Định lượng một số chất dinh dưỡng có trong nấm linh chi (ganoderma lucidum (leyss ex fr ) karst) nuôi trên môi trường lỏng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

Nội dung nghiên cứu • Thu nhận mẫu đã phân lập • Định danh sơ bộ nấm linh chi bằng bào tử • Nhân giống và bảo quản giống trên môi trường rắn • Nuôi trên môi trường lỏng • Định lượng một

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC

664 ===  ===

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

§Ò tµi:

Định lượng một số chất dinh dưỡng trong nấm

linh chi (Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst)

nuôi cấy trên môi trường lỏng bằng phương pháp

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

GV hướng dẫn : PGS.TS.Trần Đình Thắng

SV thực hiện : Trần Thị Hậu Lớp : 50K - Công nghệ thực phẩm MSSV : 0952040401

Vinh, 12/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự do -Hạnh phúc

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên : Trần Thị Hậu

Khóa : 50

MSV : 0952040401

Ngành : Công nghệ thực phẩm 1.Tên đề tài: Định lượng một số chất dinh dưỡng có trong nấm linh chi (Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst) nuôi trên môi trường lỏng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 2 Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: ………

………

………

………

………

………

Cán bộ hướng dẫn : PGs.Ts Trần Đình Thắng

Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày tháng năm 2012

Ngày hoàn thành đồ án : Ngày tháng năm 2012

Ngày tháng năm 2012

Sinh viên đã hoàn thành và nộp đồ án vào ngày tháng năm 2012

Người duyệt

(Ký, ghi rõ họ tên)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự do -Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Trần Thị Hậu Msv: 0952040401

Khóa: 50 Ngành: Công nghệ thực phẩm Cán bộ hướng dẫn: PGs.Ts.Trần Đình Thắng Cán bộ duyệt:

1 Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………

………

………

2 Nhận xét của cán bộ hướng dẫn: ………

………

………

………

………

………

Ngày tháng năm 2012

Cán bộ hướng dẫn

(Ký, ghi rõ họ, tên)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự do -Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Trần Thị Hậu Msv: 0952040401

Khóa: 50 Ngành: Công nghệ thực phẩm Cán bộ hướng dẫn: PGs.Ts.Trần Đình Thắng Cán bộ duyệt:

1 Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………

………

………

2 Nhận xét của cán bộ duyệt: ………

………

………

………

………

………

Ngày tháng năm 2012 Cán bộ duyệt

(Ký, ghi rõ họ, tên)

LỜI CẢM ƠN

Đồ án được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh, phòng thí nghiệm Hóa thực phẩm và Trung tâm Phân tích - Chuyển giao Công nghệ và Môi trường, Trường Đại học Vinh

Xin chân thành cảm ơn:

PGS.TS Trần Đình Thắng đã hết lòng hướng dẫn và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

Các thầy cô khoa Hóa học và cán bộ hướng dẫn thí nghiệm phòng Hóa thực phẩm, phòng Vi sinh, Trung tâm Phân tích - Chuyển giao Công nghệ thực phẩm và Môi trường Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Các bạn cùng phòng thí nghiệm Hóa thực phẩm đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm đồ án tốt nghiệp

Vinh, tháng 12 năm 2013

Sinh viên thực hiên

Trần Thị Hậu

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Đối tượng nghiên cứu 1

3 Nội dung nghiên cứu 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về nấm 2

1.1.1 Khái quát về nấm 2

1.1.2 Hình thái học của sợi nấm 2

1.1.2.1 Hình thái sợi nấm 2

1.1.2.2 Hình thái thể quả 2

1.1.3 Các giai đoạn phát triển của nấm 3

1.1.4 Đặc điểm biến dưỡng của nấm 4

1.1.5 Điều kiện sinh trưởng của nấm 4

1.1.5.1 Chất dinh dưỡng 4

1.1.5.2 Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý lên sự sinh trưởng hệ sợi nấm 5

1.2 Nấm linh chi 6

1.2.1 Phân loại 6

1.2.2 Đặc điểm của nấm linh chi 6

1.2.3 Phân bố và sinh thái 7

1.2.4 Tính vị và công năng 8

1.2.5 Thành phần hóa học và các hoạt chất sinh học của nấm linh chi 10

1.3 Tổng quan về axit amin 13

1.4 Tổng quan về vitamin 14

1.4.1 Vitamin C 15

1.4.2 Vitamin E 16

1.5 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao(HPLC) 16

1.5.1 Cơ sở lý thuyết 17

1.5.2 Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột 17

1.5.3 Phân loại 18

1.5.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC 18

1.5.5 Các đại lượng đặc trưng của hệ thống HPLC 22

1.5.6 Cách đo HPLC 22

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 23

2.1 Vật liệu thí nghiệm 23

2.1.1 Giống 23

2.1.2 Môi trường giữ giống 23

2.1.3 Môi trường nuôi cấy trên thạch 23

2.1.4 Môi trường nhân sinh khối 23

2.1.5 Dụng cụ 24

2.1.6 Hóa chất sử dụng 24

2.2 Phương pháp thí nghiệm 25

2.2.1 Định danh nấm linh chi thu hái được bằng bào tử dưới kính hiển vi 25

2.2.2 Kỹ thuật cấy chuyền giữ giống 26

2.2.3 Tốc độ phát triển của hệ sợi nấm trên môi trường thạch 26

2.2.4 Tốc độ phất triển của hệ sợi nấm trên môi trường lỏng 26

2.2.5 Xác định hàm lượng axit amin trong nấm 27

2.2.5.1 Chuẩn bị hóa chất phân tích 27

2.2.5.2 Nguyên tắc 27

2.2.5.3 Xây dựng đường chuẩn 29

2.2.5.4 Xác định hàm lượng axit amin tự do trong mẫu nấm 29

2.2.5.5 Xác định hàm lượng axit amin sau khi thủy phân trong mẫu nấm 29

2.2.5.6 Điều kiện chạy sắc ký 30

2.2.6 Xác định hàm lượng vitamin E trong nấm 32

2.2.6.1 Xây dựng đường chuẩn 32

2.2.6.2 Xác định hàm lượng vitamin E trong mẫu nấm 34

2.2.6.3 Điều kiện sắc ký 34

2.2.7 Xác định hàm lượng vitamin C trong nấm 34

2.2.7.1 Xây dựng đường chuẩn 34

2.2.7.2 Xác định hàm lượng vitamin C trong mẫu nấm 34

2.2.7.3 Điều kiện chạy sắc ký 34

2.2.8 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn xác định (LOQ) của phương pháp 35

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Quan sát cấu trúc bào tử nấm 36

3.2 Tốc độ phát triển của nấm trên môi trường 36

3.2.1 Tốc độ phát triển của nấm trên môi trường thạch 37

3.2.1 Tốc độ phát triển của nấm trên môi trường lỏng 37

3.3 Axit amin 38

3.3.1 Xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ…38 3.3.2 Sắc đồ hỗn hợp axit amin tự do trong mẫu nấm 44

3.3.3 Sắc đồ hỗn hợp axit amin thủy phân trong mẫu nấm 45

3.3.4 Xử lý kết quả 45

3.4 Vitamin C 48

3.4.1 Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của vitamin C 48

3.4.2 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C 51

3.4.3 Sắc đồ mẫu thử vitamin C 52

3.5 Vitamin E 53

3.5.1 Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của vitamin E 53

3.5.2 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E 55

3.5.3 Sắc đồ mẫu thử vitamin E 58

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

4.1 Kết luận 59

4.2 Kiến nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Vòng đời của nấm 3

Hình 1.2 Quả thể của nấm linh chi 6

Hình 1.3 Chu trình phát triển của nấm linh chi 8

Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 19

Hình 2.1 Nấm linh chi mọc tự nhiên 23

Hình 3.1 Hình thái quả thể nấm linh chi (Ganoderma lucidum) 36

Hình 3.2 Cấu trúc bào tử nấm linh chi (Ganoderma lucidum) 36

Hình 3.3 Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 10pmol 38

Hình 3.4 Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 25pmol 39

Hình 3.5 Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 100pmol 39

Hình 3.6 Sắc đồ hỗn hợp axit amin tự do trong mẫu nấm 45

Hình 3.7 Sắc đồ hỗn hợp axit amin thủy phân trong mẫu nấm 45

Hình 3.8 Đường chuẩn biểu thị môi quan hệ giữa diện tích peak thu được và nồng độ các chuẩn vitamin C 49

Hình 3.9 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C ở nồng độ 5ppm 51

Hình 3.10 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C ở nồng độ 10ppm 51

Hình 3.11 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C ở nồng độ 20ppm 52

Hình 3.12 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin C ở nồng độ 50ppm 52

Hình 3.13 Sắc đồ mẫu thử vitamin C trong mẫu nấm 53

Hình 3.14 Đường chuẩn biểu thị môi quan hệ giữa diện tích peak thu được và nồng độ các chuẩn vitamin E 54

Hình 3.15 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E ở nồng độ 4ppm 56

Hình 3.16 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E ở nồng độ 10ppm 56

Hình 3.17 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E ở nồng độ 20ppm 57

Hình 3.18 Sắc đồ mẫu chuẩn vitamin E ở nồng độ 40ppm 57

Hình 3.19 Sắc đồ mẫu thử vitamin E trong mẫu nấm 58

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ của axit aspatic 40

Bảng 3.2 Giá trị LOD và LOQ của chuẩn axit amin aspatic 43

Bảng 3.3 Giá trị LOD và LOQ của chuẩn 17 axit amin 44

Bảng 3.4 Đổi đơn vị 46

Bảng 3.5 Hàm lượng các axit amin tự do trong mẫu nấm 47

Bảng 3.6 Hàm lượng các axit amin thủy phân trong mẫu nấm 48

Bảng 3.7 Diện tích peak của vitamin C tương ứng với từng nồng độ chuẩn 49

Bảng 3.8 Giá trị LOD và LOQ của chuẩn vitamin C 50

Bảng 3.9 Hàm lượng vitamin C trong mẫu nấm 50

Bảng 3.10 Diện tích peak của vitamin E tương ứng với từng nồng độ chuẩn 53

Bảng 3.11 Giá trị LOD và LOQ của chuẩn vitamin E 55

Bảng 3.12 Hàm lượng vitamin E trong mẫu nấm 55

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Đã từ rất lâu, nấm linh chi không những là nấm ăn mà còn là loại dược liệu quý hiếm Trong “Thần nông bản thảo” xếp linh chi vào loại siêu thượng phẩm hơn cả nhân sâm và coi linh chi là loại thuốc quý có tác dụng bảo can (bảo vệ gan), giải độc, cường tâm, kiện não (bổ óc), tiêu đờm, lợi niệu, ích vị (bổ dạ dày)

Cũng như các loại nấm khác, nấm linh chi có hàm lượng chất béo thấp chủ yếu là axít béo chưa no và có hàm lượng protein cao chỉ sau thịt với đậu nành

Nhờ những giá trị dinh dưỡng và dược học mà ngày nay ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới nuôi trồng và tiêu thụ nấm linh chi tăng mạnh Các nước sản xuất nấm linh chi chủ yếu là Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan, Việt Nam…

Việt Nam là một nước nông nghiệp và giàu tiềm năng về lâm nghiệp, do đó nguồn phế thải nông- lâm nghiệp như bã mía, rơm rạ, mạt cưa rất dồi dào, đây là nguồn nguyên liệu thích hợp cho việc trồng nấm Nuôi trồng nấm linh chi ở nước ta đã tiến hành từ nhiều năm trước đây, nhưng chỉ với những trang trại theo quy mô nhỏ, tự phát

Nấm linh chi là một loại nấm có giá trị dinh dưỡng, giá trị dược học và giá trị kinh

tế cao Hiểu được nhưng lợi ích của nấm linh chi đem lại, xuất phát từ những thực tế trên,

chúng tôi thực hiện đề tài “Định lượng một số thành phần chất dinh dưỡng của nấm

linh chi (Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst.) nuôi cấy trên môi trường lỏng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)”

2 Đối tượng nghiên cứu

Nấm linh chi (Ganoderma lucidum) thu nhận từ vườn Quốc gia Pù mát

3 Nội dung nghiên cứu

• Thu nhận mẫu đã phân lập

• Định danh sơ bộ nấm linh chi bằng bào tử

• Nhân giống và bảo quản giống trên môi trường rắn

• Nuôi trên môi trường lỏng

• Định lượng một số thành phần chất dinh dưỡng sinh khối của nấm linh chi trên môi trường lỏng bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nấm

1.1.1 Khái quát về nấm

Theo khái niệm cũ, nấm là thực vật như cái loại cây cỏ khác, nhưng là thực vật không có sắc tố xanh (diệp lục tố) Tuy nhiên nhưng nghiên cứu ngày càng nhiều trên sinh lý và biến dưỡng cho thấy nấm có nhiều điểm khác với thực vật: không có lục lạp, không có sự phân hóa thành rễ, thân, lá, không có hoa, phần lớn không chứa cellulose trong thành tế bào, không có một chu trình phát triển chung như thực vật Nấm chỉ có thể hấp thu chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể từ cơ thể khác hay từ đất qua bề mặt của tế bào hệ sợi nấm Chính vì thế, tất cả hệ thống phân loại sinh giới hiện nay đều coi nấm là một giới riêng, tương đương với giới động vật và thực vật [14]

1.1.2 Hình thái học của nấm

1.1.2.1 Hình thái học sợi nấm

Tuyệt đại đa số nấm được cấu tạo bằng những sợi nấm Sợi nấm có dạng ống, chứa đầy tế bào chất và dịch bào Sợi nấm có 2 loại, một loại không có vách ngăn, nhiều nhân, một loại có vách ngăn, trên màng vách ngăn có lỗ thông để truyền thông tin và trao đổi chất Vách tế bào chủ yếu được cấu tạo bằng kitin- glucan Sợi nấm có thể phát triển từ bào tử hay từ một đoạn sợi nấm và có đặc điểm sinh trưởng về phía ngọn, phân nhánh

Sợi nấm trồng nhiều năm có thể tiếp xúc với nhau hình thành một khối gọi là thể sợi nấm 1.1.2.2 Hình thái quả thể

Tản hay cơ thể của nấm là những tế bào đơn hay dạng sợi kéo dài Phần lớn các sợi phân nhánh Khi các sợi nấm bện lại với nhau tạo thành thể sinh bào tử, gọi là quả thể hay tai nấm Đặc trưng của nấm lớn là có cơ quan sinh sản bào tử kích thước lớn, có thể nhìn thấy bằng mắt thường, do sự kết bện của sợi nấm khi gặp điều kiện thuận lợi Thường có

2 kiểu quả thể trong nhóm nấm lớn:

- Kiểu 1: bào tử thường được sinh ra trong những thể hình cầu, những nấm thuộc

Gasteromycetes

- Kiểu 2: bào tử sinh ra từ một phần của quả thể nấm Những nấm này thuộc

Basidiomycetes Có thể bào tử ở phần phiến hay không thuộc phiến (Aphyllophorales)

Ở nhóm này ta thường gặp 2 loại quả thể như sau:

• Quả thể lật ngược, phiến ở phía trên hay không có phiến, thường không có hình dạng nhất định Chúng rất mỏng và dày nhất đạt 2mm

• Quả thể thẳng đứng, gặp ở nhóm Basidiomycetes hay Discomycetes Các sợi nấm

phủ lên nhau ở mặt ngoài hay chỉ một phần bên trên Những kiểu này quả thể rất khác nhau ở các phần chân nấm, mũ nấm, phiến nấm [6, 11]

1.1.3 Các giai đoạn phát triển của nấm

• Giai đoạn sinh trưởng

Giai đoạn này thường dài, nấm ở giai đoạn này chủ yếu là dạng sợi Sợi nấm mỏng manh và gồm 2 nhân, có nguồn gốc từ 2 bào tử khác nhau nẩy mầm và phối hợp lại Hệ sợi nấm, còn gọi là hệ sợi dinh dưỡng, len lỏi trong cơ chất để rút lấy thức ăn Thức ăn muốn vào tế bào sợi nấm phải thông qua màng tế bào Khi khối sợi đạt đến mức độ nhất định về số lượng, gặp điều kiện thích hợp, sẽ bện kết lại tạo thành quả thể nấm Trong trường hợp bất lợi, sẽ hình thành các bào tử tiềm sinh hay hậu bào tử [15]

• Giai đoạn phát triển

Giai đoạn này thường ngắn, lúc bấy giờ sợi nấm đan vào nhau, hình thành đảm bào

tử hoặc nang bào tử Khi tai nấm dạng đặc biệt, gọi là quả thể nấm hay tai nấm Quả thể thường có kích thước lớn và là cơ quan sinh sản của nấm Trên quả thể có 1 cấu trúc, nơi tập trung các đầu ngọn sợi nấm, đó là thụ tầng Chính ở đây 2 nhân của tế bào sẽ nhập lại thành 1 Sau đó sẽ chia thành 4 nhân con hình thành các bào tử hữu tính (trưởng thành),

bào tử được phóng thích, chúng nẩy mầm và chu trình lại tiếp tục [15]

Vòng đời của nấm được mô tả bằng sơ đồ sau:

Hình 1.1 Vòng đời của nấm

1.1.4 Đặc điểm biến dưỡng của nấm

Nấm có khẳ năng sản xuất enzym ngoại bào, những enzym ngoại bào này giúp cho nấm biến đổi những chất hữu cơ phức tạp thành dạng dễ hòa tan dễ hấp thu Chính vì thế, nấm chỉ có đời sống dị dưỡng, lấy thức ăn từ nguồn hữu cơ (động vật, thực vật) Thức ăn được hấp thu qua màng tế bào của hệ sợi nấm Dựa vào cách hấp thu dinh dưỡng của nấm

có thể chia thành 3 nhóm:

- Hoại sinh: Thức ăn là xác, bã động vật hay thực vật Ở nhóm nấm này chúng có khẳ năng biến đổi những rất khó phân hủy thành những chất đơn giản dễ hấp thu, nhờ hệ men ngoại bào

- Ký sinh: Chủ yếu là loại nấm gây bệnh, chúng sống bám vào cơ thể sinh vật khác

để hút thức ăn sinh vật chủ

- Cộng sinh: Lấy thức ăn từ cơ thể sinh vật chủ nhưng không làm tổn hại sinh vật

chủ, ngược lại còn giúp cho chúng phát triển tốt hơn (như nấm Tuber hay Boletus cộng

sinh cây sồi) [14]

1.1.5 Điều kiện sinh thái của nấm

1.1.5.1 Chất dinh dưỡng

• Nguồn cacbon: Trong tự nhiên, cacbon được cung cấp chủ yếu từ các nguồn

polysaccharit như: cellulose, hemicellulose, lignin, pectin,…để tổng hợp nên các chất như: hydratcacbon, axit amin, axit nucleic, lipid… cần thiết cho sự phát triển của nấm Trong sinh khối nấm, cacbon chiếm nửa trọng lượng khô, đồng thời nguồn cacbon cung cấp năng lượng cho quá trình trao đổi chất Đối với các loài nấm khác nhau thì nhu cầu cacbon cũng khác nhau, nhưng hầu hết chúng dùng nguồn đường đơn giản là glucose, với nồng độ đường là 2%

• Nguồn đạm (N): Đạm là nguồn cần thiết cho tất cả các môi trường nuôi cấy,

cần cho sự phát triển hệ sợi nấm Hệ sợi nấm sử dụng nguồn đạm để tổng hợp các chất hữu cơ như: purin, pyrimidin, protein, tổng hợp chitin cho vách tế bào Nguồn đạm sử dụng trong các môi trường ở dạng muối: muối nitrat, muối amon Trong tế bào, ion NH4+thường gắn với cetoglutamic và những amin khác được hình thành từ những phản ứng chuyển hóa amin

• Khoáng: Cần cho sự phát triển và tăng trưởng của nấm Chúng chiếm 5- 10%

trọng lượng chất khô Các chất cần cho nấm bao gồm P, K, Mg, S, Cu, Co, Zn, Fe…Chúng là các chất không thể thiếu được trong hoạt động sống của nấm

• Vitamin: Những phân tử hữu cơ này được dùng với lượng rất ít, chúng không

phải là nguồn cung cấp năng lượng cho tế bào Vitamin cần thiết và giữ chức năng đặc biệt trong hoạt động của enzym Hầu hết nấm hấp thụ nguồn vitamin từ bên ngoài và chỉ cần một lượng rất ít nhưng không thể thiếu Hai nguồn vitamin cần thiết cho nấm là biotin (vitamin H) và thiamin (vitamin B1) [4, 9, 10]

1.1.5.2 Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý lên sự sinh trưởng hệ sợi nấm

Các yếu tố vật lý tác động lên sợi nấm khác với tác động lên sự hình thành quả thể nấm Tác nhân vật lý ảnh hưởng trực tiếp lên sợi nấm với mức độ khác nhau: mức độ tác động thấp nhất, mức độ tác động tối ưu, mức độ tác động lớn nhất Những yếu tố tác động trực tiếp lên sự sinh trưởng sợi nấm là nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm và độ thông khí [5]

• Nhiệt độ: Ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng sinh hóa bên trong tế bào, kích

thích hoạt động các chất sinh trưởng, các enzym và chi phối toàn bộ các hoạt động sống của nấm Mỗi loài nấm có nhu cầu nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển khác nhau Nhiệt

độ nuôi ủ hệ sợi bao giờ cũng cao hơn so với khi nấm ra quả thể vài độ Nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ thích hợp sẽ làm cho hệ sợi nấm sinh trưởng chậm lại hoặc chết hẳn [6, 16]

• Ánh sáng: Không cần cho quá trình sinh trưởng của nấm Cường độ ánh sáng

mạnh kiềm chế sự sinh trưởng của sợi nấm, có trường hợp giết chết sợi nấm Ánh sáng có thể phá vỡ một số vitamin và enzym cần thiết, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng bình thường của sợi nấm Phòng ủ nấm không nên quá tối, sẽ gây trở ngại cho việc phát hiện bệnh và nhất là tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc, côn trùng phát triển Trong giai đoạn nuôi hệ sợi tạo quả thể, ánh sáng có tác dụng kích thích hệ sợi nấm kết hạch (nụ nấm) [5, 13]

• Độ ẩm: Hầu hết các loài nấm cần độ ẩm cao Một số loài thuộc nấm đảm cần độ

ẩm thích hợp cho sự sinh trưởng tối ưu của sợi nấm (80 - 90%) Nhưng hầu hết các loài nấm cần độ ẩm để sinh trưởng hệ sợi là 50 - 60% [9, 10]

• Độ thông khí: Hàm lượng O2 và CO2 ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng của sợi nấm Oxy cần thiết cho việc hô hấp của hệ sợi nấm Còn nồng độ CO2 tăng cao trong không khí sẽ ức chế quá trình hình thành quả thể nấm.

• Ảnh hưởng của pH: Hầu hết các nhóm nấm mọc trên thực vật hay ký sinh thì

thích hợp đối với môi trường pH thấp Các loài nấm mọc trên mùn bã hay trên đất thì thích hợp với môi trường pH trung tính hay môi trường kiềm Nhưng một số loại nấm có khả năng mọc được ở biên độ pH khá rộng Một số loài nấm có khả năng tự điều chỉnh

pH môi trường về pH thích hợp cho sự sinh trưởng chính chúng [9, 10]

1.2 Nấm linh chi

1.2.1 Phân loại

• Họ: Ganodermataceae

• Giống: Ganoderma

• Loài: Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr.) Karst [11]

1.2.2 Đặc điểm của nấm linh chi (Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr.) Karst)

Hình 1.2 Quả thể nấm linh chi

Nấm hóa gỗ, sống một năm hay lâu năm Thể quả có mũ dạng thận, tròn hoặc dạng quạt, dày, đường kính 3 - 10 cm, cuống dài đính lệch, hình trụ tròn hay dẹt, có khi phân nhánh; mặt trên mũ có những vòng đồng tâm, mép lượn sóng Bào tử hình bầu dục hoặc hình trứng, cụt đầu, màu gỉ sắt, có một mấu lồi và nhiều gai nhọn

Mũ nấm hình bán nguyệt hay hình thận, rộng 2 – 25 cm, dài 3 – 30 cm, dày 0,5 – 2

cm, mặt trên bóng, màu nâu có vân đồng tâm, lượn sóng và vân tán xạ, mặt dưới nâu nhạt

mang các ống rất nhỏ chứa bào tử Cuống dài ở bên cạnh hình trụ tròn, nâu bóng, kích thước 1- 1,5 cm x 15- 20 cm

Toàn cây nấm màu đỏ, đỏ vàng hoặc nâu đen [2]

1.2.3 Phân bố và sinh thái

Nấm linh chi (Ganoderma lucidum) có nhiều tên gọi khác nhau như Bất Lão Thảo,

Vạn Niên Thảo, Thần Tiên thảo, Chi Linh, Đoạn Thảo, Nấm Lim,… Mỗi tên gọi của linh chi gắn liền với một giá trị dược liệu của nó Tên gọi linh chi bắt nguồn từ Trung Quốc,

hay theo tiếng Nhật gọi là Reishi hoặc Mannentake, tên gọi Latinh: Garnodema lucidum

[7]

Chi Ganoderma Karsten có khoảng vài chục loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở

vùng nhiệt đới và á nhiệt đới châu Á, châu Đại Dương và châu Mỹ Ở Việt Nam có 26 loài và 1 dưới loài (var), trong đó một số loài được dùng làm thuốc

Nấm linh chi thuộc nhóm nấm lớn, thường hoại sinh trên gỗ mục hoặc trên đất ngay ở nơi có gốc cây gỗ đã mục, thuộc đại diện của các họ Caesalpiniaceae (lim, lim xẹt,

muồng đen, me…) và Fagaceae (một số loài thuộc các chi Quercus, Lythocarpus, Castanopsis ) Môi trường sống của nấm thường ở rừng kín thường xanh ẩm, độ cao từ

vài chục met đến 1500m Có thể tìm thấy nấm linh chi ở hầu hết các tỉnh vùng núi, từ Lào Cai (Sa Pa) đến Lâm Đồng (Lang Biang) Ở các vùng rừng trước kia có nhiều cây lim đã

bị khai thác, trên gốc hoặc phần thân cành còn lại (chủ yếu ở phần giác) đều có thể thấy nấm này mọc vào mùa mưa ẩm, như vùng rừng thuộc lâm trường Hương Sơn, tỉnh hà Tĩnh; vùng rừng thuộc Vườn Quốc gia Bến En, tỉnh Khánh Hòa và Tam Đảo (Vĩnh Phúc)…

Nấm linh chi sinh sản chủ yếu bằng bảo tử nằm ở mặt dưới của quả thể Phần có chức năng sinh dưỡng chính là hệ sợi nấm mọc ẩn trong gỗ mục hoặc đất Hiện nay ở Trung Quốc, Nhật Bản và Việt Nam, người ta đã chủ động nghiên cứu trồng được nấm linh chi trên giá thể nhân tạo để dùng làm thuốc [2]

Trong bào tử linh chi chứa các thành phần giống như linh chi: Polysacharide, triterpen, axit béo, axit amin và các nguyên tố vi lượng đậm đặc hơn linh chi từ khoảng 7

- 20 lần

Khi nuôi cấy tơ nấm lúc đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu vàng, sợi nấm ngăn thành nhiều phần và hình thành các bào tử vô tính Chu kỳ sống của nấm linh chi giống như hầu hết các loại nấm khác, nghĩa là cũng bắt đầu từ các bào tử, bào tử nảy mầm phát triển thành hệ mạng sợi tơ nấm Gặp điều kiện thuận lợi sợi nấm sẽ kết thành nụ nấm, nụ phát triển thành chồi, rồi tán và thành tai trưởng thành Trên tai sinh ra các bào

tử, bào tử phóng thích ra ngoài và chu trình lại tiếp tục [4, 11, 12]

Chu trình sống của nấm linh chi [9]

Hình 1.3 Chu trình phát triển của nấm linh chi 1.2.4 Tính vị, công năng

Nấm linh chi có vị nhạt, tính ấm, có tác dụng tư bổ và làm tăng cường sinh lực

Công dụng:

Nấm linh chi được dùng trong kinh nghiệm dân gian để điều trị suy nhược thần kinh, chóng mặt, mất ngủ; viêm khí quản mãn tính, bệnh bụi silic phổi lao; tăng huyết áp, tăng cholesterol máu, bệnh động mạch vành tim; viêm gan, đau dạ dày, chán ăn; thấp khớp, thống phong Liều dùng mỗi ngày 3-10g dạng thuốc sắc, hoặc 2 – 5g tán bột uống

Dùng ngoài, xông trị viêm mũi

Trong y học dân gian Trung Quốc, linh chi được dùng rộng rãi để điều trị suy nhược thần kinh, viêm gan mạn tính đường tiêu hóa [2]

Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược lý và sử dụng nấm linh chi, người ta thấy

linh chi có tác dụng với một số bệnh:

• Đối với các bệnh tim mạch: Hàng loạt các hoạt chất của linh chi được chứng tỏ có

tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp cholesterol, kìm hãm quá trình kết tụ tiểu cầu Các nghiên cứu này được cũng cố để có kết quả trị liệu cho các bệnh nhân cao huyết áp, nhiễm mỡ xơ mạch, bệnh mạch vành tim, Hầu hết các bệnh nhân có chuyển biến tốt sau một vài tuần, huyết áp ổn định dần, không xảy ra các tác dụng phụ như các loại thuốc tân dược

• Hiệu quả chống ung thư: Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hoá trị, giải

phẫu với trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày có thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm Nhiều thông tin ở Đài Loan cho biết nếu dùng nấm linh chi trồng trên gỗ long não điều trị cho các bệnh nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt - khối u tiêu biến hoàn toàn [1, 4, 12]

• Đối với các bệnh về hô hấp: nấm linh chi đem lại kết quả tốt, nhất là những ca

điều trị viêm phế quản dị ứng - hen phế quản tới 80%, có tác dụng làm giảm và nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn [16]

• Khả năng miễn dịch: nấm linh chi có chứa một lượng lớn Germanium hữu cơ,

polysaccharit và triterpenoit Những thành phần này đã được chứng minh là tốt hơn cho

hệ miễn dịch và cải thiện hệ miễn dịch

• Khả năng kháng HIV: Các nghiên cứu tại Nhật Bản đã chứng minh các hoạt chất

từ nấm linh chi có tác dụng như sau:

- Ganoderiol F và ganodermanontirol có hoạt tính chống HIV - 1

- Ganoderderic axit B và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease HIV-1

- Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth- A (mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma)

Ngoài ra các ganoderma alcohol là lanostane triterpene với nhóm hydroxol (-OH) ở

vị trí C25 có khả năng chống HIV - 1, Meth - A và LLC ở chuột [3, 12]

• Khả năng antioxydant: Nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các saponin và

triterpenoit, mà trong đó axit ganoderic được coi là hiệu quả nhất Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu selenium - một yếu tố khoáng có hoạt tính antioxydant rất mạnh vào nấm linh chi Chính vì vậy con người có thể chờ đợi vào một

dược phẩm tăng tuổi thọ, trẻ hoá từ nấm linh chi nói chung và linh chi Việt Nam nói riêng [12]

Các hoạt chất sinh học trong nấm linh chi có khả năng khử một số gốc tự do sinh ra trong quá trình lão hóa cơ thể hay sau khi bị nhiễm xạ Chúng làm phục hồi các tổ chức bị tổn thương và không gây hiệu ứng phụ nào cho cơ thể [9, 11]

Ngoài ra nấm linh chi còn có tác dụng chữa trị chứng bí tiểu, bổ thận khí chữa trị đau nhức khớp

1.2.5 Thành phần dinh dưỡng và các hoạt chất sinh học của nấm linh chi

• Ganoderma polysaccharit (GLPs)

Có trên 200 loại polysaccharit được ly trích và thu nhận từ nấm linh chi Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn

từ 100,000 - 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào Một phần polysaccharit phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng Ngoài polysaccharit

từ quả thể, polysaccharit cũng được thu nhận từ quá trình nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa trị

Vai trò dược học của polysaccharit:

- Tăng chức năng gan

- Duy trì khả năng tái sinh tủy và cơ một cách bình thường

- Tham gia tổng hợp ADN, ARN và protein

• Triterpenoit

Triterpenoit là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren Các triterpen có

bộ khung chính từ 27 - 30 nguyên tử carbon (C28H48) rất thường gặp trong thực vật Các triterpenoit tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một

số nhóm chức như: -OH; -OOH; ete -O-; carbonil C=O; nối đôi C=C Đặc tính chung là

có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexan, eter ethyl, cloroform), ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosit [8, 9]

Vai trò dược học:

- Hạ huyết áp nhờ tác dụng của axit ganoderic B, D, F, H, K, Y và ganodermaditol

- Ức chế tổng hợp Cholesterol do axit ganoderic, axit Ganodermic M, F, T, O

- Ức chế giải phóng Histamine có axit ganoderic R, S

- Chức năng bảo vệ gan do tác dụng của Lucidone A, Lucidenol

- Chống khối u có Ganosporelacton A, B

Điểm đặc biệt chú ý ở nhóm hoạt chất dược lý triterpenoit là sử dụng từng triterpenoit tinh khiết riêng rẽ thì hoạt lực thấp hơn khi dùng các phân đoạn tách chưa tinh

chế Có nghĩa là khi sử dụng tổ hợp các đồng phân của chúng sẽ có hiệu quả hơn nên việc

sử dụng nấm linh chi thường được dùng toàn bộ dịch chiết từ nấm

- Tăng lượng lipoprotein 2 - 3 phosphoricglycerin

- Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lưu lượng máu cung cấp cho não

- Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể [22,23]

• Germanium hữu cơ

Gemanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm

1885 Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của oxygen Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến 1,5 lần Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa Cơ thể con người là thành phần của các electron Khi mức năng lượng tăng hoặc giảm thấp, dẫn đến

sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý Gemanium hữu cơ sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khoẻ Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất Gemanium sẽ điều hoà và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển [22, 23]

• Một số thành phần khác như:

- Enzym: lysozym, protease axit và một số enzym khác

- Protein: protein hòa tan, polypeptit, axit amin

- Đường: trehalose, manitol

- Amin: betain

- Alkan:tetracosan, hentriacontan

- Axit béo: các axit tetracosanoic, stearic, palmitic

- Các nguyên tố vô cơ: Ca, Mg, Na, Mn, Fe, Zn, Cu và Ge

Ngoài ra còn có các chất uracin và uridin [2]

1.3 Tổng quan về axit amin

Axitamin là cấu tử cơ bản của protein, hay nói một cách khác, axitamin là những

“viên gạch” để xây nên “các toà lâu đài muôn hình vẽ” của phân tử protein Axit amin là những hợp chất hữu cơ mạch thẳng hoặc mạch vòng trong phân tử có chứa ít nhất một nhóm amin (-NH2) và một nhóm cacboxyl (-COOH)

Các axit amin thường gặp trong các protein (trong tự nhiên) là những L- axitamin có nhóm amin dính vào nguyên tử cacbon  đứng cạnh nhóm cacboxyl

-Công thức cấu tạo tổng quát của axit amin:

R: được gọi là mạch bên hay nhóm bên, các axit amin chỉ khác nhau ở mạch R

• Phân loại axit amin

- Dựa vào khả năng tổng hợp protein trong cơ thể, người ta chia axit amin làm hai

loại: axit amin thiết yếu và axit amin không thiết yếu

Bảng 1.1 Phân loại axit amin Axit amin thiết yếu

- Hoàn toàn phụ thuộc vào sự cung cấp

từ thức ăn bên ngoài đưa vào cơ thể

- Có 10 loại axit amin thiết yếu:

Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin,

Phenillalanin, Threonin, Tryptophan và

Valin

- Cơ thể có thể tổng hợp chúng với số lượng đầy đủ từ các phân tử khác trong cơ thể

- Không bắt buộc hiện diện trong chế độ

ăn

- Các loại axit amin không thiết yếu : Alanin, Glycin, Serin, Tyrosin, Polin, Cystein, Cystin

- Dựa vào cấu tạo gốc R để phân 20 axit amin cơ bản thành các nhóm Một trong các cách phân loại là 20 axit amin được phân thành 5 nhóm như sau:

Nhóm 1: các axit amin có gốc R không phân cực kị nước, thuộc nhóm này có 6 axit

amin : Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L), ILe (I), Pro (P)

Nhóm 2: các axit amin có gốc R là nhân thơm, thuộc nhóm này có 3 axit amin :

Phe (F), Tyr (Y), Trp (W)

Nhóm 3: các axit amin có gốc R bazơ, tích điện dương, thuộc nhóm này có 3 axit

amin : Lys (K), Arg (R), His (H)

Nhóm 4: các axit amin có gốc R phân cực, không tích điện, thuộc nhóm này có 6

axit amin : Ser (S), Thr (T), Cys (C), Met (M), Asn (N), Gln (Q)

Nhóm 5: các axit amin có gốc R axit, tích điện âm, thuộc nhóm này có 2 axit amin : Asp (D), Glu (E)

Như vậy cấu tạo của chúng giống nhau ở chỗ cùng có nhóm cacboxyl – COOH và

nhóm amin – NH2 đều gắn vào nguyên tử C ở vị trí , còn khác nhau ở cấu tạo mạch bên

R

Vai trò của các axitamin không chỉ giới hạn ở sự tham gia của chúng vào tổng hợp protein cơ thể mà mỗi một axitamin đều cần thiết cho sự hoàn thành nhiều chức phận phức tạp và quan trọng khác

1.4 Tổng quan về vitamin

Vitamin, hay sinh tố, là phân tử hữu cơ cần thiết ở lượng rất nhỏ cho hoạt động chuyển hoá bình thường của cơ thể sinh vật Có nhiều loại vitamin và chúng khác nhau về bản chất hoá học lẫn tác dụng sinh lý

Vitamin không trực tiếp sinh năng lượng như protein, lipit hay gluxit Mà chỉ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sản xuất và sử dụng năng lượng Vitamin ảnh hưởng tới hoạt động và quá trình phát triển của tổ chức: là chất xúc tác, bằng cách hoạt hoá quá trình oxi hoá thức ăn và chuyển hoá Tham gia vào thành phần cấu tạo coenzym, quyết định hoạt tính đặc thù của chúng

Trong nấm có chứa một số vitamin như: thiamin (B1), riboflavin (B2), niacin (B3), axit ascorbic (vitaminC), tocopherol (vitamin E)

1.4.1 Vitamin C

Vitamin C hay axit ascorbic là một chất dinh dưỡng thiết yếu cho các loài linh trưởng bậc cao, và cho một số nhỏ các loài khác Sự hiện diện của ascorbat là cần thiết trong một loạt các phản ứng trao đổi chất trong tất cả các động vật và cây cối và được được tạo ra trong cơ thể bởi hầu như tất cả các cơ thể sinh vật, loại trừ loài người Đây là một chất được mọi người biết đến rộng rãi là một vitamin mà thiếu nó thì sẽ gây

ra bệnh scorbut cho con người

Vai trò của vitamin C:

- Vai trò sinh hóa:

+ Tham gia quá trình oxy hóa hoàn nguyên, người ta tìm thấy 2 loại enzym : ascorbin - reductase và ascorbin - oxydaza tham gia quá trình oxy hóa - hoàn nguyên chất glutation (C10H17N3SO3)

+ Có tác dụng kích thích hoạt động của enzym aconitase trong chu trình krebs, do

đó nó gián tiếp ảnh hưởng tới sự chuyển hóa glucose

+ Vitamin C có liên quan chặt chẽ đối với sự trao đổi protein, đặc biệt là protein của các mô chống đỡ như gân, xương Chức năng chủ yếu của vitamin C là sự sản xuất collagen, một protein chính của cơ thể

- Chức năng miễn dịch: vit.C làm tăng cường hệ thống miễn dịch, đặc biệt trong

ngăn ngừa và điều trị cảm cúm thông thường

- Chức năng chống oxyl hóa: vitamin C hoạt động giống như một chất chống oxyl

hóa trong môi trường nước của cơ thể - cả nội bào lẫn ngoại bào

- Ngăn ngừa ung thư : vitamin C đảm nhiệm chức năng quan trọng trong bảo vệ cơ

thể, tăng cường chức năng miễn dịch, chống ung thư, bao gồm hoạt động chống oxy hóa

và bảo vệ cấu trúc tế bào tránh các tổn thương

1.4.2 Vitamin E

Tocoferol là chất lỏng không màu, hòa tan tốt trong dầu thực vật, trong rượu etylic, ete etylic và ete dầu hỏa

α Tocoferol thiên nhiên có thể kết tinh chậm trong rượu metylic ở nhiệt độ thấp

-35oC thu được tinh thể hình kim có nhiệt độ nóng chảy 2,5 - 3,5o

C

Tocoferol khá bền với nhiệt Nó có thể chịu nhiệt tới 170oC trong không khí.Tia tử ngoại có thể phá hủy nhanh chóng tocoferol, nhạy cảm với ánh sáng do đó cần bảo quản trong nắp kín

Các tocopherol có công thức phân tử là C29H50O2

Vitamin E có các chức năng sau đây:

- Chống oxi hóa sinh học trong cơ thể và trong thức ăn: dùng Vit.E để bảo quản

thức ăn khi thức ăn có chứa nhiều caroten, vit.A và lipid, ngăn chặn sự hình thành peroxyt

và bảo vệ các axit béo chưa no

- Ngăn ngừa ung thư: vì nó kết hợp với vitamin C tạo thành nhân tố quan trọng làm

chậm sự phát sinh của một số bệnh ung thư

- Ngăn ngừa bệnh tim mạch: vitamin E làm giảm các cholestrol xấu và làm tăng sự

tuần hoàn máu nên làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch

- Hệ thống miễn dịch: Vitamin E kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động bình

thường bằng việc bảo vệ các tế bào, hoặc tăng cường sức mạnh hệ miễn dịch khi có dịch bệnh tấn công

- Chống vô sinh: do nó đảm bảo cơ năng sinh dục được bình thường vì vitamin E

có liên quan đến sự tiết kích thích tố sinh dục (gonadotropin) ở tuyến yên

- Chống lão hóa : do phản ứng chống oxy hoá bằng cách ngăn chặn các gốc tự do,

nên người ta dùng nó để sản xuất các chế phẩm dưỡng da hoặc làm trẻ hóa

1.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

H3

O

H

CH3

1.5.1 Cơ sở lý thuyết

HPLC là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure

Liquid Chromatography)

Trong đề tài này tôi dùng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định hàm

lượng axit amin, vitamin E và vitamin C trong mẫu nghiên cứu

Ưu điểm của phương pháp HPLC là tốc độ tách nhanh, độ phân giải tốt, độ nhạy

cao, độ lặp lại tốt và có thể phân tích đồng thời nhiều chất

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ,

phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử)

Trong khóa luận này chúng tôi sử dụng Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Agilent 1100

1.5.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột chúng ta cần có một pha động Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C vào cột phân tích, kết quả các chất A, B, C sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác F1, F2 và F3:

Chất phân tích A + B + C

F1 F2

F3

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại

Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1, F2, F3 Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột

1.5.3 Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:

• Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)

• Sắc ký phân bố (partition chromatography)

• Sắc ký ion (ion chromatography)

• Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography)

Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion

có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000) SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động:

• Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực

• Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực

Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP)

1.5.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC

Thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phần chính:

• Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích

• Phần tách: phần trung gian của hệ sắc ký, gốm cột tách, đôi khi có cột phụ trợ

• Phần phát hiện và xử lý số liệu: phần này bao gồm các detecter, phần khuếch tán, máy tính và phần mềm xử lý số liệu, bộ phận ghi tín hiệu

Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

Trong đó:

1- Bình chứa dung môi pha động

2- Bộ phận khử khí

3- Bơm cao áp

4- Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay autosample)

5- Cột sắc ký (pha tĩnh) (để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt)

Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chi sử dụng tối đa là 3 và 2 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định

Hiện 4 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải Gradial dung môi theo thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn

Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar Tốc độ dòng: 0,1- 9,999 ml/phút Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt Hiện tại bơm có 2 pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục

• Bộ phận tiêm mẫu (injection)

Dùng để đưa mẫu vào cột phân tích Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (autosample)

• Cột sắc ký

Có rất nhiều nhãn hiệu cột khác nhau hiện bán trên thị trường Chúng được chia làm nhiều loại theo mục đích sử dụng, trong đó chủ yếu là: cột pha đảo RP C18 (ODS), cột pha thường C8, các loại cột chuyên dụng cho từng nhóm chất Cột C18 và C8 được sử dụng cho phần lớn các hợp chất thông thường

Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10- 30cm, đường kính trong 1- 10mm

Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxit, polyme xốp, chất trao đổi ion

Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column)

• Đầu dò (Detector)

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc

ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại Detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng

độ nhất định của chất phân tích

A = k.C Trong đó: A : là tín hiệu đo được

C : nồng độ chất phân tích

k : là hằng số thực nghiệm của Detector đã chọn

Tín hiệu này có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất …

Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai Detector sau:

- Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV

- Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang và đây là loại thông dụng nhất

- Detector huỳnh quang dễ phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang và là loại Detector có độ chọn lọc cao nhất

- Loại hiện đại hơn có Detector Diod Array, ELSD (Detector tán xạ bay hơi) các Detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất

Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là:

- Detector điện hóa: Đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng…

- Detector chiết suất vi sai: Detector khúc xạ (thông thường dùng cho đo các chất đường)

- Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt…

• Bộ phận ghi tín hiệu

Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang

Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của peak, chiều cao…

Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số của peak như tính đối xứng, hệ số phân giải trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD

• Sự loãng pic và hình dáng pic

• Hiệu lực của cột và đĩa lý thuyết

• Chiều cao đĩa lý thuyết và sự loãng pic

1.5.6 Cách đo HPLC

Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm sắc

ký Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau:

• Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hết bọt khí có trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào cột

• Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như: cấu hình máy, tỷ lệ các dung môi pha động, bước sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu cầu

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 Vật liệu thí nghiệm

2.1.1 Giống

Nấm linh chi (Ganoderma lucidum) được thu hái từ vườn Quốc gia Pù mát

Hình 2.1 Nấm linh chi mọc tự nhiên

Nấm linh chi được thu nhận về sau đó được đem đi phâp lập và làm thuần giống

2.1.2 Môi trường giữ giống

2.1.3 Môi trường nuôi cấy trên thạch

Công thức môi trường PGA

2.1.4 Môi trương nhân sinh khối

Môi trường PG + khoáng + pepton:

Khoai tây 200g D- glucose 20g

2.1.5 Dụng cụ

- Đĩa petri, chai thủy tinh (250ml), ống nghiệm, bao nylon

- Dụng cụ thủy tinh các loại: pipet, ống đong, bình định mức, pipet, phễu chiết

- Nồi hấp, tủ sấy, cân phân tích, tủ cấy, que cấy, máy đo pH, máy đo Bx, kính hiển

vi

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

- Cân phân tích độ chính xác 0,0001g

- Bể siêu âm

- Tủ sấy có thể đặt nhiệt độ lên 2800C

- Máy cất quay chân không

• Hóa chất sử dụng phân tích axit amin:

- Dung dịch chuẩn: amino axit nồng độ 10pmol/l, 25pmol/l, 100pmol/l

- Chất tạo dẫn xuất: o-phthalaldehyd (OPA) và axit 3 – mercaptopropionic trong đệm borat

- Dung dịch axit axetic 1 – 2%

- Natri axetat trihydrat NaCH3COO.3H2O

- Dung dịch HCl đặc

- Đệm borat 0,4N trong nước, pH = 10,2

- Thuốc thử FMOC ( 9- fluorenylmethylchloro trong acetonitril)

- Dung dịch axit clohydic HCl đậm đặc

• Hóa chất sử dụng phân tích vitamin E:

- Dung dịch KOH 2M trong cồn: hòa tan 11,2g KOH trong 100ml cồn 960

- Dung dịch KOH 2% trong nước: hòa tan 2g KOH trong 100ml nước cất

- Acetonnitril (Merck dùng cho HPLC)

- Hexan (Merck)

- 1,4- dioxan

• Hóa chất sử dụng để phân tích vitamin C:

- Chuẩn axit ascorbic (Merk)

- Axit phosphoric (Merk)

- Etanol

- Metanol (Merk)

2.2 Phương pháp thí nghiệm

2.2.1 Định danh nấm linh chi thu hái được bằng bào tử dưới kính hiển vi

- Đổ môi trường PGA vào đĩa với 1 lớp mỏng trong tủ cấy vô trùng, sau đó bật tia

UV và để nguội

- Lam kính được khử cồn và hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn

- Cắt 1 miếng thạch ở đĩa, khoảng 1cm đặt lên lam kính

- Lấy 1 ít sợi nấm dàn đều trên miếng thạch

- Đậy lam kính