Tài liệu Kỹ thuật điện di ADN - DNA electrophoresis pptx

Điện di ADN Thang phân tử chuẩn thương được đienj di lượng kích thước của các đoạn AND trong mẫu nghiên cứu... Các đoạn DNA đượ ắ ằ c c t b ng RE có thể tách khỏi nhau tương ứng với

Kỹ thuật điện di ADN

DNA electrophoresis

 ADN tich điện âm

vì gốc phosphat hình thành khung đường-phosphate

của phân tử AND tích điện âm.

 Trong điện trường di chuyển về cực dương

Điện di ADN

 Bản gel hoạt động như một giỏ thể để phõn tỏch cỏc đoạn ADN

 ADN thường được điện di trên hai loại gel: agarose và acrylamid

 Cỏc lỗ được tạo ra trong bản gel Chỳng được xem như là cỏc giờngs để chứa dung dịch AND

Agarose và Polyacrylamide

Agarose:

có khả năng phân tách các phân tử AND có kích thước lớn khác nhau từ hàng chục thậm chí hàng trăm Kilobase Không độc

Polyacrylamide:

Có độ phân giả cao hơn song chỉ phân tách được các đoạn AND có kích thước sai khác ít Rất độc

Điện di ADN

 Dung dịch AND

chứa hỗn hợp các đoạn AND có kích thước khác nhau

được đổ vào các

giêngs trong bản

gel.

Điện di ADN

 Chất nền gel hoạt

động như một tấm sàng (sieve) Các

phân tử AND lớn đi qua các lỗ trong bản gel khó khăn hơn các phân tử AND nhỏ.

 Vì vậy, các đoạn

phân tử lớn hơn sẽ bị chậm lại so với các phân tử nhỏ khi AND

di chuyển trong bản gel.

Điện di ADN

 Thang phân tử chuẩn

thương được đienj di

lượng kích thước của

các đoạn AND trong

mẫu nghiên cứu.

Fig 20-1: DNA separation by gel electrophoresis

http://a32.lehman.cuny.edu/molbio_course/agarose.htm

Một số bước chính trong kỹ thuật điện di

Hiện hinh các b ng ADN trên b n gel điện di ă ả

tạo các liên kết nhuộm với các bazơ nitơ Khi chiếu

ánh sáng tử ngoại (cực tím) vào b n gel các liên kết ảnhuộm sẽ hấp phụ các bước sóng 300 – 360nm và phát huỳnh quang ở bước sóng 590 nm (màu da cam), kết qu có thể ghi nhận bằng mắt thường và chụp nh ả ả

được

ngâm vào dung dịch AgNO3, ADN sẽ tương tác với AgNO3, khi bổ sung formaldehyt ở pH kiềm, ion bạc chuyển thành bạc nguyên tử tạo các hạt bạc kết tụ có màu xám, có thể phát hiện dễ dàng

Kết quả điện di AND trên gel

Kết quả điện di AND trên gel có nông đô

khác nhau

Faster migration

in a less concentrated gel

Tương quan giữa NĐ agarose và độ lớn của ADN

Các đoạn DNA đượ ắ ằ c c t b ng RE có thể tách khỏi nhau tương ứng với kích thước của chúng khi chạy điện di trên gel agarose Sau khi điện di các gel được nhuộm ethidium bromide và có thể quan sát trực tiếp các đoạn cắt dưới ánh sáng tử ngoại hoặc chụp nh .vntime ả

Kỹ thuật lai phân tử

Các dạng phức hợp lai bổ sung

Lai DNA-DNA hoặc DNA-RNA

Lai phân tử là quá trình kết hợp lại của hai

mạch đơn DNA Cơ sở của việc lai phân tử là

các mối liên kết hydro giữa các base trên hai

mạch Giữa một base A và một base T hình

thành hai liên kết hydro còn giữa G và C hình

thành ba liên kết

DNA có thể biến tính hoặc tái hồi khi đun nóng hoặc làm lạnh

Để tiến hành phản ứng lai phân tử trước hết DNA mạch kép phải được biến tính Đó là một quá trình trong đó các liên kết hydro của mạch DNA kép ban đầu bị phá vỡ giải phóng hai

mạch đơn với toàn bộ các base sẵn sàng tiếp nhận các liên kết hydro mới

Tính đặc hiệu của phản ứng lai

 1) lai đặc hiệu: probe gắn với DNA mục tiêu chỉ khi có trình tự

bổ sung

 2) Lai không đặc hiệu: phản ứng lai xảy ra khi DNA mục tiêu có trình tự tương tự (không bổ sung hoàn toàn)

Sự tương hợp giữa mẫu dò và DNA trên thực tế không nhất

thiết phải hoàn toàn chính xác Các trình tự mẫu dò ở những

độ sai khác nhất định vẫn có thể bám vào DNA cho dù sự

tương hợp không cao Lẽ dĩ nhiên, độ tương hợp càng thấp

thì càng có ít mối liên kết hydro giữa mẫu dò và DNA mạch

đơn Người ta có thể tính toán được khả năng các mẫu dò có

độ tương hợp thấp bám vào DNA bằng cách thay đổi nhiệt độ

của phản ứng lai hay thay đổi lượng muối trong dung dịch

đệm

Phản ứng lai có thể không đặc hiệu

Một số trường hợp xảy ra khi lai ADN

42 C

is more stringent

condition that 35 C

(hybridization

is more specific)

Kỹ thuật Southern Blot cho biết

 Sự có mặt của đoạn ADN (gen)

 Số lượng đoạn ADN có mặt (tương ứng với số gen)

 Độ lớn của đoạn ADN

 Trình tự tương tự giữ đoạn ADN mục tiêu và mẫu dò

Edwin Southern University of Oxford

Nguyờn tắc

 Southern Blot dựa trên kh n ng gi lại các đoạn ả ă ữADN đã qua xử lý enzyme giới hạn, trên một màng mỏng đặc biệt (Hybond - N)

 Màng mỏng này sau đó được ngâm trong dung dịch chứa m u dũ đã cho ở dạng có đánh dấu ẫ 32P Nếu có mặt gen đã cho trong ADN trên màng mỏng thỡ các

đoạn ADN của cùng gen sẽ bắt cặp (lai) theo cơ chế

bổ sung (complementation) và nhận biết qua phóng xạ

tự ghi

Các bước ti n h nh (ti p) ế à ế

2 Thấm truyền (blotting):

để chuyển nguyên vẹn các ADN đã biến tính trên gel lên màng lai (màng nitrocellulose, màng nylon (gi chặt các đoạn ADN được chuyển lên ữ

từ gel điện di) Phía trên để một lớp giấy thấm Trên cùng đặt một vật nặng

dẫn chuyển là NaOH 0,5M trong 8-12h

Các bước ti n h nh (ti p) ế à ế

3 Lai phân tử

 Các đoạn ADN cố định trên màng lai được đem lai với dung dịch mẫu dò đã được đánh dấu hoặc bằng p 32 hoặc một chất gây ph n ứng màu Quá tr ả ỡnh được thực hiện ở buồng lai (nhiệt độ 65- 68 0 C) trong thời gian 3- 12 giờ.

 Rửa màng lai ở 65 0 C bằng dung dịch SSC (NaCl 3M, natri citrat 0,3 M và nước, pH=7.0) để loại bỏ các mẫu dò không tham gia ph n ứng lai ả

Các bước ti n h nh (ti p) ế à ế

4 Xác định kết qủa bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiogragh)

 Màng lai sau khi được làm khô, lấy một tấm phim nhạy

X quang đặt lên màng lai và để trong một thiết bị chuyên dụng Xử lý ánh sáng tử ngoại, Nơi x y ra ph n ả ảứng lai sẽ mang hoạt tính phóng xạ (do có mặt mẫu dò),

Vị trí x y ra ph n ứng lai sẽ phát xạ vào phim Tráng ả ảphim sẽ thu được các vết đen tại nơi phát xạ địa điểm lai

Southern Blot Technique

Southern Blot Technique

 MOVIE_Southern Blot

Phương pháp Northern Blot

 Phương pháp lai Northern Blot là phương pháp lai

ARN của tế bào với mẫu dò ADN Về mặt nguyên lý

và các bước tiến hành cũng tương tự như phương pháp trên

 Phương phỏp này cho biết

 Sự cú mặt của mARN trong mụ

 Mức độ thể hiện của gen

 Độ lớn của mRNA

 Trỡnh tự tương đồng giữa đoạn mục tiờu và mẫu dũ

Northern blot

Western blot

 Lai Western Blot ®­îc thùc hiÖn gi a c¸c ữ

protein víi nhau dùa trªn nguyªn t¾c ph n øng ả miÔn dÞch gi a kh¸ng nguyªn vµ kh¸ng thÓ ữ

Các bước tiến hành - Western Blot

Mixture of protein molecules

Protein ở dạng cấu trúc 2' and 3' thường

không tích điện âm xử lý với SDS (sodium

dodecyl sulfate) để bọc protein với điện tích

âm

So sánh 3 phương pháp lai

Blot Type Matrix Molecule Detection

Cỏc phương phỏp lai khỏc

 Phương pháp lai tại chỗ (insitu hybridzation) nhằm tỡm ra đoạn ADN cần tỡm (gen mong muốn) ngay trong tế bào và mô

 Phương pháp lai trên khuẩn lạc

In situ hybridization

Là kỹ thuật dùng để xác định số bản copy của một đoạn DNA đặc thù có mặt trong tế bào Thường sử dụng mẫu dò được đánh dấu huỳnh quang (Fluorescence in situ hybridization

(FISH) hoặc động vị hoặc không đồng vị phóng xạ)

DNA probes có thể lai với chromosome của tế bào ở metaphase hoặc interphase

Mẫu dò ADN (DNA Probe)

mục tiêu

 Các loài có quan hệ họ hàng ­ heterologous probe

 Dịch ngược từ trình tự của protein

 Các trình tự có quan hệ về mặt tiến hóa

 Không giống hoàn toàn nhưng phải có tính tương tự

Thiết kế mẫu dò để phát hiện một gen khi đã

biết trình tự aa của protein

Bảng

mã di truyền

Đánh dấu không sử dụng phóng xạ