QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG COLLAGEN TỪ THỰC VẬT

Những bó collagen hay còngọi là sợi collagen là thành phần chính của thể nền màng tế bào cấu tạo nên hầu hết cá mô và cấu trúc bên ngoài tế bào, nhưng collagen cũng được tìm thấy trong t

TỪ THỰC VẬT

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI MỞ ĐẦU

Collagen là một dạng protein cấu trúc sợi dài và hầu hết các chức năng của nó khácvới dạng protein phổ biến là enzyme (cấu trúc collagen) Những bó collagen hay còngọi là sợi collagen là thành phần chính của thể nền màng tế bào cấu tạo nên hầu hết

cá mô và cấu trúc bên ngoài tế bào, nhưng collagen cũng được tìm thấy trong tế bào.collagen có cường độ kéo đứt lớn và là thành phần chính của gân, sụn, xương, dâychằng, da Collagen tạo ra sự đàn hồi của da và nếu nó thoái hóa sẽ gây ra nếp nhăntuổi già

Trong quá trình triết ly collagen có công đoạn thủy phân Quá trình này tạo ra ollagenthủ phân, được gọi là collagen hydrolysate Tùy theo mức độ thủy phân mà collagen

có ứng dụng khác nhau Collagen hydrolysate được ứng dụng phổ biến trong côngnghệ thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và công nghiệp nhiếp ảnh Chúng được sửdụng như chất đông, chất gây lắng trong thực phẩm Chúng được dùng như chất thaythế cao su, keo dán, xi măng, mực in nhân tạo, là chất tạo kết dính trong diêm quẹt,trong bộ lọc sáng của đèn thủy ngân,…

Hiện nay collagen được coi như là một loại dược liệu quý để kéo dài tuổithanh xuân cho con người Việc nghiên cứu và sản xuất collagen có nhiều ý nghĩađối với ngành sản xuất thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm, …

Trong ngành thực phẩm: collagen được ứng dụng để làm vỏ bao xúc xích,kẹo, và các ứng dụng của nó dưới dạng gelatin

Trong y học: collagen được ứng dụng trong việc chế tạo da nhân tạo đểđiều trị vết bỏng, ứng dụng trong phẫu thuật chỉnh hình, làm vỏ bọc thuốc, …

Trong mỹ phẩm: collagen có vai trò chống nhăn, giữ cho da mềm và sáng,hơn nữa collagen còn là nguyên liệu để sản xuất các sản phẩm như: mặt nạ, kemdưỡng da, dầu gội, …

Nhận thấy nhu cầu rất lớn về collagen ở trên Thế Giới cũng như ở Việt

cho sản xuất collagen I tương đồng của người được trình bày trong báo cáo này Các cấutrúc đã được thiết kế từ cDNA mã hóa chuỗi proα1 (I) của người để tạo ra các cây thuốc lábiến đổi gen biểu hiện collagen I Các chuỗi proα1 (I) tái tổ hợp được biểu hiện dưới dạngcác trimers có liên kết disulfide và được cho là có thể gấp lại thành một vòng xoắn ba kếthợp ổn định Hơn nữa, procollagen tái tổ hợp sau đó được xử lý để collagen như nó xảy ra

ở động vật Một lượng lớn collagen tái tổ hợp đã được tinh chế từ nguyên liệu thực vật Dữliệu cho thấy cây trồng là một sự thay thế có giá trị cho việc sản xuất collagen tái tổ hợpcho các mục đích y khoa và khoa học khác nhau

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN 5

1.1 Giới thiệu sơ lược về Collagen 5

1.2 Cấu trúc của collagen 6

1.2.1 Cấu trúc phân tử của collagen 6

1.2.2 Cấu trúc sợi của collagen 7

1.3 Phân loại collagen 9

1.4 Thành phần các acid amin có trong collagen 11

1.5 Tính chất của collagen 11

1.6 Chức năng của collagen 12

1.7 Ứng dụng của collagen 13

1.7.1 Ứng dụng collagen trong thực phẩm 13

1.7.2 Ứng dụng collagen trong y học và dược phẩm 14

1.7.3 Ứng dụng collagen trong mỹ phẩm 15

1.8 Các yếu tố ảnh hưởng tới collagen 17

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 Cấu trúc và chuyển đổi cây thuốc lá 19

2.2 Qui trình tách chiết collagen 21

2.2.1 Quy trình thu nhận Collagen được xây dựng như sau 21

2.2.2 Thuyết minh qui trình 22

2.3 Phân tích Western blot 22

2.4 Phương pháp phân tích và kính hiển vi điện tử 22

2.5 Lưỡng sắc tròn 23

CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG COLLAGEN TRONG THỰC PHẨM 24

3.1 Ứng dụng collagen vào các sản phẩm thức uống (trà, cà phê) nhằm bổ sung thêm lượng protein cho cơ thể 24 3.2 Ứng dụng collagen làm trong các sản phẩm thửc uống có cồn 27

3.3 Ứng dụng collagen trong chế biến các sản phẩm từ sữa 30Tài Liệu Tham Khảo

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN

1.1 Giới thiệu sơ lược về Collagen

Collagen là loại protein cấu trúc chính yếu, chiếm khoảng 30% tổng lượngprotein trong cơ thể ở các động vật có xương sống Collagen có nhiều trong gân, da,xương, hệ thống mạch máu của động vật và có mặt trong các lớp màng liên kết baoquanh các cơ Khoảng 10% protein trong cơ ở động vật có vú là collagen; các proteinngoại bào (hơn 90% trong gân, xương và khoảng 50% trong da) có chứa collagen Nó cótác dụng giống như một chất keo liên kết các tế bào lại với nhau để hình thành các mô và

cơ quan nền tảng trong cơ thể

Collagen cung cấp cho các mô liên kết những đặc tính nổi trội nhờ vào sự hiệndiện rộng khắp và sự sắp xếp mang tính cấu trúc của nó Nó phân bố khắp nơi trong

cơ thể, từ chỗ gân nối bắp chân với gót chân cho tới giác mạc Trong gân và dâychằng, collagen có tác dụng truyền lực từ cơ sang xương và tích trữ năng lượng đànhồi Sự di chuyển nhịp nhàng, uyển chuyển sẽ không thể thực hiện được nếu thiếunhững tính chất này Collagen còn là chất nền hữu cơ có trong xương và men rănggiúp chúng chống lại sự rạn nứt Nó là thành phần chính trong da, mạch máu, các cơ.Collagen không chỉ có chức năng cơ học, chẳng hạn như ở giác mạc, trật tự cấu trúccủa các sợi collagen tạo nên sự trong suốt

Collagen được xem như một vật liệu mang tính xây dựng Sự linh hoạt của nó lànhờ vào cấu trúc cấp bậc phức tạp, tạo nên sự đa dạng trong tính chất nhằm phục vụnhững chức năng nhất định

1.2 Cấu trúc của collagen

1.2.1 Cấu trúc phân tử của collagen

Phân tử collagen (hay còn gọi là tropocollagen) là một protein hình trụ, dàikhoảng 300 nm, đường kính khoảng 1,5 nm

Hình 1.1 Cấu trúc của phân tử collagen (triple helix).

Nó bao gồm 3 chuỗi polypeptide (gọi là chuỗi ) cuộn lại với nhau Mỗi chuỗi cuộn thành đường xoắn ốc theo hướng từ phải sang trái với 3 gốc trên một vòng xoắn

Ba chuỗi này xoắn lại với nhau theo hướng từ trái sang phải tạo thành đường bộ baxoắn ốc

Hình 1.2 Sự hình thành chuỗi xoắn ốc nội phân tử và giữa các chuỗi polypeptide.

Mỗi chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử khoảng 100 kDa, tạo nên tổng khốilượng phân tử của collagen khoảng 300 kDa Chuỗi  được cấu tạo bởi khoảng 1000amino acid Các chuỗi  khác nhau (1, 2 và 3) ở thành phần amino acid Sự phân

bố của các chuỗi 1, 2 và 3 trong các phân tử collagen khác nhau tùy thuộc vào sựkhác nhau về gene

Collagen không có chứa tryptophan, giàu thành phần glycine, proline vàhydroxyproline, là một trong số ít những protein có chứa hydroxylysine Nó chứakhoảng 33% glycine, 12% proline và 11% hydroxyproline Các amino acid sắp xếptrong chuỗi xoắn ốc theo các dãy với sự phân bố như sau:

Bảng 1.1 Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide.

Gly – X – XGly – X – IGly – I – XGly – I – I

0,440,20,270,09

1.2.2 Cấu trúc sợi của collagen

Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìm thấy ở dạng sợi, bao gồmnhững sợi mảnh, nhỏ Thông qua quá trình tạo sợi, các phân tử collagen tổ hợp với

với số lượng nhiều hơn sẽ tạo thành các sợi (fibril) Những sợi này có đường kính từ

10  500 nm tùy thuộc vào loại mô và giai đoạn phát triển Các sợi collagen sẽ thiếtlập nên các sợi lớn hơn (fiber) và cao hơn nữa là các bó sợi (fiber bundle)

Hình 1.3 Cấu trúc sợi của collage.

Hình 1.4 Quá trình tổ hợp tạo sợi của các phân tử collagen.

Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc tạo thành các sợi với tínhchu kỳ nhất định Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67 nm và có mộtkhoảng trống khoảng 40 nm giữa những phân tử liền kề nhau

Nhờ vào cấu trúc có thứ bậc, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sangcác sợi collagen, cung cấp cho các mô độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ họcriêng biệt

Hình 1.5 Hình ảnh của bó sợi (a) và sợi (b) collagen.

Sợi collagen là các tổ hợp có cấu trúc bán kết tinh của các phân tử collagen Các

vi sợi kết hợp tạo nên sợi lớn hơn Các sợi collagen được sắp xếp với những cách thứckết hợp và mức độ tập trung khác nhau trong các mô khác nhau để cung cấp các đặctính khác nhau của mô

1.3 Phân loại collagen

Tính đến thời điểm hiện tại, có 42 loại chuỗi polypeptide được nhận dạng Chúngđược mã hóa bởi 41 loại gene khác nhau, tạo thành 27 loại collagen Họ collagen đượcphân loại thành những phân họ khác nhau dựa vào sự tổ hợp của các siêu phân tử.Hiện tại, có ít nhất khoảng 13 loại collagen đã được trích chiết Chúng khác nhau về

chiều dài của chuỗi xoắn ốc cũng như bản chất và kích cỡ của những phần không xoắnốc.

Bảng 1.2 Kết cấu chuỗi và sự phân bố của các loại collagen trong cơ thể người.

Giác mạc, xương, mạch máu, sụn,

nướu răng

XI 1(XI) 2(XI) 3(XI) Sụn, đĩa đệm cột sống, dịch thủy tinh

Hơn 90% collagen trong cơ thể là các collagen loại I, II, III và IV Những bệnhtật liên quan đến collagen là do sự khuyết tật về gene ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp,

sự sắp xếp cũng như các quá trình khác trong sự sản sinh collagen một cách bìnhthường

1.4 Thành phần các acid amin có trong collagen

Mỗi loại collagen gồm có hàng nghìn cấu trúc amino acid, chủ yếu gồm có glycine,proline, hydroxyproline Collagen không chứa tryptophan, và là một trong số ít các proteinchứa hydroxylysine Các amino acid sắp xếp trong chuỗi xoắn ốc theo các dãy với sự phân

Tính chất hóa học:

Collagen là chất duy nhất có thể chuyển thành gelatin khi đun sôi với nướcnóng, đó là kết quả của sự mở vòng xoắn 3 sợi kèm theo sự phá vỡ liên kết hydro.gelatone và gelatose là sản phẩm phân giải gelatin Tỷ lệ giữa gelatin, gelatone vàgelatose được quyết định bởi nhiệt độ và thời gian nấu.

Collagen bị thủy phân chậm bởi trysin và pepsin, trong khi đó gelatin dễ bịphân hủy hơn

Collagen khi thêm cồn, muối hoặc aceton đặc biệt là heparin thì chúng cósợi dày và kết tủa lại

Collagen tan trong glycerin, acid acetid, ure nhưng không tan trong nướclạnh

1.6 Chức năng của collagen

Protein này là giá đỡ cho các mô và các cơ quan và liên kết các cấu trúc nàyvới xương Collagen cũng có trong cấu trúc của da Nó tiêu biểu cho sự khỏe mạnh

và độ bền của da, thể hiện qua sự trơn láng, đầy đặn của da khi còn trẻ Cấu trúc độcnhất này đã làm cho collagen có sức căng mạnh hơn cả thép Sự mất cấu trúc 3-Dcũng có nghĩa là mất đi sự giúp đỡ của khung sườn của da.Collagen này có nhiều trong các mô liên kết ở da cá Tương tự như sợicollagen trong động vật có vú, các sợi collagen ở các mô của cá cũng tạo nên cấutrúc mạng lưới mỏng với mức độ phức tạp khác nhau Tuy nhiên collagen ở cá kémbền nhiệt hơn nhiều và ít có các liên kết chéo hơn nhưng nhạy cảm hơn collagen ởđộng vật máu nóng có xương sống (Phan Thị Thanh Quế,2005)Collagen là loại protein phổ biến nhất trong cơ thể (chiếm khoảng ¼ tổnglượng protein), là protein chính của mô liên kết, là một trong các thành phần chínhcủa da, cơ vân, sụn, dây chằng, gân, xương và răng; đóng vai trò quan trọng trongviệc phát triển các mô trong cơ thể và cũng cố thành mạch, tồn tại trong các giácmạc và thủy tinh thể của mắt dưới dạng kết tinh Lớp bì, lớp đệm trong cùng của dachứa rất nhiều collagen, mà chính các sợi collagen này tạo ra một hệ thống nâng đỡ,

hỗ trợ cho các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm…

1.7 Ứng dụng của collagen

Ngày nay collagen được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực đặc biệt là lĩnh vực yhọc và trong các ngành khoa học khác Ví dụ như các sản phẩm bông gạc làm từcollagen của tập đoàn Suwelack sẽ giúp các vết thương nhanh lên da non và maulành sẹo, các mỹ phẩm giúp làm đẹp da mặt cho phụ nữ

1.7.1 Ứng dụng collagen trong thực phẩm

Trong ngành thực phẩm collagen được ứng dụng cụ thể như: sản xuất sợi collagen làmthực phẩm, sản xuất collagen vi tinh thể, những ứng dụng của collagen giống như gelatin

Collagen được ứng dụng rộng rãi dưới dạng gelatin:

+ Thực phẩm ( Gottoffer, 1945; Idson và Braswell, 1957)

Dựa vào tính chất tan chảy ở nhiệt độ cao và đông đặc ở nhiệt độ thấp người

ta ứng dụng trong thực phẩm đông lạnh Lúc này Gelatin đóng vai trò là một chấtkeo bảo vệ ngăn chặn sự kết tinh của đường

Hình 1.6 Thực phẩm có chứa gelatin

Trong kem và phomát mềm, gelatin ngăn chặn sự mất nước Ngoài ra trongsản phẩm bơ sữa gelatin đóng vai trò quan trọng trong việc tạo độ mịn, độ sánh cho

sản phẩm Trong kẹo dẻo, gelatin cung cấp cho sản phẩm độ dẻo và dai.

+ Dược phẩm (Chvapil và cộng sự, 1973; Wood, 1977)

Gelatin được sử dụng trong sản xuất bao con nhộng cứng hay mềm Nó cótác dụng bảo vệ thuốc chống những tác nhân có hại như ánh sáng và oxi Thànhphần chính của vỏ là Geltin và các tá dược khác như: glycerol hay sorbitol, nhữngchất hoạt động bề mặt, chất màu cho phép, hương liệu…

Hình 1.7 Những nang thuốc có chứa gelatin

+ Kỹ thuật chụp ảnh (Cox, 1972; Rose, 1977)

Nguyên liệu chụp ảnh chứa nhiều lớp gelatin được bao phủ lên phim hoặc giấy

Gelatin vận dụng hơn một trăm năm nay như là chất kết dính, chức năng củagelatin hữu ích trong việc sản xuất phim ảnh

1.7.2 Ứng dụng collagen trong y học và dược phẩm

+ Collagen dạng sợi

Collagen dạng sợi được dùng trong việc làm lành các vết thương, vết mổtrong phẫu thuật Sợi collagen có thể được xử lý để tạo cấu trúc sợi thẳng, dài dùnglàm những sản phẩm y học cho gân và dây chằng

+ Màng mỏng collagen

Collagen dạng màng và lớp mỏng được sử dụng để giữ cố định các vật chấtsinh học, dùng trong sự tái tạo các mô, nối kết lại võng mạc, làm vật thay thế lớpmàng cứng của não… Nó còn được dùng cho việc tái tạo dây thần kinh, khôi phụcmàng nhĩ, sụn và xương, có tác dụng phục hồi các vết thương.

ở các bộ phận khác Các liên kết sợi collagen ở da lỏng hơn nhằm làm tăng sự đànhồi và tính linh hoạt của collagen, tuy nhiên cũng vì vậy mà chúng dễ bị tổn thươnghay đứt gãy do tác động bên ngoài

Collagen của da khoẻ mạnh và liên kết tốt sẽ giúp da có sự đàn hồi nhưkhông bị rạn khi mang thai, không bị da thừa khi giảm cân, không bị nếp nhăn khichuyển động cơ lặp đi lặp lại, không bị chùng nhão da mặt và không bị sẹo sau tổnthương Chính vì vậy, collagen đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong sức khỏecũng như sắc đẹp của con người

Hình 1.8 Các liên kết sợi ở collagen

Trước kia muốn sử dụng collagen các bác sĩ phải lấy chúng ngay trên cơ thể từvùng này dùng cho vùng khác Tuy nhiên phương pháp này quá tốn kém và phứctạp Ngày nay, công nghệ thẩm mỹ hiện đại đã nghiên cứu và ứng dụng thành côngmột số loại collagen từ động vật như da bò, da lợn, cá da trơn và một số loại thựcvật để cho ra đời collagen nhân tạo có hiệu quả điều trị thẩm mỹ rất tốt.Collagen phục hồi: thường được sử dụng trong trường hợp da bị tổn thươnghoặc trong giai đoạn tái tạo sau khi điều trị nám, mụn trứng cá, sẹo, rạn da và tiêu

da thừa sau khi giảm béo Sản phẩm Phials of Collagen and Elastin với các thànhphần chính là collagen, elastin và vitamin E, trong đó collagen được chiết xuất từ daheo giúp kích thích tế bào và sửa chữa các khuyếm khuyết ở mô nhờ đó phục hồikhả năng đàn hồi của da Ngoài ra, sản phẩm còn có thể điều trị các vết rạn do tăngcân hay mang thai

Collagen trẻ hoá: được sử dụng cho những phụ nữ từ 35 tuổi bắt đầu có dấuhiệu lão hoá với sự xuất hiện của các nếp nhăn, da bị mất nước, chùng nhão, chảy

xệ không còn căng mịn như trước nữa, màu sắc da cũng trở nên sạm lại Sản phẩmBeautee Collagen Cell Pure với hàm lượng collagen nguyên chất lên tới 25%, cókhả năng bổ sung và duy trì độ ẩm cho da, cung cấp dinh dưỡng và bảo vệ da chốnglại môi trường ô nhiễm bên ngoài Ngoài ra, sản phẩm còn có khả năng xoá bỏ cácnếp nhăn nông, cải thiện và làm mờ các nếp nhăn sâu do tuổi tác, phục hồi lại khảnăng đàn hồi tự nhiên cho da, ngăn chặn sự hình thành nếp nhăn trên da, thúc đẩytrẻ hoá tế bào theo cơ chế tự nhiên

Collagen phục hồi liên kết cơ: thường được sử dụng trước khi đắp mặt nạ vàđược đưa sâu vào lớp màng đáy của da bằng dòng xung điện hoặc máy đẩy dưỡngchất Led Medicare Phương pháp này chỉ định cho những người cần có trị liệu sâu

do da lão hoá quá lâu hoặc nếp nhăn do chuyển động quá nhiều Sản phẩm chỉ đượcdùng trong các MedicalSpa

Collagen trong kem dưỡng da.Trong các sản phẩm dưỡng da cho độ tuổingoài 30 đều bổ sung hàm lượng collagen, tuy nhiên chỉ chiếm một phần rất nhỏtrong việc khôi phục chuỗi collagen và elastin yếu ớt trên da Do vậy, để thực sựđiều trị đàn hồi của da, bạn cần có những sản phẩm collagen chuyên nghiệp nhất.Theo đánh giá của hiệp hội sức khoẻ Hoa Kỳ, nồng độ collagen từ 18 - 27% đượccoi là chất lượng cao Một khoá trị liệu collagen tối thiểu 12 lần sẽ giúp bạn xoá nếpnhăn và làm săn chắc cơ mặt hoàn hảo nhất, có thể kết hợp với các công nghệ thẩm

mỹ tiên tiến khác như sóng radio, RF, sóng xung điện, IPL để collagen phát huy hếtkhả năng "cải lão hoàn đồng"

1.8 Các yếu tố ảnh hưởng tới collagen

Ảnh hưởng của nồng độ muối

Muối trung tính ở nồng độ thấp làm tăng độ tan của collagen Khi tăng nồng

độ muối tới một giới hạn nhất định thì độ tan của collagen giảm xuống và nếu nồng

độ muối tiếp tục tăng lên thì collagen có thể đông kết hoàn toàn

Ảnh hưởng của dung môi

Khi cho các dung môi như cồn, benzen, aceton, chloroform vào dung dịchcollagen thì độ tan của collagen bị giảm và có thể dẫn đến đông kết do phá vỡ lớp

vỏ thủy hóa

Ảnh hưởng của không khí

Ở các tuổi khác nhau, trong cơ thể sống hay trong ống nghiệm, khôngkhí có một vai trò trong sự thay đổi cấu trúc hóa học của collagen (Sobel vàHansen, 1989) Sự oxy hóa sẽ làm thay đổi cấu trúc phân tử của các protein,

nguyên nhân là do sự thay đổi về mặt hóa học và các liên kết của vài aminoacid đã vượt quá thời gian.

Ảnh hưởng của nước

Nước ảnh hưởng đến collagen theo những con đường khác Nó giữ vai tròtrực tiếp trong các biến đổi hóa học của collagen thông qua sự thủy phân, sự hydrathóa của các gốc tự do, sự ổn định của các liên kết hydro và tỷ lệ của sự hình thànhgelatin

Bowes và Raistrick (1976) đã nghiên cứu ảnh hưởng của mối liên hệ của độ

ẩm và pH lên phạm vi suy giảm thủy phân của collagen bằng sự phóng thích nitơcòn dư ở giai đoạn cuối Ở 40oC trong tám tuần, sự thủy phân collagen tăng lên với

sự tăng độ ẩm (từ 40% lên 80%) và giảm pH (từ 5,0 xuống 2,5) Họ kết luận rằngkhi sự suy giảm thủy phân càng tiến xa, thì sự biến tính sẽ kéo theo và lần lượt tănglên hơn là sự hoạt động thủy phân

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Đo lường ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự hư hỏng của collagen bị cản trở bởi

vì có sự hao hụt nhiệt độ ở tại hoặc trên nhiệt độ đo lường đưa ra những kết quảkhông đáng tin cậy (Bowes và Raistrick, 1964) Mối quan tâm đặc biệt là collagen

bị hư hỏng về mặt vật lý và hóa học sẽ bị hư hỏng ở tỷ lệ nhanh hơn, nhưng điềunày đã không được chứng minh và là một nội dung cho việc nghiên cứu sâu hơn.Như ta đã biết, sự biến tính phá hủy collagen được điều khiển bởi ít các điều kiệnhơn là sự biến tính đầu tiên khi collagen còn nguyên vẹn Tính toàn vẹn về mặt vật

lý và hóa học của collagen có thể được biểu thị qua sự ổn định thủy nhiệt, cả khigiảm nhiệt độ sai lệch đối với các sợi đã bị hư hỏng (Young, 1990)

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Cấu trúc và chuyển đổi cây thuốc lá

Các dòng cDNA 1α3 và α22, cùng mã hóa chuỗi collagen proα1(I) hoàn chỉnh củangười, thu được bằng cách sàng lọc một MG63 (dòng tế bào động mạch xương người,ATCC, 1427) thư viện cDNA (J Biol Chem , 272, 1997 ) với hai γ- 32 oligonucleotide P-đánh dấu ( nucleotide 152-171 và 4268-4274 bản sao proα1 (I) của con người, đánh số từ

vị trí bắt đầu dịch) Để có được ba cấu trúc được sử dụng trong nghiên cứu

này, đoạn Bam HI- Eco RI 1554 bp từ clona cDNA α22 đã được nhân bản vào pBluescriptSK (Stratagene) (clone 1) Các Eco RI- Hin đoạn DIII PCR mã hóa các carboxy cuối của chuỗi proα1 (I) được gắn vào các Eco RI và HindIII của clone 1 để thu

được clone 2 Clone 3 đã được tạo ra bằng cách nhân bản một đoạn 1441

bp Xba I- Bam HI PCR vào plasmid pUC19

Phần PCR này chứa chuỗi mã hóa cho chuỗi acid amin và amino cuối cùng của xoắn

ba trung tâm của chuỗi proα1 (I) Đoạn Dra III- Bam HI đã được chèn vào vị trí Dra III- Bam HI của clone 3 để thu được clone 4 Clone 5 đã được tạo ra bằng cách chèn vào đoạn Xba I- Bam HI của clone 4 đến cùng một vị trí trong clone 2 Một đoạn 473

bp Sac II- NheI PCR mã hóa các peptide tín hiệu và N-propeptide của chuỗi preproα1 (I)

đã được chèn vào một vị trí trong clone 5 và kết quả là xây dựng, α1 (I), mã hóa chuỗipreproα1 (I) hoàn chỉnh

Điểm hạn chế được tạo bởi PCR Nhe I tạo ra thay thế cho Asn-158 và Phe-159 cho các

phần dư Lys và Leu, các dư lượng được đánh số từ methionine đầu

tiên Một Sac II- NheI đoạn I PCR mã hóa các peptide tín hiệu máy của PR-protein (protein bệnh liên quan đến), được gọi là PRS, được chèn vào SacII- NheI của clone 5 để

có được cấu trúc PRS (ΔN-pro) Nó mã hóa các tín hiệu peptide PRS và chuỗi proα1 (I)hoàn chỉnh, ngoại trừ chuỗi N-propeptit

Đối với cấu trúc cuối cùng, một 407 bp NheI- NheI PCR đoạn mã hóa N-propeptide của chuỗi proα1 (I) được chèn vào vị trí NheI của cấu trúc PRS (ΔN-pro) Các kết quả cấu

được thay thế bằng PRS Tất cả các mảnh PCR đã được sắp xếp Các cấu trúc được phân

loại bởi Hin dIII và chèn vào plasmid pBIOC21 Plasmid này chứa vị trí mã hóa tái tổ hợp

dưới sự kiểm soát của promoter 35S được cải tiến và trình tự kết thúc 35S của virut hoacải

Vùng lựa chọn gen NPT2 nằm dưới sự kiểm soát của promoter NOS và trình tự kết

thúc NOS của Agrobacterium tumefaciens Các kết quả cấu trúc được gọi là pBIOC-α1 (I),

pBIOC-PRS (ΔN-pro) và pBIOC-PRSα1 (I), tương ứng Sự biến đổi đã đạt được bằng

cách lây nhiễm các phiến lá của cây thuốc lá bằng A tumefaciens tái tổ hợp Các chất

chuyển kháng kháng Kanamycin được chọn lọc và tái tạo để kiểm tra các cây con biểuhiện collagen I