Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ để chẩn đoán ung thư vú

Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ để chẩn đoán ung thư vú.ung thư vú dần trở thành một trong hai loại ung thư phổ biến nhất và gây tử vong nhiều nhất ở phụ nữ, tương tự như ung thư tiền liệt tuyến ở nam giới.

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, ngoài những kiến thức đã được học

và tích lũy trong 5 năm qua, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến

TS Lê Lý Thùy Trâm đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian làm

đồ án tốt nghiệp

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Đặng Đức Long và ThS Tạ Ngọc Ly đãđóng góp ý kiến, giúp đỡ tôi hoàn thiện đồ án tốt nghiệp này Đồng thời, tôi xin gửilời cảm ơn đến các thầy, cô giáo phụ trách phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệsinh học là KS Võ Công Tuấn và KS Phạm Thị Kim Thảo đã tạo mọi điều kiệnthuận lợi cho tôi hoàn thành tốt các thí nghiệm trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp.Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến các anh, chị ở Trường Cao đẳngLương thực Thực phẩm, Trung tâm Y tế Dự phòng cũng như Bệnh viện Ung thư ĐàNẵng đã hỗ trợ tôi trong việc sử dụng các máy móc, thiết bị liên quan đến đề tài tốtnghiệp này

Cuối cùng tôi xin cảm ơn các bạn trong nhóm sinh viên nghiên cứu ngànhCông nghệ Sinh học đã tận tình giúp đỡ và chia sẽ những kinh nghiệm hữu ích đểtôi có thể hoàn thành tốt công việc của mình

Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp, do kiến thức bản thân còn hạn hẹpnên khó tránh khỏi những hạn chế và thiếu sót Vì thế tôi rất mong sẽ nhận được ýkiến đóng góp của thầy cô, bạn bè để đồ án của tôi có thể được hoàn chỉnh hơn.Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ tận tình, quý báu của thầy

cô và bạn bè

Đà Nẵng, ngày 01 tháng 06 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đinh Thị Kim Ngọc

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH VẼ

ST

6 1.6 Các cách gắn kết các phân tử sinh học với hạt nano 8

7 1.7 Gắn kết trực tiếp thông qua liên kết amine-carboxylic 10

9 1.9 Gắn kết các nhóm carbon-hydrate bị oxy hóa trên phần Fc của kháng thể 11

10 1.10 Gắn kết không hóa trị giữa hạt nano silica gắn streptavidin với các kháng thể được biotin hóa 11

11 1.11 Mô hình thiết bị cảm ứng sinh học điện từ 12

12 2.1 Cơ sở của phương pháp cố định kháng thể lên MNPs

thông qua hoạt hóa bề mặt bằng APTES – GA 14

13 2.2 Quy trình hoạt hóa bề mặt MNPs bằng APTES – GA 15

14 2.3 Quy trình gắn Streptavidin lên MNPs đo UV - VIS 17

15 2.4 Quy trình đo phản ứng màu giữa enzyme HRP và cơ chất

16 2.5 Kiểm tra sự hiện diện của kháng thể sau khi gắn lên MNPs 19

17 2.6 Quy trình khảo sát sự hiện diện của kháng thể lên MNPs 20

18 2.7 Quy trình xác định hoạt tính kháng thể sau khi cố định lên

19 2.8 Hình minh họa phương pháp xác định hoạt tính kháng thể tự do 22

20 2.9 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học của kháng thể tự do 23

21 2.10 Quy trình khảo sát hoạt tính sinh học của kháng thể cố định 24

22 2.11 Quy trình khảo sát lượng kháng thể gắn lên MNPs 25

23 2.12 Quy trình khảo sát khả năng bắt chước enzyme peroxydase

24 2.13 Quy trình khảo sát hoạt tính kháng thể dựa trên khả năng bắt chước enzyme peroxydase của MNPs 27

25 3.1 Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa giá trị OD280nm với

26 3.2 Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs 33

27 3.3 Biến thiên giá trị OD450nm theo nồng độ kháng nguyên 34

28 3.4 So sánh hoạt tính của kháng thể tự do và kháng thể cố định 37

29 3.5 Kiểm tra hoạt tính của kháng thể sau khi gắn lên MNPs 38

30 3.6 Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs 40

DANH MỤC BẢNG BIỂU

ST

1 3.1 Biến thiên giá trị OD280nm theo nồng độ Streptavidin 30

2 3.2 Giá trị OD450nm giữa mẫu đối chứng và mẫu thử nghiệm 32

3 3.3 Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs 33

4 3.4 Biến thiên giá trị OD450nm theo nồng độ kháng nguyên 34

5 3.5 Biến thiên Delta OD450nm theo nồng độ kháng thể tự do 36

6 3.6 Biến thiên Delta OD450nm theo nồng độ kháng thể cố định 36

7 3.7 So sánh Delta OD450nm của kháng thể tự do và cố định ở

8 3.8 Biến thiên Delta OD450nm theo nồng độ kháng thể trong

9 3.9 Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng MNPs 39

10 3.10 Biến thiên giá trị OD450nm theo lượng nồng độ kháng thể 41

MES 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid monohydrate

MNPs Magnetic nanoparticles (Hạt nano sắt từ)

OD Optical Density

PBS Đệm Phosphate pH = 7.4

SMCC Succinimidyl-4-( N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylateTMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine

TÓM TẮT

Công nghệ sinh học cũng như công nghệ nano đều đóng vai trò quan trọngtrong nhiều lĩnh vực liên quan đến sự phát triển khoa học, xã hội và cuộc sống, đặcbiệt là trong việc cố định các phân tử sinh học như acid nucleic, enzyme hay khángthể, lên hạt nano sắt từ (MNPs) để phục vụ cho mục đích chẩn đoán y sinh Trongphạm vi đề tài tốt nghiệp này, tôi khảo sát việc cố định kháng thể kháng khángnguyên HER2 lên hạt nano sắt từ nhằm chẩn đoán ung thư vú Với mục tiêu này, bềmặt hạt nano sắt từ được amin hóa bằng 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)sau đó xử lý bằng Glutaraldehyde (GA) trước khi gắn kết với kháng thể Kết quảcho thấy rằng mặc dù phương pháp này đem lại hiệu suất gắn khá cao nhưng khángthể còn rất ít hoạt tính sinh học

Từ khóa: hạt nano sắt từ; kháng nguyên HER2; kháng thể; ung thư vú.

ABSTRACT

Biotechnology and Nanotechnology play important roles in many fieldsrelated to the development of science, society and life, especially, in theimmobilization of a variety of molecules such as nucleic acid, enzymes orantibodies on ferric magnetic nanoparticles (MNPs) serving the biomedicaldiagnostic purposes In this study, we examine the immobilization of antibody anti –HER2 on ferric magnetic nanoparticles to diagnose breast cancer For this purpose,the surface of ferric magnetic nanoparticles is covered by (-NH2) group with 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) before treating with glutaraldehyde (GA) tolink to antibody The result illustrates although this method brings high performance

of the antibody anti – HER2 immobilization on ferric magnetic nanoparticles,antibody has low level of bioactivity to capture HER2 antigen

Key words: antibody; ferric magnetic nanoparticles; HER2 antigen; breast

cancer

LỜI MỞ ĐẦU

Từ những năm đầu thế kỉ 21 đến nay, ung thư vú dần trở thành một trong hailoại ung thư phổ biến nhất và gây tử vong nhiều nhất ở phụ nữ, tương tự như ungthư tiền liệt tuyến ở nam giới Trên thế giới nói chung, cũng như ở Việt Nam nóiriêng, các con số thống kê hằng năm về số lượng người mắc bệnh ung thư vú tăngnhanh ở ngưỡng rất cao, đáng báo động

HER2 là một loại thụ thể thuộc họ các yếu tố phát triển biểu mô, có hoạt tínhtyrosine kinase, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và biệt hoá tếbào Sự biểu hiện quá mức HER2 có thể biến đổi tế bào thành dạng ác tính và làmtăng quá trình hình thành khối u Theo nhiều nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30%bệnh nhân mắc ung thư vú có sự khuếch đại gen HER2 hoặc biểu hiện quá mức gennày trong các tế bào ung thư Chính điều này làm cho HER2 trở thành một trongnhững chỉ thị quan trọng trong việc chẩn đoán ung thư vú

Mặc dù ngày nay có rất nhiều phương pháp được áp dụng để sớm phát hiện vàđiều trị căn bệnh quái ác này nhưng số người chết hằng năm chỉ giảm đi một lượngrất nhỏ Nguyên nhân một phần có thể vì những khối u được phát hiện khi chúng đãhình thành, tăng kích thước và di căn Vì vậy, việc phát hiện sớm đóng vai trò rấtquan trọng trong điều trị ung thư vú Trên cơ sở này, nhóm nghiên cứu kết hợp giữa

bộ môn Công nghệ sinh học và Điện tử viễn thông của trường Đại học Bách Khoa

Đà Nẵng đã đề xuất thiết kế một thiết bị đo tín hiệu từ dựa trên hạt nano sắt từ đãđược cố định kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên HER2, nhằm tìm ra phươngpháp mới chẩn đoán sớm bệnh ung thư vú

Trong phạm vi đề tài này, tôi bước đầu khảo sát khả năng cố định kháng thểđặc hiệu với kháng nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ mà vẫn đảm bảo giữ nguyên

hoạt tính sinh học của kháng thể này Đề tài “Nghiên cứu cố định kháng thể kháng kháng nguyên HER2 lên hạt nano sắt từ để chẩn đoán ung thư vú” là

tiền đề cho việc tìm ra công cụ giúp chẩn đoán ung thư vú sớm với hy vọng giúpcác bệnh nhân sớm phát hiện để điều trị căn bệnh này một cách hiệu quả nhất

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. ag

1.1. Bệnh ung thư vú

1.1.1.Khái niệm chung về bệnh ung thư vú

Ung thư vú là một trong hai loại ung thư phổ biến và gây chết nhiều nhất ởphụ nữ, theo sau đó là ung thư cổ tử cung Thường khi về già, từ độ tuổi 40 trở đi,các tế bào bất thường hay còn gọi là tế bào ung thư vú phát sinh từ biểu mô ốngtuyến hay biểu mô của tiểu thùy Nếu không chữa trị sớm, các tế bào ung thư sẽphát triển nhanh chóng, tạo thành khối u ác tính Trong quá trình phát triển, từ khối

u đó cho ra những tế bào ung thư đi vào mạch bạch huyết, lan tới các hạch bạchhuyết Có khi tế bào ung thư đi theo các mạch máu để xâm nhập các cơ quan nộitạng (gan, phổi, óc ) hay bộ xương, dẫn đến nhiều biến chứng nguy hiểm chếtngười [2]

Theo ước tính, từ khi tế bào hình thành khối u đến khi phát hiện được khối ukhoảng 1 cm thì mất khoảng từ 7 – 8 năm nhưng khối u có kích thước từ 1 – 2 cmthì mất thời gian trung bình chỉ khoảng 4 tháng, đây là thời gian cần có sự chữa trịsớm Phụ nữ trẻ cũng có thể mắc ung thư vú, nhưng xuất độ (tần xuất, độ xảy đến)thấp hơn nhiều so với người lớn tuổi [2]

Hình 1.1 Cấu tạo bầu vú khi có tế bào ung thư [15]

Hình 1.2 Các giai đoạn phát triển bệnh ung thư vú [14]

1.1.2.Tình hình mắc bệnh ung thư vú trên thế giới và Việt Nam

Mỗi năm có khoảng 1.3 triệu người chẩn đoán mắc bệnh ung thư vú và khoảng465,000 người chết vì bệnh này Ở Mỹ, năm 2009, tỉ lệ ung thư vú ở phụ nữ là160/100,000 Ở Châu Âu, năm 2009 có khoảng 3.2 triệu trường hợp ung thư đượcchẩn đoán và trong đó 1.8 triệu trường hợp tử vong do ung thư Trong đó, loại ungthư thường gặp nhất là ung thư vú (13.5%), sau đó là ung thư đại trực tràng (12.9%)

và ung thư phổi (12.1%) [17]

Ở Việt Nam, theo ghi nhận thì tỉ lệ mắc bệnh ung thư vú có xu hướng tăngdần Ở Hà nội, năm 2001, tỉ lệ ung thư vú ở phụ nữ là 20.3/100,000 trước khi tănglên 29.7/100,000 vào giai đoạn 2008 – 2011 Ở Thành phố Hồ Chí Minh, tỉ lệ nàylần lượt tăng từ 11.7 (năm 1997); 16.1 (năm 1998); 19.2 (năm 1999) đến19.4/100,000 (năm 2003) và đến năm 2011 thì tăng lên đến mức 29.9/100,000 [17]

1.1.3.Phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh ung thư vú

Số lượng bệnh nhân mắc ung thư vú có xu hướng tăng trên toàn thế giớinhưng số ca tử vong đã từng bước giảm dần nhờ những thành tựu đạt được trongchẩn đoán và điều trị bệnh ung thư vú Một số phương pháp thông dụng trong chẩnđoán ung thư vú hiện nay bao gồm chẩn đoán lâm sàng (bệnh nhân thường xuyênkiểm tra tại nhà hoặc có thể siêu âm để cho kết quả chẩn đoán tốt hơn), chụp nhũảnh, chọc hút dịch tế bào và sinh thiết tế bào vú [13]

Đối với việc điều trị, bệnh nhân có thể được xạ trị, hóa trị hoặc kết hợp vớiphẫu thuật Tuy nhiên, các phương pháp điều trị này sẽ ảnh hưởng lên cả các cơquan bình thường xung quanh khối u nên vẫn còn nhiều hạn chế trong cuộc chiến

chống lại căn bệnh quái ác này Sau khi tiến hành hóa trị, sức đề kháng của cơ thể

có thể bị suy giảm Hơn nữa, một số trường hợp áp dụng biện pháp hóa trị làm tổnhại đến tim, gan Đó là chưa kể, các biện pháp truyền thống trong điều trị ung thưrất tốn kém Chính vì vậy mà việc chẩn đoán sớm sẽ đtôi lại một tia hy vọng rất lớncho các bệnh nhân mắc ung thư vú để họ có thể tiếp tục cuộc sống của mình [13]

Hình 1.3 Các giai đoạn phát triển bệnh ung thư vú [14]

1.2. Tổng quan về kháng nguyên HER2

1.2.1.Cấu trúc kháng nguyên HER2

HER2 (Human Epidermal growth Receptor) là một loại thụ thể thuộc họ cácyếu tố phát triển biểu mô (Human Epidermal growth Receptor, EGFR), có hoạt tínhtyrosine kinase, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và biệt hoá tếbào Cho đến nay vẫn chưa tìm thấy ligand đặc hiệu của HER2; tuy nhiên nó có thểtạo dạng nhị hợp (dimer) với chính bản thân nó hoặc với các thụ thể khác trong họ

để hình thành đồng thụ thể thúc đẩy các con đường truyền tín hiệu [2]

Sự khuếch đại gen HER2 trên nhiễm sắc thể 17 dẫn đến sự tăng biểu hiện thụthể HER2 trên bề mặt tế bào ung thư vú Sự biểu hiện quá mức HER2 có thể biếnđổi tế bào thành dạng ác tính và làm tăng quá trình hình thành khối u Theo nhiềunghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung thư vú cho thấy có sự khuếchđại gen HER2 hoặc biểu hiện quá mức gen này trong các tế bào ung thư Chính điềunày khiến HER2 trở thành một trong những chỉ thị hữu hiệu để chẩn đoán sớm cũngnhư là đích tấn công cho các liệu pháp điều trị miễn dịch [2]

Protein HER2 có khối lượng phân tử 185 kDa, gồm 3 phần chính:

- Một vùng ngoại bào giàu Cystein có chứa phần đầu (–NH2) Nằm ở vùng ngoại bàonày là một vùng lớn có khả năng gắn kết với các yếu tố tăng trưởng biểu mô.

- Vùng xuyên màng lipit

- Vùng nội bào có chứa đuôi (–COOH) có mang các gốc tyrosine được phosphorylhóa chịu trách nhiệm cho hoạt tính tyrosine kinase của thụ thể [2, 10]

Hình 1.4 Cấu trúc của protein HER2 [2]

Cấu trúc của HER2/neu: (1): Vùng ngoại bào gồm có 2 vùng liên kết với chất cảm ứng LD1, LD2 (Ligand binding regions); (2): Hai vùng giàu Cystein (CR1 và CR2); (3): Một vùng xuyên màng (TM – transmembrane); (4): Một vùng có hoạt tính tyrosine kinase (TK); (5): Một đuôi Cacboxyl (CT – Carboxyl terminal)

1.2.2.Ý nghĩa kháng nguyên HER2 trong việc chẩn đoán ung thư vú

Tất cả các tế bào biểu mô bình thường gồm hai bản sao của gen HER2 và có

số lượng thụ thể HER2 trên bề mặt tế bào là thấp nhất Trong vài trường hợp, sốlượng các bản sao của gen HER2 tăng lên dẫn đến sự phiên mã ra mARN tăng, sốlượng các thụ thể HER2 cũng tăng lên gọi là sự biểu hiện quá mức của gen HER2[2]

Sự biểu hiện quá mức của HER2 là nguyên nhân của sự tăng dimer hóa vớichính nó và các thụ thể khác (HER1, HER3), đây là tín hiệu khởi đầu cho các conđường tạo ra các tế bào ung thư khác nhau Sự tăng dimer hóa đồng hình HER2 làmmất tính phân cực của tế bào Sự tăng dimer HER2 - HER3 có ảnh hưởng tới sựtăng sinh, khả năng tồn tại, tính xâm lấn và chức năng trao đổi chất của tế bào Tăng

sự biểu hiện quá mức của HER2 dẫn tới tăng cường độ truyền tín hiệu Một vài yếu

tố phiên mã được cảm ứng trong những tế bào có sự biểu hiện quá mức HER2 là kếtquả của những sự thay đổi biểu hiện gen ở mức dư thừa [2]

1.3. Kháng thể

1.3.1.Cấu tạo chung của kháng thể

Kháng thể là các globulin có trong huyết thanh của động vật có khả năng liênkết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó Kháng thể theo định nghĩatrên còn gọi là kháng thể miễn dịch hay kháng thể đặc hiệu Kháng thể tự nhiên haycòn gọi là kháng thể không đặc hiệu, có sẵn ở trong các dịch thể trước khi tiếp xúcvới kháng nguyên như sữa, nước tiểu [3]

Tất cả các kháng thể đều có cấu trúc giống nhau, gồm một hay nhiều đơn vịhợp thành Mỗi đơn vị là một phân tử protein chứa 4 chuỗi polypeptide, 2 chuỗinặng (kí hiệu là H) và 2 chuỗi nhẹ (kí hiệu là L) Chuỗi nặng và chuỗi nhẹ được nốivới nhau bằng 1 cầu disulfide, hai chuỗi nặng được nối với nhau bởi 2 cầu disulfide[3]

Hình 1.5 Cấu trúc của kháng thể [3]

Chuỗi nhẹ: Ở tất cả các lớp globulin miễn dịch đều có hai loại chuỗi nhẹ:

kapa (κ) và lambda (λ) Mỗi phân tử Ig chỉ chứa hoặc hai chuỗi nhẹ lambda hoặchai chuỗi nhẹ kapa mà không bao giờ chứa cả hai loại Mỗi chuỗi nhẹ của Ig chứa 2vùng axit amin, 2 vùng có trật tự axit amin có thể thay đổi gọi là vùng biến đổi có kihiệu VL(variable), nằm ở phía đầu amin (-NH2) của phân tử Vùng còn lại có trật tựaxit amin không thay đổi gội là vùng hằng định kí hiệu CL(constant), nằm ở phíađầu cacboxyl (-COOH) [3]

Chuỗi nặng: có 5 loại chuỗi nặng là μ, γ, δ, α và ε ứng với 5 lớp kháng thể là

IgM, IgG, IgD, IgA và IgE Chuỗi nặng chứa 4 vùng axit amin, 1 vùng biến đổi và 3vùng cố định Cũng tương tự như ở chuỗi nhẹ, vùng biến đổi của chuỗi nặng nằm ởphần đầu amin Vùng này có kí hiệu là VH Vùng cố định nằm ở đầu cacboxyl, bavùng cố định của chuỗi nặng được kí hiệu là CH1, CH2, CH3 Hai vùng biến đổi củachuỗi nặng và chuỗi nhẹ nằm kề nhau tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên do vậyđảm bảo tính đa dạng của kháng thể [3]

1.3.2.Một số kháng thể đơn dòng sử dụng trong điều trị ung thư vú

Hiện nay trên thị trường đã có nhiều loại kháng thể được sản xuất để phòngchống bệnh ung thư vú như: muMAb, Herceptin (Trastuzumab), Lapatinib,Immunoliposomes Riêng Herceptin đã được FDA (Food and Drug Administration)chấp thuận (1998) và sử dụng lần đầu tiên kết hợp với paclitaxel trong việc điều trịung thư vú di căn dương tính với sự biểu hiện quá mức thụ thể HER2 [2]

1.4. Hạt nano sắt từ

1.4.1.Giới thiệu về hạt nano sắt từ

Ngày nay, công nghệ nano đang là một trong ba ngành công nghệ mũi nhọn rấtđược quan tâm trên thế giới, đóng vai trò rất quan trọng trong sự phát triển của khoahọc và xã hội, đặc biệt trong lĩnh vực y sinh Với các ưu điểm nổi bật như tính ổnđịnh cao khi bảo quản và đo đạc, đơn giản trong việc chế tạo nên không đòi hỏi chiphí cao cũng như quá trình rửa có thể sử dụng nam châm nên hạt nano sắt từ đangdần chiếm lĩnh các vị trí ưu thế

Hạt nano sắt từ dùng trong chẩn đoán y sinh cần phải thỏa mãn ba điều kiệnsau: tính đồng nhất của các hạt cao, từ độ bão hòa lớn và vật liệu có tính tương hợpsinh học (không có độc tính) Tính đống nhất về kích thước và tính chất liên quannhiều đến phương pháp chế tạo còn từ độ bão hòa và tính tương hợp sinh học liênquan đến bản chất của vật liệu Trong tự nhiên, sắt là vật liệu có từ độ bão hòa lớnnhất tại nhiệt độ phòng, sắt không độc đối với cơ thể người và tính ổn định khi làmviệc trong môi trường không khí nên các vật liệu như oxit sắt (Fe3O4) được nghiêncứu rất nhiều để làm hạt nano từ tính [1]

Các hạt nano từ tính có kích thước tương ứng với kích thước của các phân tửnhỏ chính vì thế mà hạt nano có thể thâm nhập vào hầu hết các cơ quan trong cơ thể

và giúp cho chúng ta có thể thao tác ở quy mô phân tử và tế bào Hơn nữa, diện tích

bề mặt lớn giúp cho các hiệu ứng xảy ra bên trên bề mặt diễn ra rất mạnh mẽ [1]

1.4.2.Các phương pháp hoạt hóa bề mặt MNPs để gắn phân tử sinh học

Hiện nay có rất nhiều phương pháp hoạt hóa bề mặt hạt nano sắt từ để có thểgắn kết các phân tử sinh học cần quan tâm Tuy nhiên, dù là phương pháp nào cũngcần đáp ứng được các yêu cầu sau:

− Hạt nano sắt từ phải liên kết chặt chẽ với các phân tử sinh học;

− Phương pháp hoạt hóa không làm ảnh hưởng đến hình dạng, cấu trúc cũng nhưhoạt tính sinh học của các phân tử sinh học được sử dụng, chẳng hạn như đối vớikháng thể thì phải còn khả năng bắt giữ kháng nguyên

Thông thường thì các phân tử sinh học sẽ được gắn lên hạt nano sắt từ theophương pháp gắn kết trực tiếp hoặc phương pháp gắn kết không trực tiếp [22]

1.4.2.1. Phương pháp gắn kết trực tiếp

Cách gắn kết đơn giản nhất là các phân tử sinh học gắn trực tiếp lên bề mặt hạtnano sắt từ (Hình 1.6a) Cách gắn kết trực tiếp thường được sử dụng nhiều nhất làgắn kết đồng hóa trị giữa phân tử sinh học và hạt nano Các hạt nano được biến đổivới các nhóm carboxyl (-COOH) trên bề mặt hạt tạo điều kiện thích hợp cho liênkết đồng hóa trị với phân tử sinh học có nhóm amin (-NH2) [22]

Hình 1.6 Các cách gắn kết các phân tử sinh học với hạt nano [22]

a) Gắn trực tiếp với các phân tử sinh học; b) Gắn gián tiếp qua phân tử trung gian; c) Liên kết hóa học của phân tử sinh học với cầu nối trung gian hoặc được gắn kết hoặc liên kết hóa học với bề mặt hạt nano; d) Liên kết hóa học trực tiếp của phân tử sinh học với hạt nano; e) Liên kết

hướng đích của phân tử sinh học đã được biotin hóa với streptavidin được bọc trên các hạt nano qua liên kết biotin-streptavidin.

1.4.2.2. Phương pháp gắn kết không trực tiếp

Các phân tử sinh học đầu dò thường có những vị trí có hoạt tính sinh học cao

để nhận biết các phân tử sinh học đích, do đó, khi gắn kết các hạt nano với các phân

tử sinh học đầu dò cần tránh những vị trí này Vì vậy, phương pháp gắn kết khôngtrực tiếp thường được dùng trong gắn kết hạt nano với phân tử sinh học thông quamột chất khác dùng làm cầu nối, một đầu gắn với hạt nano, đầu còn lại gắn với phân

tử sinh học [22]

Phương pháp này có thể thuận lợi hơn phương pháp gắn kết trực tiếp vì nó cóthể giúp các phân tử sinh học liên kết có tính định hướng thích hợp Dựa trên liênkết hóa học giữa các nhóm chức của phân tử sinh học (như thiol, amine) với cácphân tử cầu nối trung gian và các cầu nối trung gian này lại liên kết với bề mặt hạtnano qua hút bám hoặc liên kết hóa học (liên kết cộng hóa trị) (hình 1.6c) Tuynhiên việc điều khiển các liên kết là vấn đề khó khăn trong phương pháp này Hiệnnày người ta thường sử dụng những cặp phân tử có ái lực cao với nhau để làm cầunối trung gian giữa hạt nano sắt từ và các phân tử sinh học như biotin –streptavidin , biotin – avidin (Hình 1.6e) [22]

1.4.2.3. Các phương pháp đã được nghiên cứu và sử dụng

Phức hợp hạt nano silica với kháng thể có thể được tạo ra bởi nhiều cơ chếkhác nhau Theo các tác giả người Mỹ Xing Y và cộng sự (2008), thì hiện nay có 5cách để tạo ra phức hợp này là:

a. Gắn kết trực tiếp thông qua liên kết amine–carboxylic

Kiểu gắn kết này dựa trên phản ứng hóa học giữa nhóm carboxyl và nhómamin nhờ có EDAC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimidehydrochloride) làm chất xúc tác, được dùng để liên kết nhóm carboxyl với amin bậcmột, hình thành nên liên kết peptide (Hình 1.7) Sử dụng đệm MES (2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid mono hidrate) có pH từ 4,7 - 6 là thích hợp nhấtcho phản ứng có EDAC xúc tác [22]

Hình 1.7 Gắn kết trực tiếp thông qua liên kết amine-carboxylic [22]

b. Sử dụng SMCC làm xúc tác tạo cặp sulfhydryl-amine

Các liên kết disulfide trong vùng nối giữ hai chuỗi nặng cùng nhau được chia

ra một cách chọn lọc, tạo thành 2 đoạn kháng thể, mỗi đoạn chứa sulfhydryl tự do

và vị trí liên kết với kháng nguyên Sự gắn kết các hạt nano silica với các mảnhkháng thể thông qua sự khử lưu huỳnh và tạo cặp sulfhydryl-amine, có SMCC(succinimidyl-4-( N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate) làm chất xúc tác[22]

Hình 1.9 Gắn kết các nhóm carbon-hydrate bị oxy hóa trên phần Fc của kháng

thể [22]

d. Gắn kết không hóa trị của hạt nano silica được bọc streptavidin với các kháng thể được biotin hóa

Streptavidin là một protein dạng tứ phân, có ái lực rất lớn với biotin Một phân

tử streptavidin có khả năng liên kết được với 4 phân tử biotin Dựa trên tính chất đó,kiểu gắn kết thông qua streptavidin, phân tử liên kết với kháng thể gắn biotin đãđược áp dụng để tạo ra phức hợp hạt nano silica và kháng thể (hình 1.10) Điều nàyđảm bảo rằng các vị trí nhận biết của kháng thể được định hướng ra xa khỏi bề mặtcủa hạt nano silica, vì thế, chúng sẽ không bị mất đi khả năng liên kết với vi khuẩnđích mà vẫn giữ được hoạt tính [22]

Hình 1.10 Gắn kết không hóa trị giữa hạt nano silica gắn streptavidin với các

kháng thể được biotin hóa [22]

Tóm lại, có rất nhiều cách để gắn kết kháng thể với hạt nano sắt từ bọc silica

Vì vậy, tùy theo các nhóm chức năng trên bề mặt hạt và tùy vào từng điều kiện cụthể mà sử dụng kĩ thuật gắn kết nào cho phù hợp

1.5. Mô hình thiết bị đo tín hiệu điện từ

Việc sử dụng phương pháp ELISA trong chuẩn đoán ung thư vú còn bộc lộmột số nhược điểm như kĩ thuật tương đối phức tạp, tín hiệu nền mạnh, thời giancho kết quả lâu,… Trên cơ sở đó, bộ môn Công nghệ sinh học và Điện tử viễn thông

Đại học Bách Khoa Đà Nẵng đã đề xuất thiết kế thiết bị đo tín hiệu từ để phát hiệnung thư vú Với khả năng tương thích cao với các phân tử sinh học, dễ tổng hợp nênkhông yêu cầu quá cao về mặt chi phí, cũng như có thể được phát hiện bằng tín hiệu

từ nên hạt nano sắt từ đã được nhóm nghiên cứu sử dụng để làm vật liệu cho đề tài.Trên thế giới, từ trước đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu về việc cố địnhkháng thể lên hạt nano sắt từ với nhiều phương pháp phát hiện khác nhau như việc

cố định Aflatoxin B1 lên hạt nano sắt từ bằng liên kết không hóa trị và phát hiệnbằng phương pháp ELISA [7], cố định kháng thể Goat IgG bằng liên kết hóa trị(APTES – GA) và phát hiện bằng ELISA [5],… Tuy nhiên vẫn chưa có đề tài nào

sử dụng phương pháp đo tín hiệu từ, vậy nên chúng tôi tin tưởng rằng với đề tài này

sẽ mở ra nhiều hướng đi mới cho các nghiên cứu sau này cũng như đưa ra phươngpháp mới nhằm phát hiện ung thư vú hiệu quả hơn Sau đây là mô hình thiết bị đotín hiệu từ:

Hình 1.11 Mô hình thiết bị cảm ứng sinh học điện từ [18]

(a) Kháng thể thứ nhất đặc hiệu với kháng nguyên HER2 được cố định lên đếsinh học của thiết bị;

(b) Tiến hành phủ mẫu bệnh phẩm chưa xác định rõ nồng độ kháng nguyênHER2, kháng nguyên HER2 đặc hiệu với kháng thể sẽ bị kháng thể bắt giữ;

(c) Thêm kháng thể thứ hai đặc hiệu kháng nguyên HER2 đã được gắn trên hạtnano sắt từ nhờ vào phương pháp hoạt hóa bề mặt thích hợp;

(d) Hạt nano sắt từ có kháng thể thứ hai sẽ được giữ lại sau những lần rửa vàtạo phức hợp bền chặt giữa kháng thể và kháng nguyên;

(e) Dựa vào thiết bị đo tín hiệu từ sẽ xác định được lượng hạt nano sắt từ, từ

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

− Những hóa chất như Glutaraldehyde (GA) 25%, (Sigma – Aldrich, Mỹ), Aminopropyltriethoxysilane (APTES) 99.8%, (Sigma – Aldrich, Mỹ) là những hóachất độc hại, cần cẩn thận trong quá trình thao tác

3-− Hạt nano sắt từ bọc SiO2 (Fe3O4.SiO2)được mua tại trường Đại học Khoa học Tựnhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

− Human ErbB2/HER2 ELISA Kit (Sigma – Aldrich, Mỹ) gồm: Giếng Elisa đã đượcphủ kháng thể thứ nhất đặc hiệu với kháng nguyên HER2, kháng nguyên chuẩnHER2, kháng thể thứ hai đặc hiệu với kháng nguyên HER2 đã được biotin hóa,Streptavidin – HRP, 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine (TMB), dung dịch pha loãngDiluent A, Diluent B, dung dịch rửa Wash Solution, dung dịch ngừng phản ứng Stopsolution

− Cân phân tích điện tử E1240 – OHAUS, Mỹ

− Cân kĩ thuật ARC 120 OHAUS, Mỹ

− Máy đo pH metter TOLEDO MP 220

− Máy đo quang phổ Bio – Rad Smartspec Plus

− Máy ly tâm, MIKRO 200 24 lỗ, Đức

− Máy NANODROP 2000

− Thiết bị đọc ELISA

L1: 400µl cồn 500L2,3: 400µl PBS pH=7.4

  Rửa 3 lần

Siêu âm 37Hz, 30 phút

Hình 2.1 Cơ sở của phương pháp cố định kháng thể lên MNPs thông qua hoạt

hóa bề mặt bằng APTES – GA [7]

2.2.2.Quy trình hoạt hóa bề mặt MNPs

Dựa trên nguyên tắc hoạt hóa bề mặt hạt nano sắt từ bằng liên kết cộng hóa trịAPTES – GA đã nêu ở mục 2.2.1, tôi tiến hành quy trình sau:

LỚP: 10SH – MSV: 107261101136

Hình 2.2 Quy trình hoạt hóa bề mặt MNPs bằng APTES – GA [4]

− Phủ APTES lên hạt nano sắt từ:

+ Hòa 12µl MNPs (24 µg/µl) vào 388 µl nước cất để đạt nồng độ 7 µg/µl

+ Rửa 2 lần với 400 µl cồn 500 để loại bỏ dịch bảo quản

+ Siêu âm trong 30 phút ở điều kiện 37 Hz với 400 µl cồn 500

+ Bổ sung 400 µl APTES 1%, lắc khô 5 giờ ở 500C

+ Rửa 1 lần với cồn 500, 2 lần với đệm PBS pH = 7.4, loại bỏ dịch rửa

− Phủ GA lên hạt nano sắt từ:

+ Tái huyền phù với 400 µl GA 5%, ủ trong 1 giờ và lắc nhẹ

+ Rửa 3 lần với đệm PBS pH = 7.4

+ Bảo quản trong đệm PBS pH = 7.4 ở 40C cho đến khi sử dụng

2.2.3.Thử nghiệm gắn Streptavidin lên MNPs

2.2.3.1. Thử nghiệm gắn Streptavidin lên MNPs, đo bằng UV – VIS

Để khẳng định hạt nano sắt từ sau khi hoạt hóa bề mặt có thể gắn được cácphân tử sinh học hay không, đặc biệt là kháng thể kháng kháng nguyên HER2 phục

vụ cho mục đích chẩn đoán ung thư vú thì tôi tiến hành thử nghiệm gắn Streptavidinlên hạt nano sắt từ trước vì Streptavidin và kháng thể đều có bản chất là protein.Như vậy có thể bước đầu đưa ra quy trình tổng quát, sau đó sẽ tiến hành tối ưu hóa

Thu dịch (1)Rửa 3 lần với PBS

0,1mg/ml

Bảo quản trong 400µl PBS

Tiến hành thử nghiệm gắn Streptavidin lên hạt nano sắt từ như sau:

− Xây dựng đường chuẩn Streptavidin:

Chuẩn bị dãy Streptavidin với các nồng độ khác nhau lần lượt là 0, 0.05, 0.10,0.20, 0.30, 0.40 mg/ml để xây dựng đường chuẩn Streptavidin và đo UV – VIS ởbước sóng 280nm

Hút 50µl hạt nano vào giếngRửa và tái huyền MNPs - Streptavidin vào đệm Diluent solution

Hình 2.3 Quy trình thử nghiệm gắn Streptavidin lên MNPs đo UV - VIS

− Đo nồng độ Streptavidin gắn trên hạt nano sắt từ bằng ở OD280nm:

Đo nồng độ Streptavidin trong dịch hút và dịch rửa thu được Từ đó thấy được

sự thay đổi giữa lượng Streptavidin gốc và Streptavidin trong dịch hút, dịch rửa đểsuy ra được lượng Streptavidin gắn lên hạt nano sắt từ cũng như từ đó kiểm tra độtin cậy của phương pháp này

2.2.3.2. Thử nghiệm gắn Streptavidin lên MNPs, đo dựa trên phản ứng màu giữa enzyme HRP và cơ chất TMB

Sau khi tiến hành đo bằng phương pháp UV – VIS, tôi nhận thấy có khả nănggiá trị OD280nm có thể phản ánh cả lượng Streptavidin và các loại protein khác Do

đó, tôi phải thử nghiệm với một phương pháp khác đặc hiệu hơn dựa trên phản ứngchuyển màu cơ chất TMB khi tiếp xúc với enzyme HRP được cố định trênStreptavidin sau đó đo OD450nm để có thể định lượng chính xác hơn sự hiện diện củaStreptavidin gắn trên hạt sắt từ

Thí nghiệm sử dụng Streptavidin – HRP được pha loãng với Diluent B 1X cónồng độ 500X (trong bộ kit)

− Chuẩn bị mẫu:

+ Mẫu đối chứng bị biến tính bởi nhiệt độ (1000C trong 5 phút)

+ Mẫu thử nghiệm tiến hành quy trình gắn Streptavidin – HRP như quy trình đã đượctiến hành ở mục 2.2.3.1

Mẫu đối chứng MNPs – APTES – GA – Streptavidin – HRP, 1000C trong 5pMẫu thử nghiệm MNPs – APTES – GA – Streptavidin – HRP

− Tiến hành đo mẫu:

Sau khi đã gắn Streptavidin – HRP lên hạt nano sắt từ, tôi tiến hành xác địnhlượng Streptavidin gắn được bằng cách dựa vào phản ứng màu giữa enzyme HRP

và cơ chất TMB tạo chất màu đo ở bước sóng OD450nm theo quy trình như sau:

+ Hút 50 µl mẫu Blank (mẫu a) và 50 µl mẫu thử nghiệm (mẫu b, c, d)

+ Thêm 50 µl TMB, ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, trong bóng tối

+ Thêm 25 µl Stop solution vào mỗi giếng để dừng phản ứng, đo ở bước sóng OD450

nm