QUY TRÌNH sản XUẤT PHÂN bón VI SINH cố ĐỊNH đạm

QUY TRÌNH SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH CỐ ĐỊNH ĐẠM Tổng hợp các chất cần thiết cho sự phát triển của cây trồng và tăng nguồn dinh dưỡng cho đất như tổng hợp các chất đạm hữu cơ từ Nitơ của khí quyển nhờ vi khuẩn nốt sần, sống cộng sinh vào cây họ đậu góp phần cung cấp các chất dinh dưỡng có Nitơ hữu cơ cho cây và vi khuẩn cố định đạm

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU VỀ VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ĐẠM

1.1.Giới thiệu

Phân vi sinh cố định đạm là sản phẩm chứa chủng vi sinh vật sống đã được tuyểnchọn có mật độ đạt theo tiêu chuẩn hiện hành Thông qua các hoạt động của chúng sauquá trình bón vào đất tạo ra chất dinh dưỡng mà cây trồng sử dụng được (Nitơ) hay cáchoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng nông sản Phân vi sinh cốđịnh đạm đảm bảo không gây ảnh hưởng xấu đến con người, hệ sinh thái và chất lượngnông sản

Nói đến môi trường đất ta phải kể đến vai trò của hệ sinh vật đất Trong đó, vi sinhvật đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình hình thành đất do các dụng:

- Tổng hợp các chất cần thiết cho sự phát triển của cây trồng và tăng nguồn dinh dưỡngcho đất như tổng hợp các chất đạm hữu cơ từ Nitơ của khí quyển nhờ vi khuẩn nốt sần,sống cộng sinh vào cây họ đậu góp phần cung cấp các chất dinh dưỡng có Nitơ hữu cơcho cây và vi khuẩn cố định đạm

- Tăng cường sự phân giải các hợp chất hữu cơ trong đất, góp phần hình thành chất mùntrong đất để tăng độ phì nhiêu trong đất

- Tăng cường sự chuyển hóa hợp chất vô cơ trong đất

Như vậy chế phẩm phân vi sinh cố định đạm không hại đến sức khỏe con người, vật nuôi và cây trồng Không gây ô nhiễm môi trường sinh thái

Chế phẩm phân vi sinh cố định đạm có tác dụng cân bằng hệ vi sinh vật trong môi trường sinh thái

Chế phẩm phân vi sinh cố định đạm không làm chai đất, mà làm tăng độ phì nhiêu cho đất

Chế phẩm phân vi sinh cố định đạm đồng hóa chất dinh dưỡng cho cây trồng, tăngsuất và chất lượng sản phẩm

Chế phẩm phân vi sinh cố định đạm có tác dụng làm tăng chất đề kháng cho câytrồng.

Chế phẩm phân vi sinh cố định đạm phân hủy chuyển hóa các chất hữu cơ bền vững,làm sạch môi trường

Quá trình cố định Nitơ sinh học là quá trình khử Nitơ trong không khí thành NH3

dưới tác dụng của enzyme Nitrogenase của vi sinh vật

1.2.Lịch sử phát triển

Trong khí quyển của Trái Đất khí Nitơ chiếm 78%, con người, động thực vật đều cầnđến đạm Song đại đa số các sinh vật đều không sử dụng trực tiếp khí Nitơ chỉ có nhóm

vi sinh vật cố định Nitơ là có khả năng này

Hàng năm, nhu cầu về Nitơ đối với cây trồng trên toàn thế giới là hàng trăm triệutấn Tuy nhiên, phân bón hóa học chỉ đáp ứng được khoảng 30% lượng còn lại là do quátrình cố định Nitơ phân tử cung cấp

Khả năng cố định đạm của vi khuẩn đạm cố định hội sinh Azospirillum được

Beijerinck phát hiện từ năm 1922, nhưng vai trò của nó trong hoạt động cố định đạmvùng rễ của cây hòa thảo chỉ được biết đến vào những năm của thập kỷ 70 nhờ việc tìm

ra nơi trú ngụ của chúng Năm 1976 đã phát hiện Azospirillum bên trong và bên bề mặt

của mô rễ, tạo ra mối quan hệ cộng sinh với cây, chúng có thể tồn tại trong đất vùng rễ,trên bề mặt rễ Đây là loài vi khuẩn có khả năng cố định đạm khá lớn, chúng nhận cácchất hữu cơ như pectin, acid hữu cơ làm nguồn dinh dưỡng để phát triển và cố định đạm,đồng thời cung cấp các hợp chất Nitơ cho cây chủ Hiện nay, người ta sản xuất ra cácphân vi sinh cố định đạm cho cây hòa thảo, đặc biệt là cây lúa mang tên Azogin và đãđược chuyển khai cho các cây trồng khác nhau ở nhiều vùng sinh thái khác nhau có thểtăng năng suất cây trồng từ 5-15%

Chế phẩm vi khuẩn nốt sần đã được sản xuất từ rất lâu trên thế giới Năm 1896 lầnđầu tiên người Đức chế ra loại chế phẩm gọi là Nitrazin, ở Mỹ sản xuất ra chế phẩm

Nitroculture, ở Anh sản xuất ra loại phân nitrobacterin Đến nay, hầu hết các nước đều sửdụng sản phẩm vi khuẩn nốt sần cho cây bộ đậu đặc biệt là cây đậu tương

Ơ Việt Nam, phân vi sinh cố định đạm cho cây bộ đậu đã được nghiên cứu từ 1960.Đến năm 1987 phân bón nitrazin trên nến chất mang than bùn mới được hoàn thiện Năm

1991 đã có hơn 10 doanh đã tham gia nghiên cứu lĩnh vực này

Việt Nam và nước ngoài cho thấy, phân bón hữu cơ vi sinh có tác dụng tốt đến sựsinh trưởng, phát triển, năng suất cây trồng, giảm giá thành nâng cao hiệu quả trồng trọt

và cải tạo môi trường đất canh tác Chính phủ Việt Nam đã sớm nhận thấy được vai tròcủa phân bón vi sinh, vì vậy từ năm 1994, Thủ tướng Chính phủ đã ra Chỉ thị số:644/TTg ngày 05 tháng 11 năm 1994 chỉ đạo việc quản lý: sản xuất, kinh doanh và chấtlượng phân bón vi sinh, trong đó đã nhấn mạnh:” Để tiến đến một nền nông nghiệp sạch,giữ cho đất màu mỡ cần sử dụng hợp lý các loại phân và thuốc trừ sâu hóa học dựa trênnguồn tài nguyên dồi giàu về than bùn và photphosrit ở nước ta cần khuyến khích sửdụng các nguyên liệu này làm chất nền và chất phụ gia để sản xuất phân bón vi sinh, chếphẩm vi sinh, dùng chúng để thay thế dần các loại phân hóa học trong nông nghiệp theo

xu hướng chung của thế giới…”

1.3. Vai trò của vi sinh vật cố định đạm

Cố định đạm là khả năng đồng hóa nitơ phân tử của một số sinh vật và dùng nitơ này

để cấu tạo nên tất cả các hợp chất chứa nitrogen của tế bào Khả năng này có ở nhiều visinh vật sống tự do trong đất và trong nước

Trong môi trường đất, vi sinh vật tham gia chuyển hóa các chất hữu cơ, cố định nitơlàm giàu đạm cho đất, tích lũy vào đất các auxin kích thích sự phát triển của cây trồng,tổng hợp các vitamin thyamin, nicotinic và biotin… Vi sinh vật cố định đạm góp phầnvào cân bằng sinh thái trong đất

Phần lớn VSV (vi sinh vật) sống trong đất là những sinh vật có ích sống theo kiểucộng sinh, chỉ một số rất ít là có hại, gây bệnh cho cây trồng sống theo kiểu vừa ký sinh(gây bệnh cho thực vật) vừa hoại sinh (sống trong đất) Số lượng quần thể VSV có ích

trong đất chiếm ưu thế hơn rất nhiều lần so với VSV gây bệnh hại Phần lớn các VSV cóích tham gia vào quá trình phân giải xác thực vật thành thức ăn có nguồn gốc hữu cơ chocây trồng và VSV khác, chúng có vai trò rất quan trọng trong quá trình khoáng hóa và cốđịnh đạm VSV còn tạo ra rất nhiều loại enzym, acid amin, vitamin, kháng sinh…là thức

ăn và vũ khí tự vệ quan trọng cho cây trồng Ngoài ra khi các VSV đất chết đi sẽ để lạimột lượng thức ăn khổng lồ và có chất lượng rất tốt cho cây trồng…

VSV có ích giữ vai trò quan trọng cải tạo đất, làm cho đất tăng độ mùn, tơi xốp,thoáng khí, có độ pH trung tính; làm cho khả năng giữ nước, giữ phân của đất được tăngcường… Nhờ có hoạt động của VSV làm cho đời sống của đất được tăng lên.VSV có ích đã giúp cho cây trồng hấp thụ dinh dưỡng được tốt hơn VSV đã góp phầnbảo vệ cây trồng làm giảm tác hại của ký sinh gây bệnh cây Trong tập đoàn VSV có ích

có một số lượng rất lớn VSV đối kháng ngăn chặn sự phát triển các VSV gây bệnh hạicho cây trồng rất hữu hiệu…

1.4. Phân loại

Vi sinh vật cố định đạm được chia làm 2 nhóm:

- Vi khuẩn không cộng sinh:

a. Vi khuẩn dị dưỡng

Vi khuẩn hiếu khí : Azotobacter, Beijerinckii

Vi khuẩn yếm khí : Clostridium

b. Vi khuẩn hóa tự dưỡng : Methanobacillus omelianski.

c. Vi khuẩn quang tổng hợp : Chorobium, Chromatium, Rhodomicrobium,

Rhodopseudomonas, Rhodospirillum.

d. Tảo lam : Anabaena, Anabaenapsis.

- Vi khuẩn cộng sinh:

a. Vi khuẩn cộng sinh với cây họ đậu:

Brachyrhizobium meliloti cộng sinh với cỏ alfalfa.

B trilolii cộng sinh vơi cỏ clover.

B phaseoli cộng sinh với các loài đậu hình thận.

B japonicum cộng sinh ở cây đậu nành.

b Vi khuẩn cộng sinh với cây không thuộc họ đậu

Alnus và cây Casuarina (phi lao, dương) có khả năng cộng sinh với một loài xạkhuẩn có khả năng cố định N – chi Frankia

1.4.1. Vi khuẩn tự do: Azotobecter,

1.4.1.1. Vi khuẩn tự do: Azotobecter

Năm 1901, nhà bác học Beyjeirinh đã phân lập được từ đất một loài vi sinh vật có

khả năng cố định nitơ phân tử cao, ông đặt tên cho loài vsv này là Azotobacter

Vi khuẩn Azotobacter khi nuôi cấy ở môi trường nhân tạo thường biểu hiện tính đa

hình, khi còn non có tiêm mao, có khả năng di động được nhờ tiêm mao (Flagellum)

Hình 1.1 Vi khuẩn Azotobacter

Vi khuẩn cố định nitơ hiếu khí, sống tự do trong đất và nước Tế bào hình bầu dục,hình cầu, được bọc trong lớp vỏ nhày, kích thước khoảng 2 × 5 µm, di động hoặc không,gram âm, không sinh bào tử Khi dùng 1g đường, thường cố định được 2mg N Ngoài ra,còn có khả năng tổng hợp vitamin, chất sinh trưởng (loại auxin) và một số chất chốngnấm Loại chế phẩm được dùng trong nông nghiệp có nhiều tên thương phẩm khác nhau

(azotobacterin, vv.) Các loài Azotobacter thuộc loại các vi sinh vật cố định nitơ họat

động nhất, chúng có khả năng đồng hóa manit, tinh bột, sử dụng nhiều loại hợp chất hữu

cơ khác nhau để phát triển và cố định nitơ, làm giàu nitơ cho đất Azotobacter chủ yếu có

4 loài:

- Azotobacter chroocuccum: Kích thước 3,1 x 2,0 µm; khi còn non có khả năng di

động, khi già có sắc tố màu nâu đến màu đỏ, không khuyếch tán vào môi trường

- Azotobacter beijerincki: kích thước 3,1 x 2,0 µm; không di động, khi già có sắc tố

màu vàng đến màu nâu sáng, không khuyếch tán vào môi trường

- Azotobacter Vinelandi: Kích thước 3,4 x 1,5 µm; có khả năng di động, sắc tố màu

vàng lục đến huỳnh quang, khuyếch tán vào môi trường

- Azotobacter agilis: Kích thước 3,3 x 2,8 µm; có khả năng di động, sắc tố màu lục,

huỳnh quang, khuyếch tán vào môi trường

Azotobacter làm tăng cường nguồn thức ăn cung cấp cho cây trồng, kích thích khả

năng tăng trưởng, nâng cao tỷ lệ nảy mầm và độ phát triển của mầm (vì nó tiết ra môitrường thiamin, a.nicotinic, a.pantotenic, piridoxin, biotin, ) và có khả năng tiết ra một sốchất chống nấm

Chế phẩm Azotobacterin là dịch Azotobacter cho hấp thụ trong than bùn (hoặc các

loại đất giàu hữu cơ đã trung hòa và bổ sung photpho, kali)

1.4.1.2. Vi khuẩn Clostridium

Năm 1939 nhà bác học người Nga Vinogratxkii đã phân lập tuyển chọn được mộtloài vi khuẩn yếm khí, có khả năng cố định nitơ phân tử cao, ông đặt tên cho loài vi

khuẩn này là vi khuẩn Clostridium

Đây là loài trực khuẩn gram dương, sinh nha bào, khí sinh nha bào nó kéo méo tếbào Kích thước tế bào dao động 0,7 – 1,3 x 2,5 – 7,5 µm, khuẩn lạc thuộc nhóm S, màutrắng đục, lồi nhày

Hình 1.2 Vi khuẩn Clostridium

Vi khuẩn Clostridium ít mẫn cảm với môi trường, nhất là môi trường thừa P, K, Ca

và có tính ổn định với pH, nó có thể phát triển ở pH 4,5 – 9, độ ẩm thích hợp 60 – 80%,

nhiệt độ 25-30 độ C -Vi khuẩn Clostridium có rất nhiều loài khác nhau: Clostridium

butyrium; Clostridium beijerinskii; Clostridium pectinovorum…

Vi khuẩn Clostridium đồng hóa tốt tất cả các nguồn thức ăn nitơ vô cơ và hữu cơ,

cứ 1g đường gluco thì đồng hóa được 5 – 12mg N

1.4.1.3. Vi khuẩn Beijerinskii

Vi khuẩn Beijerinskii có khả năng đồng hóa tốt các loại đường đơn, đường kép, cứ

tiêu tốn 1 gam đường gluco nó có khả năng cố định được 5 – 10mg N.

Khác với vi khuẩn Azotobacter, vi khuẩn Beijerinskii có tính chống chịu cao với

acid, nó có thể phát triển ở môi trường pH= 3, nhưng vẫn phát triển ở pH trung tính hoặckiềm yếu, vi khuẩn Beijerinskii thích hợp ở độ ẩm 70 – 80% ở nhiệt độ 25 – 28 độ C Vikhuẩn Beijerinskii phân bố rộng trong tự nhiên, nhất là ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đớiNăm 1893 nhà bác học Ấn Độ Stackê đã phân lập được một loài vi khuẩn ở ruộnglúa nước pH rất chua có khả năng cố định nitơ phân tử, ông đặt tên là vi khuẩn

Beijerinskii.

Vi khuẩn Beijerinskii có hình cầu, hình bầu dục hoặc hình que, gram âm không sinhnha bào, hảo khí, một số loài có tiêm mao có khả năng di động được Kích thước tế bàodao động 0,5 – 2,0 x 1,0 – 4,5 µm, khuẩn lạc thuộc nhóm S, rất nhầy, lồi không màuhoặc màu nâu tối khi già, không tạo nang xác

Hình 1.3 Vi khuẩn Beijerinskii

1.4.1.4.Tảo lam

Là thành phần cố định N quan trọng trong thiên nhiên Có trong các ao, mặt nướcruộng lúa…Cần độ ẩm cao, ánh sáng, điều kiện nhiệt độ khoảng 30oC, pH tối hảo là từ 7-8.5.Ở ruộng chua, sự tăng trưởng của tảo lam bị hạn chế, trường hợp này bón vôi giúptăng thêm lượng tảo và lượng N cố định được

Hiện nay đã phát hiện nhiều loài tảo lam sống tự do trong đất và trong nước có khảnăng cố định nitơ Có một số sống cộng sinh với thực vật, trong đó đáng chú ý nhất là tảocộng sinh trong bèo hoa dâu (tảo này có tên là Asiabaena azollae) Đa số các loài tảo phát

triển tốt trong môi trường trung tính hoặc kiềm, hiếu khí, thích hợp ở nhiệt độ 28-30oC,cần khí CO2.

1.4.2. Vi khuẩn cộng sinh: Rhizobium

1.4.2.1.Lịch sử phát triển

Năm 1886, Hellriegel và Uynfac đã khám phá ra bản chất của quá trình cố định nitơ

phân tử Họ đã chứng minh được khả năng của cây họ đậu lấy được nitơ khí quyển là nhờ

vi khuẩn nốt sần( VKNS) sống ở vùng rễ cây họ đậu Họ đặt tên cho loài vsv này là

Bacillus radicicola

Năm 1889, Pramovskii đã đổi tên vsv này thành Bacterium radicoicola

Cuối năm 1889 Frank đề nghị đổi tên là Rhizobium.

Từ đó cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm ứng dụng và mở rộngviệc sản xuất các loại phân bón vi sinh cố định nitơ mà thànhphần còn được phối hợpthêm một số vi sinh vật có ích khác như một số xạ khuẩn cố định nitơ sống tự do, các xạkhuẩn có khả năng giải cellulose …

Ở việt nam phân vsv cố định đạm cây họ đậu đã nghiên cứu từ năm 1960 Đến năm

1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả nước tập trung nghiên cứu phân vi sinh

1.4.2.2. Phân loại

Ở đây nhóm sẽ trình bày 2 cách phân loại Tất nhiên không có cách phân loại nào sai

cả, mà là tùy theo từng giai đoạn hay từng người mà người ta có những cách phân loạikhác nhau

Rhizobium leguminosarum: gây ra sự hình thành nốt sần ở các loài Pisum ssp ( đậu

hà lan), Vicia ssp( đậu tằm)…

Rhizobium phaseolin: gây ra sự hình thành ở các loài ôn đới

Chuyển động nhờ tiêm mao trên đầu hoặc dưới thân, không có tua viền

Khuẩn lạc dạng vòng, dạng chấm, đục, lồi và có dạng hạt trong cấu trúc Đường kínhkhông vượt quá 1mm sau 5-7 ngày nuôi cấy trên môi trường chứa khoáng, dịch chiết nấmmen, manitol

b) Cách phân loại thứ hai

Rhizobium có những loại quan trọng như:

R.phaseoly( ở đậu nành, đậu tây, đậu ngựa)

R.leguminosarum( đậu hà lan)

R.trifolli(cỏ ba lá)

Trong đó có một số chủng mọc chậm không làm acid hóa môi trường nuôi cấy ) như

R.phaseoli) và các chủng mọc nhanh làm acid hóa môi trường nuôi cấy (như R.leguminosarum).

1.4.2.3 Cấu tạo

Rhizobium là một chi vi khuẩn gram âm sống trong đất có vai trò cố định đạm

Nghiên cứu của W.nowah, A.Netzsch-Lehner (1965) vi khuẩn có kích thước và hìnhdạng thay đổi phụ thuộc vào giai đoạn phát triển

Khi vi khuẩn còn non, tế bào có dạng hình que, kích thước 0,5-0,9 x 2-3 µm bắt màuđông đều, có khả năng di động nhờ tiêm mao

Khi nốt sần hữu hiệu trở nên già, Haemoglobin bị biến đổi thành Leghaemoglobin có

sắc tố màu xanh, khi đó nốt sần không còn khả năng cố định nitơ.

Khi già, vi khuẩn nốt sần trở nên bất hoạt, khi đó vi khuẩn chuyển sang trạng thái bắtmàu phân đoạn khi nhuộm bằng anili.

Khi sống trong đất hoặc trong lúc nuôi cấy, vi khuẩn nốt sần tạo dạng hình cầu diđộng hoặc không di động

Trên môi trường nhân tạo cũng như những nốt sần ngta thường gặp những tế bào gọi

là thể khuẩn giả So với tế bào hình que bình thường thì chúng có kích thước to hơn,thường phân nhánh

Trong đất có đạm vô cơ, nốt sần hữu hiệu vẫn hình thành nhưng nhỏ và có đặc điểmgần như nốt sần vô hiệu Khi lượng đạm trong đất cạn, nốt sần hữu hiệu phát triển làmtăng kích thước và lại có khả năng cố định nitơ

Điều này cần được chú ý đặc biệt trong sản xuất nông nghiệp Để phát huy tối đahiệu lực của vi khuẩn nốt sần, không nên bón thúc đạm cho cây bộ đậu Bón thúc đạmvừa tốn kém lại không sử dụng được hiệu quả cộng sinh giữa vi khuẩn nốt sần và cây bộđậu

Tế bào Rhizobium có kích thước 0,5-0,9 x 1,2-3,2 µm

Khuẩn lạc: trên môi trường đặc tạo khuẩn lạc trơn bóng, nhày, màu trắng Chất nhàynày là một polysaccharide cấu tạo bởi hexose, pentose và acid uronic

CHƯƠNG II: QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH NỐT SẦN Ở RỄ CÂY

2.1. Cơ chế cố định Nitơ

2.1.1. Enzyme nitrogenase

Quá trình cố định đạm xảy ra trong tế bào vi khuẩn và vi khuẩn lam đều giống nhau

là nhở chúng có hệ thống gen nif (ni là chữ viết tắt của nitrogen- nitơ và f là fixing –cốđịnh.) điều khiển quá trình tổng hợp Enzyme nitrogenase

Nitrogenase là một đa enzyme (phức hệ enzyme) xúc tác cho phản ứng cố định N2,khử N2 thành NH3

Như vậy, hệ thống gen nif được xem là hệ thống gen điều khiển cho quá trình cố địnhđạm sinh học

2.1.2. Bộ gen (genome) của Pseudomonas và sự điều khiển tổng hợp nitrogenase

a. Genome và hệ thống gen nif của Pseudomonas

Thông tin di truyền chuyên biệt về sự cố định đạm đã được xác định trong bộgenome của Pseudomonas stutzeri A1501 Đó là “vùng cố định đạm” (nitrogen fixationregion) có kích thước 49kb, gồm 59 gen có liên quan

Thứ tự của các gen nif trong cấu trúc của “vùng cố định đạm” ở Pseudomonasstutzeri A1501 được khởi đầu là vùng PST1301, vùng giữa lần lượt bao gồm các gennifQ – nifB – nifA – nifL - nifY2 – nifHDKTY – nifENX – nifUSV – nifWZM – nifF vàvùng PST1360 ở đầu còn lại

b. Sự điều khiển tổng hợp enzyme nitrogenase

Theo nghiên cứu của Yan et al (2008), hệ thống của gen nif ở Pseudomonas stutzeriA1501 là một hệ thống hoàn chỉnh gồm các loại gen nif quy định tổng hợp các thànhphần cấu tạo nên phức nitrogenase

Hình 2.1 “Vùng cố định đạm” (nitrogen fixation region) của Pseudomonas

stutzeri A1501 (Yan et al., 2008)

2.1.3. Cơ chế cố định Nitơ phân tử

Trong thành phần cấu tạo nitrogenase, số nguyên tử Fe và nguyên tử S có thể không

ổn định với acid Phân tử protein nhỏ hơn có chức năng vận chuyển e–, trong đó e– củaferredoxin hoặc flavodoxin vận chuyển lên phức hệ Mo-Fe

Hầu hết các vi sinh vật không thể sử dụng N2 nên chúng phải cố định nguồn N2 tựnhiên để dễ dàng sử dụng

Cơ chế cố định đạm xảy ra theo phương trình

N2 + 8H+ + 8e + 16ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi

Cơ chế hóa sinh của quá trình cố định N cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ hoàntoàn, nhưng đa số các nhà nghiên cứu đồng ý với giả thuyết cho rằng N là sản phẩm đồnghóa sơ cấp của N2 và có thể nêu ra 2 giả thuyết về 2 con đường cố định N của vi sinh vậtsống tự do trong đất như sau:

Trong công nghiệp, nhờ các chất xúc tác nên năng lượng dùng cho phản ứng cố định

N2 được giảm nhiều, chỉ vào khoảng 16-20 Kcalo/M, song lượng năng lượng vẫn còn lớn

so với trong cơ thể sinh vật Tốc độ phản ứng nhanh chóng trong tế bào vi sinh vật ởnhiệt độ thấp nhờ có hệ thống enzyme hydrogenase họat hóa H2 và enzyme nitrogenasehoạt hóa N2

Năm 1961-1962, người ta đã tách từ Clostridium pasteurrianum hai tiểu phần hoạthóa H2 và N2 Sau này người ta tìm thấy ởAzotobacter cũng có các tiểu phần đó Trong

quá trình hoạt hóa này có sự tham gia của 2 nguyên tố khoáng Mo và Fe.Nguồn hydro để khử N2 có thể là hydro phân tử (H2) Trong trường hợp này thì dưới tácdụng của enzyme hydrogenase, điện tử được chuyền theo hệ thống:

Hình 2.2: Sơ đồ giả thuyết về các con đường của quá trình cố định

N2

Nguồn cho điện tử và hydro là acid pyruvic Đáng chú ý là trong quá trình chuyềnđiện tử có sự tham gia tích cực của feredocine (Fd) Fd là cầu nối giữa 2 hệ enzymehydrogenase và nitrogenase để cố định N2.

2.5.1. Cơ chế cố định nitơ trong nốt sần của rễ cây họ đậu

Sự cố định N2 của vi khuẩn nốt sần có thể xãy ra theo sơ đồ phức tạp hơn Trong cácnốt sần có một chất có bản chất hem rất giống với hemoglobin trong máu gọi làleghemoglobin Nó dễ dàng liên kết với O2 để biến thành oxyhemoglobin

Leghemoglobin chỉ được tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh với cây bộ đậu, cònkhi nuôi cấy tinh khiết các Rhizobium sẽ không tạo leghemoglobin và không cố địnhđược N2

Những nghiên cứu gần đây về quá trình cố định N2 cho thấy quá trình cố định nàyđòi hỏi:

- Quá trình cố định nitơ được thực hiện bởi phức hệ nitrogenase Thành phần chínhcủa phức hệ này là nitrogenase reductase và nitrogenase Phức hệ này nằm trong tế bào

chất của thể vi khuẩn (bacteroid) Có thể coi đây là nhân tố chìa khóa cho quá trình này.Enzyme này hoạt động trong điều kiện yếm khí (Nitrogenase đặc biệt nhạy với oxy và bịbất hoạt khi có mặt oxy).

- Có lực khử mạnh với thế năng khử cao (NAD, NADP, )

- Có năng lượng (ATP) đủ và có sự tham gia của nguyên tố vi lượng Nhóm hoạtđộng của enzyme nitrogenase có chứa Mo và Fe Vì vậy sử dụng Mo và Fe cho cây họđậu thường có hiệu quả rất cao Bacteroid cần năng lượng từ thực vật cung cấp để cố địnhđạm

- Tiến hành trong điều kiện yếm khí

Các chất khử là NADH2 và Fd cùng với năng lượng do hô hấp, quang hợp của câychủ cung cấp Sự cố định N2 cần rất nhiều năng lượng, cần 16 ATP để khử 1 N2.NH3 tạo thành trong quá trình cố định N2 được sử dụng dễ dàng vào quá trình amine hóacác cetoacid để tổng hợp một cách nhanh chóng các acid amine, từ đó tham gia vào tổnghợp protein và nhiều quá trình trao đổi chất khác

Quá trình cố định nitơ phân tử theo hai hướng cơ bản: Con đường khử và con đườngoxy hóa

Con đường khử theo chuỗi biến hóa: N2  HN=NH H2N-NH2 NH3 NH4OH

Con đường oxy hóa: N2  N2O  HNO2 NH4OH

Qua 2 hướng đó, người ta thu được kết quả sau:

- Nếu nồng độ Oxy nhiều sẽ ức chế quá trình cố định nitơ phân tử

- Hiệu suất cố định nitơ phân tử của những vi sinh vật kỵ khí thường cao hơn những

vi sinh vật hiếu khí

- Tìm thấy hợp chất loại khử khi nuôi các vi sinh vật cố đinh nitơ phân tử

N2 + 8H+ + 8e- → 2NH3 + H2

16-24ADP + 16-24Pi 16-24ATP

Qua đó cho thấy con đường khử có nhiều khả năng xảy ra hơn

2.2.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định đạm