QUY TRÌNH THU NHẬN CAO CHIẾT PHÂN đoạn CHỨA POLYPHENOL từ THỰC vật

Polyphenol là các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và tồn tại trong thực vật được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa vô cùng hiệu quả. Polyphenol có thể bảo vệ cơ thể, giúp cơ thể chống lại nhiều loại bệnh khác nhau do gốc tự do gây ra.

QUY TRÌNH VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỂ THU NHẬN CAO CHIẾT PHÂN ĐOẠN CHỨA

POLYPHENOL TỪ THỰC VẬT

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN HỢP CHẤT POLYPHENOL 1 CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG CAO POLYPHENOL TRIẾT XUẤT TỪ LÁ SAKÊ TRONG TRÀ TÚI LỌC 17

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN HỢP CHẤT POLYPHENOL

OH với bộ khung hóa học mà các tính chất lý hoá học hoặc hoạt tính sinh học thay đổi Dựa vào đặc trưng của cấu tạo hóa học người ta chia các hợp chất polyphenol thành banhóm chính:

Nhóm hợp chất phenol C6 – C1: Acid Galic

Nhóm hợp chất phenol C6 – C3: Acid Cafeic

Nhóm hợp chất phenol C6 – C3 – C6 : Catechin, Flavonoid

Phản ứng cộng: Khi có mặt các acid amin thì các Quinon này sẽ tiến hành phản ứng cộngvới acid amin để tạo thành các octoquinon tương ứng

Phản ứng ngưng tụ: Các octoquinon này dễ dàng ngưng tụ với nhau để tạo thành các sảnphẩm có màu gọi chung là Flobafen

1.2 Chức năng của các polyphenol

Polyphenol được chú ý đến bởi khả năng chống oxy hóa của chúng Chúng có khả năngchuyển electron trong chuỗi hô hấp bình thường định cư trong ti thể Chúng có được khả năng

đó là do chúng có khả năng tạo phức bền với các kim loại nặng, do đó làm mất hoạt tính xúctác của chúng, đồng thời chúng có khả năng nhận các gốc tự do tức là có khả năng dập tắt cácquá trình tạo ra các gốc tự do

Ngoài ra polyphenol còn có khả năng ức chế sự phát triển của vi nấm

Nhiều polyphenol có hoạt tính vitamin P, nghĩa là có khả năng làm tăng độ đàn hồi vàchuẩn hóa tính thẩm thấu của vi ti huyết quản

Hiện nay nhiều tài liệu nghiên cứu polyphenol có khả năng chống và ức chế các tế bàoung thư và sự hấp thụ các tia UV

CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH VÀ PHƯƠNG PHÁP THU CAO POLYPHENOL TỪ LÁ

SAKÊ

2.1 Các yếu tố khảo sát quy trình trích ly và thu nhận polyphenol từ thực vật

Nghiên cứu được tiến hành trên cơ sở xác định điều kiện tối ưu của các biến phụ thuộcảnh hưởng đến hiệu suất trích ly Polyphenol Các yếu tố khảo sát bao gồm: Nồng độ dungmôi (H2O, Cồn 50o, 60o, 70o, 80o, 96o), tỷ lệ dung môi trích ly (1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25,1:30), nhiệt độ trích ly (30, 40, 50, 60, 70 ,80oC), thời gian trích ly (30, 60, 90, 120, 150, 180phút), điều kiện môi trường (pH) (5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3), hiệu suất trích ly ( 1, 2, 3, 4 lần).2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình trích ly và thu nhận polyphenol từ thực vậta) Khảo sát quá trình trích ly

Trích ly là nhằm mục đích tách polyphenol ra khỏi thực vật bằng cách sử dụng dung môi

để hoà tan dựa trên cơ sở chênh lệch nồng độ

Phương pháp khảo sát: khi khảo sát một yếu tố nào đó (nhiệt độ, thời gian… ) thì các yếu

tố còn lại được cố định Yếu tố nào khảo sát xong thì sẽ được cố định ở giá trị tối ưu để tiếptục khảo sát đến các yếu tố khác

Trong quá trình trích ly cần khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình như sau:

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của dung môi trích ly:

• Chuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm theo các nồng độ dung môi trích ly như sau: H2O, cồn 500,

600, 700, 800, 960

Đo OD Chọn dung môi tối ưu

Trích ly

Tiến hành khảo sát tỷ lệ dung môi trích ly: Chuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm theo các tỷ lệ khốilượng nguyên liệu: dung môi như sau: 1:5; 1:10; 1:15; 1:20; 1:25; 1:30

Tiến hành khảo sát nhiệt độ trích ly: Chuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm theo các nhiệt độ như sau: 30, 40, 50, 60, 70, 80 (0C)

Tiến hành khảo sát thời gian trích ly: Chuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm theo các thời gian nhưsau: 30, 60, 90, 120, 150, 180 (phút)

Tiến hành khảo sát điều kiện môi trường (pH) trích ly: Chuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm theocác pH như sau: 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3

Đo OD Chọn tỷ lệ dung môi phù hợp

Trích ly

30oC 40oC 50oC 60oC 70oC 80oC

Đo OD Chọn nhiệt độ tối ưu Trích ly

Đo OD

Ño OD Chọn thời gian tối ưu

Trích ly

Tiến hành xác định hiệu suất trích ly

xong thì tiến hành lọc thu lấy dịch lọc Phần bã tiếp tục được sử dụng để trích ly lại(lần 2, 3, 4) ở các điều kiện tương tự như trích ly lần 1

trích ly Từ đó so sánh với hàm lượng ban đầu để tính được hiệu suất trích ly

b) Khảo sát quá trình xử lý acid

Xử lý acid nhằm mục đích thuỷ phân và loại bỏ các thành phần protein và các hợp chấtcao phân tử có trong dịch trích ly dựa vào việc giảm pH và dùng tác nhân thủy phân acid HCl.Tiến hành khảo sát tỷ lệ cao chiết 1/dung môi

1/20

Đo OD Chọn pH tối ưu Trích ly

Đo OD Chọn số lần trích ly Trích ly

Tiến hành khảo sát nhiệt độ xử lý acid: Chuẩn bị 6 mẫu thí nghiệm theo các nhiệt độ như sau: 30, 40, 50, 60, 70, 80 (0C)

Tiến hành khảo sát thời gian xử lý acid: Chuẩn bị 5 mẫu thí nghiệm theo các thời giannhư sau: 15, 30, 45, 60, 75 (phút)

Tiến hành khảo sát thời gian lắng tủa: Chuẩn bị 4 mẫu thí nghiệm theo các thời gian nhưsau: 12, 24, 36, 48 (giờ)

Đo OD Chọn tỷ lệ dung môi phù hợp

Xử lý acid

30oC 40o0C 50oC 60oC 70oôC 80oC

Đo OD Chọn nhiệt độ tối ưu

Xử lý acid

Đo OD Chọn thời gian tối ưu

Xử lý acid

c) Khảo sát quá trình tinh sạch

Tinh sạch dung dịch sau khi lắng tủa nhằm mục đích thu nhận polyphenol tinh khiết, vìkhi cho dung dịch ethyl acetate vào dung dịch sau xử lý acid thì hỗn hợp sẽ chia thành 2 pha,trong đó polyphenol sẽ hoà tan vào trong lớp ethyl acetate Sau khi kết thúc, cô đặc để đuổiethyl acetate và thu lại sản phẩm cuối cùng là cao chiết polyphenol

Tiến hành khảo sát tỷ lệ dịch sau xử lý acid/ ethyl acetate:

Lắng tủa

Đánh giá cảm quan (màu sắc, độ trong)

Đo OD Chọn tỷ lệ dung môi phù hợp

Tinh sạch

Tiến hành xác định hiệu suất tinh sạch:

lần 1 xong thì tiến hành gạn lọc thu lấy dịch trong (pha ethyl acetate) Phần dịch caochiết (pha nước) còn lại tiếp tục được cho ethyl actetate vào để tinh sạch lại (lần 2, 3,

4, 5) ở các điều kiện tương tự như tinh sạch lần 1

dịch ethyl acetate sau mỗi lần tinh sạch Từ đó so sánh với hàm lượng ban đầu để tínhđược hiệu suất tinh sạch

2.3 Xác định hợp chất polyphenol trong lá sakê

2.3.1 Tác dụng dược lý của lá sakê

Theo các công trình nghiên cứu trên thế giới người ta phát hiện ra rằng ngoài các thànhphần khoáng chất, vitamin và một số chất vi lượng chúng có hàm lượng cao các hợp chấtpolyphenol

Trong lá sakê có chứa:

• 5 hợp chất loại geranyl dihydrochalcone (2, 4, 5, 8, 9)

Đo OD Chọn thời gian tối ưu Tinh sạch

Tuy nhiên những nghiên cứu mới đây chỉ ra rằng các hoạt chất polyphenol trong lá sakê

có tác dụng trị được nhiều loại bệnh khác nhau như bệnh về đường tim mạch, đái tháo đường,bệnh parkison, bệnh béo phì, bệnh sỏi thận và đặc biệt theo các tài liệu mới đây chỉ ra rằngcác hoạt chất polyphenol trong lá sakê có tác dụng ức chế và ngăn ngừa các tế bào ung thư ở

người loại SPC-A-1, SW 480,SMMC-7721 (Phytochemistry Số 68-2007); Quercetin,Campherol)

Tác dụng ngăn chặn và chữa bệnh ung thư của polyphenol được nghiên cứu rất mạnh mẽtrong những năm gần đây Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy polyphenol có khả năngtương tác ngăn chặn và hạn chế các quá trình khơi mào, hình thành và phát triển các tế bàoung thư Trong giai đoạn khơi mào các polyphenol trung hòa các tác nhân kích hoạt bởicytorchom P450 enzyme, các tác nhân này có khả năng tương tác làm thay đổi cấu trúc củaAND, ngăn chặn sự tạo thành Nitrosamine là một nhóm các hợp chất phát sinh từ khói thuốc

lá, các amin dị vòng trong thịt, cá nấu chín – các tác nhân được cho là gây ung thư

Trong giai đoạn bắt đầu của tế bào ung thư, các polyphenol có khả năng ức chế AP-1 mộtdẫn xuất truyền khơi mào cho sự phát triển của tế bào ung thư da, thể hiện khả năng ngănchặn protein kinase, enzyme kích hoạt tế bào trong giai đoạn phát triển của tế bào ung thư, ứcchế hoạt động của Telomerase, làm giảm thời gian sống của tế bào ung thư

Khi quá trình ung thư diễn ra, polyphenol có thể can thiệp, ức chế hoạt động củaurokinase, enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển và biến đổi của tế bàoung thư, phá hủy các dạng biến đổi đặc thù của tế bào gây ra do sdevirus, hay ngăn chặn quátrình tổng hợp AND trong tế bào ung thư hepatoma, leukemia, ung thư phổi Ngoài ra còn cómột số công bố chưa chính thức cho rằng polyphenol có khả năng ngăn chặn một số loại ungthư như: ung thư vú, ung thư vòm họng, ung thư đường tiêu hóa, giảm khối u…

2.3.2 Tác dụng chống oxy hóa của polyphenol trong lá sakê

Theo các tài liệu nghiên cứu đã công bố, các bệnh như: ung thư, tim mạch, lão hóa… cóliên quan rất gần với các quy luật về quá trình oxy hóa trong các tế bào sống Các quá trìnhoxy hóa diễn ra dưới tác dụng của các gốc tự do trong tế bào là cần thiết để tạo ra năng lượnghoặc trong các quá trình sinh tổng hợp của cơ thể Gốc tự do là những hợp chất hoạt độngmạnh, được tạo ra trong cơ thể trong quá trình trao đổi chất hay được đưa vào từ bên ngoài dovirút, vi khuẩn… Các gốc tự do được tạo thành gồm các gốc có hoạt tính cao như Hydroxyl(OH), Ion sắt( Fe2+O) Cu(OH)2 những gốc tự do có hoạt tính trung bình và yếu như Peroxyl(ROO), Hydrogen Peroxde H2O2, Singlet Oxy (O1), Nitric oxide (NO), Ankoxyl ( RO)… Gốc tự do là các nguyên tử không trọn vẹn, số điện tử vòng ngoài của nó là số lẻ nênkhông bền vững, nó phải kết hợp với một nguyên tử khác để có số điện tử chẵn để bền vững

Sự bền vững này chỉ trong chốc lát, chính nó lại tạo ra một nguyên tử không trọn vẹn khác vàtiếp tục kết hợp với một nguyên tử khác rồi trở thành nguyên tử không trọn vẹn và tiếp tục

chu kỳ bất tận như thế Phản ứng hóa học của nó rất mãnh liệt và nó sẽ kéo theo một điện tửcủa phân tử khác về nó, cho ra những phân tử khác bị hư hại hay bị oxy hóa Một khi phân tử

bị oxy hóa rồi thì phân tử đó sẽ tự mất đi tất cả các chức năng vốn có của nó, tiếp đó chính nólại là tác nhân oxi hóa các phân tử chung quanh nó, làm hư hại các tế bào của các phân tửxung quanh Và quá trình này cứ tiếp tục như thế sẽ tạo thành các tế bào không bình thườngdẫn tới các loại bệnh như: xơ vữa động mạch, ung thư…

Thông thường các gốc tự do trong tế bào sinh ra trong quá trình sinh dưỡng được kiểmsoát chặt chẽ thông qua quá trình kháng oxy hóa nội tại bằng các hợp chất như glutathione,vitamin E, vitamin C và enzym superoxide dismutase Ngoài ra cơ thể còn có các tế bào nhưneutrophil, monocyte, B-cell… có khả năng chống lại các yếu tố oxy hóa ngoại lai xâm nhập Tuy nhiên, trong các tế bào có thể xuất hiện hiện tượng các gốc tự do được tạo ra quánhiều do mất cân bằng trong hoạt động hoặc do các yếu tố bên ngoài như các chất độc, donhiễm vi sinh vật, do ozone, bức xạ, tia UV, nhiễm phóng xạ, do thuốc lá, môi trường ônhiễm… Các gốc tự do dư thừa trong khi cơ thể thiếu các yếu tố bảo vệ để ngăn chặn, có khảnăng tương tác, phá hủy màng lipid không bão hòa của tế bào, làm giảm khả năng bảo vệ các

tế bào dẫn đến sự xâm nhập các tác nhân gây bệnh từ bên ngoài oxy hoá các nucleotid cănbản làm thay đổi cấu trúc AND, dẫn đến các quá trình đột biến, phát sinh các khối u, ung thư,làm hỏng cấu trúc protein hoặc hoạt hóa enzym trong các quá trình trao đổi chất gây bệnh…

Trong cơ thể con người có sẵn một vài enzyme dùng để bảo vệ và ngăn ngừa nhiều loạigốc tự do làm nguy hại tế bào như: superoxide dismutase phân hóa nhiều trong các tế bàohồng cầu và gan Tuy nhiên với số lượng gốc tự do quá nhiều nên cơ thể phải nhờ đến cácchất chống oxy hóa từ bên ngoài như vitamin E, vitamin C… Tuy nhiên người ta đặc biệt chútâm tới khả năng chống oxy hóa của các hợp chất polyphenol có trong các loại thực phẩmnhư: lá dâu tằm, trà xanh, lá sakê…

Công thức hóa học của các geranyl dihydrochalcone (2, 4, 5, 8, 9), geranyl flavonoids (1,

3, 6, 7) có mặt các hydrogen phenolic thể hiện khả năng kháng oxy hóa mạnh Quá trìnhkháng oxy hóa của chúng được thể hiện bằng cách tác động trực tiếp lên các gốc tự do đượcsinh ra trong cơ thể, chúng sẽ tương tác với các gốc tự do đưa chúng về trạng thái các chấtbền qua đó làm cho quá trình oxy hóa bị loại bỏ thông qua các dạng phản ứng sau:

RO2* + AH ROOH + A* (1)

RO* + AH ROH + A* (2)

RO2* + A* ROOA* (3)

Các chất A* tạo ra trong các phản ứng (1) (2) khác với các gốc RO2 , RO* vì chúng không

không tạo ra các gốc tự do mới để tiếp tục khởi động quá trình oxy hóa Các sản phẩm tạo ratrong phản ứng (3)(4) là những sản phẩm khá bền và kết quả là chuỗi phản ứng của các gốc tự

Diệt menXay nhỏ

Trích ly

Cô đặcë Thu hồi Ethanol

BãLọc

Cao chiếtá 1

1

Xử lý acidLắng, làm trongLọc

Tinh chế bằng Ethyl acetate

Pha nước ëCặn

Thuyết minh quy trình:

Lá được lựa chọn kỹ để loại bỏ lá hư, sâu, quá già khô, chọn lá không bị dập nát, chỉlấy các lá tốt còn nguyên vẹn Sau đó đem đi cân lấy 10g/ mẫu Cân theo số lượngmẫu cần trích sau đó tiến hành diệt men

o Mục đích: Xử lý để làm mất hoạt tính của enzyme polyphenol oxydase, ngănchặn hoạt động của hệ enzyme này làm polyphenol bị oxy hóa

gian 2 – 3 giây Vớt ra để ráo, sau đó chuyển sang giai đoạn xay

o Mục đích: Lá sakê sau khi diệt men được xay nhỏ để thuận tiện cho việc tiếpxúc của nguyên liệu với dung môi, làm tăng khả năng khuyếch tán và thẩmthấu của các chất vào trong dung môi, làm tăng khả năng trích ly

o Cách thực hiện: Dùng máy xay thông thường để thực hiện quá trình xay nhỏ,sau đó đem chia đều khối lượng cho các mẫu trích ly Sau khi diệt men lá sẽhấp thụ một lượng nước nên khối lượng tăng 8 – 10%

o Mục đích: Trích ly polyphenol trong lá sakê nhờ dung môi cồn và nước Cồn

và nước là 2 loại dung môi phân cực nên được sử dụng để trích ly các chấtphân cực có trong lá sakê, cụ thể là polyphenol

o Thực hiện thí nghiệm nhiều lần với các dung môi là nước, cồn được thay đổi ởcác nồng độ khác nhau So sánh lượng polyphenol có trong dịch trích từ đóchọn loại dung môi, nồng độ dung môi thích hợp

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly, dựa theo các tài liệu công bố các yếu

tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly gồm có: Loại dung môi, tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi, nhiệt

độ trích ly, thời gian trích ly, pH

• Lọc: Để thu hồi dịch chiết cần phải qua khâu lọc thô để loại cặn lá lẫn trong dịch chiết,thu dịch trong để chuẩn bị quá trình tinh chế

• Cô đặc: Nhằm thu hồi dung môi ethanol để tái sử dụng Dịch sau cô đặc được chuyểnsang dung môi khác để loại bỏ tạp chất khác không mong muốn cũng như thực hiệnquá trình tiếp theo Cô đặc bằng cách đun cách thủy ở nhiệt độ 70 – 800C, sau đó tiếnhành quá trình xử lý acid

o Mục đích: Tạo môi trường acid thích hợp cho sự tồn tại của polyphenol vìpolyphenol rất bền trong môi trường acid Đồng thời dùng acid để phá hủy cấu trúcliên kết của các nhóm phức như đường, protein… với polyphenol để giải phóngpolyphenol tự do

o Hướng nghiên cứu xử lý acid, dựa theo tài liệu công bố các yếu tố ảnh hưởng củaquá trình xử lý acid gồm có: pH, tỷ lệ dịch cao chiết/ dung môi, nhiệt độ, thờigian… Quá trình được tiến hành trên nhiều mẫu và thí nghiệm được lặp lại nhiềulần

protein… Do đó cần lắng để làm trong dịch

o Cách thực hiện: Dịch sau khi xử lý acid xong, tiến hành khảo sát thời gian tối ưucủa quá trình kết lắng để chuẩn bị bước vào quá trình tinh chế polyphenol

gian, một số thành phần bị kết tủa Do đó cần phải lọc để thu lấy dịch trong Dịchtrong này chứa các thành phần tan trong nước như polyphenol, đường, cafein…Quátrình lọc thường lặp lại 3 lần cho đến khi thu được dịch trong

o Mục đích: Để loại bỏ dần các tạp chất, thành phần không mong muốn như đường,protein… nhằm làm tăng độ tinh sạch của chế phẩm polyphenol

o Dùng dung môi là ethyl acetate để lôi kéo polyphenol có trong dung dịch Sau khi

để yên, hỗn hợp phân tách thành 2 lớp, lớp bên trên là dịch ethyl acetate, bên dưới

là nước Polyphenol sẽ nằm trong ethyl acetate Đem cô đặc để thu hồi dung môi,thu được cao dạng paste chứa chủ yếu là polyphenol

o Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này gồm: Tỷ lệ dung dịch polyphenol/dungmôi, thời gian…

o Pha Etyl acetate được xử lý nhiệt để thu hồi ethyl acetate và cao chứa polyphenol

2.3.4 Định tính, định lượng polyphenol từ lá sakê

a) Phương pháp định tính

o Phản ứng với hơi amoniac: nhiều flavonoid thay đổi màu khi gặp hơi NH3 Có thể