Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung protease lên quá trình thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế (perionyx excavatus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘTKHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNGBÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2015-2016 NGHIÊN CỨU

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘTKHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA

CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2015-2016

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BỔ SUNG PROTEASE LÊN QUÁ TRÌNH THU NHẬN DỊCH THỦY PHÂN TỪ TRÙN QUẾ

(Perionyx excavatus)

Bình Dương - Tháng 3 năm 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘTKHOA TÀI NGUYÊN MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA

CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2015-2016

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BỔ SUNG PROTEASE LÊN QUÁ TRÌNH THU NHẬN DỊCH THỦY PHÂN TỪ TRÙN QUẾ

(Perionyx excavatus)

Sinh viên thực hiện: Huỳnh Thị Kim Trang Dân

tộc: Kinh

Lớp, khoa: Tài Nguyên Môi Trường

Ngành học: Khoa Học Môi Trường

Người hướng dẫn: Thạc sĩ Trần Ngọc Hùng

Nam, Nữ: Nữ

Năm thứ: 3 /Số năm đào tạo: 4

UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung protease lên quá trình

thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế (Perionyx excavatus).

- Sinh viên thực hiện: Huỳnh Thị Kim Trang

- Lớp: D13MT02 Khoa: Tài Nguyên Môi Trường Năm thứ: 3 Số năm đào tạo: 4

- Người hướng dẫn: Thạc sĩ Trần Ngọc Hùng

2 Mục tiêu đề tài:

Thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế qua quá trình thủy phân

Xác định ảnh hưởng của việc bổ sung protease lên quá trình thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế

3 Tính mới và sáng tạo:

Nghiên cứu đi sâu và quan tâm vào vấn đề mới là bổ sung enzyme protease và cácyếu tố ảnh hưởng như nhiệt độ và thời gian nhằm tối ưu quá trình thủy phân trùn quế, rút ngắn thời gian thủy phân, nâng cao hiệu suất thủy phân trùn để thu được dịch trùn

có hàm lượng đạm cao

4 Kết quả nghiên cứu:

Để tối ưu quá trình thủy phân trùn quế và thu được dịch thủy phân với hàm lượng đạm cao, cần thiết phải tiên hành quá trình tự phân trùn quế trong điều kiện bổ sung enzyme protease Quá trình nghiên cứu cho thấy với hoạt độ enzyme protease bổ sung

là 2,5UI, ở nhiệt độ 35oC và thời gian thủy phân 8 giờ là tối ưu cho việc bổ sung

enzyme protease để thu nhận dịch thủy phân với tổng lượng đạm hòa tan là 15,4g/lít

5 Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng

và khả năng áp dụng của đề tài:

Nghiên cứu đã đưa ra các yếu tố và điều kiện về hàm lượng protease cần thêmvào, nhiệt độ và thời gian ủ để tối ưu quá trình thu nhận dịch thủy phân trùn quế, rútngắn thời gian và tăng hiệu suất thủy phân của trùn quế đồng thời thu được lượng đạmhòa tan cao trong dịch thủy phân trùn giúp góp phần mang lại giá trị cao hơn cho cácsản phẩm trùn quế đồng thời giúp phát triển nghề nuôi trùn

Ngoài ra, dịch trùn có hiệu suất thủy phân cao giúp tăng hiệu quả cho cây trồng,vật nuôi, giúp phát triển ngành trồng trọt và chăn nuôi khi sử dụng dịch trùn phun lêncây trồng cũng như làm thức ăn cho thủy sản, gia cầm

6 Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ họ

tên tác giả, nhan đề và các yếu tố về xuất bản nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá

của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu (nếu có):

Ngày tháng năm

Sinh viên chịu trách nhiệm chính

thực hiện đề tài

(ký, họ và tên)

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên thực hiện

đề tài (phần này do người hướng dẫn ghi):

Xác nhận của lãnh đạo khoa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN:

Họ và tên: Huỳnh Thị Kim Trang

Sinh ngày: 27 tháng 9 năm 1994

Nơi sinh: Bình Dương

Lớp: D13MT02 Khóa: 2013-2017

Khoa: Tài Nguyên Môi Trường

Địa chỉ liên hệ: Phường Phú Thọ, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương

Điện thoại: 0909619944 Email: kimtranghyun2794@gmail.com

II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP (kê khai thành tích của sinh viên từ năm thứ 1 đến năm đang

Ngành học: Khoa học Môi trường

Khoa: Tài Nguyên Môi Trường

Khoa: Tài Nguyên Môi Trường

Khoa: Tài Nguyên Môi Trường

Kết quả xếp loại học tập: Khá

Sơ lược thành tích:

7 Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu đề tài:

1 Huỳnh Thị Kim Trang D13MT02 1324403010107

2 Nguyễn Trường Nam D13MT02 1324403010152

TÀI LIỆU THAM KHẢO 22

Xác nhận của lãnh đạo khoa

DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Hàm lượng amino acid trong bột trùn quế chưa thủy phân

PHỤ LỤC Bảng 1 Ảnh hưởng của hàm lượng protease đến khả năng thủy phân trùn quế

Hoạt độ protease

(UI/100ml dịch trùn)

L

Thể tíchthử không(Vk)

Thể tích thử thật(Vt)

Hàm lượng đạm(g/lít)

Bảng 2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân trùn quế

Nhiệt độ

(oC) L

Thể tích thửkhông(Vk)

Thể tích thử thật(Vt)

Hàm lượng đạm(g/lít)

Bảng 3 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân trùn quế

Hàm lượng đạm(g/lít)

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tổng quan vể tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài

Vai trò của trùn quế đã được các nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu và ứngdụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như ngành chăn nuôi, trồng trọt, nuôi cấy vi sinh vật, yhọc

1.1.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Bột trùn quế đã được nhiều nhà khoa học bổ sung vào khẩu phần của gia cầm như làmột nguồn protein chính Kết quả cho tăng trưởng tương đương hoặc tốt hơn khi khi cho giacầm ăn thức ăn truyền thống giàu protein[17,19,20,21]

Harwood (1976), Mekada và cộng sự (1979) cho rằng, gà được cho ăn trùn quế đã cảithiện mức tiêu tốn thức ăn tốt hơn đối chứng, nghĩa là gà ở lô thí nghiệm có cùng tăng trọngvới lô đối chứng nhưng lại tiêu thụ ít thức ăn hơn[17,21]

Mekada và cộng sự (1979) dùng 5% bột trùn quế trong khẩu phần ăn của gà và không

có sự tăng trọng rõ rệt nhưng có xu hướng giảm tiêu hao thức ăn Họ cũng thành công trênnhững thí nghiệm với gà đẻ trong khẩu phần ăn có bổ sung trùn tươi[19]

Một số thí nghiệm ở India (Kale và cộng sự, 1982) và Philippines (Guerro, 1983) cho

rằng trùn quế Perionyx excavatus sử dụng tốt phân gia súc, tạo ra nguồn nguyên liệu protein

bổ sung vào thức ăn cho gia súc[16,18]

1.1.2 Các nghiên cứu trong nước

Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy, bổ sung trùn quế tươi vào khẩu phần thức ăn của gàcho tác dụng tốt đến sự sinh trưởng, phát triển, khả năng thu nhận và hấp thu chất dinhdưỡng từ thức ăn, tăng tỷ lệ nuôi sống Từ đó, giúp tăng trọng nhanh, cải thiện hệ số chuyểnhóa thức ăn

Nguyễn Xuân Trúc (2008), bổ sung 5% trùn quế tươi vào khẩu phần thức ăn của gàLương Phượng; Hoàng Thị Mai và cộng sự (2014), bổ sung 3% trùn quế vào khẩu phần thức

ăn của giống gà ri lai thì trọng lượng tăng và hệ số tiêu tốn thức ăn giảm ở lô thí nghiệm sovới lô đối chứng[5,11]

12

Đồng thời, trùn quế đã được nghiên cứu và sản xuất thành các chế phẩm sinh học phục

vụ cho công nghiệp, nuôi cấy vi sinh vật, là loại thức ăn giàu đạm để bổ sung thêm khẩuphần dinh dưỡng cho các loại tôm cá vừa qua giai đoạn ấu trùng hoặc khôi phục sức khỏevật nuôi sau bệnh

Năm 2008, Phan Thị Bích Trâm và cộng sự đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến

hiệu suất đạm amine của quá trình tự phân giải trùn quế (Perioyx excavatus) . Kết quả thínghiệm cho thấy, điều kiện tối ưu cho hệ protease trùn quế tự thủy phân ở nhiệt độ 55oC vàhoạt động tốt trong môi trường nước và pH 10 Hiệu suất thủy phân đạt cao nhất 46,2%tương ứng với hàm lượng protein trong dung dịch thủy phân đạt 9%, hoạt tính đặc hiệu củaenzym ban đầu là 0,097 UI/mg protein và thời gian thủy phân là 24 giờ[8]

Theo Võ Thị Hạnh và cộng sự (2009), đã nghiên cứu và ứng dụng thành công các sảnphẩm chiết xuất từ trùn quế và các loại vi sinh vật hữu ích vào trong nông nghiệp như chănnuôi, trồng trọt Kết quả ghi nhận rằng các chế phẩm sử dụng trong chăn nuôi có tác dụngkích thích sự thèm ăn, tăng trọng nhanh, giảm tiêu hao thức ăn, giảm tỷ lệ chết cũng nhưgiảm chi phí sản xuất Các chế phẩm dùng trong trồng trọt dưới dạng phân bón qua lá hoặc

bổ sung qua đất có tác dụng cạnh tranh và đối kháng với vi sinh vật gây bệnh có trong đất,phân giải chất hữu cơ, cố định đạm và hòa tan lân Khi sử dụng các chế phẩm này về lâu dài

sẽ giúp đất sạch bệnh và cải thiện độ màu mỡ của đất[3]

Năm 2009, Nguyễn Thị Xuân Thanh đã sử dụng đạm thủy phân trùn quế để nuôi visinh vật, kết quả cho thấy có thể thay thế đạm pepton hoàn toàn bằng đạm thủy phân từ trùn

quế dùng nuôi cây nấm men Saccharomyces cerevisiae, sự tăng trưởng của nấm tốt hơn khi

nuôi cấy bằng đạm pepton Hà Lan Đồng thời, giá thành khi nuôi bằng đạm trùn quế thấphơn lần so với đạm pepton Hà Lan[6]

Những nghiên cứu của Phạm Thị Quỳnh Trâm và cộng sự (2008), Phan Thị Bích Trâm

và cộng sự (2010) cho thấy, khi bổ sung bột đạm thủy phân vào thức ăn của ấu trùng tôm súcho kết quả rất khả quan, kết quả tăng trưởng chiều dài tốt hơn bột đạm trùn quế chưa thủyphân, tỷ lệ nuôi sống cao hơn và giá thành của sản phẩm giảm[9,10]

Ngoài ra, các sản phẩm từ quá trình thủy phân trùn quế còn được sử dụng trong y dược

13

học, phòng và chữa tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim, chứng tắc nghẽn mạch mau Năm 2009, các nhà khoa học thuộc Viện Sinh học nhiệt đới đã chứng minh rằngenzyme fibrinolytic trong trùn quế có khả năng thủy phân mạnh mẽ, làm đứt các sợi fibringây tắc thành mạch máu gồ ghề, xơ vữa của bệnh nhân tim mạch hoặc mỡ máu.

Phan Thị Bích Trâm và cộng sự (2007) nghiên cứu một số serine protease có khả năngthủy phân fibrin từ trùn quế Từ đó, có thể ứng dụng vào trong điều trị các bệnh liên quanđến tim mạch như tắc nghẽn mạch máu do fibrin bị đóng cục[7,14]

1.2 Lí do lựa chọn đề tài

Nhiều nghiên cứu cho thấy hiếm có loài động vật nào có giá trị hấp dẫn như trùn quế

15 - 20% trọng lượng cơ thể Hàm lượng các chất tính trên trọng lượng chất khô cao nhất làprotein (68 -70%), kế tiếp là đường (12 - 14%), lipid (7 - 8%) và tro (11 - 12%) Do có hàmlượng protein cao, giàu vitamin, các acid amin và acid béo thiết yếu nên trùn quế được xem

là nguồn dinh dưỡng bổ sung quý giá cho các loại gia súc, gia cầm, thủy hải sản giúp cácloại vật nuôi tăng trưởng nhanh, kháng bệnh, tăng năng suất Trùn quế được sử dụng trựctiếp hoặc phối trộn để làm thức ăn cao cấp nuôi gia súc, gia cầm và thủy sản Phân trùn quế

là loại phân hữu cơ sinh học, có hàm lượng dinh dưỡng cao, thích hợp cho nhiều loại câytrồng và là nguồn phân thích hợp cho việc sản xuất rau sạch, dịch trùn quế còn được sửdụng rất phổ biến trong trồng trọt như một loại phân bón lá giúp cây trồng phát triển tốt hơn.Bên cạnh đó, trùn quế còn được làm nguyên liệu trong y dược để sản xuất ra các loại thuốchoặc sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm phục vụ đời sống con người Ngoài ra, trùnquế còn phân hủy rác hữu cơ, bảo vệ môi trường[1,19] Hơn nữa, hiện nay nông dân ở nhiềunơi xây dựng mô hình chăn nuôi sạch, khép kín từ nuôi bò lấy phân nuôi trùn quế làm thức

ăn cho tôm, kết hợp trồng vườn, vừa cung cấp thức ăn cho gia cầm, thủy sản, vừa bảo vệđược môi trường do tận dụng lượng chất thải trong chăn nuôi[23]

Trùn quế thuộc nhóm trùn ăn phân, thường sống trong môi trường có nhiều chất hữu

cơ đang phân hủy Nhiều nghiên cứu cho thấy trùn quế phát triển rất tốt trên phân bò[22] Do

đó, hiện nay các mô hình nuôi trùn phát triển mạnh xung quanh các trại bò sữa Điển hình cóthể kể đến các địa phương có diện tích nuôi trùn quế lớn như Hà Nội, Khánh Hòa, Trà Vinh,

14

TP Hồ Chí Minh

Tuy nhiên việc sử dụng trùn quế tươi gây nhiều khó khăn trong việc bảo quản, quátrình sử dụng và thương mại hóa Vì vậy, để tiện cho việc bảo quản, dễ dàng sử dụng vàgiúp thương mại hóa trùn quế, người ta đã thủy phân trùn quế thành dịch Dịch trùn quế có

ưu điểm là dễ dàng sử dụng khi phun lên thức ăn vật nuôi, hòa vào nước làm thức ăn chothủy sản hay phun lên cây trồng Tuy nhiên, việc sản xuất dịch trùn hiện nay gặp khó khăn

do thời gian thủy phân trùn quế quá dài và trùn quế chưa được thủy phân hoàn toàn, khôngthu được hết lượng đạm có trong trùn quế Chính vì những thực tế trên chúng tôi đề xuất đềtài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung protease lên quá trình thu nhận dịch thủy phân

từ trùn quế (Perionyx excavatus)”.

1.3 Mục tiêu đề tài

Thu nhận dịch thủy phân từ trùn quế qua quá trình thủy phân

Xác định ảnh hưởng của việc bổ sung protease lên quá trình thu nhận dịch thủy phân

từ trùn quế

1.4 Vật liệu[2,4]

Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong đề tài do phòng thực hành thí nghiệm Sinh Học

thuộc Khoa Tài nguyên Môi trường, trường Đại học Thủ Dầu Một cung cấp

Đối tượng thử nghiệm là trùn quế đông lạnh được mua từ cơ sở Trùn Quế Củ Chihuyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh

Môi trường giữ giống: Glucose 50 g; Pepton 10 g; Cao thịt 3 g; Agar 20 g; Nước cấtvừa đủ 1 lít

Môi trường tăng sinh: Glucose 35 g; Pepton 10 g; Nước giá 10% vừa đủ 1 lít

Môi trường bán rắn thu nhận protease: ZnSO4 0,0014 g; KH2PO4 0,4 g; DAP 0,8 g;NaCl 1,44 g; CaCO3 2,4 g; MgSO4 0,2 g; Bắp 200 g; Đậu nành 200g; Nước 60% (w/w)

1.5 Phương pháp nghiên cứu

1.5.1 Phương pháp xác định hoạt độ protease[4]

Hoạt tính protease được xác định theo phương pháp Anson cải tiến: cho 1 ml dung

15

dịch enzyme vào 2,5 ml dung dịch Casein 1% trong đệm Phosphate pH 7,6 Ủ ở 35oC trong

20 phút Mẫu đối chứng được làm ngừng phản ứng bằng 5 ml dung dịch TCA 5% Xác địnhhàm lượng Tyrosine trong dịch bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm với thuốcthử Folin Một đơn vị hoạt tính (UI) là lượng enzyme protease tối thiểu thủy phân Caseintrong thời gian 1 phút tạo thành Iimol Tyrosine

1.5.2 Phương pháp nuôi cấy bán rắn thu nhận chế phẩm có hoạt tính protease[4]

Chủng Bacillus subtilis được tăng sinh trên môi trường tăng sinh trong 48 giờ Cấy

dịch tăng sinh vào môi trường bán rắn sao cho mật độ giống khoảng 1x107 CFU/g canhtrường, trộn đều, giữ ở nhiệt độ phòng Sau thời gian thích hợp, thu nhận canh trường bánrắn, sấy thông gió ở nhiệt độ 45 - 50oC Khi canh trường khô, xay nhuyễn và bảo quản canhtrường ở dạng bột mịn

1.5.3 Phương pháp thủy phân trùn quế[9]

Trùn quế được bổ sung nước theo tỉ lệ 2 : 1 Sau đó, cho vào các erlen và tiến hànhthủy phân ở nhiệt độ 55oC Sau các khoảng thời gian xác định, chúng tôi tiến hành lọc, litâm, thu dịch thủy phân và sử dụng phương pháp Kjeldahl để xác định hàm lượng đạm tổng

số có trong dịch thủy phân

2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4

1.5.4.2 Hóa chất

H2SO4 đậm đặc (d = 1,84); chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4: CuSO4 n = 9:1, xay nhuyễn;

16

Dung dịch NaOH N/100; Dung dịch H2SO4 N/100; Dung dịch (COOH)2 N/100, Dung dịch(COOH)2 N/100, NaOH đậm đặc: cân 40 g NaOH trong nước cất thành 100 ml Thuốc thử

đỏ Methyl 0,5% trong cồn Thuốc thử Phenolphtalein 1% trong cồn

1.5.4.3 Cách tiến hành

Vô cơ hóa

Lấy 6 bình Kjeldahl, thực hiện 3 mẫu thử thật và 3 mẫu thử không Hút chính xác vào

3 bình thử thật, mỗi bình 1 ml nguyên liệu lỏng (hoặc 0,1 g nguyên liệu khô nghiền nát), 3bình thử thật, mỗi bình 1 ml nước cất Tiếp theo, cho vào 6 bình Kjeldahl mỗi bình 5 ml

H2SO4 đậm đặc và khoảng 0,5g chất xúc tác Đề vào tủ hút chất độc cho đến khi dung dịchbằng bên trong bình Kjeldahl trong suốt (khoảng 2 - 3 giờ) Để nguội

Lấy 6 bình Kjeldahl ra, mỗi bình được pha loãng với nước cất thành 100 ml bình địnhmức

vô cơ hóa đã pha loãng trên cho vào phễu của máy cất đạm, mở khóa cho vào bình phản ứng

từ từ cho đến khi hết, tráng phễu 3 lần, mỗi lần một ít nước cất, rồi cũng cho xuống bìnhphản ứng, cho 10 ml dung dịch NaOH đậm đặc và cũng cho xuống bình từ từ, tráng một ítnước cất (mỗi lần cần chừa lại một ít để hệ thống kín) Để máy lôi cuốn trong vòng 3 phútrồi hạ bình hứng xuống, để thêm 2 phút nữa Rửa vòi bằng 1 tia nước cất (nước rửa cho vàobình tam giác) Rồi lấy bình tam giác ra, định phân với dung dịch NaOH chuẩn độ đúng làx.N/100 cho đến khi có màu vàng cam

Thực hiện 3 mẫu thử thật, 3 mẫu thử không để lấy trị số trung bình Phải xác định hệ

số hiệu chỉnh x của dung dịch NaOH N/100 bằng dung dịch (COOH)2 N/100

1.5.4.4 Cách tính kết quả

Tính lượng nitơ tổng số có trong 1 lít nguyên liệu

17