Báo cáo bài tập lớn dược liệu bình vôi (stephania)

BÁO CÁO BÀI TẬP LỚN DƯỢC LIỆU: BÌNH VÔI (Stephania) GVHD: Phan Nguyễn Quỳnh Anh Lớp: HC17HD Nhóm 3   NỘI DUNG I. SƠ LƯỢC VỀ CÂY BÌNH VÔI 6 1. Phân loại khoa học 6 2. Đặc điểm thực vật 7 2.1. Stephania glabra (Roxb.) Miers 7 2.2. Stephania kuinanensis H. S. Lo et M. Yang 7 2.3. Stephania pierrei Diels 8 2.4. Stephania hainanensis H. S. Lo et Y Tsoong 8 2.5. Stephania cambodiana Gagnep 8 2.6. Stephania dielsiana Y. C. Wu 8 2.7. Stephania excentrica H. S. Lo 9 2.8. Stephania cepharantha Hay 9 2.9. Stephania sinica Diels 9 2.10. Stephania viridiflavens H. S. Lo et M. Yang. 9 3. Phân bố, trồng hái và chế biến 9 II. THÀNH PHẦN HÓA HỌC 10 1. Rotundin 10 1.1. Công thức phân tử: C21H25NO4. 10 1.2. Công thức cấu tạo: 10 1.3. Tính chất vật lý 11 1.4. Một số kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học 11 2. Roemerin 12 2.1. Công thức phân tử: C18H17NO2. 12 2.2. Công thức cấu tạo 12 2.3. Tác dụng 12 3. Cepharanthin 12 3.1. Công thức phân tử: C37H38N2O6. 12 3.2. Công thức cấu tạo: 13 3.3. Tác dụng 13 III. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ ROTUNDIN TRONG CÂY BÌNH VÔI 13 1. Phương pháp chung chiết tách các hợp chất alkaloid 13 1.1. Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực. 13 1.2. Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid hoặc cồn (ethanol, methanol ) 15 1.3. Các phương pháp tách alcaloid dưới dạng tinh khiết 16 2. Tách chiết và tinh chế Rotundin từ củ Bình vôi 18 IV. CHIẾT XUẤT CÁC ALKALOID TRONG CÂY BÌNH VÔI 21 1. Chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm 21 2. Phương pháp chiết xuất Routundin trong công nghiệp 22 2.1. Chiết xuất Routundin thô 22 2.2. Quy trình tinh chế routundin thô 23 V. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH: 23 1. Định tính bằng thuốc thử 23 2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng 24 VI. ĐỊNH LƯỢNG ROTUNDIN 24 1. Định lượng bằng phương pháp cân: 24 1.1. Nguyên tắc chung 24 1.2. Các bước tiến hành: 25 2. Định lượng alkaloid bằng phương pháp acid base 26 2.1. Nguyên tắc chung 26 2.2. Các bước tiến hành 27 3. Phương pháp đo quang: 29 4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 30 VII. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA ROEMERINE 31 1. Nguyên liệu 31 2. Kiểm tra độ nhạy 31 3. Kết quả 31 VIII. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA ROUTUNDIN 33 IX. Ứng dụng 34 X. TÀI LIỆU THAM KHẢO: 35

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN HỮU CƠ

BÁO CÁO BÀI TẬP LỚN

DƯỢC LIỆU: BÌNH VÔI (Stephania)

GVHD: Phan Nguyễn Quỳnh Anh Lớp: HC17HD

Nhóm 3

NỘI DUNG

I SƠ LƯỢC VỀ CÂY BÌNH VÔI 6

1 Phân loại khoa học 6

2 Đặc điểm thực vật 7

2.1 Stephania glabra (Roxb.) Miers 7

2.2 Stephania kuinanensis H S Lo et M Yang 7

2.3 Stephania pierrei Diels 8

2.4 Stephania hainanensis H S Lo et Y Tsoong 8

2.5 Stephania cambodiana Gagnep 8

2.6 Stephania dielsiana Y C Wu 8

2.7 Stephania excentrica H S Lo 9

2.8 Stephania cepharantha Hay 9

2.9 Stephania sinica Diels 9

2.10 Stephania viridiflavens H S Lo et M Yang 9

3 Phân bố, trồng hái và chế biến 9

II THÀNH PHẦN HÓA HỌC 10

1 Rotundin 10

1.1 Công thức phân tử: C21H25NO4 10

1.2 Công thức cấu tạo: 10

1.3 Tính chất vật lý 11

1.4 Một số kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học 11

2.1 Công thức phân tử: C18H17NO2 12

2.2 Công thức cấu tạo 12

2.3 Tác dụng 12

3 Cepharanthin 12

3.1 Công thức phân tử: C37H38N2O6 12

3.2 Công thức cấu tạo: 13

3.3 Tác dụng 13

III PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ ROTUNDIN TRONG CÂY BÌNH VÔI 13

1 Phương pháp chung chiết tách các hợp chất alkaloid 13

1.1 Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực 13 1.2 Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid hoặc cồn (ethanol, methanol ) 15

1.3 Các phương pháp tách alcaloid dưới dạng tinh khiết 16

2 Tách chiết và tinh chế Rotundin từ củ Bình vôi 18

IV CHIẾT XUẤT CÁC ALKALOID TRONG CÂY BÌNH VÔI 21

1 Chiết bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm 21

2 Phương pháp chiết xuất Routundin trong công nghiệp 22

2.1 Chiết xuất Routundin thô 22

2.2 Quy trình tinh chế routundin thô 23

V PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH: 23

1 Định tính bằng thuốc thử 23

2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 24

VI ĐỊNH LƯỢNG ROTUNDIN 24

1 Định lượng bằng phương pháp cân: 24

1.1 Nguyên tắc chung 24

1.2 Các bước tiến hành: 25

2 Định lượng alkaloid bằng phương pháp acid- base 26

2.1 Nguyên tắc chung 26

2.2 Các bước tiến hành 27

3 Phương pháp đo quang: 29

4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 30

VII PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA ROEMERINE 31

1 Nguyên liệu 31

2 Kiểm tra độ nhạy 31

3 Kết quả 31

VIII PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA ROUTUNDIN 33

IX Ứng dụng 34

X TÀI LIỆU THAM KHẢO: 35

MỤC LỤC HÌNH

Hình 1 Cây bình vôi 6

Hình 2 Củ bình vôi khô 9

Hình 3 Công thức cấu tạo của Rotundin 11

Hình 4 Công thức cấu tạo của Roemerin 12

Hình 5 Công thức cấu tạo của Cepharanthin 13

Hình 6 Sơ đồ chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực 15

Hình 7 Sơ đồ quy trình chiết L- Tetrahydropalmatin từ củ bình vôi 21

Hình 8 MIC của roemerine và kháng sinh trong môi trường nuôi cấy Mueller-Hinton 32

Hình 9 Sự ức chế phụ thuộc vào nồng độ của roemerine đến sự sinh trưởng của bốn chủng S aureus 32

Hình 10 Trục quay Rotarod 33

Hình 11 Sơ đồ nghiên cứu thời gian bám của chuột trên trục quay Rotarod 33

Hình 12 Viên Rotundin 30mg 34

I SƠ LƯỢC VỀ CÂY BÌNH VÔI

1 Phân loại khoa học

Hình 1 Cây bình vôi

Giới (regnum): Plantae(không phân hạng): Angiospermae(không phân hạng) Eudicots

Bộ (ordo): Ranunculales

Họ (familia): Menispermaceae

Chi (genus): Stephania Lour.

Chi Stephania có khoảng trên 45 loài Một số loài công bố ở Việt Nam:

 Stephania glabra (Roxb.) Miers

 Stephania kuinanensis H S Lo et M Yang

 Stephania pierrei Diels

 Stephania hainanensis H S Lo et Y Tsoong

 Stephania cambodiana Gagnep

 Stephania excentrica H S Lo

 Stephania cepharantha Hay

 Stephania sinica Diels

 Stephania viridiflavens H S Lo et M Yang

 Stephania brachuandra Diels

 Stephania kwangsiensis H S Lo

2 Đặc điểm thực vật

2.1 Stephania glabra (Roxb.) Miers

Thân leo phát triển từ củ hình tròn, củ thường nằm ở khe đá, vỏ củ có các nốt sần, đôi khi

có những rãnh nhỏ ngang dọc Nhựa từ thân và lá không mang màu Lá đơn, mọc so le,mép lá nguyên, đôi khi hơi chia thùy phần ngọn lá Toàn thân và lá không có lông Cuống

lá dài 6 – 25 cm, gốc hơi phình lên và cong Phiến lá hình tim, ngọn lá thuôn nhọn, mặtdưới xanh lợt Lá có 9 – 11 gân xếp tỏa tròn do cuống lá dính vào 1/3 phiến lá tính từ gốclá

Cụm hoa đực dạng tán kép, cuống cụm hoa dài 3 – 12 cm, mỗi cuống cụm hoa gồm nhiềután, mỗi tán lại có nhiều tán cấp II, mỗi cuống tán cấp II mang 4 tán cấp III, kết thúc gồm

3 hoa với cuống của mỗi hoa rất ngắn Hoa đực gồm 6 đài rời xếp thành 3 vòng (3 + 3),kích thước gần như bằng nhau Đài hình trứng hẹp, chiều dài 1,55 mm Ba cánh hoa hìnhtrứng màu xanh khi còn trong nụ và chuyển màu vàng khi hoa nở, gốc cánh hoa đôi khi cóthể tuyến Bộ nhị hàn liền thành 1 trụ với 6 bao phấn màu vàng xếp thành vòng tròn, trên

1 trụ do chỉ nhị hàn liền tạo thành cột ngắn 0,5 – 1 mm Khi hoa nở, các bao phấn mở nắpngang ra xung quanh Hạt phấn nhỏ màu vàng

Cụm hoa dạng xim tán, cuống các bông hoa rất ngắn nên các bông hoa xếp xít vào nhauthành dạng đầu Mỗi đầu gồm 20 – 70 bông hoa Cuống cụm hoa dài 2 – 5 cm Hoa cáibất đối xứng Mỗi hoa có một lá đài hình elip dài 1 mm Hai cánh hoa gần như tròn,đường kính 1 – 1,2 mm, 1 đài và 2 cánh hoa xếp lệch về một phía của hoa Bầu hìnhtrứng, núm nhụy chia 4 – 5 thùy dạng gai nhỏ và hầu như không có vòi nhụy

Quả hạch hình trứng ngược dài 5 – 6 mm, rộng 4 – 5 mm Vỏ quả ngoài nhẵn, lúc nonmàu xanh, chuyển sang màu vàng rồi đỏ sẫm khi chín Hạt hình trứng ngược, cụt một đầu,

vỏ hạch cứng chia nhiều vạng (17 – 20 vạch) Giá noãn có lỗ thủng ở giữa

Mùa hoa: tháng 2 – 4

Mùa quả: tháng 5 – 6

2.2 Stephania kuinanensis H S Lo et M Yang

Thân leo dài 2 – 3 m, củ tròn, bề mặt vỏ củ có nhiều nốt sần Toàn cây không có lông, lá

có cuống, phiến lá dạng tam giác, chop lá nhọn, gốc lá thay đổi từ từ đến gần bằng ít khihơi lõm nông và rộng Gân chính 9 – 10 chiếc, xếp dạng chân vịt, hệ gân phụ dạng mạngrõ

Cụm hoa đực xim tán kép mọc ở nách lá, cuống cụm hoa dạng sợi nhỏ dài 1 – 3,5 cm.Đỉnh cuống cụm hoa có 6 – 7 cuống tán giả (xim tán) dài 0,6 – 0,8 cm Gốc mỗi cuốngtán giả có một lá bắc hình mác nhỏ dạng vạch Mỗi tán lá giả có 5 – 6 xim nhỏ Mỗi ximnhỏ có 5 – 6 hoa Hoa đực nhỏ, cuống ngắn 0,5 mm, có 6 lá đài xếp 2 vòng, 3 lá đài vòngtronh hình thìa dài khoảng 1,5 mm, rộng khoảng 0,5 mm, 3 cánh hoa hình quạt gần tròn,cong lõm đều, cao khoảng 0,8 – 1 mm, rộng 1 – 1,5 mm, phía trong gốc cánh hoa có 2tuyến Nhị đính thành cột ngắn, bao phấn dính liền thành đĩa, nứt ngang

Cụm hoa cái gần dạng đầu có cuống dạng sợi nhỏ dài 1 – 1,5 cm Đỉnh cuống cụm hoa có

6 – 7 xim nhỏ Ở gốc mỗi xim nhỏ có một phiến lá bắc dạng gai nhỏ, mềm Mỗi xim nhỏ

có 6 hoa Hoa cái nhỏ, gần như không cuống, có một lá đài hình trứng ngược cao 1 – 1,2

mm, rộng 0,5 – 0,7 mm Hai cánh hoa gần tròn, cong dạng vỏ hến, đường kính 1,5 mm.Bầu hình trứng, đường kính 4 – 5 mm, núm nhụy có 5 thùy dạng gai nhỏ mềm ngả ra phíangoài

Chùm quả nhỏ, ít quả Quả hạch hình trứng ngược, khi chín màu hồng Vỏ quả trong hìnhtrứng ngược, dài 5,5 – 6,5 mm, rộng 5,5 mm Trên lưng có hai hàng vân ngang dạng trụ.Hai đầu trụ tù tròn, tạo thành 4 hàng vân hạt trên lưng vỏ quả trong Giá noãn có lỗ

Mùa hoa: tháng 3 – 5

Mùa quả: tháng 6 – 7

2.3 Stephania pierrei Diels

Ngọn có nhiều chấm màu tím hồng Lá có kích thước nhỏ hơn tất cả các loài khác Hoađực không có cánh hoa

2.4 Stephania hainanensis H S Lo et Y Tsoong

Cành non và cuống lá có dịch màu trắng hoặc vàng nhạt

2.5 Stephania cambodiana Gagnep

Cuống cụm hoa và cuống tán giả dài hơn so với các loài khác

2.6 Stephania dielsiana Y C Wu

Nửa cuống lá phía đính vào phiến lá và gân lá mặt sau có màu tím hay tím hồng.

2.7 Stephania excentrica H S Lo

Cuống lá rất dài, có khi đến 14 cm Giá noãn có lỗ lệch một bên

2.8 Stephania cepharantha Hay

Giá noãn không có lỗ

2.9 Stephania sinica Diels

Giá noãn không có lỗ

2.10 Stephania viridiflavens H S Lo et M Yang.

Lá có phiến tam giác, cuống lá bằng hoặc dài hơn phiến lá

3 Phân bố, trồng hái và chế biến

Các loài bình vôi ở nước ta phân bố khá rộng trên cả 3 miền Bắc, Trung, Nam Thườnggặp ở các vùng núi đá vôi: Tuyên Quang, Hòa Bình, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái Nguyên,Phú Thọ, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Lâm Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu… Một số loài thương

chỉ gặp ở vùng núi đất và biển như Stephania pierrei Diels, Stephania brachuandra Diels,

Stephania hainanensis H S Lo et Y Tsoong Riêng loài Stephania pierrei Diels tập trung

chủ yếu ở các tỉnh ven biển Bình Định, Phú Yên, Ninh Thuận

Hiện nay ta đang thu hái củ bình vôi chủ yếu từ nguồn mọc hoang Khi thu về đem cạosạch vỏ nâu đen, thái lát mỏng đem phơi hoặc sấy khô hoặc đem chiết lấy 1-tetrahydropalmatin

Có thể trồng bằng hạt Thu hái quả chín, sấy lấy hạt đem gieo Ngoài ươm cây giống bằnghạt có thể lấy các đoạn thân cây hoặc cắt phần đầu của củ đem trồng

Hình 2 Củ bình vôi khô

Trong củ bình vôi có alkaloid Các loài cây bình vôi ta đang khai thác có alkaloid chính là

l – tetrahydropalmatin Hàm lượng alkaloid toàn phần cũng như l – tetrahydropalmatin(rotundin) thay đổi tùy theo loài và vùng thu hái

Theo Bùi Thị Hằng, hàm lượng l – tetrahydropalmatin đạt 3,55% ở loài Stephania

brachuandra Diels (thu hái ở Hoàng Liên Sơn), 1,31% ở loài Stephania kwangsiensis H.

S Lo (thu hái ở Quảng Ninh), 0,72% ở loài Stephania hainanensis H S Lo et Y Tsoong (thu hái ở Thanh Hóa), 0,62% ở loài Stephania cambodiana Gagnep (thu hái ở Lâm Đồng), 0,29% ở loài Stephania cepharantha Hay (thu hái ở Hà Sơn Bình), 0,21% ở loài

Stephania pierrei Diels (thu hái ở Tây Nguyên).

Theo Nguyễn Tiến Vững, Phạm Thanh Kỳ, loài Stephania glabra (Roxb.) Miers thu hái ở Ninh Bình có 2,96% alkaloid toàn phần và 0,59% l – tetrahydropalmatin; loài Stephania

kuinanensis H S Lo et M Yang thu hái ở Lạng Sơn có 4,41% alkaloid toàn phần và

3,06% l – tetrahydropalmatin

Năm 1941, Bùi Đình Sang chiết từ củ bình vôi một hỗn hợp alkaloid, trong đó chủ yếu là

l – tetrahydropalmatin gọi à rotundin Năm 1964, Ngô Văn Thu chiết được một alkaloidkhác từ củ bình vôi gọi tên là alkaloid A Đến năm 1971, Nuhn và Ngô Văn Thu xác địnhalkaloid A là roemerin Năm 1992, Ngô Thị Tâm đã chiết được cepharanthin từ loài

Stephania pierrei mọc ở Nghĩa Bình Nam 1997 – 1999, Nguyễn Tiến Vững, Phạm Thanh

Kỳ đã phân lập được l – tetrahydropalmatin, roemerin, palmatin từ loài Stephania glabra mọc ở Ninh Bình và l – tetrahydropalmatin, stepharin từ củ loài Stephania kuinanensis

mọc ở Lạng sơn; cycleanin từ loài bình vôi thu hái ở Quảng Ninh Năm 1999, Nguyễn ThịHoài An đã phân lập được 3 alkaloid từ củ bình vôi mọc ở Mộc Châu (Sơn La) là 9,10 –hydroxy, 2,3 – dimethoxy tetrahydro – protoberberine, stepholidin,tetrahydrocolumbamin

Ngoài alkaloid, trong củ bình vôi còn có tinh bột, đường và acid hữu cơ.

1 Rotundin

1.1 Công thức phân tử: C 21 H 25 NO 4

1.2 Công thức cấu tạo:

Hình 3 Công thức cấu tạo của Rotundin

Danh pháp IUPAC: isoquinolino[2,1-b] isoquinoline

(13aS)-2,3,9,10-tetramethoxy-6,8,13,13a-tetrahydro-5H-1.3 Tính chất vật lý

Bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, không mùi không vị

Không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ như ethanol, ether, chloroform Kết tinh trong cồn có điểm chảy: 141 - 144°C

1.4 Một số kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Năm 1941, DS Trần Xuân Thuyết cùng với Giáo Sư, Tiến Sĩ Đỗ Tất Lợi và P.Bonnet đãphát hiện ra hỗ hợp alkaloid của củ bình vôi, đặt tên là rotundin – có tác dụng an thần gâyngủ, hạ huyết áp, điều hòa tim, giãn cơ trơn, do đó giảm các cơn đau do co thắt cơ trơn,đưa Việt Nam trở thành nước đầu tiên trên thế giới chiết được rotundin (1944: Nhật;1957: CHDC Đức; 1960: Liên Xô; 1962: Trung Quốc…)

Theo Ngô Đại Quang (1999) tác dụng dược lý của rotundin đã được nghiên cứu ở nước ta

từ thời Pháp thuộc Rotundin được áp dụng từ năm 1944 và suốt trong cuộc kháng chiến

chống Pháp đã được dùng để điều trị có kết quả một số trường hợp đau tim, mất ngủ, hen,đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và an thần Rotundin nguồn gốc tự nhiên cónhững ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh

lý Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từhóa chất

Phan Thị Kim, Bùi Minh Đức và các cán bộ khoa học khác ở Viện Dinh Dưỡng và Họcviện Quân y đã thử nghiệm routindin liều cao trên chuột (150 mg/kg thể trọng) tươngđương với 7,5 g dùng cho người lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dược điển TrungQuốc – 1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được LD50 đường uống.Điều đó chứng tỏ độ an toàn là cao của chế phẩm Rotundin ít độc Khi tiêm vào mạchmáu thỏ với liều 30 mg/kg, con vật đó tuy mệt nhất thời nhưng lại khỏi sau 1 – 2 ngày ỞTrung Quốc, ngoài dạng viên 30 mg và 60 mg, rotundin còn ở dạng tiêm là rotundinsulfat, mỗi ống 2 ml (60 mg) làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ trong điều thị loét dạdày hành tá tràng, đau dây thần kinh, mất ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh, hen thắt phếquảng

2 Roemerin

2.1 Công thức phân tử: C 18 H 17 NO 2

2.2 Công thức cấu tạo

Hình 4 Công thức cấu tạo của Roemerin

2.3 Tác dụng

Theo Fakhrutdino Sf (1962), roemerin gây tê niêm mạc và phong bế Đối với tim ếch côlập, roemerin có tác dụng ức chế, giảm biên độ và tần số co bóp, với liều cao tim ếchngừng đập ở thời kỳ tâm trương Roemerin đối kháng với tác dụng tăng co bóp ruột củaacetylcholine Đối với hệ thần kinh trung ương, với liều thấp, roemerin có tác dụng anthần, gây ngủ, liều cao kích thích gây co giật dẫn đến tử vong Roemerin còn có tác dụnggiãn mạch, hạ huyết áp Liều LD50 trên chuột là 0,125 g/kg tương đương với liều độc củacocain hydroclorid.

3 Cepharanthin

3.1 Công thức phân tử: C 37 H 38 N 2 O 6

3.2 Công thức cấu tạo:

Hình 5 Công thức cấu tạo của Cepharanthin

3.3 Tác dụng

Theo kết quả nghiên cứu của Mutsuo Kozuka, Kryoe Miyaji, Tokunosuke Sawada vàMasao Tomita (1984), cepharanthin có tác dụng giãn mạch nhẹ trên những mạch vi tuầnhoàn, có tác dụng tăng cường sinh sản kháng thể nên có tác dụng rõ rệt đối với các bệnhgiảm bạch cầu do bệnh nhân bị bom nguyên tử, do chiếu tia phóng xạ, do dùng thuốcchữa ung thư, sự biến động số lượng hồng cầu hoặc sắc tố máu hầu như không có thay đổikhi dùng cepharanthin Tác dụng phụ do uống cepharanthin liều cao không thấy xuất hiện

III PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ ROTUNDIN TRONG CÂY BÌNH VÔI

1 Phương pháp chung chiết tách các hợp chất alkaloid

Theo bộ môn Công nghiệp Dược (2001), Dựa vào các tính chất chung của alkaloid người

ta đưa ra 2 phương pháp chung để chiết tách alkaloid ra khỏi nguyên liệu thực vật, baogồm:

- Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực

- Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid hoặc cồn(ethanol, methanol )

1.1 Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực

Ưu điểm:

Hiệu suất chiết các hoạt chất từ dược liệu cao do dịch chiết rút ra sạch, dễ tinh chế loạicác tạp đi kèm theo Các dung môi hữu cơ không phân cực thường là các dung môi có khảnăng chiết chọn lọc đối với các alkaloid ở dạng base

 Nhược điểm:

Dung môi hữu cơ thường là các dung môi đắt tiền Khi sử dụng các dung môi này để chiếtđòi hỏi các thiết bị phức tạp

Phương pháp này bao gồm các giai đoạn sau:

 Giai đoạn 1: Chuẩn bị nguyên liệu

Để tăng khả năng chiết ta phải chia nhỏ dược liệu trước khi chiết nhằm làm tăng bề mặttiếp xúc giữ hai pha rắn và lỏng đẩy nhanh quá trình khuếch tán Tuy nhiên nếu ta chianhỏ dược liệu quá thì dung môi sẽ khó chuyển động qua khối dược liệu và ta rất khó thuđược dịch chiết, do đó tùy thuộc vào từng loại dược liệu ta có thể xay nhỏ khác nhau vừa

để đảm bảo đẩy nhanh quá trình khuếch tán vừa dể dàng trong rút dịch chiết

Kiềm hóa và làm trương nở nguyên liệu bằng dung dịch kiềm (thường dùng Ca(OH)2,

NH4OH, Na2CO3…) để chuyển alkaloid trong nguyên liệu sang dạng base

 Giai đoạn 2: Chiết

Sử dụng các dung môi chiết là các dung môi hữu cơ không phân cực (các dung môi khônghòa lẫn với nước)

 Giai đoạn 3: Tinh chế

Tinh chế thu các alkaloid bằng cách chuyển dạng muối với acid và chuyển dạng basebằng kiềm và phân chia chúng giữa hai pha dung môi hữu cơ không phân cực và nước đểloại các tạp chất không phải alkaloid

Hình 6 Sơ đồ chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực

Ứng dụng:

Hiện nay hầu hết các alkaloid được sản xuất trong nước cũng như trên thế giới sữ dụngphương pháp này Mặt khác phương pháp này khi sử dụng chiết các dược liệu có nhiềuchất nhầy có độ trương nở cao, tránh được sự trương nở quá mức của dược liệu và sự hòatan chất nhầy vào dung môi gây khó khăn cho rút dịch chiết và tinh chế

1.2 Phương pháp chiết alkaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid hoặc cồn (ethanol, methanol )

Ưu điểm:

Dung môi rẻ tiền, dể kiếm

Thiết bị chiết xuất đơn giản, đầu tư ít

Phương pháp tiến hành bao gồm các giai đoạn sau:

 Chuẩn bị nguyên liệu

Nguyên liệu thực vật được xay thô, sau đó được làm ẩm cho trương nở bằng nước

 Tiến hành chiết

Sử dụng dung môi là nước chiết alkaloid dưới dạng muối tự nhiên hoặc muối với acid vô

cơ, hoặc dung môi là cồn ethylic hoặc methylic để chiết alkaloid cả dưới dạng muối vàbase

 Tinh chế:

Trong trường hợp chiết bằng nước, alkaloid base được giải phóng từ dịch chiết bằng cáchthêm kiềm sau đó được chiết bằng một dung môi hữu cơ không hòa tan trong nước Tiếptục tinh chế bằng cách bốc hơi dung môi và kết tinh lại trong dung môi hữu cơ hoặcchuyển sang dạng kết tinh lại

Trong trường hợp chiết bằng cồn, dịch chiết cồn được cô đặc , thêm acid và loại các tạpchất bằng cách chiết bằng dung môi hữu cơ không phân cực, thêm kiềm chuyển alkaloidsang dạng base rồi chiết alkaloid bằng một dung môi hữu cơ Bốc hơi dung môi hữu cơrồi kết tinh alkaloid hoặc chuyển sang dạng muối kết tinh lại

Đối với các alkaloid khó tách có thể sử dụng phương pháp sắc ký hấp phụ hoặc phươngpháp trao đổi ion

1.3 Các phương pháp tách alcaloid dưới dạng tinh khiết

Thăng hoa

Thăng hoa có thể thực hiện trực tiếp trên dược liệu như tách caffein từ chè hoặc có thể sửdụng để tách và tinh chế các hợp chất có trong dịch chiết thô Các thiết bị hiện đại chophép sử dụng áp suất giảm và kiểm soát được nhiệt độ trong quá trình thăng hoa

Cất

Cất phân đoạn thường được sử dụng để tách các hợp phần trong một hỗn hợp các chất dễbay hơi Trong hóa thực vật nó được sử dụng rộng rãi trong phân lập các hợp phần củatinh dầu Tuy nhiên khó có thể sử dụng phương pháp này để tách các hợp phần phụ tronghỗn hợp tinh dầu dưới dạng tinh khiết Để phân lập tinh dầu và acid hydrocyanic và một

số alcaloid thể lỏng như spartein, nicotin từ thực vật thường sử dụng phương pháp cắt lôicuốn hơi nước

Giải phóng phân đoạn

Một số nhóm các hợp chất tự nhiên có thể giải phóng phân đoạn từ một hỗn hợp Có thểlấy ví dụ một hỗn hợp muối alcaloid trong dung dịch nước nếu thêm từ từ vừa đủ từngphần kiềm lúc đầu các base yếu nhất sẽ được giải phóng ra dưới dạng base tự do Tăngdần độ kiềm lên sẽ lần lượt giải phóng các base có tính kiềm mạnh dần Mỗi lần thêmkiềm vào ta lắc hỗn hợp với dung môi hữu cơ ta sẽ thu được một loạt các phân đoạn base

Có thể dùng phương pháp này để tách các acid hữu cơ có thể hoà tan trong dung môikhông trộn lẫn nước Nếu ta có một hỗn hợp muối các acid hữu cơ ta có thể giải phóngphân đoạn các acid đó bằng cách thêm dần các acid vô cơ

Kết tinh phân đoạn

Đây là một phương pháp phân lập đã được sử dụng nhiều trước đây và hiện nay vẫn cógiá trị trong việc tách các hỗn hợp khó tách Phương pháp này sử dụng độ tan khác nhaucủa một hợp phần của một hỗn hợp cần tách trong một dung môi hoặc hỗn hợp dung môinhất định Người ta thường sử dụng các dẫn xuất của các hợp phần cần tách để thay đổi

độ tan của nó (ví dụ muối pirat của các alkaloid, asazon của đường)

Sắc ký hấp phụ

Trong các trường hợp khác nhau tách và phân lập các hợp chất từ thực vật, kỹ thuật sắc

ký là một trong những kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất Để tẩy màu và làm trong dungdịch ta sử dụng than hoạt, các tạp chất màu sẽ bị hấp phụ bởi than hoạt và sau khi lọc ta sẽthu được một dung dịch không màu

Tất cả các chất rắn khi được phân chia nhỏ đều có khả năng hấp phụ ít nhiều các chấtkhác trên bề mặt của nó và ngược lại tất cả các chất đều có thể bị hấp phụ từ dung dịch ởcác mức độ khác nhau Hiện tượng hấp phụ chọn lọc là nguyên lý cơ bản của sắc ký Quátrình cơ bản của sắc ký có thể được mô tả dựa trên thí nghiệm của Tswett như sau:

Dịch chiết ether dầu hoả (40-60°C) của lá cây tươi được cho qua một cột thuỷ tinh thẳngđứng trong có chứa bột Calci carbonat Các sắc tố trong cột bị hấp phụ vào chất nhồi cột

và sẽ tách trong quá trình chảy qua cột Các sắc tố hấp phụ mạnh hơn như xanthophyl vàclorophyl sẽ tập trung thành các băng màu đặc trưng rõ rệt gần đỉnh cột trong khi các sắc

tố có độ hấp phụ kém hơn như các caroten tập trung ở các băng thấp hơn phía dưới

Thường việc tách hoàn toàn các thành phần thành các băng rõ rệt không xảy ra ở giaiđoạn hấp phụ đầu tiên mà trong giai đoạn này các băng còn tập trung gần nhau ở phầnđỉnh cột Tiếp tục triển khai cột bằng dung môi tinh khiết, các chất bị hấp phụ sẽ dichuyển dần xuống phía dưới và các băng được tách ra xa nhau hơn Trong nhiều trườnghợp quá trình được tiến hành hiệu quả hơn nhờ sử dụng dung môi triển khai khác mà cácchất ít bị hấp phụ từ nó hơn Ví dụ nếu ether dầu hỏa có chứa một ít alcol được cho thẳng

qua cột trong thí nghiệm được mô tả ở trên thì các băng sẽ tách ra xa nhau hơn và sẽ chạyqua cột nhanh hơn so với khi chỉ dùng ether - dầu hỏa để triển khai Khi ta cho dung môitiếp tục chạy qua cột, băng thấp hơn trong cột sẽ chạy tới đáy và biến mất, sắc tố sẽ thuđược ở dịch chảy ra ở đáy cột Quá trình này gọi là quá trình giải hấp phụ (elution ), dungdịch đó được gọi là dung dịch giải hấp phụ (eluate ) Các chất dễ dàng hấp phụ từ cácdung môi không phân cực như ether dầu hỏa, benzen thường dễ dàng giải hấp phụ bằngcác dung môi phân cực như alcol, nước, piridin Một vài các hợp chất bị hấp phụ ở pHnhất định sẽ được giải hấp phụ ở một pH khác

Các chất khác nhau thường được dùng làm chất hấp phụ là: nhôm oxyd, silicagel,magnesi oxyd, kaolin, calci carbonat, than hoạt và các loại đường

Sucrose ở dạng bột được Tswett sử dụng để tách các chlorophyl A và B

Khi ta tiến hành sắc ký các chất không màu, các băng của các chất bị hấp phụ không thểtrông thấy được Trong một số trường hợp có thể sử dụng đèn tử ngoại để xác định cácvùng phát quang dưới ánh sáng tử ngoại hoặc có thể chia sắc phổ ra nhiều phần nhỏ riêngbiệt và giải hấp phụ hoặc chiết rừng phần nhỏ đó riêng rẽ Đôi khi người ta thu dịch giảihấp phụ của toàn bộ cột thành các phần riêng biệt rồi tiến hành phân tích riêng các phầnriêng biệt đó

Dụng cụ để tiến hành sắc ký hấp phụ rất đơn giản chỉ gồm một cột bảng thủy tinh trongnhồi chất hấp phụ Sắc ký hấp phụ thương được sử dụng trong phân lập và tinh chế cácVitamin, hormon, một số các alcaloid, các glycosid tim, antraquinon

2 Tách chiết và tinh chế Rotundin từ củ Bình vôi

Theo Ngô Đại Quang (1999) quy trình chiết tách được tiến hành như sau:

 Chiết tách sản phẩm thô:

Trước hết củ bình vôi được rửa sạch cạo vỏ ngoài rồi xát nhỏ thành miếng với kích thướcthích hợp rồi ngâm ở bể chứa dung dịch chiết xuất gồm nước và các chất đệm vô cơ ở pHthích hợp Các hoạt chất alcaloit sẽ hoà tan và được chiết ra khỏi bã Quá trình chiết đượcthực hiện 2-3 lần rồi bã được ép kiệt Dịch chiết để lắng, lọc và trung hoà ở ph thích hợp

để thu kết tủa Kết tủa được lọc, phơi và sấy

Sản phẩm thô sau khi sấy có hàm lượng rotundin vào khoảng 27- 32%

 Quá trình tinh chế: