Một số thành phần hóa học kháng nấm và kháng khuẩn từ cốt khí củ (polygonum cuspidatum siebold zucc ) ở việt nam`

Phương pháp nghiên cứu các hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học kháng bệnh gây bởi nấm hại cây trồng 15... DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của các hợp chất từ cốt khí củ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ KIM LIÊN

MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC KHÁNG NẤM VÀ KHÁNG KHUẨN TỪ CỐT KHÍ CỦ

(Polygonum cuspidatum Siebold & Zucc.)

Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGHỆ AN – 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ KIM LIÊN

MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC KHÁNG NẤM VÀ KHÁNG KHUẨN TỪ CỐT KHÍ CỦ

(Polygonum cuspidatum Siebold & Zucc.)

Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGHỆ AN – 2016

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được thực hiện tại các phòng thí nghiệm chuyên đề Hoá Hữu

cơ - Khoa Hoá học - Trường Đại học Vinh

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:

- PGS TS Trần Đình Thắng đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình thực hiện luận văn

- PGS.TS Hoàng Văn Lựu, TS Đậu Xuân Đức đã đọc và đóng góp

nhiều ý kiến quý báu cho luận văn

- TS Đỗ Ngọc Đài, trường Đại học kinh tế Nghệ An giúp định danh mẫu

thực vật

Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô, cán bộ bộ môn Hoá Hữu cơ, khoa Hoá học, phòng Đào tạo Sau đại học - Trường Đại học Vinh; các bạn đồng nghiệp; nghiên cứu sinh; học viên cao học; sinh viên; gia đình và người thân đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

MỤC LỤC

Trang

1.2.3 Công dụng dân gian và hoạt tính sinh học của cây cốt khí củ 9

1.3 Hiện trạng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) sinh học 10

1.4 Hoạt tính kháng nấm hại cây trồng của các anthraquinone thực vật 13

1.5 Phương pháp nghiên cứu các hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh

học kháng bệnh gây bởi nấm hại cây trồng

15

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của các hợp chất từ cốt khí củ 9 Hình 1.5: Hoạt tính in vivo kháng nấm hại cây trồng của hrysophanol,

emodin và phiscion tách ra từ cây Cassia tora

13

Hình 1.6: Quy trình phân tách các hoạt chất tự nhiên ứng dụng trong

nghiên cứu thuốc bảo vệ thực vật

DANH SÁCH BẢNG

Trang Bảng 1.1 Hoạt tính in vivo của chrysophanol, nepodin, physcion trên

Sơ đồ 2.3 Sơ đồ phân lập và tách chất từ phân đoạn F9 23

MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

CHỮ VIẾT TẮT TỪ, CỤM TỪ

DPPH 1,1 – diphenyl – 2 – picrylhydrazyl radical

EC50 Effective concentration, 50% -Nồng độ trung hoà 50% gốc tự

do

IC50 Inhibitory concentration, 50% - Nồng độ ức chế 50%

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cốt khí củ là 1 vị thuốc trong đông y chủ trị về phong tê thấp, đau nhức gân xương, ngã ứ huyết, viêm gan cấp, viêm phổi, viêm ruột cấp, nhiễm trùng đường tiết liệu…[13] Trong những năm gần đây các nghiên cứu về những hợp chất có trong cốt khí củ được quan tâm Một trong các loại hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh được tách chiết từ cốt khí củ là anthraquinone Anthraquinone giúp giảm peroxyt hóa lipid, giảm hư hại cơ quan và cải thiện thiếu máu cục bộ

cơ tim Trong thử nghiệm, Các hợp chất thuộc anthraquinone cho thấy tính chống viêm mạnh hơn aspirin và ibuprofen Ở Châu Á, chất này được sản xuất chủ yếu từ cây cốt khí củ do cây có đặc tính dễ trồng và có hàm lượng các dược chất cao như resveratrol, piceid, emodin Hoạt tính của anthraquinone cao hơn hẳn so với piceid trong khi hàm lượng anthraquinone trong cây cốt khí củ lại thấp hơn nhiều lần so với hàm lượng piceid

Tuy nhiên, trên thực tế các nghiên cứu về tối ưu hoá phuơng pháp chiết xuất và khảo sát hoạt tính sinh học của các loại hợp chất anthraquinone trong

cây cốt khí củ hiện còn chưa đầy đủ Xuất phát từ thực tế đó, đề tài “Một số

thành phần hóa học kháng nấm và kháng khuẩn từ cốt khí củ (Polygonum

cuspidatum Siebold & Zucc.) ở Việt Nam” từ đó góp phần xác định thành

phần hoá học của cốt khí củ và tìm ra nguồn nguyên liệu cho ngành dược liệu, hương liệu

2 Nhiệm vụ nghiên cứu

Trong luận văn này, chúng tôi có các nhiệm vụ:

- Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp

chất của cốt khí củ (Polygonum cuspidatum Siebold & Zucc.)

- Sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh phân đoạn để phân lập các hợp chất

- Sử dụng các phương pháp phổ để xác định cấu trúc các hợp chất thu được

3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cốt khí củ (Polygonum cuspidatum Siebold &

Zucc.) thuộc Chi Polygonum - một chi lớn thuộc họ Polygonaceae

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về chi Polygonum

Chi Polygonum là một chi lớn thuộc họ Polygonaceae, gồm các loài thảo mộc, cây nhỏ, cây bụi Trên thế giới chi này gồm khoảng 300 loài được công nhận Một số nhà thực vật học phân chia chi vào một số chi nhỏ hơn là Fagopyrum, Fallopia, Persicaria [2]

1.1.1 Đặc điểm hình thái

Chi Polygonum gồm các loài cây thân phủ phục cao dưới 5m, các loại thân cỏ lâu năm phát triển cao tới 3-4 m, hay thân bụi đôi khi là dây leo, thân có màu đỏ, hay lốm đốm đỏ Lá trơn dài từ 1-30 cm, có hình dạng mũi mác hẹp, hình bầu dục, hình tam giác, hình trái tim, hình đầu mũi tên Lá thường mọc cách, các lá kèm ở gốc dính lại với nhau thành một ống bao lấy gốc dóng gọi là

bẹ chứa Hoa thường lưỡng tính, hoa mọc thành chùm, cụm, hoa nhỏ, màu hồng, trắng, màu xanh lục Ra hoa vào mùa hè, ra từ các khớp lá Đài gồm 3- 6 mảnh, màu lục, trắng hay đỏ hồng, rời nhau hay dính, tồn tại ở quả Nhị 6, xếp thành 2 vòng, đôi khi 9 nhị Nhụy gồm 3 noãn, bầu trên chứa 1 noãn thẳng ở đáy Quả đóng, hạt có phôi thẳng và nội nhũ bột lớn [2]

Hình 1.1: Hình ảnh một số loài trong chi Polygonum

1.1.2 Phân bố

- Trên thế giới:

Chi Polygonum phân bố rộng rãi trên thế giới, chi chủ yếu phát triển ở vùng ôn đới phía bắc Ở Châu Á chi Polygonum khá phong phú, chi có mặt ở

nhiều nước như Nhật Bản, Việt Nam, Hàn Quốc, Ấn Độ, Trung Quốc… Tại Trung Quốc đã tìm thấy 113 loài như Polygonumpopovi, Polygonum cognataum, Polygonum aviculare, Polygonum assimica phát triển chủ yếu ở các vùng núi như Tân Cương, Hồ Bắc, Vân Nam, Giang Tây…[8] Ở Châu Âu chi Polygonum có măt ở các nước như Nga, các nước thuộc miền nam Châu Âu… Ở Châu Mỹ chi Polygonum phát triển rộng rãi tại Mỹ, Mehico…Ở Mỹ chi Polygonum có 80 loài được công nhận, chi Polygonum được coi như một loài cỏ xâm lấn có mặt gần như trên khắp cả nước như Polygonum caurianum mọc nhiều ở Alaska, Polygonum califonicum có nhiều ở Califoria, Colorado, Arizona…[9]

- Việt Nam:

Ở nước ta hiện nay chi Polygonum chi Polygonum đã tìm thấy khoảng 42 loài, trong đó có tới 20 loài được dùng làm thuốc như: Hà thủ ô, nghể răm , nghể trắng…chi Polygonum phân bố rộng rãi khắp cả nước, ở các vùng núi, các ruộng bỏ hoang ở đồng bằng như Sa Pa, Đà Lạt, Hà Nội, Phú Thọ…[3]

1.1.3 Một số loài trong chi

Polygonum multiflorum Thunb (Hà thủ ô đỏ)

- Hình thái: Cây dây leo quấn, sống lâu năm Thân, rễ phồng thành củ, củ dài màu đỏ Thân quấn mọc xoắn vào nhau, mặt ngoài thân có màu xanh tía, nhẵn , có vân Lá mọc sole, có cuống dài Phiến lá hình tim, dài 4-8 cm, rộng 2,5- 5 cm, đầu nhọn mép nguyên hoặc hơi lượn song, cả hai mặt đều nhẵn Bẹ chìa mỏng, màu nâu nhạt ôm lấy thân Hoa mọc thành chùm, nhiều nhánh, hoa nhỏ, đường kính 2mm, mọc cách xa nhau ở kẽ những lá bắc ngắn mỏng Bao hoa màu trắng, 8 nhụy Bầu hoa có 3 cạnh, 3 vòi ngắn rời nhau Đầu nhụy hình mào gà rủ xuống Quả 3 góc, nhẵn bóng, đựng trong bao hoa còn lại, 3 bộ phận ngoài của bao hoa phát triển thành cánh rộng, mỏng nguyên [3]

- Phân bố: Cây mọc hoang ở vùng núi cao, nhiều nhất ở các tỉnh Lai Châu, Sơn La, Hoàng Liên Sơn Cây được trồng bằng dây hay hạt, có nơi cây được trồng ở vùng đát đồi trung du cây phát triển tốt

- Thành phần hóa học: Thân rễ Hà thủ ô chứa antranoid, trong đó có emodin, chrysophanol, rthein, physcion, protid, tinh bột, lipid, chất vô cơ, các chất tan trong nước, lecitin, rhaponticin (rhapontin, ponticin), 2,3,5,4 tetrahydroxytibene- 2-0-b-D-glucoside Tanin [3]

- Tác dụng:

+ Rễ, củ dùng làm dược liệu có tác dụng hạ cholesterol huyết thanh, được chứng minh rõ trên mô hình gây cholesterol cao ở thỏ nhà, thuốc còn có tác dụng làm giảm hấp thụ cholesterol của ruột thỏ Thuốc có tác dụng phòng chống

và giảm nhẹ xơ cứng động mạch do thuốc có thành phần lecithin

+ Thuốc làm chậm nhịp tim, làm tăng nhẹ lưu lượng máu đông mạch và bảo vệ được cơ tim thiếu máu

+ Thuốc giữ được tuyến ức của chuột nhắt già không bị teo giữ được mức như lúc chuột non, tác dụng này có ý nghĩa chống lão hóa nhưng cơ chế này còn cần nghiên cứu thêm

+ Thuốc có tác dụng nhuận tràng do dẫn chất oxymethylanthraquinone làm tăng nhu động ruột, hà thủ ô sống có tác dụng nhuận tràng mạnh hơn hà thủ

ô chín

+ Tác dụng kháng khuẩn và virus: thuốc có tác dụng ức chế đối với trực khuẩn lao ở người và trực khuẩn lỵ Flexner Thuốc có tác dụng ức chế virus cúm

- Công năng: bổ huyết giữ tinh, hòa khí huyết, bổ can thận, mạnh gân xương, nhuận tràng [3, 10]

Polygonum aviculare L (biển súc, rau đắng)

- Hình thái: Cây nhỏ mọc bò, thân và cành mọc tỏa tròn gần sát mặt đất màu đỏ tím, đôi khi mọc cao từ 10- 30 cm, giống như rau muống biển Lá đơn nhỏ hẹp, mép nguyên, hình mũi mác thuôn, mọc sole có bẹ chìa, phiến lá dài 1,5- 2 cm rộng 4 cm Hoa nhỏ màu hồng tím mọc tụ, thường từ 3-4 hoa mọc ở nách lá Quả có 3 cạnh chứa một hạt đen Mùa hoa từ tháng 5- 6

- Phân bố: Rau đắng mọc hoang ở những vùng đất có độ ẩm ướt vừa, như ruộng ẩm, lòng suối cạn ở các tinh phía bắc Cao Bằng, Lạng Sơn, Hà Bắc, Hà

Nội, hoặc đất pha cát ướt như ven dọc bờ biển miền trung, như tỉnh Quảng Nam,

Đà Nẵng

- Thu hái: toàn cây kể cả rễ vào mùa xuân và hạ

- Thành phần hóa học: trong rau đắng có 0,35% chất tannin, 39% carotene, flavonoid aviculare, khi thủy phân aviculare sẽ cho quercetin và L-arabinozo Ngoài ra còn có đường, tinh dầu, nhựa, sáp Ở rau đắng khô có chứa

900 g Vitamin C Độ tro 2,44%

- Tác dụng: lợi tiểu, thanh nhiệt, sát trùng, cầm máu [3]

Polygonum odoratum L (rau răm )

- Hình thái: là cỏ đa niên , bò rồi đứng cao từ 30- 35 cm , nhỏ, có vị cay

và thơm Lá mọc so le, hình bầu dục ngọn giáo, có phiến thon, không lông, thường có một bớt sẫm giữa phiến Hoa mọc thành bông dài, hẹp, mảnh, đơn độc hay xếp thành từng đôi hoặc thành chùm, ít phân nhánh Quả nhỏ có 3 cạnh, nhọn hai đầu nhẵn và bóng

- Phân bố: mọc hoang hoặc được trồng rộng rãi trên cả nước

- Thu hái: thu hái cành lá quanh năm, thường dùng tươi

- Thành phần hóa học: chủ yếu là tinh dầu màu vàng nhạt (tinh dầu của rau răm tìm thấy các aldehyd chuỗi dài như decanal 28%, docecanal 44%, ngoài

Hình 1.2: Củ và cây Cốt khí củ

- Hình thái: Cây Cốt khí củ là cây bụi nhỏ sống lâu năm Thân mọc thẳng, thường cao 0,5 – 1 m nhưng đặc biệt có nơi cao tới 2 m Thân không có lông, trên thân và cành thường có những đốm màu tím hồng Lá mọc so le có cuống ngắn Phiến lá hình trứng, rộng, đầu trên hơi thắt nhọn, phía cuống hoặc hơi phẳng hoặc hẹp lại, mép nguyên, dài 5 – 12 cm, rộng 3.5 – 8 cm, mặt trên có màu xanh nâu đậm mặt dưới màu nhạt hơn Cuống dài 1 – 3 cm Bẹ chìa ngắn Hoa mọc thành chùm ở kẽ lá, mang rất nhiều hoa nhỏ Cánh hoa có màu trắng Hoa đơn tính, hoa đực và hoa cái riêng Hoa đực có 8 nhị, hoa cái có bầu 3 góc Quả khô, 3 cạnh màu nâu đỏ khi chín Mùa hoa quả: tháng 6 – 10 [1]

- Phân bố: cốt khí củ có nguồn gốc ở vùng Đông Á, sau lan xuống khắp vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới như: Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Việt Nam, Lào và một vài nơi khác [1]

Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở vùng núi cao, từ 1000 – 1600 m như Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát), Lai Châu (Phong Thổ, Sìn Hồ)…Hiện nay cây được trồng rải rác ở các tỉnh đồng bằng và vùng trung du Bắc Bộ [1]

- Đặc điểm sinh học: Cốt khí củ có sức sống dai, phát triển mạnh mẽ trong mùa xuân hè Mùa hoa quả từ tháng 6 đến tháng 10 Cây rụng lá vào mùa đông, tái sinh từ hạt và phần thân rễ Cốt khí củ ưa sáng ưa ẩm thường mọc thành khóm trong các thung lũng, nơi gần nguồn nước [4]

- Bộ phận dùng: Rễ cốt khí củ thu hái quanh năm, tốt nhất là vào mùa thu đông, rửa sạch đất cát, cắt bỏ rễ con, thái miếng dày chừng 1- 2 cm, phơi sấy khô Dược liệu có mặt ngoài nâu xám, sần sùi nhăn nheo theo chiều dọc, mặt cắt

ngang màu vàng bẩn, lõi gần như rỗng, phần không rỗng có màu nâu sẫm Chất nhẹ, hơi cứng, mùi không rõ, vị hơi đắng [4]

1.2.2 Thành phần hóa học trong cây cốt khí củ

Thành phần của cốt khí củ khá phức tạp, nhưng theo các nhà khoa học, thì cốt khí củ gồm những thành phần chính sau:

- Anthraquinone: physcion, emodin – 8 – O – β – glucoside, rhein, falacinol, citreorosein, questin, questinol

- Stilben: resveratrol, piceid

- Phenol: acid protocatechuic

- Quinon: 2 – methoxy- 6 – acetyl – 7 – methyl juglon

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của acid protocatechuic

và 2 – methoxy- 6 – acetyl – 7 – methyl juglon Các thành phần khác: catechin, 7 – hydroxyl- 4 - methoxy – 5 methyl – coumaryl, torachrysin – 8 – O – D – glucoside [20, 21, 22,23]

α-hydrojuglon-4-β-D-glucoside

β glucoside

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của các hợp chất từ cốt khí củ

Ở Việt Nam cũng có nhiều nghiên cứu xác định hàm lượng các chất có trong dịch chiết cây cốt khí củ Việt Nam Nhóm tác giả Nguyễn Hải Nam và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc của resveratrol, piceid, emodin trong rễ cây cốt khí củ [5] Nhóm tác giả Vũ Đình Hoàng, Trần Việt Hùng đã nghiên cứu phương pháp định lượng resveratrol trong cây cốt khí củ và một số loại rượu nho thành phẩm trên thị trường [6]

1.2.3 Công dụng dân gian và hoạt tính sinh học của cây cốt khí củ

Theo đông y, rễ cây có vị ngọt đắng, tính mát, cây có tác dụng khu phong trừ thấp lợi tiểu, hoạt huyết, thông kinh, giảm đau, giảm độc [4]

Công dụng: Cốt khí củ thường được dùng chữa phong thấp tê bại, đau nhức gân xương, chấn thương, ngã sưng đau ứ huyết, kinh nguyệt khó khăn đau đớn, sau khi đẻ bị huyết hôi tích trong tử cung, bụng chướng, đái rắt, đái buốt và đái ra máu Còn dùng trị mụn nhọt, lở ngứa và làm thuốc cầm máu trong trường hợp vết thương chảy máu [4]

Do xuất hiện ở Trung Quốc nên cốt khí củ được sử dụng chủ yếu trong các loại thuốc cổ truyền của Trung Quốc cũng như của các nước Châu Á Rễ của cây được sử dụng chủ yếu như một chất chống viêm, chống ho, lợi tiểu, thuốc điều kinh, làm dịu, thuốc hạ sốt, thích thích tiêu hóa, v.v [31]

Hoạt tính sinh học:

Các chất phân lập được từ cốt khí củ thuộc nhóm stilbenes (piceid, resveratroloside, và resveratrol), hydroxyanthraquinones (emodin, emodin-1-O-glucoside và physcion) có hoạt tính kháng lại các loại vi khuẩn có trong thực phẩm, chúng có thể dùng làm chất bảo quản tự nhiên.[19]

Ở Châu Á, sự lây nhiễm virus đang diễn ra rất phức tạp, đặc biệt là nhiễm virus viêm gan B mãn tính (HBV) Sự lây nhiễm của nó là một trong những vấn

đề mà cộng đồng y tế thế giới đang quan tâm Những điều trị hiện tại vẫn chưa đạt được kết quả như các nhà khoa học trên thế giới mong muốn Trong các nghiên cứu để tìm kiếm thuốc kháng virus hiệu quả, tác giả [46] đã nghiên cứu

và kiểm tra dịch chiết của Polygonum cuspidatum Sieb Et Zucc và dịch chiết

này có khả năng kháng lại loại virus này Cụ thể: dịch chiết ethanol của Polygonum cuspidatum Sieb Et Zucc có thể ức chế được HBV với một liều

lượng tối thiểu 10 µg/ml có hiệu lực Dịch chiết nước của Polygonum cuspidatum Sieb Et Zucc cũng có thể ức chế được HBV ở một liều lượng cao hơn Dịch chiết nước của Polygonum cuspidatum Sieb Et Zucc có thể ức chế

biểu hiện của HBeAg ở liều lượng 30 µg/ml

Vì vậy, tác giả [46] dự đoán rằng trong dịch chiết của Polygonum cuspidatum Sieb Et Zucc có thể chứa những hợp chất ức chế, kiểm soát được

virus HBV trong tương lai Tuy nhiên, nó cũng có thể gây độc, do đó các nhà khoa học đang tìm cách biến đổi cấu trúc của nó để cải thiện tính hiệu quả và làm giảm khả năng gây độc

Tác giả [31] đã dẫn ra rằng Polygonum cuspidatum Sieb Et Zucc được sử

dụng trong dân gian để điều trị các bệnh về răng miệng, các chất có chứa trong

Polygonum cuspidatum Sieb Et Zucc có khả năng chống lại các lại vi khuẩn và

tiêu diệt vi khuẩn có trong răng miệng

1.3 Hiện trạng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) sinh học

Trong nền nông nghiệp hiện đại, việc sử dụng của các loại thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) để chống các bệnh hại cây trồng là vô cùng cần thiết, là yếu tố quan trọng tăng sản lượng mùa màng Đã có nhiều loại BVTV tổng hợp hữu cơ được áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đóng vai trò chính trong việc bảo vệ cây trồng [1-4] Tuy nhiên các thuốc BVTV tổng hợp hóa học

có nhược điểm là gây ô nhiễm môi trường, tiêu diệt cả các loài sinh vật hữu ích

và ảnh ưởng đến môi trường sinh thái [1,3-5] Những năm 1990 Cục bảo vệ môi trường Mỹ (Environmental Protection Agency), và Tổ chức kiểm tra an toàn thực phẩm Mỹ (Food Quality Protection Act) đã cố gắng loại bỏ nhiều loại

thuốc BVTV từng được sử dụng trước năm 1980 đồng thời đưa ra các mức giới hạn dư lượng thuốc trừ sâu trong thực phẩm [1,6]

Giá trị của thị trường thuốc BVTV toàn thế giới năm 2012 là 49,9 tỷ USD

và dự tính năm 2017 sẽ đạt 76,5 tỷ USD [8] Trong giai đoạn 2006 - 2010, xu hướng sử dụng thuốc BVTV tổng hợp hóa học của thế giới giảm dần từ 1480,6 nghìn tấn năm 2006 xuống mức 678,1 nghìn tấn năm 2010 Trung bình mỗi năm giảm 17,1% Trong hai năm 2011-2012, xu hướng này càng rõ nét do sự phát triển của nhóm thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học, phục vụ sản xuất nông nghiệp hữu cơ [8]

Từ năm 1995 đến 2000 có khoảng 45 sản phẩm thuốc BVTV sinh học được đăng ký sử dụng ở Mỹ và Châu Âu Thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học chiếm hơn 1% (khoảng 350 triệu USD) thị trường BVTV trên thế giới năm 1998 [6] Cho đến những năm 2000, đã có nhiều hơn 500 loại thuốc trừ sâu sử dụng hoạt chất sinh học (170 hoạt chất) từ tự nhiên được cho phép sử dụng [1] Số liệu thống kê của Cục Bảo Vệ Môi Trường của Mỹ cho thấy từ năm 1997-2010

có 277 hoạt chất tự nhiên đã được đăng ký sử dụng cho BVTV tại Mỹ, số lượng hoạt chất BVTV đăng ký có tới 69,7% là các hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên và bán tổng hợp dẫn xuất từ tự nhiên [2]

Thuốc BVTV sinh học (biopesticide) có nhiều ưu điểm hơn so với các loại thuốc trừ sâu tổng hợp là ít độc với con người cũng như động vật có vú [1-7] Thuốc BVTV sinh học có tính đặc hiệu cao khi tác dụng vào các loài sâu bệnh [4] Một ưu điểm rõ ràng nữa là thuốc BVTV sinh học có quá trình tự phân hủy sinh học ngắn trong môi trường tự nhiên nên sẽ giảm hẳn mức dư lượng trong thực phẩm và cũng giảm thiểu tác động lâu dài vào môi trường [1-6] Dòng thuốc BVTV sinh học còn được chú ý vì có khả năng diệt được một số sâu bệnh và đặc biệt là nấm đã kháng thuốc do hậu quả của việc sử dụng thuốc trừ sâu bừa bãi, sử dụng đơn thuần một loại thuốc trong thời gian dài và liều lượng ngày càng cao dẫn đến tình trạng kháng thuốc trừ sâu tổng hợp ngày càng phổ biến [4,6] Nghiên cứu và ứng dụng thuốc BVTV sinh học có thể đẩy lùi được

nguy cơ này, do các loại thuốc BVTV sinh học có cơ chế tác dụng mới và chỉ đặc hiệu lên một số bề mặt cảm ứng của cơ quan cảm thụ của sâu bệnh [4]

Các hợp chất tự nhiên chiết ra từ thực vật (nếu có hoạt tính sinh học) có thể trực tiếp dùng làm thuốc BVTV (botanical pesticide) hoặc được sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp thành các sản phẩm có hoạt tính phòng trừ sâu, bệnh Trường hợp thứ hai cũng tạo ra những sản phẩm thân thiện với môi trường vì chúng có tính tương hợp với cây trồng và khả năng phân hủy sinh học cao Hiện nay trên thế giới, nguồn nguyên liệu từ thực vật dùng để sản xuất thuốc BVTV đang được các nhà nghiên cứu quan tâm

Các hóa chất BVTV có nguồn gốc thảo mộc thường được sử dụng nhiều

là những sản phẩm sau:

- Các thuốc trừ sâu, nhện (insecticides, acaricides)

- Các thuốc trừ tuyến trùng (nematocides)

- Thuốc trừ nấm bệnh (fungicides)

- Thuốc trừ cỏ dại (herbicides)

- Các chất dẫn dụ (attractants, pheromones), xua đuổi (repellents) côn trùng

- Các chất có tác dụng hiệp lực (synergists)

Công nghệ sản xuất các thuốc BVTV có nguồn gốc thảo mộc khó và phức tạp hơn các sản phẩm tổng hợp và thường có sản lượng nhỏ hơn, độ bền bảo quản kém hơn, lại dễ bị thay đổi hiệu quả tác dụng do biến đổi khí hậu, vì vậy có giá thành cao Chúng thường được ưu tiên sử dụng ở những vùng có nền kinh tế nông nghiệp với kỹ thuật canh tác đã phát triển hoặc trong lĩnh vực sát trùng gia dụng (phòng trừ các côn trùng y tế gây hại cho người và gia súc), bảo quản nông sản, các qui trình phòng trừ tổng hợp (IPM) trong nông nghiệp và kiểm dịch thực vật [1,6]

1.4 Hoạt tính kháng nấm hại cây trồng của các anthraquinone thực vật

Các anthraquinone từ họ Đậu (Senna spp.) được tách ra từ Cassia tora (Senna tora) gồm có emodin, physcion và chrysophanol bằng phương pháp phân lập định hướng sinh học (bioassay guided isolation) sử dụng các nấm gây hại cây trồng làm đối tượng thử nghiệm [9] Thực nghiệm thu được cho thấy hoạt

tính kháng nấm của cả 3 anthraquinone này đối với các nấm Magnaporthe grisea, Corticium sasaki, Botrytis cinerea, Phytophthora infestans, Puccinia recondita và Blumeria graminis f.sp.hordei [9]

Hình 1.5: Hoạt tính in vivo kháng nấm hại cây trồng của chrysophanol, emodin

và phiscion tách ra từ cây Cassia tora [9]

Nấm hại cây trồng RCB (rice blast) bệnh đạo ôn (Magnaporthe grisea); RSB (rice sheath blight) bệnh khô vằn (Corticium sasaki); TGM (tomato gray mold) bệnh mốc xám trên cà chua (Botrytis cinerea); TLB (tomato late bright) bệnh mốc sương trên cây cà chua (Phytophthora infestans); WLR (wheat leaf rust) bệnh rỉ sắt trên lá lúa mì (Puccinia recondita); BPM (barley powdery mildew) nấm mốc sương trên lúa mạch (Blumeria graminis f.sp.hordei) và PAN (red pepper anthracnose) bệnh thám thư cây ớt đỏ (Colletotrichum gloeosporioides)

Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm hại cây trồng của các anthraquinon và quinone từ cây chút chít, năm 2004 [10,11], Jin-Cheol Kim cùng các cộng sự tại Viện Công nghệ Hoá học Hàn Quốc (KRICT) đã công bố nghiên cứu thử hoạt tính kháng nấm của dịch chiết từ rễ Rumex crispus Kết quả cho thấy Rumex crispus cho hiệu quả diệt nấm tốt, đặc hiệu với loại bệnh nấm mốc trên đậu Hà Lan, lúa mạch và dưa chuột Ngoài ra cũng tác dụng tới các loại nấm mốc gây bệnh như Magnaporthe grisea, Botrytis cinerea, Phytophthora infestans, Puccinia recondite ở lúa và khoai tây Các hợp chất chrysophanol, nepodin,

parietin đã được phân lập ra từ dịch chiết từ rễ Rumex crispus Kết quả cho thấy những chất này có tính diệt nấm với liều EC50 như sau: 4,7 µg/ml chrysophanol, 0,48µg/ml parietin, 20µg/ml nepodin Chrysophanol (100µg/ml), nepodin (400 µg/ml) có hiệu quả trị nấm gây bởi Podosphaera xanthii cao hơn chất kháng nấm fungicides fenarimol (30 µg/ml) và polyoxin (100µg/ml) trong cùng điều kiện thí nghiệm trên cây dưa chuột nuôi trồng trong nhà kính Parietin (30 và 10µg/ml) giảm sự phát triển nấm mốc sương trên dưa chuột hiệu quả như fenarimol (30 µg/ml) và hiệu quả hơn polyoxinB (100 µg/ml) [10]

Bảng 1.1 Hoạt tính in vivo của chrysophanol, nepodin, physcion trên 5 loại

1.5 Phương pháp nghiên cứu các hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học kháng bệnh gây bởi nấm hại cây trồng

Quá trình phân lập các hoạt chất tự nhiên nói chung và đối với các anthraquinone nói riêng có quy trình chiết tách tương tự nhau Mẫu ban đầu được sơ chế và tạo dịch chiết tổng bằng quá trình chiết dung môi Cao chiết tổng được thử hoạt tính sơ bộ bằng các phương pháp thử hoạt tính kháng nấm ở điều kiện in vitro sơ cấp [9,10] Khi cao chiết ban đầu được xác định có hoạt tính, nguyên liệu được chiết ở lượng lớn hơn để thu được lượng cao chiết đáp ứng đủ cho quá trình phân lập bằng các phương pháp phân tách lỏng-lỏng bằng dung môi hữu cơ và phân tách bằng các phương pháp sắc ký Các phân đoạn ban đầu thường được thử hoạt tính kháng nấm để lựa chọn các phân đoạn sắc ký có hoạt tính, từ đó tiến hành các bước tách sắc ký tiếp theo Chất tinh khiết tách ra được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ như IR, MS, NMR; bên cạnh đó hoạt tính kháng nấm của chất cũng được định lượng, xác định phổ tác dụng, cơ chế tác dụng nếu có thể ở quy mô in vitro [9,10,20] Hỗn hợp các hoạt chất thu được do bán tinh chế cao chiết thường được thử hoạt tính in vivo trong nhà kính hoặc nhà lưới để tiếp cận hướng triển khai thành chế phẩm thuốc BVTV [1,9,10] Bước cuối cùng, chế phẩm có thể thử sơ bộ trên ruộng trồng ở quy mô hẹp từ 15-100 m2 [3-6]