Mỗi chai Yakult có chứa hơn 6.5 tỉ khuẩn L.casei Shirota. Không giống như hầu hết những chủng khuẩn bình thường khác trong yogurt, mà khuẩn L.casei Shirota có khả năng sống sót trong dịch vị dạ dày và dịch vị mật, tiến đến ruột vẫn sống, hỗ trợ phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Khi tiêu thụ Yakult hàng ngày, khuẩn L.casei Shirota hỗ trợ cải thiện tiêu hóa, điều hòa hệ miễn dịch và ngăn ngừa các bệnh truyền nhiễm.
Trang 3CHƯƠNG I: TỔNG QUANI.1 Giới thiệu về Yakult
Yakult là sữa uống lên men từ sữa bột gầy, đường, nước và chủng khuẩn
probiotic Lactobacillus casei Shirota.
Mỗi chai Yakult có chứa hơn 6.5 tỉ khuẩn L.casei Shirota Không giống như hầu hết những chủng khuẩn bình thường khác trong yogurt, mà khuẩn L.casei Shirota có khả
năng sống sót trong dịch vị dạ dày và dịch vị mật, tiến đến ruột vẫn sống, hỗ trợ phục hồi
sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột Khi tiêu thụ Yakult hàng ngày,
khuẩn L.casei Shirota hỗ trợ cải thiện tiêu hóa, điều hòa hệ miễn dịch và ngăn ngừa các
bệnh truyền nhiễm
Hình 1.1 Sản phẩm đặc trưng của sữa chua uống Yakult
Trong sản phẩm Yakult, chỉ chứa duy nhất chủng khuẩn Lactobacillus casei Shirota,
là chủng probiotic đã được chứng minh một cách khoa học là kháng dịch vị tiêu hóa, tiếnđến ruột vẫn sống và đã được chứng minh là có những tác động có lợi cho sức khỏe
I.2 Đặc điểm chủng Lactobacillus casei Shirota
Đây là một chủng vi khuẩn lactic thuộc một loài thông thường, nhưng khác với cácchủng khác ở chỗ chúng đề kháng mạnh mẽ với dịch dạ dày (độ acid rất cao) và dịch mậtcùng các enzyme tiêu hóa khác, do đó đến được ruột non và phát triển được trong ruột
non Chính vì vậy đây là một trong những lợi khuẩn mạnh nhất L casei Shirotakhông có
Trang 4gene kháng kháng sinh hay chuyển gene kháng kháng sinh cho vi sinh vật bản địa củangười sử dụng, đặc biệt là các kháng sinh dùng phổ biến hiện nay như Vancomycin(Khuẩn probiotic phải không có gene kháng kháng sinh hay chuyển gene kháng khángsinh cho vi sinh vật bản địa vì nếu không, nó sẽ làm rối loạn và ảnh hưởng đến quá trìnhđiều trị bệnh sau này).
Khả năng bám dính của khuẩn L casei Shirota vào bề mặt của các tế bào thành ruột
là không cao (khuẩn probiotic phải có khả năng bám dính vào bề mặt các tế bào ruột đểkích thích hệ miễn dịch và chống lại các vi sinh vật gây bệnh bản địa định cư trong ruột.Khuẩn L casei Shirota không có khả năng phân giải niêm mạc dạ dày (gastricmucin) (khuẩn probiotic phải không có khả năng phân giải lớp niêm mạc dạ dày Lớpniêm mạc có vai trò bảo vệ dạ dày không bị tác động chính bởi dịch vị acid dạ dày Nếulớp niêm mạc này bị phá vở, dạ dày sẽ bị chính dịch vị acid do dạ dày tiết ra và phá hủygây loét, và tạo điều kiện cho vi sinh vật bản địa gây bệnh và gây nhiễm trùng đến các cơquan khác)
I.3.Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Lactobacillus casei: Lên men lactic đồng hình, trực khuẩn nhỏ, Gram (+), thường
gặp ở dạng chuỗi dài hoặc ngắn, tích tụ tới 1,5% acid Chúng không có khả năng chuyểnđộng Có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose, mannose, galactose,maltose, lactose, salicin Trong quá trình lên men chúng tạo ra D-acid lactic Nhiệt độ tốithích cho phát triển là 38-40oC, nhờ có hoạt tính protease nên có thể phân hủy proteintrong sữa thành acid amin
I.3.1 Khả năng chịu được điều kiện dịch dạ dày nhân tạo
Nguyên tắc: Các mẫu sẽ được cho vào môi trường dạ dày nhân tạo SGJ Theo nghiên
cứu của Zhou và cộng sự (2009) cho rằng giá trị pH 2 và pH 3 được xem là giới hạnquyết định trong sàng lọc các chủng vi sinh vật có khả năng sống sót Thời gian xử lý môphỏng theo thời gian lưu của thức ăn trong dạ dày từ 2 giờ đến 3 giờ
Tiến hành: Chuẩn bị môi trường MRS dạ dày nhân tạo pH 2 cho vào các ống nghiệm
và đem thanh trùng ở nhiệt độ 90ºC trong 5 phút Bổ sung dịch sản phẩm Asau khi đã lên
Trang 5men với tỷ lệ cấy giống 10% Tiến hành xác định mật độ vi sinh vật bằng phương phápcấy trải trên đĩa petri sau các khoảng thời gian: 0; 60; 120 phút.
I.3.2 Khả năng chịu muối mật
Nguyên tắc: Sản phẩm đạt tiêu chuẩn probiotic phải có vi sinh vật có khả năng sống
và phát triển trên môi trường có bổ sung muối mật (một thành phần được tiết ra trongquá trình tiêu hóa thức ăn) Chính nhờ khả năng này mà vi khuẩn mới có thể tồn tại vàphát triển trong cơ thể
Tiến hành: Chuẩn bị môi trường MRS và bổ sung muối mật để đạt nồng độ cuối
0,3% Cho vào các ống nghiệm vô trùng 10 ml môi trường rồi bổ sung 1 ml dịch mẫu.Tiến hành xác định mật độ vi sinh vật bằng phương pháp cấy trải đĩa sau các khoảng thờigian: 0; 2; 4 giờ
I.3.3 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các vi sinh vật thử nghiệm đối với một số vi
khuẩn gây hại như B subtilis, Salmonella sp theo phương pháp của Aslim và cộng sự
(2005)
Nguyên tắc: Thực hiện theo nguyên tắc khuếch tán trên đĩa thạch, nguyên tác này
dựa trên khả nắng kháng các vi sinh vật chỉ thị của
hai sản phẩm
Tiến hành: Dịch sữa của hai sản phẩm sau khi được lên men tiến hành đem ly tâm
4000 rpm, 10 phút để thu dịch nổi bên trên Các chủng Salmonella sp và B subtilis được
nuôi cấy 12 giờ và cấy trải trên các đĩa môi trường NA (25ml/đĩa) với thể tích 20 µL Sau
đó, sử dụng ống thép đã được vô trùng đục các lỗ đường kính 5 mm trên các đĩa thạch.Dịch của mẫu được cho vào các lỗ thạch với thể tích 35 µL Đọc kết quả các đĩa thạchsau 12 giờ ủ ở 37°C Khả năng kháng khuẩn của hai sản phẩm được xác định dựa vàođường kính vòng vô khuẩn xuất hiện xung quanh lỗ thạch
I.4 Lợi ích của sữa Yakult
1.4.1 Giúp điều hòa nhu động ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón.
Trong cuộc sống hiện nay, chúng ta rất dễ bị tác động bởi các nhân tố như stress,dùng kháng sinh, sự lão hóa, sự nhiễm khuẩn hay hóa chất từ thực phẩm, hoặc chế độ ăn
Trang 6nhiều béo và đạm nhưng ít chất xơ,… gây rối loạn tiêu hóa, ảnh hưởng đến sức khỏe vàchất lượng cuộc sống của chúng ta, mà phổ biến nhất là gây ra các bệnh về đường tiêuhóa như tiêu chảy, táo bón, hội chứng ruột kích thích, hội chứng ruột ngắn, viêm dạ dày,thậm chí là ung thư ruột…
Hiện nay, liệu pháp probiotic dùng trong phòng và điều trị các bệnh về đường tiêuhóa cũng như để tăng cường sức khỏe ngày càng được ứng dụng rộng rãi Chúng có thểđược dùng dưới dạng thực phẩm như sữa lên men, thức uống hoặc thuốc Và có thể nóiprobiotics được xem là 1 liệu pháp thay thế hiệu quả cho liệu pháp dùng kháng sinhtrong điều trị bệnh hiện nay
Trong điều kiện in vitro, chủng khuẩn L.casei Shirota đã được chứng minh là kháng
dịch vị acid dạ dày và dịch vị mật nhân tạo Và trong những thử nghiệm lâm sàng trên
người, kết quả cho thấy rằng khả năng kháng dịch vị tiêu hóa của chủng L.casei Shirota, sống sót qua hệ tiêu hóa và được bài tiết ra ngoài qua phân [M Shirota et al 1966 và Touhy et al 2007] Sau khi vượt qua hàng rào dịch vị tiêu hóa, chủng khuẩn L.casei Shirota tiến đến ruột và có những tác động hỗ trợ đối với hệ tiêu hóa cũng
như là tăng cường hệ miễn dịch Chúng có sự tương tác với thành phần của hệ vi sinh vậtđường ruột, giúp điều hòa và duy trì hệ vi sinh vật đường ruột ở mức cân bằng bằng cáchlàm tăng các vi khuẩn có lợi thuộc chi Lactobacilli, Bifidobacteria đồng thời ức chế sự
phát triển của những vi khuẩn gây hại như E.coli, Clostridium, Staphylococus,…[Tanaka
et al 1994, M Shirota et al 1966], cũng như là tạo ra các sản phẩm trao đổi chất giúp
điều tiết chức năng của ruột Từ đó giúp cải thiện tình trạng tiêu chảy, táo bón hay cácbệnh lý khác về đường tiêu hóa như viêm dạ dày, hội chứng ruột ngắn, hội chứng ruộtkích thích,
Trong các bệnh về đường tiêu hóa, thì tiêu chảy là một trong những bệnh lý thườnggặp và phổ biến nhất Nguyên nhân phổ biến nhất là do sự nhiễm khuẩn gây hại
như E.coli, Vibrio, Shigella,… từ thực phẩm không vệ sinh, chúng làm mất cân bằng hệ
vi sinh vật đường ruột, và tạo điều kiện cho những vi sinh gây hại phát triển tạo độc tốgây tiêu chảy Mục tiêu hàng đầu trong điều trị bệnh tiêu chảy là cân bằng hệ vi sinh vật
đường ruột bằng vi khuẩn có lợi probiotics Chủng khuẩn probiotic L.casei Shirota đã được ghi nhận có hiệu quả trong điều trị bệnh tiêu chảy Trong điều kiện in
Trang 7vitro, L.casei Shirota cho thấy có hiệu quả ức chế đáng kể sự phát triển các vi khuẩn gây tiêu chảy như E.coli (ETEC-enterotoxigenic E.coli), Salmonella enteritidis, Shigella dysenteriae và Vibrio cholerae [Godiosa O et al 1993] ).
1.4.2 Giúp duy trì cân bằng lượng khuẩn có lợi và vi khuẩn gây hại có trong đường ruột.
Hệ tiêu hóa của chúng ta chứa hàng trăm tỉ khuẩn, bao gồm khuẩn có lợi và khuẩngây hại Chúng ta rất dễ bị tác động bởi các nhân tố gây rối loạn hệ đường ruột như làdùng kháng sinh, chế độ ăn không cân bằng, lão hóa, stress, sự nhiễm khuẩn,…Chínhnhững nhân tố này tạo điều kiện cho các vi sinh vật gây hại phát triển và chiếm ưu thếtrong ruột, gây ảnh hưởng đến sức khỏe
Yakult có khả năng duy trì sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột và hỗ trợ ngănngừa các bệnh truyền nhiễm và ung thư Yakult là một probiotic, nó có chứa hơn 6.5 tỉ
khuẩn có lợi Lactobacillus casei Shirota Chủng khuẩn L.casei Shirota kháng được dịch
vị tiêu hóa, tiến đến ruột và phát triển trong ruột, và hỗ trợ cho sức khỏe bằng cách: Làmtăng vi khuẩn có lợi và làm giảm vi khuẩn gây hại, giúp cân bằng hệ vi sinh vật đườngruột
1.4.3 Giúp giảm độc tố trong ruột
Ngoài ra L.casei Shirota còn giúp đào thải các độc tố trong ruột cũng như là giúp ngăn ngừa và phòng chống ung thư ruột [Miyazaki K and Takeshi Matsuzaki 2009 và Ishikawa et al 2005] Các độc tố gây hại như p-cresol, indican, phenol, ammonia,…từ
thực phẩm hay do các vi sinh vật gây hại tạo ra, nếu không được đào thải ra ngoài sẽ ảnhhưởng đến sức khỏe, thậm chí nếu tích lũy lâu ngày sẽ gây những rối loạn chức năng củagan, thận, và có thể dẫn đến ung thư
1.4.4 Giúp tăng cường hệ miễn dịch, phòng chống các bệnh truyền nhiễm và ngăn ngừa ung thư
Tế bào NK (Natural Killer Cell) được phát hiện vào khoảng năm 1970 từ trong mộtquần thể tế bào limpho, nhưng công năng của nó thì nhiều năm sau mới được công nhận
Trang 8Trong cơ thể có 3 loại tế bào limpho, đó là: tế bào B (chuyên sinh kháng thể, đượchình thành từ lá lách); tế bào T (điều khiển tế bào miễn dịch, sinh trưởng) và tế bào NK(tế bào miễn dịch tự nhiên, sinh trưởng trong tủy sống) 3 loại tế bào limpho này có 2loại mọi người đều biết rõ và nó chiếm gần 90% trong tổng số các tế bào limpho
Tỷ lệ tế bào NK không lớn chỉ chiếm 10%- 15% nhưng là loại vũ khí sắc bén nhấttrong các tế bào tự nhiên nhằm loại bỏ các “phần tử phiến loạn” khi các tế bào NK hoạtđộng mạnh thì mắc khối u giảm, điều này đều được đông đảo giới khoa học kiểm chứng.Nhiều nơi trên thế giới đã triển khai điều trị khối u bằng “Liệu pháp tế bào NK”
Phương pháp này là rút máu từ cơ thể bệnh nhân và tiến hành các biện pháp kíchthích tế bào NK trong máu đó sau đó bơm nó trở lại cơ thể
“Liệu pháp tế bào NK” ngăn chặn sự phát triển của khối u một cách hữu hiệu,chứng minh tăng cường tế bào NK hoàn toàn có thể điều trị khối u Có nghiên cứu liênquan chứng minh khi một tế bào NK ngã xuống nó có thể tiêu diệt 27 tế bào ung thư Năm 1990, phát hiện ra cơ chế nhận biết tế bào ung thư của tế bào NK thông quaviệc phát hiện tế bào không có phân tử MHC Vì thế lý giải tại sao tế bào NK lại gọi làsát thủ tự nhiên Khi phát hiện ra phân tử MHC thấp đi là nó sẽ tiến hành các biện pháp
để tiêu diệt tế bào ung thư ngay lập tức chứ không phải đợi đến khi tiếp xúc với tế bàoung thư mới có thể phát giác ra chúng Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng tần suất mắc khối u
có mối quan hệ tỷ lệ nghịch với số lượng tế bào NK Do đó nâng cao số lượng tế bào NKtrong cơ thể có thể phòng bệnh ung thư
Hoạt tính tế bào NK có sự thay đổi khi sử dụng Yakult, hoạt tính tăng dần trong khi
sử dụng và khi ngừng sử dụng hệ miễn dịch đã giảm lại như ban đầu, tiếp tục bổ sung lợikhuẩn để duy trì sức khỏe của hệ miễn dịch
Acrylamide là độc tố được tạo ra do quá trình chế biến thực phẩm nào đó ở nhiệt độcao (chẳng hạn như khoai tây chiên, bánh phồng tôm,…) Theo các chuyên gia nghiêncứu ghi nhận được thì việc hấp thụ độc tố Acrylamid qua chế độ ăn uống hàng ngày sẽgia tăng nguy cơ bị ung thư và có thể gây hại cho hệ thần kinh của chúng ta Đối với namgiới, nếu tiêu thụ trong thời gian dài sẽ ảnh hưởng đến các tuyến sinh sản Tại Việt Nam,Viện Vệ sinh Y tế Công cộng cũng đã từng công bố “nếu chiên khoai tây ở nhiệt độ cao
và trong thời gian dài thì sẽ sinh ra độc tố acrylamide, có nguy cơ gây ung thư” sau khiphân tích các mẫu khoai tây chiên đang bán tại các cửa hàng thức ăn nhanh và cửa hàng
Trang 9bán lẻ trên địa bàn Tp.HCM Vì vậy thật sự rất cần thiết phải có biện pháp mà có thể gópphần làm giảm hoặc đào thải độc tố arcylamid từ thực phẩm mà chúng ta ăn vào.
Một nghiên cứu gần đây của GS Serrano Nino vừa được đăng trên tạp chí Journal ofFood Safety hồi đầu tháng 2 về hiệu quả của 14 lợi khuẩn axit lactic có khả năng giúp
đào thải độc tố arcylamide trong điều kiện in vitro, trong đó khuẩn Lactobacillus casei Shirota trong sữa Yakult là có hiệu quả cao nhất
Cho đến nay chưa có biện pháp nào hoàn toàn có thể loại bỏ acrylamide ra khỏi thựcphẩm Trong thời gian chờ đợi các nhà khoa học tìm ra liệu pháp hữu hiệu thì việc sửdụng các thực phẩm chứa lợi khuẩn acid lactic hàng ngày, chẳng hạn như sữa uống lênmen Yakult, là cần thiết và hữu ích, nó không chỉ giúp duy trì đường ruột khỏe mạnh màcòn góp phần giúp đào thải bớt các độc tố acrylamide, giảm nguy cơ gây ung thư gây ra
từ thực phẩm mà chúng ta ăn vào
CHƯƠNG II: VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN SỮA CHUA
2.1 Lịch sử hình thành chủng
Trang 10Tên "lactobacillus" đề cập đến khả năng của vi khuẩn lên men đường để tạo ra axidlactic Tên "casei" là tiếng Latin chỉ pho mát, liên quan đến việc sử dụng các vi khuẩntrong quá trình làm ra pho mát Tiến sĩ Nhật Bản Minoru Shirota (1899-1982) có mộtphát minh quan trọng vào năm 1930, khi ông làm việc tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vậthọc của Trường Đại học Hoàng gia Y khoa Kyoto (nay là Đại học Kyoto) Đó là việc
phân lập và nuôi cấy được một chủng vi khuẩn thuộc loài Lactobacillus casei và về sau
được mang tên là chủng Lactobacillus casei Shirota theo tên của tiến sĩ Chủng là một
trong khoảng 300 chủng của vi khuẩn mà Tiến sĩ Minoru Shirota, người sáng lập Yakult,chọn lọc từ nhiều nguồn thực phẩm
Các chủng được đặt tên Shirota vào năm 1966 nhưng thường được tham khảo trong
các tài liệu khoa học như chủng L.casei YIT 9018.
Năm 1930, vi khuẩn được phân lập bị nhiễm một thể thực khuẩn trong DNA, ảnhhưởng kiểu hình của sự lây nhiễm này không được sản xuất acid lactic trong quá trìnhlên men
Để ổn định quá trình sản xuất, một thực khuẩn được loại bỏ dẫn xuaatscuar chủnggốc được chọn vào năm 1980, được chỉ định YIT 9029, và được kết lắng trong lên menchọn lọc của International Depositary Authority, Cơ quan khoa học và Công nghệ NhậtBản, số đăng ký FERM BP-1366
Chủng YIT 9029, hiện nay được chỉ định chủng L.Casei Shirota và được sử dụng để
sản xuất các sản phẩm sữa lên men, bao gồm thức uống được bán trên toàn thế giới dướitên Yakult
2.2 Phân loại khoa học:
Trang 11Giới (regnum): Bacteria
Ngành (phylum): Firmicutes
Lớp (class): Bacilli
Bộ (ordo): Lactobacillales
Họ (familia): Lactobacillaceae Chi (genus): Lactobacillus Loài (species): Lactobacillus casei
Hình 2.1 Vi khuẩn Lactobacillus casei Shirota 2.3 Mô tả và xác định lactobacillus casei Shirota
Lactobacillus casei là một vi khuẩn Gram dương là một chi của việc phân loại rộng các vi khuẩn axit lactic (LAB) LAB bao gồm một nhóm vi khuẩn liên quan đến chức năng trao đổi chất thông thường - sản xuất axit lactic là sản phẩm cuối cùng trao đổi chất chính của quá trình chuyển hóa carbohydrate và các đặc điểm sinh lý phổ biến LAB là dương tính, không bào tử, và catalase âm tính và không có cytochromes (Holzapfel et al 2001) Chúng là những chất chống oxy hóa ưu việt nhưng có khả năng
chịu lạnh, chịu được axít và lên men nghiêm ngặt Mặc dù chúng không phải là nhómphân loại được xác định chặt chẽ, LAB thường được coi là bao gồm các chiphylogenetically liên quan đến chi, có một số tính năng sinh hóa và sinh thái chung(Axelsson 1998): Aerococcus, Alloicoccus, Carnobacterium, Dolosigranulum,Enterococcus, Globicatella, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc,Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenoccus, Vagococcus, và Weissella Donhững điểm tương đồng trong sinh hóa, sinh lý học và sinh thái của nó, chiBifidobacterium thường được coi là LAB, mặc dù nó không liên quan đến
Trang 12phylogenetically (Axelsson 1998) Ngoại trừ một số loài Streptococcus và có thể một sốchủng Enterococcus, hầu hết các chủng LAB được xem là có ít hoặc không có tiềm nănggây bệnh (Donohue và Salminen 1996; Adams 1999) LAB có một lịch sử sử dụng lâudài trong thực phẩm lên men và không lên men và đã được ghi nhận về khả năng ức chếcác vi sinh vật khác có khả năng gây bệnh thực phẩm hoặc hư hỏng thực phẩm (Donohue
và Salminen 1996; Adams, 1999) Hơn nữa, một số LAB có mặt khắp nơi như các thànhphần nhỏ trong biểu mô ruột và đường tiêu hóa của con người ở mọi lứa tuổi Tất cảnhững yếu tố này dẫn đến kết luận hợp lý rằng hầu hết các chủng LAB đều an toàn để sửdụng trong thực phẩm thông thường có thể được tiêu thụ bởi tất cả các thành viên củadân số nói chung
Lactobacillus là một chi không gây bệnh bao gồm hơn một trăm loài Một báo cáocủa Cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu vào tháng 11 năm 2007 (EFSA 2007b) đã xácđịnh 112 loài, trong khi Bemardeau et al (2008), viết cùng năm, cho rằng chi có 135 loài
và 27 phân loài Lactobacillus là một chi không đồng nhất với nhiều tính chất kiểu hình,sinh hóa và sinh lý; nó đã được gợi ý rằng sự đa dạng cực đoan của bộ gen Lactobacillus
sẽ biện minh cho sự công nhận của các đơn vị mới subgeneric (Bemardeau et al 2008).Lactobacilli có dạng hình que, không di chuyển và không bào tử L casei thường thẳng,
có kích thước khoảng 1 x 3 gm, và được sắp xếp theo dây chuyền Lactobacilli phát triểntrong điều kiện oxy giảm trong môi trường sống nơi có nhiều chất dinh dưỡng tồn tại.Các thành viên của chi có thể là homo- hoặc heterofermentative Các cựu chuyển đổicarbohydrate thành axit lactic thông qua các đường glycolytic, trong khi sau này chuyểnđổi carbohydrate bằng cách sử dụng phosphoketolase để sản xuất axit lactic, axit axetic,
và carbon dioxide L casei là homofermentative (Cogan 1996) Lactobacilli được sửdụng trong các ứng dụng thương mại cho quá trình lên men các sản phẩm sữa, trái cây,rau và thịt (Aguirre và Collins 1993; Gasser 1994) Một số chủng Lactobacillus được tìmthấy trong đường tiêu hóa của người khỏe mạnh ở mọi lứa tuổi, nơi chúng nằm trong sốcác vi khuẩn "bình thường" (Saxelin et al 1996b; Goldin et al 1992)
Việc phân loại chi Lactobacillus đã tiến hóa trong vài thập kỷ qua như một số tiến bộtrong sinh học phân tử, đặc biệt là việc sử dụng phân tích chuỗi gen 16S rDNA, đã cho
Trang 13phép phân biệt hơn nữa trong các nhóm trước đây được coi là các loài đơn lẻ Như vậy,hơn 100 loài đã được công nhận trong khi chỉ có một thập kỷ trước con số này chỉ gần 50(Axelsson 1998) Bemardeau et al (2006) quan sát thấy rằng quá trình thay đổi danhpháp là liên tục và liên tục Nhóm L casei, trước đây được coi là một loài duy nhất, làmột trường hợp tại điểm.
2.4 Hình thái học và tăng trưởng
Các tế bào chủng L casei Shirota có hình que, 0,4-0,6 x 2-3 gm, và xảy ra đơn lẻ,theo cặp, hoặc trong các chuỗi ngắn bao gồm ba hoặc bốn tế bào Các chủng có khả năngphát triển ở nhiệt độ từ 27 ° C đến 43 ° C với tối ưu là 37 ° C Sau khi tăng trưởng kỵ khí
ở 37 ° C trong 48 giờ, các khuẩn lạc trên thạch thạch Man Rogosa Sharpe (MRS) cóđường kính 2-3 mm, màu be, nhẵn, và tròn với toàn bộ cạnh (mịn) Trong nước canhMRS, tăng trưởng xảy ra ở 15 ° C nhưng không ở 45 ° C Trong khi nó có thể phát triển
ở độ pH thấp tới 3,5, độ pH tối ưu của nó là 6,5
Các chủng là một vi khuẩn axit lactic homofermentative đồng hóa, tạo ra 2 phân tửaxit lactic từ mọi phân tử glucose (mặc dù nó cũng tạo ra một lượng nhỏ acetate, etanol
và diacetyl) Chỉ có L-enantiomer của axit lactic được hình thành Các chủng là chấtdinh dưỡng cho 12 amino acid, đòi hỏi một môi trường giàu có cho sự phát triển(Morishita et al 1981)
Xác định GRAS đối với khả năng lên men của chủng L casei Shirota, axit lacticđược sản xuất từ ribose, adonitol, galactose, D-glucoza, D-fructose, D-mannose, L-sorbose, mannitol, sorbitol, methyl-aD -glucoside, / V-acetylglucosamine, amygdalin,arbutin, salicin, cellobiose, maltose, lactose, trehalose, turanose, D-lyxose và D-tagatose,
và được sản xuất yếu từ inositol, sucrose, P-gentiobiose, gluconate và 5- keto-gluconate,nhưng không phải từ glycerol, erythritol, D- hoặc L-arabinose, D- hoặc L-xylose,methyl-P-xyloside, rhamnose, galactitol, methyl-aD-mannoside, melibiose, inulin,melezitose, raffinose, tinh bột , glycogen, xylitol, D- hoặc L-fucose, D- hoặc L-arabitolhoặc 2-keto-gluconate Aesculin được thủy phân, nhưng dextran không được sản xuất từsucrose, amoniac không được sản xuất từ arginine, và nitrat không bị giảm
Trang 142.5.Cơ sở hóa sinh tổng hợp sản phẩm
Quá trình lên men sữa chua là do vi khuẩn thuộc nhóm lactic cụ thể là Lactobacillus casei Shirota phát triển và tích tụ một lượng acid lactic làm giảm pH của môi trường gây
đông tụ casein của sữa và tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm
2.5.1 Cơ chế của quá trình lên men Lactic
Dựa vào sản phẩm sinh ra trong quá trình lên men, người ta chia vi khuẩn lactic ralàm 2 nhóm: nhóm vi khuẩn lên men lactic đồng hình (điển hình) và nhóm vi khuẩn lênmen lactic dị hình (không điển hình)
a Lên men lactic dị hình
Là quá trình lên men mà sản phẩm tạo thành ngoài acid lactic còn có nhiều sản phẩmkhác: 40% acid lactic, 20% acid sucxinic và etanol, 10% acid acetic, 20% các chất khí…
nhóm vi khuẩn này gồm có vi khuẩn như: Bacterium coli, Bac Aeogenes, Bac Pentoacetium, L brevis, Strep Votrovorus…
Quá trình này, vi khuẩn lactic dị hình do thiếu hai enzyme chủ yếu của con đườngEMP là aldolase và triozophosphate- isomerase nên giai đoạn đầu của quá trình phân giảiglucose xảy ra theo con đường PP (pentose phosphate)
b Lên men lactic đồng hình
Là quá trình lên men mà sản phẩm tạo thành là acid lactic, nó chiếm 90-98% sảnphẩm của quá trình lên men, sản phẩm phụ là etanol, acid acetic, CO2, axetoin Nhóm vi
khuẩn này chủ yếu là hai giống Lactobacterum như: Lactobacterium bungaricum, L.casei, l.debruckii, l cucunmeris fermentati…và Streptococcus như: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris…
Trong trường hợp này acid pyruvic được tạo ra theo sơ đồ Embden- Meyerhoff Sau
đó acid pyruvic sẽ tạo thành acid 10 actic dưới tác dụng của enzyme lactatedehydrogenase Chỉ một lượng nhỏ pyruvic bị khử carbon để tạo thành acid acetic,ethanol, CO2 và acetone Ở đây khuẩn Lactobacillus casei Shirota lên men đồng hình.
C6H12O6 → CH3-CO-COOH CH3-CHOH-COOH + Năng lượng
(glucose) (acid pyruvic) (acid lactic) (21,8.104 J)
Trang 15Vi khuẩn lên men lactic đồng hình có ý nghĩa lớn trong công nghiệp vì để đảm bảonăng lượng cho hoạt động sống, đồng thời cung cấp năng lượng cho sinh trưởng và pháttriển, chúng phải phân giải một lượng lớn đường và tạo thành một lượng đáng kể acidlactic Đây là sản phẩm có vai trò trong công nghiệp thực phẩm Là một gia vị đối vớicác đồ uống nhẹ, dịch quả, mứt và siro Trong ngành sữa, acid lactic được ứng dụng đểtạo các sản phẩm như sữa chua, phomat, và các loại sữa lên men lactic và lên men rượu
CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH
3.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật
Trang 16- Môi trường sử dụng để phân lập là MRS agar là môi trường chọn lọc chứa nhiềuthành phần thích hợp với sự tăng trưởng của vi khuẩn lactic (DeMan et al., 1960).
- Sử dụng phương pháp pha loãng mẫu bằng nước cất, cấy gạt dịch pha loãng ở nồng
độ 10-3 và 10-5 trên đĩa Petri chứa môi trường MRS, sau đó phủ tiếp 1 lớp thạch mỏng đểtạo điều kiện kị khí Nuôi ở 37oC trong 48h
- Kiểm tra sự xuất hiện các khuẩn lạc trên đĩa Petri, tách và thuần khiết các khuẩnlạc có vùng trong suốt xung quanh (axit phân giải CaCO3 tạo vòng trong)
- Bảo quản giống trong ống nghiệm môi trường MRS thạch nghiêng
- Quan sát tế bào dưới kính hiển vi
3.2 Phương pháp định danh vi sinh vật
3.2.1.Định danh Lactobacillus casei Shirota ở mức độ loài
3.2.1.1 Trích ly DNA và giải trình tự 16S rRNA
Chuỗi gen 16S rR.NA của chủng L casei Shirota là 100% giống với chủng L casei
được chỉ định ATCC 334 và NCDO 151 Ngược lại, mức độ trình tự gen 16S rRNA
tương tự giữa chủng L casei Shirota và Các chủng L.zeae được chỉ định ATCC 393 và
ATCC 15820, và chủng L rhamnosus ATCC 7469, lần lượt là 99,23, 99,23 và 98,9%.Chuỗi gen 16S rRNA đã được đăng ký trong cơ sở dữ liệu ADN công khai với số gianhập AB531131
Trang 173.2.2.Định danh Lactobacillus casei Shirota ở mức độ chủng
3.2.2.1 DNA đa hình khuếch đại ngẫu nhiên
Một phương pháp dựa trên PCR đặc biệt đã được phát triển để xác định và địnhlượng chủng L casei Shirota sử dụng một chủng L casei dạng mồi đặc trưng Shirota(pLcS) bắt nguồn từ phân tích ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (Fujimoto et al.2008) Trong một nghiên cứu cho con người, chủng L casei Shirota được định lượngtrong phân sau khi ăn chủng bằng PCR định lượng (qPCR) sử dụng pLcS Khả năng củaphương pháp để xác định chủng phù hợp với một ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng vàphân tích RAPD trong một mẫu đại diện của các khuẩn lạc được nuôi cấy từ phân người.Sau 14 đối tượng khỏe mạnh ăn 1011 cfu L casei chủng Shirota hàng ngày trong 7 ngày,
10 9.1 +/-0.5 cfu / g L casei chủng Shirota được phát hiện bởi qPCR trong các mẫu phân củatất cả các đối tượng, trong khi 108.04+/-0.9 cfu / g được phát hiện bằng phương pháp nuôicấy chọn lọc Chuỗi L casei Trình tự DNA đặc trưng của Shirota thu được trong nghiêncứu này đã được đăng ký trong cơ sở dữ liệu ADN công cộng với số gia nhập AB246299
3.2.2.2 So sánh DNA trực tiếp
Xác định chủng L casei Shirota có thể trực tiếp thông qua trình tự DNA của nó, vìtoàn bộ nhiễm sắc thể được biết (Sato et al 2004) Mặc dù trình tự cơ bản thực tế của nóvẫn được giữ kín, nhưng các phần khác nhau của chuỗi gen L casei đã được công bố.Các chuỗi ADN này được đăng ký trong cơ sở dữ liệu DNA theo các số gia nhập X02734(Shimizu-Kadota et al 1985), AB023773 (Shimizu-Kadota et al 2000), và AB470649(Yasuda et al 2008)
3.2.2.3 Xung điện trường Gel điện di
Trong một nghiên cứu về sự sống còn của chủng L casei Shirota qua đường tiêuhóa, được thảo luận chi tiết trong Phần 4.4.2.1.1, Tuohy et al (2007) cho thấy tính khảthi của việc sử dụng điện di gel xung để xác định L casei biến dạng Shirota trong cácchủng L casei trong phân
3.2.2.4 Miễn dịch
Trang 18Yuki et al (1999) đã thiết lập một phương pháp phát hiện và xác nhận đối với chủng
L casei Shirota sử dụng một môi trường nuôi cấy cụ thể và các kháng thể đơn dòng đặchiệu được nâng lên chống lại chủng này Phương pháp này đặc biệt hữu ích trong trườnghợp chủng L casei Shirota phải được phân biệt với các vi khuẩn khác và liệt kê trongmột mẫu phức tạp, chẳng hạn như mẫu phân
Tóm lại, việc xác định chủng như chủng L casei Shirota đạt được bằng cách so sánh
mô hình RAPD và mô hình PFGE cũng như bằng cách trình tự DNA trực tiếp của cácvùng gen cụ thể Ngoài ra, việc xác định cũng đạt được bằng cách nuôi cấy chủng vớimôi trường thạch chọn lọc, sau đó xác nhận bằng một kháng thể đơn dòng đặc hiệu.Ngoài ra, Maze et al (2010) giải mã bộ gen của L casei biến dạng BL23, xác định kíchthước 3.079.196 cặp cơ sở với hàm lượng G + C là 46,34% Họ so sánh vật tìm thấy của
họ với thông tin tuần tự có sẵn cho chủng neotype, ATCC 334 và chủng Shirota, kết luậnrằng 3 chủng "có vẻ rất giống nhau", với hầu hết sự khác biệt do chèn thể tiền thực phẩmhoặc mã hóa gen để sử dụng carbohydrate Điều này cung cấp thêm xác nhận về sự suyđoán của chủng Shirota
3.3 Phân tích gen
3.3.1 Trình tự Shotgun
Sato et al (2004) đã xác định toàn bộ chuỗi gen shotgun của L casei và Shirota vàchuỗi kết quả được chú thích và phân tích cho các gen có thể là mối quan tâm an toàn cóthể xảy ra chủng L casei Trình tự DNA chuỗi gen của Shirota dẫn đến khoảng 60.000lần đọc cho 31 megabases (Mb) Một ước tính trước đây về kích thước bộ gen dựa trên
dữ liệu PFGE là khoảng 3,1 Mb, cho độ bao phủ 10 lần của bộ gen Lắp ráp các dữ liệunày tạo ra 120 contigs 3,104,260 cặp base (bp); kích thước trung bình của các contigs là25.868 bp Kích thước ước tính cuối cùng của bộ gen là 3.035.755 bp cộng với mộtplasmid đơn (pLY101) chứa 66.801 bp Phân tích này được công bố đầy đủ trong một tạpchí khoa học Nhật Bản (Sato et al 2004)
3.3.2 Nghiên cứu bộ Gen và Plasmid
Sato et al (2004) so sánh bộ gen với chuỗi các chủng Lactobacillus và Lactococcus,bao gồm L casei ATCC 334 và L casei BL23, đều liên quan chặt chẽ đến chủng L caseiShirota Kết quả của phân tích này là danh sách các con đường và quá trình sinh hóa mô