điều kiện thuận lợi( nhiệt độ, độ ẩm,
có sự tương hợp ký sinh- ký chủ), bào tử nấm nảy mầm thành ống mầm để xâm nhập vào mô cây
- Qua lỗ mở tự nhiên như khí khổng, thủy khổng( Bào tử nấm Cercospora, gỉ sắt)
- Xâm nhập trực tiếp: ống mầm sẽ hình thành mật cấu trúc đặc biệt gọi là giác bám( vòi
bám, vòi áp) và tạo ra tiếp vòi xâm nhập để xuyên qua bề mặt ký chủ ( nấm Phytophthora)
- Xâm nhập qua vết thương cơ giới, các vết nứt tự nhiên giữa rễ bên và rễ chính ( nấm Fusarium)
Sau khi xâm nhập vào được bên trong, nấm phải thiết lập được mối quan hệ ký
sinh với cây ký chủ => quá trình này phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh
Độ ẩm: thông thường là bào tử nấm nảy mầm khi độ ẩm cao( nấm
Trang 2sương mai) Độ ẩm thấp như nấm phấn trắng.
Nhiệt độ: ảnh hưởng tới tốc độ của quá trình xâm nhiễm, tới tỷ lệ nảy
mầm của bào tử và tới kiểu nảy mầm của bào tử
VD: bệnh mốc sương mai ở cà chua ( 20-220C nảy mầm trực tiếp thành ống mầm, 14-180C nảy mầm gián tiếp thành bào tử động)
Oxy: Hầu hết đều đòi hỏi oxy đầy đủ
Ánh sáng: ít có ảnh hưởng.
pH:Ảnh hưởng lớn tới quá trình lây bệnh.
Cơ chế bảo vệ của cây: Cấu tạo của cây ký chủ như: độ dày lớp biểu
bì, lớp sáp trên mặt biểu bì, kích thước và số lượng khí khổng,thay đổi
pH của tế bào, sản sinh ra các hợp chất hóa học có tác dụng chống nấm )
Dinh d ưỡ ng ký sinh c a n m: ủ ấ
Khi đã hoàn thành quá trình xâm nh p qua b m t ký ch và thi tậ ề ặ ủ ế
l p m i quan h ký sinh, n m ti n hành phân h y c u trúc t bào và cácậ ố ệ ấ ế ủ ấ ế
h p ch t h u c khó tan thành d tan đ h p th ch t dinh dợ ấ ữ ơ ễ ể ấ ụ ấ ưỡng c nầ thi t Đ th c hi n quá trình này n m ti t ra enzyme, ch t đi u hòa sinhế ể ự ệ ấ ế ấ ề
trưởng và đ c t ộ ố
Enzyme:
- Enzyme phân hủy vách tế bào như: Cellulase, hemicellulase, pectinase, ligninase, để phân hủy cellulose, pectin, lignin
- Enzyme phân hủy các hợp chất hữu cơ của tế bào: Protease, peptidase, amylase, maltase, để phân hủy protein, các hợp chất carbonhydrate và chất béo
Độc tố: Nấm tiết ra độc tố để tahy đổi tính thấm của màng tế bào, kích thích
sinh trưởng không bình thường và kìm hãm hoạt động của các enzyme của các
tế bào thực vật VD: tentoxin( của nấm Alternaria altenata) ức chế sự phát
triển của lục lạp tạo ra triệu chứng biến vàng
Sự lan truyền của nấm:
Chủ động: bào tử hữu tính từ quả thể đĩa, quả thể bầu tự phóng av2o không
khí
Bị động:
Mưa làm bắn các bào tử vào không khí
Gió bão đưa các bào tử đi xa
Côn trùng
Các yếu tố khác( đất, hạt giống, cây giống, )
Một số ví dụ về nấm hại cây trồng:
1 Phytophthora infestans( bệnh mốc sương mai cà chua): gây hại ở tất cả
các bộ phận của cây( có nhiều vết đốm, lan rộng, )
Biện pháp phòng trừ:
- Biện pháp canh tác: chọn nơi đất tốt + Bón phân cân đối
+ Giống sạch bệnh
- Biện pháp sinh học: Phun nấm đối kháng Tricoderma -Biện pháp hóa học: Zinep 80Wp
2 Fusarium oxysporum( héo Fusarium cà chua): Biến vàng cả cây cà chua
Trang 3 Biện pháp phòng trừ:
- Biện pháp canh tác:
+ Luân canh cây trồng khác họ Tưới tiêu hợp lý + Bón vôi trước khi trồng, bón phân hữu cơ
+ Tránh tạo vết thương cho cây + Nhổ bỏ cây bệnh
- Biện pháp sinh học: Phun nấm đối kháng Tricoderma.
Hiện nay, người ta sử dụng nhiều biện pháp để trừ nấm gây hại cây trồng:
hóa học, sinh học…Tuy nhiên biện pháp sinh học vẫn ưu tiên khuyến khích được sử dụng hơn: dùng nấm đối kháng kháng lại nấm bệnh
Muốn kháng lại nấm bệnh thì nấm đối kháng phải có enzyme chitinase, B-1,3-glucanase, protease đặc biệt enzyme chitinase phải mạnh Đối với các loại vi sinh vật giống nấm gây hại cây trồng thì nấm đối kháng phải có enzyme cellulose mạnh
☺ Cơ chế đối kháng nấm bệnh:
+ Ký sinh:
Tiếp xúc với bề mặt nấm tạo giác bám
Tiết enzyme: chitinase, glucanase, protease, cellulase….phá hủy vách tế bào
Tấn công vào tế bào chất phá hủy chất nguyên sinh nấm chủ và sinh trưởng trong đó làm nấm chủ teo lại và chết
+Tiết kháng sinh: độc tố ức chế khả năng hình thành sợi nấm của nấm bệnh +Cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống.
(Ngoài ra, 1 số nấm đối kháng còn tiết ra chất kích thích sinh trưởng: IAA, Gibberellin… giúp cây phát triển tăng sức đề kháng chống lại sự tấn công của nấm bệnh.)
Vi khu n gây b nh h i cây tr ng: ẩ ệ ạ ồ
Có 2 nhóm là vi khu n th c ( bacteria) và d ch khu n bào( mollicus).ẩ ự ị ẩ Mollicus g m 2 lo i: Phytoplasma ( không nuôi c y trên môi trồ ạ ấ ường nhân t o) vàạ Spiroplasma ( nuôi c y trên môi trấ ường nhân t o)ạ
C u t o c a vi khu n: ấ ạ ủ ẩ
-Đa s vi khu n có hình g y, 2 đ u tù, kích thố ẩ ậ ầ ước nh , cũng có loài có t bàoỏ ế
d ng s i Ph n l n vi khu n gây b nh đ u có lông roi và h u h đ u là gram dạ ợ ầ ớ ẩ ệ ề ầ ế ề ương
-T bào vi khu n có c u t o g m vách t bào, t bào ch t và nhân.ế ẩ ấ ạ ồ ế ế ấ
Dinh d ưỡ ng và c ch gây b nh: ơ ế ệ
- Dinh d ưỡ ng: VSV ho i sinh có đi u ki n ạ ề ệ ( có th nuôi c y trên mt nhân t o) vàể ấ ạ
Vk bi t d ệ ưỡ ( không th nuôi c y trên môi tr ng ể ấ ường nhân t o)ạ
- C ch gây b nh: ơ ế ệ nh m t h th ng enzyme và đ c t phong phú.ờ ộ ệ ố ộ ố
Enzyme :Vi khu n không xâm nh p vào trong t bào cây nh ngẩ ậ ế ư chúng ti t ra nhi u enzyme đ phân h y t bào th c v t và h p thế ề ể ủ ế ự ậ ấ ụ dinh dưỡng wa màng
Đ c t ộ ố : phá h y h th ng enzyme c a t bào cây ch , đ ng th iủ ệ ố ủ ế ủ ồ ờ cũng phá h y ch c năng sinh lý và trao đ i ch t c a t bào cây Có 2ủ ứ ổ ấ ủ ế nhóm: pathotoxin và vivotoxintamine
Trang 4 Xâm nhi m: ễ
Vi khu n xâm nh pẩ ậ vào cây hoàn toàn th đ ng:ụ ộ -Các v t thế ương xây xát
-Các l m t nhiên( th y kh ng, khí kh ng, )ỗ ở ự ủ ổ ổ
- Qua b u nh y và m t s ít thông qua vecto côn trùng.ầ ụ ộ ố
Lan truy n: ề -Lan truy n nh gió, không khí, nề ờ ước
-Lan truy n nh h t gi ng, cây gi ngề ờ ạ ố ố
-Lan truy n nh côn trùng và các đ ng v t khácề ờ ộ ậ
- Lan truy n qua d ng c và các ho t đ ng c a con ngề ụ ụ ạ ộ ủ ười
Virus gây b nh cây tr ng: ệ ồ
Đ c đi m hình thái: ặ ể
Virus có kích thướ ấc r t nh và có c u t o đ n gi n g m: lõi acid nucleic đỏ ấ ạ ơ ả ồ ược bao b c b ng m t v protein Vi rus khá đa d ng v hình thái( hình s i, hình g y,ọ ằ ộ ỏ ạ ề ợ ậ hình nh ng, )ộ
C ch gây b nh: ơ ế ệ nh 2 quá trìnhờ
- S d ng v t li u c a t bào cây đ sinh s nử ụ ậ ệ ủ ế ể ả
- Các s n ph m protein c a virus tả ẩ ủ ương tác v i các thành ph n c a tớ ầ ủ ế bào cây làm r i lo n ch c năng sinh lý c a t bào cây và gây ra tri uố ạ ứ ủ ế ệ
ch ng.ứ
Xâm nhi m: ễ -Qua v t thế ương c gi i: c xát t o v t thơ ớ ọ ạ ế ương
-Qua môi gi iớ
Lan truy n: ề
- Lan truy n c h c: ti p xúc, c xát, chi t, ghép, va ch mề ơ ọ ế ọ ế ạ
- Lan truy n qua v t li u gi ng: h t gi ng, ề ậ ệ ố ạ ố
- Lan truy n qua môi gi i( vect truy n b nh)ề ớ ơ ề ệ
Câu 2: Ưu và nhược điểm của chế phẩm bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ vi sinh vật? Trình bày tiêu chí để sản xuất chế phẩm sinh học Cho biết những biện pháp có thể sử dụng được để khắc phục những nhược điểm này?
Ưu điểm:
a) Trước hết các tác nhân sinh học trong phòng chống các loài gây hại
phần lớn có tính chuyên hóa cao
Ví dụ: vi khuẩn Bt chỉ có tác dụng trong ruột côn trùng có pH cao.
Virus NPV chí có tác dụng trong một loài sâu ký chủ nhất định
b) Các chế phẩm sinh học không gây nhiễm bẩn môi trường, không gây tác động
Trang 5có hại đến người và động vật máu nóng
c) Các chế phẩm sinh học hầu như không gây tác động tiêu cực với cây và có thể
sử dụng bất cứ giai đoạn phát triển nào của cây.
d) Thời tồn lưu của các chế phẩm sinh học trên đồng ruộng thấp
e) Chế phẩm sinh học không tạo nên tính quen và tính kháng của các loài sinh vật bị tác động.
Nh ượ c đi m: ể Tác đ ng ch m, b gi m hi u l c do nh hộ ậ ị ả ệ ự ả ưởng các y u t môiế ố
trường, khó b n qu n và khó s d ng h n thu c hóa h c.ả ả ử ụ ơ ố ọ
Tiêu chí đ t o ch ph m sinh h c: ể ạ ế ẩ ọ
- Gi đữ ược ho t tính c a tác nhân sinh h c trong quá trình s d ng và b oạ ủ ọ ử ụ ả
qu n.ả
- B o v đả ệ ược tác nhân dưới tác tác đ ng c a đi u ki n môi trộ ủ ề ệ ường
- An toàn trong s n xu t và s d ngả ấ ử ụ
- Ti n l i cho ngệ ợ ườ ử ụi s d ng
- D v n chuy nễ ậ ể
- Cho hi u l c di t đ i tệ ự ệ ố ượng c n di t cao.ầ ệ
Bi n pháp kh c ph c: ệ ắ ụ
- Xác đ nh th i đi m phun h p lý: khi sâu còn nh và lúc chi u mátị ờ ể ợ ỏ ề
- Cách phun: phun nhi u nề ước, rãi đ u trên cây, c n th n khi ph i tr nề ẩ ậ ố ộ
v i các lo i thu c khácớ ạ ố
- Ph i tr n v i ph gia và ch t mang đ tăng cố ộ ớ ụ ấ ể ường hi u l c và gi m tácệ ự ả
h i c a tia c c tím.ạ ủ ự
Câu 3: Cơ chế của thuốc trừ sâu?
Cấu tạo da côn trùng: gồm có 3 lớp chính:
a) Lớp biểu bì: lớp ngoài cùng có cấu tạo chitin, protein và sắc tố
Biểu bì của côn trùng được phân thành :
- Biểu bì trên (epicuticle): Biểu bì trên cấu tạo chủ yếu từ lipit, protein biến tính
và không có chitin
Trang 6- Biểu bì dưới (procuticle) : Thực chất là một tổ hợp chitin- protein ưa nước.
b) Lớp tế bào nội bì: nằm phía dưới lớp biểu bì và tiết ra các chất tạo nên lớp biểu bì
c) Màng đáy: là một lớp màng mỏng không có cấu tạo tế bào, nằm sát ngay dưới lớp
tế bào nội bì
Cơ chế trừ sâu: có 2 con đường
+ Tiếp xúc: vi nấm, tuyến trùng
+ Vị độc (tiêu hóa): virus, vi khuẩn
Cơ chế tác động lên côn trùng của vi nấm
- Con đường xâm nhập của nấm vào cơ thể côn trùng là tiếp xúc (qua da)
- Côn trùng bị chết là do kết quả của sự phối hợp hoạt động của nấm như: làm giảm dinh dưỡng, xâm lân các cơ quan trong cơ thể và tác động của nội độc tố
- Cơ chế tiêu diệt sâu:
+ Phá hủy lớp da của côn trùng: Khi bào tử nấm rơi vào cơ thể côn trùng, gặp điều kiện
thích hợp, chỉ sau 24-48 h thì bào tử sẽ nảy mầm và xâm nhập vào lớp biểu bì ngoài.Khi tiến tới lớp biểu bì dưới, đỉnh của đĩa bám phình ra để hình thành các phiến xâm nhiễm Các phiến xâm nhiễm phát triển và đâm xuyên qua lớp biểu bì và tiến vào bên dưới lớp da Bào tử nấm xâm nhập được vào lớp biểu bì côn trùng được là nhà sự phối hợp giữa enzyme phân hủy biểu
bì và áp lực cơ giới Đầu tiên các enzyme phân hủy gồm: enzyme protease, lipase và chitinase, làm mềm lớp sáp ở biểu trên và tạo thành các lỗ thủng chung quanh vòi xâm nhiễm giúp cho ống mầm xâm nhập vào bên trong khoang ruột của tế bào máu kí chủ Tùy theo cấu tạo lớp da côn trùng và từng chủng nấm ký sinh àm enzyme tiết ra khác nhau Enzyme protease đóng vai trò quan trọng quyết định tinh thể độc của nấm
+ Tiết độc tố gây chết côn trùng: Sau khi xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng, nấm
phát triển tạo ra nhiều sợi ngắn, phân tán khắp theo cơ thể dịch máu Trước khi phát triển trong máu, nấm phải vượt qua sự phòng vệ của côn trùng bằng cách tiết ra độc tố
-Tiêu chí lựa chọn các chủng nấm kí sinh:
+ Sinh trưởng mạnh
+ Có khả năng sinh các enzyme: protease, chitinase và lipase
+ Có khả năng sinh độc tố gây chết côn trùng
+ An toàn sinh học: không gây ô nhiễm môi trường, không gây hại đến người và các sinh vật khác
+ Quá trình sản xuất đơn giản; dễ sản xuất, thu hoạch và bảo quản, khả năng sống sót cao và thời gian sống dài
Trang 71.Cơ chế diệt sâu của NPV (virus)
- Con đường xâm nhập: qua đường tiêu hóa
- Cơ chế tiêu diệt sâu: Khi sâu non ăn thức ăn vào ruột có chứa virus (NPV) lẫn với thức ăn, các thể bao hàm PIB của virus sẽ đi vào ruột giữa của côn trùng và sẽ bị phân giải dưới tác động của điều kiện môi trường kiềm (pH 9-11) Ở ruột giữa, các thể bao hàm sẽ bị sẽ bị hòa tan để giải phóng ra các virion Các virion này đi vào các tế bào ruột giữa Ở đây chúng sử dụng bộ máy của tế bào vật chủ thực hiện quá trình sao chép, phiên mã và tạo ra các virion mới Từ đó, các virion mới sẽ tiếp tục tấn công sang các tế bào khác của cơ thể như huyết tương, ống tiêu hóa, biểu bì Trong các tế bào này, xảy ra quá trình hình thành lớp vỏ protein, bao bọc các virion để tạo thành hang triệu các thể bao hàm (PIB) và cũng là lúc toàn bô cơ thể sâu đã bị phá hủy và sâu non bị chết Các thể bao hàm giải phóng ra bên ngoài để lây nhiễm cho các cá thể khác
2.Cơ chế tác động của vi khuẩn lên côn trùng (Bt)
- Con đường xâm nhập: qua đường tiêu hóa, tác động đường ruột, đường nhiễm trùng
- Nơi phá hủy của vi khuẩn: ruột giữa của côn trùng
- Yếu tố chính gây chết sâu: tinh thể nội độc tố
- Cơ chế tiêu diệt sâu: Tinh thể độc cùng với bào tử xâm nhập vào cơ thể sâu bằng con đường tiêu hóa khi sâu ăn phải thức ăn chứa vi khuẩn Trong điều kiện bình thường, tinh thể độc không bị hòa tan, khi đi vào ruột giữa của sâu, nơi có pH kiềm (9-11) tinh thể độc bị hòa tan tạo thành tiền độc tố Dưới tác dụng của enzyme protease trong ruột giữa, tiền độc tố này được hoạt hóa thành dạng hoạt tính độ tố σ Độc tố này liên kết với tế bào biểu mô thành ruột, đâm qua màng tạo thành lỗ thủng xuyên màng, làm mất cân bằng ion nội bào của tế bào biểu mô và làm cho chúng bị phân giải, sâu ngừng ăn và bị chết Lúc này pH trong ruột giảm xuống bằng với pH trong huyết tương, tạo điều kiện cho bào tử nảy mầm và sinhs ản xâm chiếm vật chủ
3 Cơ chế tác động của vi khuẩn đối kháng
- Cạnh tranh các yếu tố dinh dưỡng như C, N, O2 và nhiều nguyên tố khác
- Một số vi khuẩn đối kháng có thể sản sinh ra cyanide, làm tăng tính chống chịu của cây, sản sinh ra các chất kích thích sinh trưởng và có khả năng phân giải độc tố do vi sinh vật gây bệnh tiết ra
- Có khả năng cạnh tranh, chiếm chỗ ở vùng rễ của cây trồng
- Có khả năng phòng chống nhiều loại vi sinh vật gây bệnh cây chủ yếu Ngoài ra, vi khuẩn đối kháng còn có khả năng chống lại nhiều vi sinh vật thứ yếu hại cây
4 Cơ chế tác động của nấm đối kháng Trichoderma
Trang 8- Cơ chế kí sinh: Hiện tượng “giao thoa sợi nấm” Trước tiên, sợi nấm Trichoderma vây xung
quanh sợi nấm gây bệnh cây, sau đó các sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm bệnh Cuối cùng nấm Trichoderma xuyên qua sợi nấm bệnh làm thủng màng ngoài của nấm bệnh, gây nên sự phân hủy các chất nguyên sinh trong sợi nấm bệnh Nguyên sinh chất bị mất đi và sợi nấm vật chủ bị phá vỡ, giải phóng các sợi nấm đang sinh sản của nấm Trichoderma Điều quan trọng cho sự kí sinh của nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh là các conidi của nấm Trichoderma sau khi mọc mầm tạo thành sợi nấm phải tiếp xúc với được với vật chủ và phải hình thành giác bám Thể giác bám này sẽ bám chắc và xâm nhập vào trong thành tế bào của nấm vật chủ
- Cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống: Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn C, N
và các yếu tố tăng trưởng khác Nấm Trichoderma có khả năng cạnh tranh, sử dụng những mô già và mô chết của cây làm nguồn dinh dưỡng từ đó cạnh tranh và triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm bệnh Không những thế nó còn cạnh tranh dịch tiết của cây, làm giảm sự nảy mầm bào tử của nấm bệnh Trichoderma còn đối kháng với các nấm gậy bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh
- Khả năng kích thích sinh trưởng thực vật: Trichoderma tác động trực tiếp lên vùng rễ,
loại bỏ các tác nhân gây bệnh tiềm ẩn trong đât, kích thích cơ chế tự bảo vệ của thực vật chống lại virus, vi khuẩn, nấm Nấm Trichoderma còn có tác dụng tạo điều kiện tốt cho VSV
cố định đam trong phát triển trong đất, kích thích sự tăng trưởng và phục hồi bộ rễ, đồng thời
có khả năng phân giải chất xơ, ligin, chitin… trong các phế thải hữu cơ thành các chất dinh dưỡng tạo điều kiện cho cây trồng hấp thụ
5 Quy trình sản xuất chế phẩm Trichoderma
Thu sinh khối, hong khô, đóng gói
Tăng sinh khối trong điều kiện nhiệt độ
22-280C trong vòng 8-10 ngày
Chuẩn bị môi trường nhân sinh khối (hạt thóc lửng đã hấp vô trùng ở nhiệt độ 1210C) Nhân giống cấp 1 ( môi trường PDA)
Giống thuần
Trang 9- Phân lập nguồn nấm: Nấm Trichoderma có thể được phân lập từ đất ở những vùng có mầm bệnh gây hại
- Tuyển chọn: chọn những chủng có khả năng sinh trưởng nhanh, đối kháng tốt với nấm gây bệnh cây trồng
- Nhân giống cấp 1: trên đĩa petri (môi trường PGA) và thu nhận bào tử sau 7 ngày nuôi cấy
- Chuẩn bị môi trường và nhân sinh khối: Có thể nhân nuôi nấm Trichoderma trên một số nguồn cơ chất như: cám, trấu, thóc, bắp xay nhỏ…Nguồn nguyên liệu này được hấp khử trùng
ở nhiệt độ 1210C trong 45 phút Để nguội môi trường đến khoảng 25-300C thì tiến hành lấy khoanh thạch từ đĩa môi trường nhân giống cấp 1 cho vào và ủ ở 25-300C
Chú ý: thường xuyên theo dõi nguồn giống gốc trở lại môi trường của nấm bệnh sau đó phân lập trở lại để giữ được hoạt tính của nấm
- Tạo chế phẩm: sinh khối nâm sau khi thu được đem hong khô ở 30-400C, sau đó đem trộn với chất mang (bột talt, cao lanh) với tỉ lệ thích hợp
- Bảo quản: đóng gói kín bằng túi nilon, bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát trong 6 tháng
* Yếu tố ảnh hưởng đến nấm Trichoderma
- Nguồn cơ chất: môi trường PDA là tốt nhất để sử dụng nhân giống, có thể sử dụng nhiều loại
cơ chất (cám, trấu, lúa nấu chin, bắp…)
- Nguổn C: nấm Trichoderma có thể sử dụng cả đường đơn, đường đôi và đường đa (glucose, maltose, fructose…), lượng bào tử đạt cao nhất khi bổ sung sucrose
- Nhiệt độ, ánh sáng: nhiệt độ thích hợp trong khoảng 25-300C, phần lớn các loài Trichoderma
có thể này mầm dưới điều kiện sang tối lẫn lộn hoặc chiếu sang hoàn toàn
- Nồng độ oxy: Trichoderma là sinh vật hiếu khí, tuy nhiên chúng có thể tồn tại trong điều kiện nồng độ oxy thấp
- pH: Trichoderma có khoảng chịu đựng pH khá rộng, trong khoảng pH từ 2-6, phát triển tối
ưu ở pH 4
6 Quy trình sản xuất NPV trong điều kiện invivo
* Thuyết minh
a Nhân nuôi sâu số lượng lớn
- Nguồn sâu giống đầu tiên được bắt từ ngoài đồng trên những cánh đồng không phun thuốc
và được nhân nuôi trong phòng
Trang 10- Sâu non sau khi hóa nhộng sẽ được thu nhận, xử lí rồi cho vào trong hộp có chứa bông ẩm.
Để hạn chế sự lây nhiễm NPV trong quá trình nuôi, nên xử lí với formalin 1% trong 5 phút Nên tách riêng nhộng cái và nhộng đực để sau khi vũ hóa dễ thu nhận và ghép cặp
- Sau 7-10 ngày, nhộng vũ hóa trưởng thành, tiến hành ghép cặp ngay, thường tỉ lệ đực cái thích hợp là 2:3 hoặc 3:4
- Thức ăn cho sâu trưởng thành: đường 5g, methyl paraben 1g, cồn tuyệt đối 1ml, vitamin tổng hợp 10 ml, nước cất 500 ml
- Sau 1-2 ngày, sâu trưởng thành cái sẽ đẻ trứng Trứng được thu nhận và để riêng từng ngày Trứng sâu thường nở vào ban đêm Để sâu nở ra có thức ăn ngay, nên cho trứng vào hộp thức
ăn trước khi nở vài giờ
- Sâu kí chủ được nuôi bằng thức ăn nhân tạo, bảo đảm cho chúng sinh trưởng và phát triển bình thường Nuôi sâu bằng thức ăn nhân tạo sẽ hạn chế được sự lây nhiễm, tán công của các yếu tố tự nhiên gây chết sâu thông qua nguồn thức ăn tự nhiện
b Nhiễm virus cho sâu kí chủ
- Sau khi sâu kí chủ đạt 4 tuổi thích hợp nhất để sản xuất virus Quá trình sản xuất virus trong sâu kí chủ được bắt đầu tử việc cho sâu ăn thức ăn đã bị phơi nhiễm virus:
1 Cho virus lên bề mặt thức ăn và dung chổi lông đã khử trùng trải đều dịch lên bề mặt thức ăn
2 Cho sâu ăn thức ăn đã nhiễm virus trong vòng 24-48 h ở 260C
3 Chuyển sau sang thức ăn mới không nhiễm virus và ủ ở 260C, theo dõi hang nagy2 cho đến khi sâu chết
4 Thu sâu chết trước khi cơ thể sâu bị vỡ và cất đông lạnh ở nhiệt độ -200C cho đến khi đồng nhất và lọc
c Tạo chế phẩm
NPV có thể sản xuất ở cả dạng bột và dạng nước:
- Chất mang: thường sử dụng trong trường hợp tạo dạng bột thấm nước Một số loại chất mang được sử dụng như cao lanh, bột mì, bột bắp Trong đó cao lanh được sử dụng phổ biến
vì giá thành rẻ và không gây ảnh hưởng đến hoạt lực diệt sâu của virus
- Phụ gia: phụ gia để tạo chế phẩm dạng nước thường là các chất tạo sức căng bề mặt hoặc các chất chống tia UV, ngoài ra còn bổ sung một sô loại thuốc sâu thảo mộc hoặc acid boric
d Bảo quản virus
- Bảo quản nguồn virus: virus có thể bảo quản ở 2 dạng li tâm và không li tâm Bảo quản