Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng bánh men thuốc bắc và nồng độ đường ban đầu lên hàm lượng một số hợp chất thứ cấp trong sản phẩm rượu vang dứa

MỤC LỤC PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích đề tài 2 1.3. Nội dung đề tài 2 PHẦN 2 TỔNG QUAN 3 2.1. Giới thiệu về dứa 3 2.1.1. Giá trị của dứa 3 2.1.2. Thu hoạch và bảo quản dứa 4 2.2. Giới thiệu về rượu vang 5 2.2.1. Giá trị rượu vang 5 2.2.2. Phân loại rượu vang 5 2.2.3. Tiêu chuẩn chất lượng vang 5 2.2.4. Thành phần cơ bản của vang 7 2.3. Quá trình lên men rượu vang 9 2.3.1. Giới thiệu về nấm men 9 2.3.2. Nấm men dùng trong sản xuất rượu vang 11 2.3.3. Cơ chế lên men rượu 13 2.3.4. Sự tạo thành các sản phẩm phụ của quá trình lên men rượu 18 2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men vang 21 2.4.1. Ảnh hưởng của hàm lượng đường 21 2.4.2. Ảnh hưởng của độ pH 21 2.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ rượu 21 2.4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ 22 2.4.5. Ảnh hưởng của acid hữu cơ 22 2.4.6. Ảnh hưởng của Nitơ 22 2.4.7. Ảnh hưởng của các loại muối khoáng 23 2.4.8. Ảnh hưởng của lượng men giống 23 2.4.9. Ảnh hưởng nồng độ ôxy hoà tan 23 PHẦN 3 VẬT LIỆU, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 25 3.1.1. Vật liệu 25 3.1.2. Phạm vi 26 3.2. Nội dung nghiên cứu 26 3.2.1. Nghiên cứu xác định hàm lượng đường của dịch dứa theo độ chín 26 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thông số lên hàm lượng ethanol và các sản phẩm bậc hai tạo thành trong sản phẩm 26 3.3. Phương pháp nghiên cứu 27 3.3.1. Phương pháp vật lý 27 3.3.2. Phương pháp hóa học 27 3.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm để thực hiện nội dung nghiên cứu 29 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1. Nghiên cứu xác định nồng độ chất khô trong dứa theo độ chín 35 4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khô lên sự biến đổi một số chỉ tiêu trong quá trình lên men. 36 4.2.1. Sự thay đổi của Bx theo thời gian với các nồng độ chất khô ban đầu của dịch lên men khác nhau 40 4.2.2. Sự thay đổi của giá trị pH. 43 4.2.3. Sự thay đổi của giá trị ethanol 45 4.2.4. Sự thay đổi của giá trị của các sản phẩm bậc hai 46 4.2.5. Xác định thời gian lên men chính 53 4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng bánh men lên hàm lượng ethanol và các sản phẩm bậc hai tạo thành trong sản phẩm. 55 4.3.1. Ảnh hưởng của khối lượng bánh men ban đầu lên giá trị Bx 55 4.3.2. Ảnh hưởng của khối lượng bánh men ban đầu lên giá trị pH 56 4.3.3. Ảnh hưởng của khối lượng bánh men ban đầu lên giá trị ethanol 57 4.3.4. Ảnh hưởng của khối lượng bánh men ban đầu lên giá trị các sản phẩm bậc hai tạo ra trong quá trình lên men 58 PHÂN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 5.1. Kết luận 62 5.2. Kiến nghị 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 66 KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT Acetyl – CoA: Acetyl coenzyme A A. awamori: Aspergillus awamori A. usami: Aspergillus usami A. flavus: Aspergillus flavus A. niger: Aspergillus niger ATP: Adenosine Triphosphate ATTP: An toàn thực phẩm B. cereus: Bacillus cereus Bộ NN và PTNT: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn E. Coli: Escherichia coli EDTA: Ethylenediaminetraacetic acid EMP: Electromagnetic pulse FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc hay Tổ chức Nông lương Liên Hiệp Quốc). FAD: flavin adenine dinucleotide Gr: gram M. sircinilloides: Mucor sircinilloides NAD+: Nicotinamide adenine dinucleotide P. aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam RE: Refined Extra PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Việt Nam có đặc điểm địa hình khá đặc biệt, dài và hẹp, khoảng cách từ cực Nam đến cực Bắc là 1650 km. Theo chiều dài đất nước, Việt Nam có nhiều vùng khí hậu khác nhau dẫn đến việc hình thành các vùng sinh thái nông nghiệp khác nhau. Sản phẩm nông nghiệp nói chung và sản phẩm rau trái nói riêng vì vậy mà rất đa dạng và phong phú. Trong đó phải kể đến là dứa. Nhờ đặc tính dễ thích nghi trong bất kỳ điều kiện thời tiết trải dài từ Bắc vào Nam, dứa một loại trái cây nhiệt đới cho giá trị kinh tế lẫn chất lượng dinh dưỡng khá cao. Trong những năm qua, dứa đã trở thành một loại quả có giá trị xuất khẩu cao, được nhiều thị trường trong và ngoài nước yêu thích nhất là thị trường các nước Châu Âu và các nước thuộc vùng khí hậu ôn đới. Việc sử dụng dứa để làm nguyên liệu cho một số ngành công nghệ trong đó có công nghệ rượu vang là điều tất yếu để phát triển sản phẩm từ nông sản này. Ở một số quốc gia trên thế giới, sản xuất rượu vang trở thành một ngành mang lại doanh thu lớn và tạo dựng được những thương hiệu nổi tiếng trên thị trường như: Robert Mondavi (Mỹ), Château GruaudLarose (Pháp), Concha Y Toro (Chile), Urbina (Tây Ban Nha), Lucente (Ý), .... Bên cạnh việc dùng nho làm nguyên liệu sản xuất chính cho vang thì việc sử dụng những nguên liệu khác để làm đa dạng hóa thị trường vang đang là hướng đi mới đầy tiềm năng hiện nay. Ở Việt Nam, cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội nhu cầu thị hiếu của người tiêu dùng về rượu vang ngày càng cao. Tuy nhiên, ngành công nghiệp sản xuất rượu vang ở nước ta vẫn chưa thực sự đáp ứng được những yêu cầu đó, quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng còn hạn chế. Nhiều sản phẩm rượu trên thị trường còn chứa nhiều các hợp chất thứ cấp như methanol, aldehyd, rượu bậc cao, .... gây ngộ độc rượu cho người sử dụng. Bên cạnh đó Việt Nam có nguồn men là bánh men truyền thống cũng cần phải tìm cách để chúng được ứng dụng rỗng rãi hơn và cho chất lượng rượu tốt hơn. Vì vậy việc nghiên cứu nâng cao chất lượng sản phẩm bằng cách hoàn thiện công nghệ sản xuất là vấn đề cần thiết. Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu và khối lượng bánh men thuốc bắc gieo cấy ban đầu lên hàm lượng một số hợp chất trong sản phẩm rượu vang dứa”. 1.2. Mục đích đề tài Mục tiêu chung: góp phần đa dạng hóa sản phẩm từ quả dứa. Mục tiêu cụ thể: cung cấp một số thông số công nghệ thích hợp có ảnh hưởng đến hàm lượng các sản phẩm bậc hai tạo thành trong quá trình lên men rượu dứa gồm: nồng độ đường ban đầu và khối lượng bánh men thuốc bắc gieo cấy ban đầu. 1.3. Nội dung đề tài Xác định độ chín của quả dứa thích hợp (dựa trên màu sắc của vỏ) để làm nguyên liệu lên men rượu. Nghiên cứu xác định một số thông số công nghệ thích hợp cho quá trình lên men rượu từ nước dứa nhằm thu được sản phẩm chứa các hợp chất bậc hai thấp, bao gồm: + Nồng độ chất khô ban đầu. + Hàm lượng bánh men sử dụng gieo cấy ban đầu.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ

Khoa Cơ khí – Công nghệ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPTÊN ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng bánh men thuốc bắc và nồng độ đường ban đầu lên hàm lượng một số hợp chất thứ cấp trong sản phẩm rượu vang dứa

Sinh viên thực hiện:

Lớp: Công nghệ thực phẩm 48C Thời gian thực hiện: 11/2018 – 03/2019 Địa điểm thực hiện: Trung Tâm Nghiên Cứu, Ứng Dụng và Thông Tin Khoa Học và Công Nghệ thuộc Sở Khoa Học và Công Nghệ tỉnh Quảng Trị

Giáo viên hướng dẫn: PGS TS Đỗ Thị Bích Thủy

Bộ môn: Công nghệ thực phẩm

HUẾ - 2019

DANH MỤC BẢNG BIỂU

2

DANH MỤC HÌNH ẢNH

KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

Acetyl – CoA: Acetyl coenzyme A

A awamori: Aspergillus awamori

A usami: Aspergillus usami

A flavus: Aspergillus flavus

A niger: Aspergillus niger

ATP: Adenosine Triphosphate

ATTP: An toàn thực phẩm

B cereus: Bacillus cereus

Bộ NN và PTNT: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

E Coli: Escherichia coli

EDTA: Ethylenediaminetraacetic acid

EMP: Electromagnetic pulse

FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc hay Tổ chức Nông lương Liên Hiệp Quốc)

FAD: flavin adenine dinucleotide

Gr: gram

M sircinilloides: Mucor sircinilloides

NAD+: Nicotinamide adenine dinucleotide

P aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

RE: Refined Extra

4

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam có đặc điểm địa hình khá đặc biệt, dài và hẹp, khoảng cách từcực Nam đến cực Bắc là 1650 km Theo chiều dài đất nước, Việt Nam có nhiềuvùng khí hậu khác nhau dẫn đến việc hình thành các vùng sinh thái nông nghiệpkhác nhau Sản phẩm nông nghiệp nói chung và sản phẩm rau trái nói riêng vìvậy mà rất đa dạng và phong phú Trong đó phải kể đến là dứa Nhờ đặc tính dễthích nghi trong bất kỳ điều kiện thời tiết trải dài từ Bắc vào Nam, dứa - một loạitrái cây nhiệt đới cho giá trị kinh tế lẫn chất lượng dinh dưỡng khá cao Trongnhững năm qua, dứa đã trở thành một loại quả có giá trị xuất khẩu cao, đượcnhiều thị trường trong và ngoài nước yêu thích nhất là thị trường các nước Châu

Âu và các nước thuộc vùng khí hậu ôn đới Việc sử dụng dứa để làm nguyên liệucho một số ngành công nghệ trong đó có công nghệ rượu vang là điều tất yếu đểphát triển sản phẩm từ nông sản này

Ở một số quốc gia trên thế giới, sản xuất rượu vang trở thành một ngànhmang lại doanh thu lớn và tạo dựng được những thương hiệu nổi tiếng trên thịtrường như: Robert Mondavi (Mỹ), Château Gruaud-Larose (Pháp), Concha YToro (Chile), Urbina (Tây Ban Nha), Lucente (Ý), Bên cạnh việc dùng nholàm nguyên liệu sản xuất chính cho vang thì việc sử dụng những nguên liệu khác

để làm đa dạng hóa thị trường vang đang là hướng đi mới đầy tiềm năng hiện nay

Ở Việt Nam, cùng với sự phát triển của kinh tế - xã hội nhu cầu thị hiếucủa người tiêu dùng về rượu vang ngày càng cao Tuy nhiên, ngành công nghiệpsản xuất rượu vang ở nước ta vẫn chưa thực sự đáp ứng được những yêu cầu đó,quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng còn hạn chế Nhiều sản phẩm rượu trên thịtrường còn chứa nhiều các hợp chất thứ cấp như methanol, aldehyd, rượu bậccao, gây ngộ độc rượu cho người sử dụng Bên cạnh đó Việt Nam có nguồnmen là bánh men truyền thống cũng cần phải tìm cách để chúng được ứng dụngrỗng rãi hơn và cho chất lượng rượu tốt hơn Vì vậy việc nghiên cứu nâng caochất lượng sản phẩm bằng cách hoàn thiện công nghệ sản xuất là vấn đề cầnthiết Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thực hiện đề tài

“Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu và khối lượng bánh men thuốc bắc gieo cấy ban đầu lên hàm lượng một số hợp chất trong sản phẩm rượu vang dứa”.

1.2 Mục đích đề tài

- Mục tiêu chung: góp phần đa dạng hóa sản phẩm từ quả dứa

- Mục tiêu cụ thể: cung cấp một số thông số công nghệ thích hợp có ảnhhưởng đến hàm lượng các sản phẩm bậc hai tạo thành trong quá trình lên menrượu dứa gồm: nồng độ đường ban đầu và khối lượng bánh men thuốc bắc gieocấy ban đầu

1.3 Nội dung đề tài

- Xác định độ chín của quả dứa thích hợp (dựa trên màu sắc của vỏ) đểlàm nguyên liệu lên men rượu

- Nghiên cứu xác định một số thông số công nghệ thích hợp cho quá trìnhlên men rượu từ nước dứa nhằm thu được sản phẩm chứa các hợp chất bậc haithấp, bao gồm:

+ Nồng độ chất khô ban đầu

+ Hàm lượng bánh men sử dụng gieo cấy ban đầu

6

PHẦN 2 TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu về dứa

Dứa là loại trái cây của miền nhiệt đới có nguồn gốc từ các nước Brazil,Paraquay ở Trung và Nam Mỹ

Tên ban đầu của dứa là “Ananas”, sau đó các nhà thám hiểm Tây Ban Nhathấy quả dứa khá giống chóp quả thông nên đặt là “Pine”, người Anh thêm chữ

“Apple” để nói lên vị ngọt dịu và ăn được của nó Tiếng Việt thì gọi dứa là

“thơm” hay “khóm” [4]

Theo thống kê của FAO (2016) Việt Nam có sản lượng dứa đứng hàngthứ 10 trên thế giới với tổng diện tích trồng dứa của cả nước khoảng 34642

ha và sản lượng đạt 555047 tấn Các tỉnh có diện tích canh tác dứa lớn đáng

kể như Tiền Giang, Kiên Giang, Long An và Hậu Giang chiếm 70 – 80% sản

lượng dứa cả nước [6].

Theo Báo cáo ngành trồng trọt tại Việt Nam 2017, tình hình sản xuấtdứa ở nước ta năm 2015 đến 2017 và kế hoạch năm 2018 được thể hiện ởbảng sau:

Bảng 2.1 Tình hình sản xuất dứa từ năm 2015 – 2018

và kế hoạch sản xuất năm 2018

2.1.1 Giá trị của dứa [9]

Trái dứa có khoảng 72 – 88% nước, 8 – 18,5% đường, 0,3 – 0,8% acid,0,25 – 0,5% protein, khoảng 0,25% muối khoáng 70% đường dứa là saccharose,

còn lại là glucose Acid nhiều nhất trong thành phần acid hữu cơ của dứa làcitric acid 65%, còn lại là malic acid 20%, tatric acid 10%, succinic acid 3%.

Trong quả dứa còn có enzyme thủy phân protein là bromelin giúp cho việctiêu hóa tốt Hàm lượng bromelin được tăng dần từ ngoài vào trong và từ dướigốc lên trên ngọn, được sản xuất bằng cách trích ly từ vỏ và cùi dứa Hàm lượngvitamin C khoảng 15 – 55mg%, vitamin A 0,06mg%, vitamin B1 0,09mg%,vitamin B2 0,04mg%,

Thành phần hóa học của dứa thay đổi tùy theo giống, độ chín, thời vụ, địađiểm và điều kiện trồng trọt

Bảng 2.2 Thành phần hóa học của một số giống dứa

Giống dứa Độ khô

2.1.2 Thu hoạch và bảo quản dứa [9]

Độ chín thu hoạch của dứa

8

Theo Viện Khoa học Nông nghiệp miền Nam, người ta đánh giá độ chíncủa dứa theo 5 mức sau đây:

Độ chín 4: 100% vỏ trái có màu vàng sẫm, trên 5 hàng mắt mở

Độ chín 3: Khoảng 4 hàng mắt mở, 75 – 100% vỏ trái có màu vàng tươi

Độ chín 2: 3 hàng mắt mở, 25 – 75% vỏ trái có màu vàng tươi

Độ chín 1: trái vẫn còn xanh bóng, một hàng mắt mở

Độ chín 0: trái vẫn còn xanh sẫm, mắt chưa mở

Tại các nông trường, dứa được thu hoạch khi độ chín tại ruộng là 1 và 2,

sẽ có màu sáng đẹp, khoảng 4 – 8 ngày sau dùng để ăn tươi hay chế biến đều tốt.Trái ở độ chín 3 và 4 tại ruộng sẽ dễ dàng bị hỏng sau khi thu hoạch

2.2 Giới thiệu về rượu vang

Rượu vang là một sản phẩm nguyên chất thu được từ sự lên men rượutoàn phần từ nho tươi ép ra nước, hoặc từ hỗn hợp nước nho và bã nho ép ranước [19]

2.2.1 Giá trị rượu vang

Dùng rượu vang với lượng vừa phải có tác dụng kích thích, lợi cho sứckhỏe, rượu vang có lượng cồn trung bình nên người già và phụ nữ có thể sửdụng được [19]

Rượu vang có nhều chất dinh dưỡng hơn hẳn các loại rượu khác và cóthành phần tương đối ổn định, lên men từ nước quả nên có hương vị và mùithơm đặc trưng riêng đặc trưng cho loại quả đó

Sản xuất rượu vang thương phẩm làm tăng giá trị kinh tế và đem lại lợinhuận cho người làm vườn

2.2.2 Phân loại rượu vang

Căn cứ vào màu sắc sản phẩm phân thành: vang đỏ, vang trắng, vang hồng,tương ứng với từng loại vang này có chỉ tiêu về giới hạn, màu sắc nhất định

Căn cứ theo độ rượu, hàm lượng đường, hàm lượng acid, có trong vang

mà phân tích thành các loại: vang khô, vang dịu, vang ngọt nhưng xu hướngchung vang được phân làm hai nhóm chính là vang không gas và vang có gas(CO2), trong đó mỗi nhóm lại phân thành một số loại khác nhau tuỳ theo hương,

vị, của từng loại sản phẩm [12]

2.2.3 Tiêu chuẩn chất lượng vang

Thành phần hóa học của rượu vang tương đối phức tạp và có sự thay đổitùy vào thành phần nguyên liệu sử dụng, những biến đổi trong quá trình lên menchính, lên men phụ và quá trình tàng trữ kết hợp với phương pháp hay côngnghệ sản xuất

10

2.2.3.1 Tiêu chuẩn hóa học

Bảng 2.3 Tiêu chuẩn hóa học của vang [22]

1 Hàm lượng ethanol (cồn) ở 20 oC, % thể tích, không nhỏ hơn 8,5

2 Hàm lượng methanol, mg/l ethanol 100o, không lớn hơn

3 Độ axit dễ bay hơi, meq/l sản phẩm a), không lớn hơn 20

4 Hàm lượng lưu huỳnh dioxit (SO2), mg/l sản phẩm, không lớn hơn

- Rượu vang đỏ có hàm lượng đường kính theo tổng hàm lượng

- Rượu vang đỏ có hàm lượng đường tính theo tổng hàm lượng

- Rượu vang trắng và rượu vang hồng có hàm lượng đường tính

theo tổng hàm lượng glucose và fructose nhỏ hơn 5 g/l 200

- Rượu vang trắng và rượu vang hồng có hàm lượng đường tính

theo tổng hàm lượng glucose và fructose không nhỏ hơn 5 g/l 250

5 Áp suất dư trong chai tại 20 oC, bar, không nhỏ hơn

- Đối với chai có dung tích không nhỏ hơn 0,25 lít 3,5

- Đối với chai có dung tích nhỏ hơn 0,25 lít 3,0a) meq = mili đương lượng, 1 meq tương đương với 60 mg axit axetic

Các kim loại nặng: Đồng 4 mg/l; Kẽm 5 mg/l; Sắt 10 mg/l; Thiếc 20 mg/l;Chì 0,2 mg/l; Asen 0,2 mg/l

Các hợp chất Cyanua không được có

Độ lệch các chỉ tiêu: etylic ± 0,5%; đường ± 0,5g/100 ml; acid ± 0,1 g/l

2.2.3.2 Tiêu chuẩn vi sinh vật

Không được có các vi sinh vật gây bệnh như E.coli, Coliform,

Clostridium perfringens, Salmonella, P aeruginosa, B cereus, Streptococcus faecalis…

Đối với vi khuẩn hiếu khí thì 100 (khuẩn lạc/gr, ml)

Nấm 100 (khóm/gr, ml).

2.2.3.3 Tiêu chuẩn cảm quan [22]

- Màu sắc: đặc trưng cho từng loại sản phẩm

+ Vang đỏ là: màu đỏ, đỏ lựu, đỏ thắm

+ Vang hồng là màu hồng đến đỏ tươi

+ Vang trắng là vàng rơm đến vàng ánh

- Mùi: thơm đặc trưng của nguyên liệu và sản phẩm lên men, không cómùi lạ

- Vị: đặc trưng cho từng loại sản phẩm, không có vị lạ

- Trạng thái: trong, không vẩn đục

2.2.4 Thành phần cơ bản của vang

Hiện nay, việc nghiên cứu các thành phần trong rượu vang vẫn đang đượctiếp tục nghiên cứu Cho đến nay, chúng ta mới biết được một số thành phần cơbản như sau:

2.2.4.1 Các loại rượu

Trong vang rượu etylic đóng vai trò chủ yếu etylic có vai trong tạo mùicủa vang Ngoài rượu etylic là chủ yếu trong vang còn có nhiều loại rượu bậccao khác như:

Bảng 2.4 Thành phần các loại rượu có trong vang [13]

STT Tên các loại rượu Hàm lượng trong vang

(mg/l)

Ngưỡng nồng độ cảmnhận được (mg/l)

1 Metylic Vang trắng: 20 - 1000

Vang đỏ: 80 - 350

10001000

STT Tên các loại rượu Hàm lượng trong vang

(mg/l)

Ngưỡng nồng độ cảmnhận được (mg/l)

2.2.4.2 Các acid hữu cơ

Các loại acid hữu cơ có trong vang có nguồn gốc từ dịch quả và một phần

là sản phẩm của quá trình lên men

Các acid hữu cơ đóng vai trò hết sức quan trọng đối với hương vị củavang (lượng có trong các loại quả khác nhau sẽ tạo nên hương vị đặc trưng choloại rượu đó) Các acid như tartaric, lactic, citric là những acid hữu cơ có lợi.Còn các acid: formic, propionic, butyric, acetic ở hàm lượng cao có thể ảnhhưởng xấu đến chất lượng sản phẩm (như acid acetic nếu hàm lượng cao sẽ làmcho vang bị chua, mùi nồng, nhưng nếu không có thì hương vị của vang sẽ bịgiảm ) Các acid hữu cơ giúp cho việc duy trì độ pH thấp và ngăn chặn sự xâmnhập của các loại vi khuẩn, tăng cường sự ổn định cho vang

2.2.4.3 Các loại đường

Đường là nguyên liệu tạo nên các loại rượu trong quá trình lên men.Trong dịch quả chính chủ yếu là các loại đường khử: fructose, glucose,galactose Ngoài ra, còn có saccharose Thành phần và tỷ lệ các loại đường làkhác nhau phụ thuộc vào loại quả, vùng, năm và vụ thu hoạch Trong quá trìnhlên men các loại đường khử nhanh chóng được nấm men sử dụng chuyển hoáthành rượu và CO2 Đường saccharose trong quá trình lên men được các enzymecủa nấm men thủy phân thành đường đơn sau đó chuyển thành rượu Hàm lượngđường sót trong vang thành phẩm được coi là một trong những chỉ tiêu phân loại

và đánh giá chất lượng của vang Tuỳ theo loại vang mà hàm lượng đường sótcòn lại nhiều hay ít

2.2.4.5 Các amino acid

Theo các kết quả phân tích cho thấy trong vang thành phẩm có hầu hết cácloại amino acid Các amino acid có vai trò quan trọng đối với sự sinh sản và pháttriển của nấm men Ngoài lượng amino acid trong dịch quả, quá trình lên mencũng tạo thêm được một số amino acid làm cho vang thành phẩm có hương vịđặc trưng (chính amino acid trong mỗi loại nấm men khác nhau cũng sẽ cho mộtloại hương vị đặc trưng riêng)

2.2.4.6 Các chất thơm

Hợp chất thơm trong trái cây do các chất có nguồn gốc terpen quyết định,hầu hết chúng đều bị phân huỷ hoặc bị thoát ra ngoài cùng CO2 trong quá trìnhlên men vang Mùi thơm của vang thành phẩm do các cấu tử thơm như các loạirượu bậc cao, etylacetate, metylacetate, acetaldehyd, acetic tạo ra từ quá trìnhlên men và tàng trữ Mùi thơm của vang không phải là mùi thơm của chínhnguyên liệu làm ra vang, mà mùi thơm của vang phải là mùi đặc trưng của sảnphẩm lên men từ một loại trái cây nhất định Các chất thơm đóng vai trò quantrọng đối với giá trị cảm quan của vang [13]

2.2.4.7 Các chất khoáng

Các chất khoáng như Ca, Mg, Mn, Al, P, S, Na, K, mặc dù có hàm lượngrất nhỏ phụ thuộc vào từng nguyên liệu nhưng giữ vai trò quan trọng trong quátrình lên men vang Các chất khoáng có tác dụng tốt đối với sự sinh sản và pháttriển của nấm men làm tăng hương, vị, giá trị dinh dưỡng của vang [7; 13]

2.3 Quá trình lên men rượu vang

2.3.1 Giới thiệu về nấm men

Nấm men là tên chung để chỉ những nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sốngriêng lẻ hoặc sống thành từng đám, không di động và sinh sản vô tính bằng hìnhthức nảy chồi Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên như trong đất, nước, lươngthực thực phẩm, đặc biệt có nhiều trong các loại hoa quả chín, ngọt

14

Nấm men thường được sử dụng trong sản xuất vang là các chủng thuộc

So với các vi sinh khác, tế bào nấm men có kích thước tương đối lớn:đường kính khoảng 7 µm; chiều dài 8 – 12 µm

Trọng lượng riêng của tế bào nấm men không khác mấy so với vi khuẩn:

- Ở nấm men chỉ số này là: 1,055 – 1,060

- Ở vi khuẩn chỉ số này là: 1,050 – 1,112 [3; 11; 18]

Hình 2.1 Hình thái tế bào nấm men.

2.3.2 Nấm men dùng trong sản xuất rượu vang

2.3.2.1 Nấm men tự nhiên

Trong nước quả tươi có các vi sinh vật khác nhau nhiễm vào từ môitrường xung quanh Phần lớn là nấm mốc, nấm men, một số vi khuẩn, xạkhuẩn Nấm men ít hơn nấm mốc nhưng lại có khả năng sinh trưởng và pháttriển nhanh hơn trong điều kiện yếm khí hoặc thiếu O2 đồng thời lên men tích tụcồn Nhờ điều kiện kỵ khí và trong dịch cồn làm ức chế nấm mốc, tạo điều kiệncho nấm men phát triển chiếm ưu thế trong lên men [7]

Các men tự nhiên hay men dại luôn có sẵn trên bề mặt quả Một số loại

như: Sacchraromyces apiculata, Mycorderma, Hancelnula, Gichia Nếu để

men dại phát triển tự nhiên thì quá trình lên men rất khó điều chỉnh và chấtlượng rượu thu được không ổn định

2.3.2.2 Men bánh [7; 10]

Men bánh là men nhân dân sản xuất ở những vùng có tập quán nấu rượu

Vì nguyên liệu dùng để chế biến rượu trong nhân dân là gạo nên môi trường nền

là bột gạo, đồng thời với một số nguyên liệu khác mà người sản xuất men vẫn giữ

bí mật và gồm vài chục vị thuốc bắc như: đại tiểu hồi, thảo quả, xuyên khung,bạch chỉ, đinh hương, nhục đậu, liên kiều, cát cánh, Sau khi chế biến xong cáckhối men giống như bánh, hình tròn dẹt mặt trên phủ một lớp trấu có tác dụng làmcho khối men xốp (Hình 2.2) Khối lượng một bánh men từ 10 – 100g

Hình 2.2 Men bánh.

Hệ vi sinh vật trong bánh men:

- Nấm mốc gồm có Aspergillus oryzea, A flavus, A awamori, A usami,

A niger, Mucor (M Sircinilloides), Rhizopus, Penicillium và Amylomyces rouxii, Nấm mốc sinh enzyme amylase đường hóa tinh bột.

16

- Nấm men chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae Ngoài ra còn thấy

Hyphopichia butonii, Pichia anomada, Candida, Những nấm men này coi

như là men dại, men tạp có lẫn trong nấm men và không mong muốn Nấm menrượu chuyển hóa đường thành rượu

- Trong bánh men còn thấy có loài men giả là Endomycopsis fibuliger Giống Endomycopsis tương tự như nấm men nhưng có thể mọc sợi, có khả năng

sinh glucoamylase và thủy phân tinh bột thành đường glucose

- Vi khuẩn: thường thấy có mặt vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic, Nóichung, vi khuẩn có mặt trong bánh men đều là vi khuẩn tạp nhiễm, không mongmuốn xuất hiện

2.3.2.2 Nấm men nuôi cấy thuần chủng [3; 10]

Việc sử dụng nấm men thuần khiết trong sản xuất rượu vang ở quy môcông nghiệp được phổ biến rộng rãi do tính ưu việt của nó Sử dụng nấm menthuần khiết giúp cho thời gian lên men nhanh, quá trình lên men không bị dừnggiữa chừng, nồng độ cồn thu được cao hơn lên men tự nhiên, vang có màu sánghơn và hương vị thanh khiết hơn

Những chủng nấm men thuần khiết thường dùng cho lên men rượu vang

là Saccharomyces vini, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces oviform

- Saccharomyces vini

Nấm men Saccharomyces vini khá phổ biến trong quá trình lên men nước quả, chiếm tới 80% trong tổng số Saccharomyces có trong nước quả khi lên

men Đa số các tế bào của loài này hình oval, có kích thước (3 – 8) x (5 –

12)µm, sinh sản theo lối nảy chồi và tạo thành bào tử Saccharomyces vini có

khả năng khử đường saccharose thành đường fructose và glucose, vì vậy tronglên men có thể bổ sung loại đường này vào dịch quả và hàm lượng rượu đượchình thành đối với nhiều nòi của nấm men này chỉ đạt được 8 – 10% so với thểtích Khả năng kết lắng nhanh, ở giai đoạn cuối của quá trình lên men

Saccharomyces vini thường bị già không tiếp tục chuyển đường thành cồn và bị

chết nhanh

- Saccharomyces uvarum

Nấm men Saccharomyces uvarum được tách ra từ nước nho, rượu và nước

quả giúp bào tử lên men tự nhiên Về hình thái nó không khác với các loài khác.Khả năng sinh bào tử khá mạnh trên môi trường thạch – malt Các nòi của loàinày có thể lên men 12 – 13o cồn trong dung dịch nước nho

- Saccharomyces chevalieri

Nấm men này được tách ra từ nước nho lên men tự nhiên, từ vang non

được gây men nước dừa hoặc nước cọ Sacchromyces chevalieri thuần chủng lên

men nước nho có thể tạo 16o cồn

2.3.3 Cơ chế lên men rượu [16]

2.3.3.1 Tác nhân gây lên men

Điển hình của tác nhân gây lên men là nấm men Trong số các giống nấm

men, Saccharomyces là giống được dùng rộng rãi Nấm men có đặc điểm là

trong điều kiện sinh hoạt yếm khí, chúng có khả năng chuyển đường thành rượuethanol và CO2 Trong điều kiện yếm khí, nấm men không có khả năng chuyểnhoá tiếp các ethanol đã được tạo thành, có nghĩa là sự lên men sẽ dừng lại giaiđoạn hình thành và tích luỹ rượu ethanol Như vậy, biện pháp kỹ thuật tươngứng là phải cho lên men trong thùng kín

Tế bào nấm men còn có đặc điểm nữa là khả năng tạo ra các nội enzyme

(endoferment), nghĩa là những enzyme tiến hành xúc tác ở bên trong tế bào Như

vậy, sự phân ly đường sẽ xảy ra ở bên trong tế bào nấm men, còn rượu êtylic vàCO2 được tạo thành thì đi ra khỏi tế bào và tích tụ ở trong môi trường

2.3.3.2 Các điều kiện lên men rượu

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men như: nồng độ đường, độacid của môi trường, nhiệt độ

Nồng độ đường thích hợp cho đa số nấm men là 12 - 16% Khi nồng độđường quá cao hoặc quá thấp thì hiệu lực lên men đều bị giảm thấp

Độ acid của môi trường cũng giữ vai trò quan trọng Quá trình lên menxảy ra bình thường khi pH 4 - 4,5 Trong môi trường kiềm, sự lên men tiến triểntheo đường hướng đặc biệt, tạo sản phẩm chính là glycerin

18

C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2Hexose Ethanol Carbon dioxide

Nhiệt độ có ảnh hưởng tới vận tốc lên men Thường vận tốc lên men lớnnhất vào khoảng 29 - 32oC Trong thực tế, tuỳ yêu cầu, quá trình lên men cũng

có thể tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 24 - 28oC

Sự tích tụ rượu trong môi trường có tác dụng độc hại đối với nấm men Đa

số trường hợp sự lên men đường đình chỉ khi nồng độ rượu trong môi trường đạt

từ 12 - 14% thể tích

Khí CO2 ức chế sự lên men, nhưng sự thoát khí CO2 có tác dụng khuấyđộng dịch lên men do đó làm tăng tốc độ lên men

Cơ chế sinh hóa xảy ra trong quá trình lên men rượu

Lên men rượu là quá trình yếm khí chuyển hóa đường mà chủ yếu là

glucose và fructose thành ethanol và carbon dioxide Quá trình lên men rượu

được tóm tắt bởi phản ứng tổng quát như sau:

Tuy nhiên, lên men rượu là quá trình phức tạp Nhiều quá trình hóa lý, hóahọc và sinh hóa xảy ra đồng thời với phản ứng tổng quát này Các quá trình nàylàm hoàn thiện thêm giá trị của đồ uống có độ rượu (rượu vang, bia ) Vì vậy,bên cạnh ethanol nhiều hợp chất khác cũng được tạo ra trong quá trình lên mennhư rượu cao, ester, glycerol, succinic acid, acetoin và 2,3-butadiol Ngoài sựchuyển hóa đường, các hợp chất khác có trong môi trường lên men cũng đượcchuyển hóa bởi nấm men tạo nên giá trị cảm quan cho sản phẩm đồ uống

* Quá trình đường phân

Quá trình đường phân chuyển hóa glucose hoặc fructose thành pyruvatetrong tế bào Đây là quá trình đầu tiên của sự chuyển hóa carbohydrate trong hầuhết các sinh vật Nấm men sử dụng quá trình đường phân như là con đườngchính để chuyển hóa đường (Hình 2.3)

Hình 2.3 Sơ đồ tóm tắt quá trình đường phân xảy ra trong tế bào nấm men.

Kết thúc quá trình đường phân, pyruvate được chuyển hóa bởi nấm mentheo một vài hướng khác nhau Các hướng chuyển hóa tiếp theo có thể đượcthực hiện bằng lên men yếm khí hoặc hô hấp hiếu khí

* Lên men và hô hấp

Nấm men là những vi sinh vật hô hấp tùy tiện Chúng có thể chuyển hóađường trong điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí Vì vậy, nấm men có thể tiêu thụđường theo hai con đường chuyển hóa là lên men yếm khí và hô hấp hiếu khí.Hình 2.4 là sơ đồ tóm tắt của hai quá trình này

20

Hình 2.4 Sơ đồ tóm tắt lên men và hô hấp xảy ra trong tế bào nấm men

Cả hai quá trình này đều bắt đầu với quá trình đường phân tạo nên pyruvate Pyruvate có thể được chuyển hóa thành acetaldehyde và CO2 dưới tácdụng xúc tác bởi enzyme pyruvate decarboxylase Sau đó, acetaldehyde(ethanal) được khử để tạo thành ethanol Quá trình này xảy ra trong tế bào chất

và được gọi là quá trình lên men rượu

Quá trình lên men rượu chỉ tạo ra hai phân tử ATP cho tế bào nấm menkhi chuyển hóa một phân tử hexose

Pyruvate cũng có thể được chuyển hóa thành Acetyl-CoA và CO2 dưới tácdụng xúc tác bởi pyruvate dehydrogenase Sau đó Acetyl- CoA đi vào chu trìnhKrebs, tạo nên CO2 và một vài coenzyme dạng khử (NADH và FADH2) Cáccoenzyme khử được tạo thành trong chu trình Krebs và trong quá trình đườngphân sau đó bị oxy hóa trong chuỗi hô hấp để khử oxy phân tử thành H2O Quátrình này tạo nên 36-38 phân tử ATP khi chuyển hóa một phân tử hexose Kết

Từ đó cho thấy rằng mấu chốt của quá trình điều hòa sự trao đổi chất của

tế bào nấm men là điều khiển để nấm men chuyển hóa pyruvic thànhacetaldehyd hoặc Acetyl-CoA

* Sự lên men rượu

Trong quá trình lên men rượu, Saccharomyces cerevisiea chủ yếu chuyển

hóa pyruvate thành ethanol để tái tạo NAD+ đã được tiêu thụ bởi quá trìnhđường phân Quá trình lên men rượu xảy ra trong tế bào nấm men được tóm tắttrên hình 2.5

Hình 2.5 Tóm tắt cơ chế hóa sinh của quá trình lên men rượu.

Đầu tiên là quá trình decarboxyl pyruvate tạo thành ethanal dưới tác dụngxúc tác bởi pyruvate decarboxylase Enzyme này cần Mg và thiaminepyrophosphate như là các yếu tố đồng phản ứng Sau đó, alcohol dehydrogenasekhử ethanal thành ethanol và chuyển NADH thành NAD+

22

Acetoin OXH Diacetyl

Ở đây NADH2 tạo thành trong phản ứng oxy hoá phosphate của quá trình đường phân đóng vai trò chất cho hydro, cònacetaldehyd là chất nhận

glyceraldehyd-3-Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men (ethanol, CO2) được vậnchuyển ra ngoài tế bào bằng cơ chế khuếch tán đơn giản

2.3.4 Sự tạo thành các sản phẩm phụ của quá trình lên men rượu [15; 16]

Bên cạnh tạo thành sản phẩm chính của quá trình lên men rượu là ethanol

đó, một số sản phẩm phụ cũng được tạo thành trong quá trình lên men

2.3.4.1 Diacetyl, acetoin và 2,3-butadiol

Các hợp chất này được tạo thành do sự kết hợp pyruvate với ethanal Phảnứng này tạo nên acetolactate; sau đó, hợp chất này bị decarboxyl hóa Diacetyl

sẽ được tạo thành nếu sự decarboxyl hóa là sự oxy hóa, trong khi đó, acetoinđược tạo thành khi sự decarboxyl hóa không phải là quá trình oxy hóa Acetoincũng có thể được hình thành bằng cách khử trực tiếp diacetyl Cuối cùng,acetoin có thể bị khử để tạo thành 2,3-butadiol Phản ứng này là thuận nghịch.Acetoin và đặc biệt là diacetyl có mùi bơ góp phần hương thơm cho sản phẩm

Sự tạo thành acetoin, diacetyl và 2,3-butadiol theo sơ đồ:

Hình 2.6 Sơ đồ tóm tắt cơ chế hóa sinh sự tạo thành sản phẩm phụ trong quá

trình lên men rượu 2.3.4.2 Ethanal

Ethanal (acetaldehyd) là sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu

có được do sự decarboxyl pyruvate Sau đó, ethanal bị khử để tạo nên ethanol.Tuy nhiên, một phần ethanal được giải phóng ra môi trường và góp phần tạohương cho sản phẩm đồ uống

2.3.4.3 Acetic acid

Acetic acid là acid dễ bay hơi Nồng độ của acid này cao sẽ cho mùi giấm

và tạo nên mùi vị khó chịu cho sản phẩm Acetic acid có thể được tạo thành bởinấm men, vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic Tuy nhiên, nấm men chỉ tạo ra mộtlượng rất nhỏ acetic acid (0,1-0,3 g/l) nếu không có sự cố trong quá trình lênmen Sự tạo thành nhiều acetic acid trong môi trường chỉ có thể xảy ra do sự

24

CH3COCOOH + R - CH - COOH

NH2

R-CO-COOH + CH3 - CH - COOH

NH2 Acid pyruvic Amino acid Ceto acid Amino acid

Acid béo Rượu cao

phát triển của vi khuẩn lactic hoặc do nấm men sản sinh ra nhiều hơn bìnhthường bởi sự thủy phân Acetyl-CoA

2.3.4.4 Rượu cao

Các loại rượu cao được tạo thành do sự sai lệch về đường hướng chuyểnhóa amino acid Khi các ceto acid tương ứng với sườn carbon của các aminoacid khác nhau bị decarboxyl hóa và bị khử sẽ tạo nên rượu cao

Thường thì hàm lượng rượu cao tạo thành dưới ngưỡng phát hiện được.Tuy nhiên chúng tạo thành ester nên ảnh hưởng lớn đến cảm quan

2.3.4.5 Ester

Ester được tổng hợp từ Acetyl- CoA và rượu bởi một nhóm enzyme làmxúc tác Về cơ bản, có hai nhóm ester tạo thành trong quá trình lên men rượu là:ester của acetate với rượu cao và ester của các acid béo và ethanol Nhóm thứnhất được tạo tổng hợp từ Acetyl-CoA và các loại rượu cao khác nhau Nhómnày cho các mùi thơm khác nhau như mùi chuối (isoamyl acetate), mùi hoa hồng(phenylethanol acetate) Các ester của acid béo và ethanol cho mùi trái cây

2.3.4.6 Succinic acid

Succinic acid là một sản phẩm phụ của quá trình lên men rượu Một số tácgiả cho rằng succinic acid được tổng hợp thông qua chu trình Krebs Tuy nhiênmột số tác giả khác thì cho rằng chu trình này không tồn tại trong quá trình lênmen rượu Trong bất cứ quan điểm nào thì succinic vẫn tồn tại trong sản phẩmlên men rượu

Trong công nghiệp, sự lên men rượu chiếm một vị trí quan trọng, đượcứng dụng nhiều để sản xuất cồn công nghiệp, rượu và đồ uống có rượu (bia,rượu vang ), đồ uống có gas, sản xuất bánh mỳ

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men vang

Lên men vang chịu ảnh hưởng rất lớn của điều kiện sản xuất: chủng nấmmen, thiết bị lên men, môi trường lên men, (độ pH, hàm lượng đường, nồng độôxy hoà tan ) Mức độ tác động và ảnh hưởng của các yếu tố không như nhau

2.4.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường

Nấm men có tốc độ lên men nhanh nhất khi lượng đường trong dịch là 1

-2 % Để có lượng cồn tối đa thì nồng độ đường phải cao hơn nhiều Nhiềunghiên cứu cho thấy lượng đường phù hợp trong quá trình lên men vang là 12 -20% Còn ở hàm lượng đường 25% ức chế quá trình lên men Khi lượng đườngtrong dịch lên men càng cao thì sự chênh lệch áp suất thẩm thấu trong tế bàonấm men với môi trường lên men càng lớn ức chế hoạt động sống của nấm men

Tỷ lệ đường trong dịch lên men ảnh hưởng tới tốc độ và hiệu suất lên men Kếtquả cho thấy đường glucose phù hợp nhất cho sự sinh sản và phát triển của nấmmen cũng như qúa trình tạo rượu, tiếp đó là đường fructose, saccharose Vì vậy,quả chứa hàm lượmg đường khử càng cao thì càng có lợi cho quá trình lên men

và chất lượng vang [3; 13]

2.4.2 Ảnh hưởng của độ pH

Nấm men có thể sinh sản, phát triển trong môi trường có pH từ 2,5 - 7,5

pH phù hợp nhất đối với sự sinh sản và phát triển của nấm men là 4 - 6, nhiềuchủng nấm men có thể sinh sản và phát triển tốt ở pH 3 – 3,5 Để hạn chế quátrình lây nhiễm và phát triển của nhiều loại vi khuẩn, phù hợp với độ pH tựnhiên của nguyên liệu và chất lượng của vang, trong sản xuất vang các nhà sảnxuất duy trì độ pH ở mức 3,2 – 4,0 Thường dùng NaHCO3, CaCO3, tartric acid ,citric acid để điều chỉnh độ pH của dịch lên men Độ pH không chỉ ảnh hưởngtrực tiếp đến sự sinh sản và phát triển của nấm men mà còn ảnh hưởng đến khảnăng hoạt hoá của liên kết các enzyme tham gia trực tiếp vào quá trình lên menvang Độ pH quá thấp hoặc quá cao làm thay đổi cấu trúc protein của nhiều loạienzyme, giảm khả năng hoạt hoá của enzyme [13]

2.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ rượu

Mỗi giống nấm men có khả năng chịu được nồng độ rượu khác nhau, có

giống chịu được nồng độ cồn thấp như Hasenula, Alanama, nhiều chủng thuộc giống Saccharomyces có thể chịu được 9 - 12%V cồn, lên men đạt 14 - 16 %V.

Trong quá trình lên men rượu, nồng độ rượu tăng dần gây ức chế cho hoạt độngsống của nấm men và kìm hãm hoạt động của nhiều loại enzym chuyển hoáđường thành rượu Khả năng sống sót của nấm men phụ thuộc vào nhiệt độ và

26

nồng độ rượu có trong dịch lên men Ở khoảng 50oC, nồng độ rượu 12 -15%Vchỉ sau 2 phút tất cả nấm men không còn sống sót Những chủng lên men được ởnhiệt độ cao thì hiệu suất lên men và độ rượu lại rất thấp điều này không có lợi

và không phù hợp với lên men vang có chất lượng cao Ngoài ra, rượu có phân

tử lượng càng cao thì hoạt động sống của nấm men càng bị ức chế Vì vậy, việctuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men đạt độ cồn và hiệu suất cao làđiều quan trọng [13; 17]

2.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh sản và phát triển của nấm men

và chất lượng của vang Nấm men có thể tồn tại và phát triển ở nhiệt độ từ 4 –

45oC, nhiệt độ phù hợp cho sự sinh sản và phát triển của nấm men là 28 – 30oC

Ở nhiệt độ thấp, nấm men sinh sản chậm, thời gian lên men kéo dài, nhưng hạnchế sự nhiễm khuẩn ngược lại ở nhiệt độ cao (quá 38oC) nấm men sinh sảnnhanh, thời gian lên men ngắn hơn, khả năng nhiễm khuẩn cao Theo Jordan ởnhiệt độ > 80oF (26,7oC) làm rượu vang trắng bàn ăn kém hơn, theoHickinbotham và Ryan, Breckmann và Stier lên men ở nhiệt độ lạnh hương, vịcủa rượu có mùi trái cây, tươi hơn, hàm lượng acid bay hơi thấp hơn, hàm lượngglyxerin tăng hơn Theo nhiều tác giả Việt Nam, nhiệt độ phù hợp cho quá trìnhlên men vang là 25 – 31oC, duy trì nhiệt độ trong suốt quá trình lên men là quantrọng và cần thiết [17]

2.4.5 Ảnh hưởng của acid hữu cơ

Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy: acid là thành phần quan trọng làmgiảm độ pH, có tác dụng ức chế nhiều loại vi khuẩn Sự ảnh hưởng của acid hữu

cơ đối với quá trình lên men không phải do hàm lượng tổng số của các acid hữu

cơ không bay hơi mà do thành phần và hàm lượng một số loại acid hữu cơ trongdịch lên men: các acid béo, acetic, butyric, propyolic ảnh hưởng quyết dịnh đến

sự sinh sản và phát triển của nấm men [8]

2.4.6 Ảnh hưởng của Nitơ

Nitơ là thành phần quan trọng tham gia vào quá trình hình thành và pháttriển của tế bào nói chung Hầu như mọi thành phần tế bào đều chứa Nitơ ở tỉ lệkhác nhau Protein chiếm 25 - 60% trọng lượng khô tế bào trong đó Nitơ tổng số

4 - 12%, Nitơ dạng NH2 chiếm khoảng 75% Hầu hết, nấm men không có nhucầu tuyệt đối về axít amin nhưng hàm lượng amino acid trong dịch quả chỉ đủcung cấp cho 4 - 5 ngày lên men Vì vậy, có ý kiến cần bổ sung thêm Nitơ vàodịch lên men nhưng theo Schanderl ngoại trừ một số trường hợp không bình

thường của dịch quả nhìn chung việc bổ sung Nitơ vào quá trình lên men vang

từ nho không cần thiết, sự bổ sung Nitơ chỉ cho quá trình lên men vang lần thứhai của vang gas Thực tế, sản xuất vang khi nhân giống nấm men người ta bổsung thêm lizin, arginin hoặc (NH4)2SO4 ở nồng độ 0,6% để tăng cường khảnăng sinh sản của nấm men [3; 13]

2.4.7 Ảnh hưởng của các loại muối khoáng

Muối khoáng cần thiết cho quá trình lên men vang gồm: Mg, K, I2, Ca,

Co, Fe, S, P Trong dịch quả đã có đầy đủ muối khoáng nên việc bổ sung muốikhoáng cần thận trọng và phụ thuộc vào loại nấm men, bản chất dịch quả sự

dư thừa của nguyên tố khoáng sẽ kìm hãm quá trình lên men Một số vitamin(B1, biotin, E ) tác dụng tốt đến sự sinh sản và phát triển của nấm men Cácaxít amin, vitamin do nấm men giải phóng ra trong quá trình lên men đã làmtăng giá trị của vang Nhiều vitamin có tác dụng tăng cường sự hoạt hoá của một

số loại enzyme trong quá trình lên men rượu [13; 14]

2.4.8 Ảnh hưởng của lượng men giống

Lượng men giống trong dịch lên men thấp thì thời gian lên men vang sẽ bịkéo dài và dễ bị nhiễm khuẩn, khi lượng men giống càng cao thì thời gian lênmen ngắn, hạn chế được khả năng nhiễm khuẩn do sự áp đảo của nấm men Nếulượng men giống quá cao sẽ làm thay đổi thành phần môi trường lên men không

có lợi cho quá trình lên men và chất lượng sản phẩm Theo nhiều tác giả lượngmen giống trong dịch lên men từ 4 - 10 triệu tế bào/1ml dịch là thích hợp [7; 13]

2.4.9 Ảnh hưởng nồng độ ôxy hoà tan

Nồng độ oxy hoà tan là điều kiện quan trọng cho sự sinh sản và phát triểntối đa của nấm men vì nấm men là cơ thể hiếu khí, không thể sống lâu trongđiều kiện kỵ khí

Trong lên men rượu đầu tiên các đường đơn glucose, fructose phân giảitheo con đường EMP và chu trình tricacboxylic acid bắt đầu thực hiện, hoạtđộng hô hấp, nấm men thu được nhiều năng lượng, sinh khối trong dịch lên mentăng, môi trường dần chuyển sang kỵ khí và nấm men chuyển sang lên men rượu

do đó sản phẩm sẽ là ethanol, CO2, sinh khối, axít hữu cơ, sản phẩm phụ( glyxein, acid )

Kết quả nghiên cứu cho thấy: Môi trường có đầy đủ oxy nấm men dùngđường làm nguồn năng lượng tăng sinh khối theo phương trình:

C6H12O6 + 6 CO2 → 6CO2 + H2O + Q

28

Ngược lại khi môi trường thiếu oxy nấm men hô hấp kỵ khí chuyển hoáđường thành rượu theo phương trình:

C6H12O6 → 6 CO2 + 2 C2H5OH + Q

Vì vậy, khi lên men vang phải hạn chế tối đa sự có mặt của oxy có trongdịch lên men và tiến hành lên men kỵ khí để thu được hiệu suất lên men rượucao nhất [12; 13]

PHẦN 3 VẬT LIỆU, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu

- Thiết bị dùng trong nghiên cứu:

+ Máy ép trái cây COMET của Trung Quốc

+ Máy đo pH HANNA của Mỹ

+ Khúc xạ kế ATAGO (0 – 32%) của Nhật Bản

+ Thiết bị lên men 15L CENTRION của Hàn Quốc

30

Hình 3.2 Thiết bị lên men 15L CENTRION

+ Cồn kế 0 – 100% FUNKE – GERBER của Đức

+ Nồi hấp áp suất YUIN của Việt Hàn

+ Máy chưng cất rượu BUCHI của Trung Quốc

+ Máy đo quang UV –VIS PERKIN ELMER của Singapore

+ Bộ ngưng tụ ester BUCHI của Trung Quốc

3.1.2 Phạm vi

- Địa điểm thực hiện:

+ Phòng thí nghiệm khoa Cơ khí - Công nghệ

+ Trung tâm Nghiên cứu, ứng dụng và thông tin khoa học và công nghệthuộc Sở khoa học và công nghệ tỉnh Quảng Trị

- Thời gian thực hiện: từ ngày 08/11/2018 đến ngày 01/03/2019

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Nghiên cứu xác định hàm lượng đường của dịch dứa theo độ chín

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thông số lên hàm lượng ethanol và các sản phẩm bậc hai tạo thành trong sản phẩm

3.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khô ban đầu lên hàm lượng ethanol và các sản phẩm bậc hai tạo thành trong sản phẩm

3.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng nấm men ban đầu lên hàm lượng ethanol và các sản phẩm bậc hai tạo thành trong sản phẩm

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Trường hợp rượu không ở nhiệt độ 20oC thì đọc nhiệt độ của rượu và độrượu cùng một lúc rồi tra bảng hiệu chỉnh độ rượu ở 20oC

3.3.2.1 Xác định hàm lượng andehyde bằng phương pháp chuẩn độ [24]

Cho 50 ml phần mẫu thử và 25 ml nước cho vào bình cầu 750 ml hoặc

1000 ml có chứa 300 ml nước sôi hoặc nước đã loại khí và 10 ml dung dịchK2S2O5 Đậy nắp bình, lắc đều và để yên 15 phút Thêm 10 ml dung dịchphosphat-EDTA (pH phải trong khoảng từ 7,0 đến 7,2) Nếu không, chỉnh pHbằng cách thêm clohydric acid hoặc dung dịch natri hydroxit vào dung dịchK2S2O5 và bắt đầu với phần mẫu thử mới) Đậy nắp bình, lắc đều và để yên thêm

15 phút Thêm 10 ml clohydric acid loãng tỉ lệ 1:3 (khi cần phân tích một dãy thìkết thúc phép xác định trên phần mẫu thử thứ nhất trước khi bổ sung tiếp axit)

và khoảng 10 ml tinh bột 0,2 % mới chuẩn bị, lắc đều Thêm lượng dung dịchiot 0,1 N chỉ vừa đủ để phá hủy lượng bisulfit dư cho đến khi dung dịch có màuxanh tím

Thêm 10 ml dung dịch natri borat và chuẩn độ nhanh lượng bisulfit giảiphóng bằng dung dịch iot 0,01N từ buret 10 ml đến điểm kết thúc có màu xanhnhạt như trên, lắc đều bình trong khi chuẩn độ, tránh ánh sáng trực tiếp của mặttrời Sau đó đọc thể tích dung dịch iot đã dùng

32

Hàm lượng aldehyd, X, tính bằng miligam acetaldehyd (CH3CHO)/l

ethanol 100° theo công thức sau đây:

c V

V C

44: là khối lượng mol của CH3CHO, tính bằng gam trên mol;

C 1: là nồng độ mol của dung dịch iôt, tính bằng mol trên lít;

V 1: là thể tích dung dịch iôt chuẩn độ, tính bằng mililit;

V: là thể tích mẫu thử, tính bằng mililit;

1000: là hệ số chuyển ra lít;

c

100

: là hệ số chuyển độ rượu từ c° (phần trăm thể tích) về 100°.

3.3.2.2 Xác định hàm lượng rượu bậc cao bằng phương pháp mật độ quang [26]

Lần lượt cho vào 3 bình cầu dung tích 50 ml – 70 ml: bình thứ nhất 5 mlmẫu thử, bình thứ hai và thứ ba mỗi bình 5 ml rượu bậc cao tương ứng với 30

mg và 60 mg trong 1 lít ethanol 100o Thêm vào cả 3 bình mỗi bình 0,2 ml dungdịch aldehyd salisilic 1%, Thêm từ từ vào mỗi ống 10 ml acid sunfuric đậm đặc(d = 1,84), lắc đều Giữ các bình cầu trong 20 phút, sau đó, đem so màu củadung dịch thử với các dung dịch rượu bậc cao tiêu chuẩn (nếu khó so màu có thểrót 3 dung dịch vào 3 ống nghiệm so màu)

Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm

Đường chuẩn rượu bậc cao: y = ax + b

3.3.2.3 Xác định hàm lượng ester bằng phương pháp chuẩn độ [27]

Lấy chính xác 50ml mẫu cho vào bình cầu dung tích 250ml sau đó thêm vàigiọt chỉ thị phenolphthalein Chuẩn độ lượng acid tự do bằng dung dịch NaOH0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt Sau đó thêm vào bình chính xác 10mldung dich NaOH 0,1N lắc đều rồi lắp vào hệ thống hoàn lưu và đun trên bếp cáchthủy trong thời gian 1 giờ Để nguội rồi thêm vào 10ml dung dịch H2SO4 0,1N,lắc đều rồi chuẩn độ lượng H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khidung dịch có màu hồng nhạt Đọc thể tích dung dịch NaOH 0,1N đã dùng

Hàm lượng ester, X, tính bằng miligam acetylacetate/l ethanol 100° theocông thức sau đây:

c V

: là hệ số chuyển độ rượu từ c° (phần trăm thể tích) về 100°

3.3.2.4 Xác định hàm lượng methanol bằng phương pháp so màu [25]

a) Nguyên tắc

Cho phần mẫu thử tác dụng với thuốc thử fucsin sulfit sau khi đã oxy hóamethanol thành aldehyd focmic So màu của dung dịch thu được với màu củadung dịch chuẩn

Sau 3 phút thêm vào mỗi ống 1 ml acid oxalic bão hòa Khi dung dịchchuyển sang màu vàng nhạt thì cho thêm 1 ml acid sulfuric đậm đặc để dungdịch mất màu hoàn toàn Thêm 5 ml thuốc thử fucsin sulfit và lắc đều Để yênhai ống nghiệm 35 phút, sau đó so màu của hai dung dịch Màu của rượu thửkhông được đậm hơn màu của dung dịch rượu chuẩn.

Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm

Dựng đường chuẩn methanol và thực hiện tương tự như xác định hàmlượng rượu bậc cao

3.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm để thực hiện nội dung nghiên cứu

Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát được thể hiện trên Hình 3.3.

Thuyết minh quy trình tổng quát

Đầu tiên cần phải lựa chọn những quả dứa không bị sâu bệnh, dập nát.Sau đó chọn độ chín của dứa nguyên liệu làm thí nghiệm dựa vào màu sắccủa vỏ quả Phương pháp này được tiến hành bằng cách lấy dịch ép từ quả để đochỉ số đường bằng phương pháp khúc xạ ở thiết bị Bx kế Sau đó chọn dứa cóhàm lượng đường trong khoảng cao nhất tương ứng với màu sắc của vỏ quả

Sau khi xác định được loại dứa để làm thí nghiệm, tiến hành xử lý thudịch dứa để thực hiện thí nghiệm nhằm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chấtkhô ban đầu lên các giá trị Bx, pH, ethanol và các sản phẩm bậc hai Các bướcthực hiện như sau:

Ép lấy dịch dứa, phối trộn với đường theo các nồng độ cần khảo sát20%, 30%, 40%, 50% và điều chỉnh pH thích hợp Sau đó cho vào thiết bị lênmen để thanh trùng, sau khi thanh trùng cần để nguội trước khi bổ sung bánhmen vào, tránh trường hợp nhiệt độ gây bất lợi cho các nấm men trong bánhmen hoạt động

Bánh men trước khi cho vào thiết bị lên men cần được làm sạch lớp trấu ởphần đế của bánh men, nghiền nhỏ để nấm men phân tán ra môi trường lên men

và hoạt động Sau khi nghiền nhỏ, bột bánh men được cho vào thiết bị lên men

và tiến hành lên men Trong quá trình lên men tiến hành theo dõi các diễn biếncủa quá trình lên men và sự thay đổi của các giá trị Bx, pH, ethanol và các sảnphẩm bậc hai Từ đó xác định được nồng độ chất khô ban đầu và thời gian lênmen thích hợp

Tiến hành như trên với thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của lượng bánh mengieo cấy ban đầu lên các giá trị Bx, pH, ethanol và các sản phẩm bậc hai Nhưnglúc này chúng ta đã có được nồng độ chất khô ban đầu và thời gian lên men thíchhợp nên dựa vào thời gian lên men đó để xác định sự thay đổi các giá trị đã nêu ởtrên Từ đó xác định được lượng bánh men gieo cấy ban đầu thích hợp.

Các thông số được lựa chọn dựa vào hàm lượng của ethanol và các sảnphẩm bậc 2 tạo thành trong sản phẩm như: methanol, aldehyd, rượu bậc cao,ester Hàm lượng các sản phẩm này phải đạt được những tiêu chuẩn của Bộ Y tế

về ATTP đối với mặt hàng rượu vang – TCVN 7045:2013 [22]

36

Theo dõi một số chỉ tiêu trong quá trình lên men

Xác định nồng độ chất khô ban đầu và thời gian lên men thích hợp

Để nguội

Lên men

Quả dứa Chọn những quả không bị sâu bệnh, dập nát Phân nhóm theo màu sắc của vỏ để xác định Bx của dịch quả

Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng bánh men gieo cấy ban đầu (1,0g/L; 1,5g/L; 2,0g/L; 2,5g/L; 3,0g/L)

Xác định sự thay đổi của các chỉ tiêu Xác định lượng bánh men thích hợp

Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

3.3.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng đường trong quả dứa theo độ chín

Dứa để làm thí nghiệm là những quả không bị sâu bệnh, dập nát

Dựa vào màu sắc của vỏ dứa, chọn được 7 nghiệm thức, cho đánh dấu từD1 đến D7 theo cường độ màu sắc từ xanh đến vàng sẫm

Nghiệm thức được chọn lựa sẽ đem đi rửa sạch, loại bỏ vỏ, mắt dứa, cắtnhỏ sau đó ép ở máy ép trái cây COMET để thu dịch dứa

Dịch dứa sau đó đem lọc để thu dịch dứa trong (không có hiện tượng lắngcặn) rồi đo chỉ số nồng độ chất khô bằng phương pháp khúc xạ ở thiết bị Bx kếAtago và chỉ số pH ở thiết bị Hanna

3.3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khô ban đầu lên hàm lượng ethanol và các sản phẩm bậc hai tạo thành trong sản phẩm

a) Mục đích

Nồng độ chất khô coi như là biểu thị hàm lượng đường có trong dich dứa

mà đường là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men: lượng đườngthấp sẽ làm giảm hiệu suất lên men không tạo được độ cồn mong muốn trongrượu vang, nhưng nếu lượng đường cao sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu và lầmmất trạng thái cân bằng sinh lý của nấm men vì nó sẽ ức chế hoạt động của nấmmen Thí nghiệm này nhằm đưa ra một nồng độ chất khô phù hợp để quá trình

c) Cách tiến hành

Chuẩn bị môi trường lên men: dứa sau khi chọn lựa phù hợp với yêu cầuđược gọt vỏ, bỏ mắt dứa, cắt nhỏ sau đó ép dứa bằng máy ép dứa để thu hồi dịchdứa Dịch dứa sau khi ép vẫn còn chứa nhiều bã thô nên cần tiến hành lọc lạithêm một lần nữa trước khi tiến hành bước tiếp theo

Dịch dứa thu được sẽ được kiểm tra hàm lượng chất khô tổng số Bx, trongdịch dứa để điều chỉnh Bx lên giá trị cần khảo sát

Tiến hành điều chỉnh bằng cách bổ sung đường saccharose vào cácnghiệm thức cần khảo sát Các nghiệm thức cần khảo sát được đánh số từ 1 đến

Lượng thể tích dung dịch khảo sát là 10 lít

Dung dịch nước dứa và đường sau khi chuẩn bị đạt nồng độ yêu cầu đượcthanh trùng để tiêu diệt hoàn toàn nấm men dại cũng như các vi sinh vật hạikhác ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu sau này Quá trình thanh trùng đượcthực hiện trong nồi áp suất, nhiệt độ thanh trùng: 80oC trong 15 phút

Nước dứa sau khi thanh trùng được để nguội và bổ sung nấm men vào

và cho lên men, lượng nấm men sử dụng là 2,0g/l dịch dứa Nhiệt độ lên men

là 25oC

Các mẫu thí nghiệm được lấy theo các mốc thời gian 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ,

72 giờ, 96 giờ, 120 giờ, 144 giờ, 168 giờ và 216 giờ đối với mẫu 50% đường

Để xác định sự biến đổi hàm lượng chất khô, pH, hàm lượng ethanol, aldehyd,rượu bậc cao, ester Đồng thời, theo dõi dựa vào diễn biến của bọt khí và mùihương của cồn sinh ra trong quá trình lên men

Từ diễn biến của các chỉ tiêu trên, biện luận để xác định thời gian lên men

và nồng độ chất khô ban đầu để thực hiện thí nghiệm tiếp theo

3.3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng nấm men ban đầu lên hàm lượng ethanol và các sản phẩm bậc hai tạo thành trong sản phẩm

Bố trí ngẫu nhiên 5 nghiệm thức là hàm lượng nấm men ban đầu cho vàolần lượt là: 1,0g/l; 1,5g/l; 2,0g/l; 2,5g/l; 3,0g/l

Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

Cách tiến hành

Chuẩn bị nguyên liệu: bố trí 5 nghiệm thức đánh dấu từ 1 đến 5

Tiến hành điều chỉnh bằng cách bổ sung đường saccharose vào cácnghiệm thức cần khảo sát sao cho nồng độ chất khô ban đầu của dịch dứa lànồng độ chất khô của thí nghiệm 3.2.2.1

Điều chỉnh pH bằng Na2CO3 hay acid citric sao cho giá trị pH ban đầu đểkhảo sát là: 4,5

Lượng thể tích dung dịch khảo sát là 10 lít

Thanh trùng trong nồi áp suất, nhiệt độ thanh trùng: 80oC trong 15 phút.Nước dứa sau khi thanh trùng để nguội được bổ sung nấm men và lênmen, lượng nấm men sử dụng là:

- 1: hàm lượng nấm men ban đầu: 1,0g/l

- 2: hàm lượng nấm men ban đầu: 1,5g/l

- 3: hàm lượng nấm men ban đầu: 2,0g/l

- 4: hàm lượng nấm men ban đầu: 2,5g/l

- 5: hàm lượng nấm men ban đầu: 3,0g/l

Thời gian lên men: được xác định từ kết quả của thí nghiệm 3.3.3.3

Nhiệt độ lên men: 25oC

Các mẫu thí nghiệm được lấy để xác định sự biến đổi hàm lượng chất khô,

pH, hàm lượng ethanol, aldehyd, rượu bậc cao, ester Đồng thời, theo dõi dựavào diễn biến của bọt khí và mùi hương của cồn sinh ra trong quá trình lên men

Từ diễn biến của các chỉ tiêu trên biện luận để xác định hàm lượng bánhmen cho vào thích hợp

40