Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống keo lai ( acacia hybrid) bv32 bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro tại trung tâm sản xuất cây giống chất lượng cao bắc trung bộ, huyện thanh chương, tỉnh nghệ an

LÊ ĐẠI THẮNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG KEO LAI Acacia hybrid BV32 BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ IN VITRO TẠI TRUNG TÂM SẢN XUẤT CÂY GIỐNG CHẤT LƯỢNG CAO BẮC TRUNG BỘ, HU

LÊ ĐẠI THẮNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH

NHÂN GIỐNG KEO LAI (Acacia hybrid) BV32 BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ IN VITRO

TẠI TRUNG TÂM SẢN XUẤT CÂY GIỐNG CHẤT LƯỢNG CAO BẮC TRUNG BỘ,

HUYỆN THANH CHƯƠNG, TỈNH NGHỆ AN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGHỆ AN, 8/2016

LÊ ĐẠI THẮNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH

NHÂN GIỐNG KEO LAI (Acacia hybrid) BV32 BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ IN VITRO

TẠI TRUNG TÂM SẢN XUẤT CÂY GIỐNG CHẤT LƯỢNG CAO BẮC TRUNG BỘ,

HUYỆN THANH CHƯƠNG, TỈNH NGHỆ AN

Chuyên ngành: THỰC VẬT HỌC

Mã số: 60.42.01.11

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN ĐÌNH SAN

NGHỆ AN, 8/2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

là hoàn toàn trung thực và chưa hề sử dụng cho bảo vệ một học vị nào Mọi

sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn Các thông tin, tài liệu trình bày trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc

Vinh, ngày 25 tháng 8 năm 2016

TÁC GIẢ

Lê Đại Thắng

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy

giáo PGS.TS Nguyễn Đình San – cán bộ hướng dẫn khoa học, đã hướng dẫn

tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn những ý kiến đóng góp của các thầy giáo,

cô giáo trong các tổ bộ môn Thực vật, các Giảng viên khoa Sinh học trường Đại Học Vinh đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình triển khai thực hiện đề tài

Xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ, cung cấp thông tin tư liệu, hóa chất, nguồn giống của Trung tâm sản xuất cây giống chất lượng cao Bắc trung Bộ, huyện Thanh Chương, tỉnh Nghệ An; cảm ơn lãnh đạo và các cán bộ kỹ thuật của Trung tâm sản xuất cây giống chất lượng cao Bắc trung Bộ, huyện Thanh Chương, tỉnh Nghệ An thuộc Công ty TNHH Thanh Thanh Đạt đã tận tình hướng dẫn và cùng theo dõi sự phát triển của cây

Cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Nghiên cứu khoa học là lĩnh vực đòi hỏi nhiều yêu cầu khắt khe về chuyên môn, trong quá trình nghiên cứu sẽ không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong tiếp tục nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô, bạn bè

để đề tài của tôi được hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn!

Vinh, ngày 25 tháng 8 năm 2016

TÁC GIẢ

Lê Đại Thắng

IBA : β- Indol Butyric Acid

MS : Murashige and Skoog

DANH MỤC BẢNG

1.1 Số liệu trung bình vỏ, giác, lõi (Viện khoa học LN Việt Nam) ……… 1.2 Đặc điểm cây gỗ đứng ………

1.3 Số liệu thành phần MS ……… 2.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng sống của mẫu nuôi cấy (Thủy ngân clorua – HgCl2, nồng độ 0,1%)

2.4.2 Thí nghiệm 2: Xác định ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân chồi nhanh 2.4.3 Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân chồi nhanh 2.4.4 Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ 2.4.5 Thí nghiệm 5: Xác định ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra rễ

3.1 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của kỹ thuật và thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cấy ……… 3.2 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân nhanh chồi Keo

lai BV32 (Sau 30 ngày nuôi cấy) ……… 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Keo lai BV32 ……… 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ Keo lai BV32 (Sau 30 ngày nuôi cấy) ……… 3.5 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng α-NAA đến khả năng ra rễ Keo lai BV32 (Sau 30 ngày nuôi cấy) ……… ………… 3.6 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của giá thể ra cây sau ống nghiệm (Sau 90 ngày) ……… 3.7 Bảng 3.7 So sánh kết quả của đề tài với một số nghiên cứu khác …

DANH MỤC HÌNH

1.1 Cây keo trong vườn ươm và khi khai thác

3.1a Ảnh hưởng của kỹ thuật và thời gian khử trùng đơn đến tỷ lệ sống và bật chồi của mẫu cấy

3.1b Ảnh hưởng của kỹ thuật và thời gian khử trùng kép đến tỷ lệ sống và bật chồi của mẫu cấy

3.2 Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Keo lai BV32

3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng Kinetin đến khả năng nhân chồi Keo lai BV32

3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ của chồi Keo lai BV32

3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng α-NAA đến khả năng ra rễ của chồi Keo lai BV32

3.6 Ảnh hưởng của giá thể đến sức sống của Keo lai BV32 invitro ngoài vườn ươm

3.8 Quy trình nhân giống Keo lai BV32 bằng phương pháp nuôi cấy

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

2.1 Mục tiêu của đề tài 2

2.2 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

2.2.1 Ý nghĩa khoa học 2

2.2.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Chương 1 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 NGUỒN GỐC, PHÂN BỐ VÀ GIÁ TRỊ CỦA CÂY KEO LAI 3

1.1.1 Nguồn gốc, phân bố của cây Keo lai 3

1.1.2 Giá trị sử dụng 6

1.2 Đặc điểm sinh học và phân loại của Keo lai BV32 8

1.2.1 Đăc điểm hình thái ……… 8

1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh thái ……… … 8

1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ Keo lai trong và ngoài nước 9

1.3.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ Keo lai trên thế giới 9

1.3.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ Keo lai ở Việt Nam 11

1.4 Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào và ứng dụng trong nhân giống vô tính cây trồng 14

1.4.1 Cơ sở khoa học của Phương pháp nuôi cấy mô, tế bào 14

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô 15

1.4.3 Kỹ thuật nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô 17

1.4.4 Ưu điểm và hạn chế của nhân giống in vitro 20

1.5 Tình hình nuôi cấy mô Keo 22

1.5.1 Một số công trình nghiên cứu nuôi cấy mô Keo ở nước ngoài 22

1.5.2.Một số công trình nghiên cứu nuôi cấy mô Keo ở Việt Nam 25

Chương 2 28

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.2 Vật liệu nghiên cứu 28

2.3 Địa điểm nghiên cứu 28

2.4 Nội dung nghiên cứu 29

2.4.1 Đối với mẫu nuôi cấy 29

2.4.2 Xác định ảnh hưởng nồng độ Cytokinin đến khả năng nhân chồi nhanh 29

2.4.3 Xác định nồng độ Auxin thích hợp của giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 30

2.4.4 Xác định giá thể thích hợp cho giai đoạn ra cây ngoài vườn 31

2.5 Phương pháp nghiên cứu 32

2.5.1 Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu 33

2.5.2 Giai đoạn nhân nhanh chồi 34

2.5.3 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh (giai đoạn ra rễ) 35

2.5.4 Giai đoạn huấn luyện thích nghi 36

2.6 Phương pháp xử lý số liệu 36

Chương 3 37

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Kỹ thuật tạo vật liệu khởi đầu 37

3.2 Kỹ thuật nhân nhanh chồi Keo lai BV32 40

3.2.1 Xác định ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Keo lai BV32 41

3.2.2 Xác định ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Keo lai BV32 44

3.3 Nghiên cứu kỹ thuật ra rễ tạo cây hoàn chỉnh cây Keo lai BV32 46

3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ của

cây Keo lai BV32 46

3.3.2 Ảnh hưởng của hàm lượng α-NAA đến khả năng ra rễ của Keo lai BV32 48

3.4 Nghiên cứu kỹ thuật ra cây ngoài vườn ươm 50

Quy trình nhân giống Keo lai BV32 bằng phương pháp nuôi cấy mô 53

3.5 So sánh kết quả của đề tài với một số nghiên cứu khác ……… 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

A Kết luận 56

B Kiến nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC: XỬ LÝ SỐ LIỆU 60

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Keo lai đối tượng chính trong các chương trình trồng rừng sản xuất ở Nghệ An nói chung và huyện Thanh Chương nói riêng Vì vậy, nhu cầu nghiên cứu tuyển chọn giống mới cũng như nhân giống theo tiến bộ kỷ thuật nuôi cấy mô cho các loài keo lai, có ý nghĩa thực tiễn vô cùng lớn nhằm nâng cao năng suất, chất lượng di truyền, và đảm bảo tính an toàn sinh học của hệ sinh thái rừng trồng ở Việt Nam

Gần đây nhiều dòng Keo lai, có tiềm năng sinh trưởng và sức chống chịu đã được chọn lọc, và một số dòng keo lai đã được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật hoặc giống có triển vọng, bao gồm các giống AH1, AH7, TB1, TB11, BV10, BV32, AA1, AA9, Clt26, Clt7, Clt18, Clt57 của Keo lá tràm và keo tai tượng Đây là nguồn giống cây trồng quý, trong trồng rừng kinh tế của các tỉnh nòi chung và nghệ an nói riêng Đăc biệt là dòng 32 có nhiều đặc tính vượt trội trên đất đồi núi

Cho tới nay, để cung cấp giống cho trồng rừng, ở nhiều địa phương, phương pháp nhân giống chủ yếu là giâm hom hoặc ươm từ hạt, trong khi công nghệ nuôi cấy mô tế bào giúp tạo cây hoàn chỉnh với độ trẻ hoá và đồng đều cao, sinh sạch bệnh, thân dẻo và bộ rễ phát triển, để tạo lập rừng keo có năng suất cao, chất lượng tốt thì chưa thực sự được chú ý nhiều Trước đây, nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô cho một số giống keo đã được Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp; Trường đại học Lâm nghiệp tiến hành, song do cây rừng có chu kỳ sống dài ngày, hệ gen phức tạp, đặc điểm di truyền không đồng nhất giữa các giống nên phản ứng của kiểu gen với cùng một loại môi trường là rất khác nhau Chính vì vậy, nghiên cứu các giống keo mới luôn luôn cần thiết nhằm đưa nhanh kết quả nghiên cứu vào sản xuất

Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng

quy trình nhân giống keo lai (Acacia hybrid) BV32 bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro tại Trung tâm sản xuất cây giống chất lượng cao Bắc trung Bộ, huyện Thanh Chương, tinh Nghệ An”

2 Mục tiêu của đề tài

2.1 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống keo lai (Acacia hybrid) BV32 bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro nhằm tạo ra cây keo giống có chất lượng cao, sạch bệnh,

đồng đều với số lượng lớn so với phương pháp nhân hom, đáp ứng nhu cầu cây giống cho sản xuất lâm nghiệp, thuộc địa bàn huyện Thanh Chương nói riêng và tỉnh Nghệ An nói chung tại Trung tâm sản xuất cây giống chất lượng cao Bắc trung Bộ, huyện Thanh Chương, tinh Nghệ An

2.2 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

2.2.1 Ý nghĩa khoa học

Xác lập và hoàn thiện được quy trình nhân giống cây keo lai một cách tối ưu, bằng

phương pháp nuôi cấy mô in vitro, góp phần duy trì các đặc tính quý được thị trường người

trồng rừng ưa chuộng

Đánh giá được tác động của một số chất điều tiết sinh trưởng dòng BV32 và xây dựng

quy trình nhân giống Keo lai BV32 bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro

2.2.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tạo ra giống Keo lai BV32 sạch bệnh, đồng đều, chất lượng cao với sống lượng lớn phục vụ nhu cầu sản xuất lâm nghiệp

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc, phân bố và giá trị của cây Keo lai BV32

1.1.1 Nguồn gốc, phân bố của cây Keo lai BV32

Nguồn gốc; cây keo lai là tên gọi tắt của giống lai tự nhiên, giữa giống keo lá tràm và keo tai tượng

Keo (Acacia) là một chi thực vật, thuộc họ Đậu (Leguminosae), phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) Các loài keo Acacia có phân bố rộng khắp châu Á, châu Phi, châu Mỹ và châu

Đại dương, song chúng đặc biệt tốt ở châu Phi và Australia Theo đánh giá hiện nay, trên toàn

thế giới chi keo Acacia có khoảng 1200 loài, riêng Australia có tới 850 loài (Pedley, 1987)

[28] Trong đó hai loài keo lá tràm và keo tai tượng được sử dụng để tạo giống keo lai, đang được phổ cập rộng rại ở nghệ an , nhằm tao ra dòng keo lai BV32 để trồng rừng đại trà

Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) có nguồn gốc từ Australia, Papua New Guinea

và Indonesia, phân bố chủ yếu ở vĩ độ 8 - 160

Nam, ở độ cao 100 - 400 trên mặt biển, lượng mưa 1400 - 3400 mm/năm song có thể chịu được lượng mưa 500 - 1000 mm/năm (Doran & Turnbull, và cs, 1997) [21] Keo lá tràm thường có kích thước trung bình, thân ngắn, nhiều cành nhánh, sống trên các lập địa tốt, loài này có thể cao 30 m với đường kính

80 cm và thân thẳng đơn trục (Pinyopusarerk, 1990), gỗ có tỷ trọng 0,5 - 0,6, thậm chí 0,7

có thể dùng làm gỗ củi, làm giấy, làm gỗ xây dựng và gỗ đồ mộc (Cẩm nang ngành Lâm nghiệp, 2006) [2] Từ những năm 1960, Keo lá tràm đã được du nhập vào Việt Nam, cho đến nay đã trở thành một trong ba loài keo vùng thấp có diện tích trồng rừng lớn nhất (trên 90.000 ha, chiếm 4,5% tổng diện tích rừng trồng cả nước (Lê Đình Khả, 2003) [7] Đây là loài cây sinh trưởng nhanh, có khả năng thích lớn, khă năng cải tạo đất tốt và có tiềm năng bột giấy cao Đối với với keo lá tràm ở Việt Nam được trồng vào đầu những năm 1990 Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng, nay là Viện nghiên cứu giống và công nghệ sinh học lâm nghiệp đã khảo nghiệm một số dòng keo lai, từ keo lá tràm với keo tai tượng

Keo tai tượng (Acacia mangium) có nguồn gốc từ Australia, Papua New Guinea và

Indonesia, có phân bố chủ yếu ở vĩ độ 8 - 180

Nam, độ cao 300 m trên mặt biển, lượng mưa 1500 - 3000 mm/năm (Doran, Turnbull, và cs., 1997).[21] Keo tai tượng có thân cây thẳng, sinh trưởng nhanh hơn Keo lá tràm Gỗ Keo tai tượng có tỷ trọng 0,45 - 0,50, ở giai đoạn sau 12 tuổi có thể đạt 0,59 (Razali & Mohd, 1992), thích hợp cho sản xuất gỗ lớn, gỗ dán, ván dăm, làm giấy Hiện nay, loài keo này được trồng ở nhiều nơi phục vụ nguyên

liệu cho công nghiệp (Cẩm nang ngành Lâm nghiệp, 2006) [2] Keo tai tượng đã được du nhập vào Việt nam từ những năm 1960 Theo số liệu của Cục lâm nghiệp (nay là Tổng cục lâm nghiệp), tới năm 2006 diện tích rừng trồng Keo tai tượng ở nước ta là khoảng 100.000

ha Hàng năm diện tích trồng rừng của Keo tai tượng được dự đoán khoảng 15.000ha/năm (Cẩm nang ngành Lâm nghiệp, 2006) [2]

10.000-Keo lá tràm (A.auriculiformis) và 10.000-Keo tai tượng (A.mangium) là 2 trong số 4 loài keo vùng thấp (gồm cả Keo lá liềm A.crassicarpa và Keo nâu A.alaucocarpa) có diện tích

trồng rừng lớn nhất ở nước ta Có thể nói gần 40% diện tích trồng rừng ở vùng đồi thấp hiện nay là Keo lá tràm và Keo tai tượng (Cẩm nang ngành Lâm nghiệp, 2006) [2]

Keo lai (Acacia hybrid), tên gọi tắt của giống keo lai tự nhiên giữa Keo tai tượng và

Keo lá tràm được phát hiện đầu tiên vào năm 1972 ở Sabat - Malaixia

Ở việt nam các nhà nghiên cứu khoa học, đã chọn lọc và khảo nghiệm một số dòng Keo lai tự nhiên, giữa Keo tai tượng và Keo lá tràm có năng suất trung bình từ 17 - 35

m3/ha/năm, cao gấp 1,5 - 3 lần các loài cây bố mẹ (Lê Đình Khả & Đoàn Ngọc Dao, 2004) [8] Trong giai đoạn 1993 - 1999, một số giống keo lai tự nhiên đã được Trung tâm Khoa học sản xuất lâm nghiệp Đông Nam Bộ phối hợp với Trung tâm nghiên cứu Giống cây rừng chọn lọc và khảo nghiệm tại Trảng Bom với ký hiệu là TB (dẫn theo Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng, 2011) [18] Từ 1996 - 2000 và 2001 - 2005, đề tài “Nghiên cứu chọn các giống keo chống chịu bệnh có năng suất cao” (PGS.TS Nguyễn Hoàng Nghĩa) cũng đã chọn tạo được 2 dòng keo lai tự nhiên, ký hiệu là AH1 và AH7, có mẹ là keo lá tràm và bố là keo tai tượng, Rừng ở giai đoạn phát triển trưởng thành, cây có dáng thân thẳng, chiều cao dưới cành lớn, có sinh khối lớn khi đến tuổi khai thác Kích thước lá nhỏ và thưa (giống keo lá

tràm), dễ dàng tránh được sự xâm nhiễm của nấm Corticium salmonicolor, một loài nấm gây

bệnh phấn hồng rất nguy hiểm cho Keo tai tượng và Keo lai [18]

Keo lai đang được coi là giồng cây trồng chính ở nhiều nơi trong nước, đặc biệt là ở các tỉnh vùng Trung bộ và Đông Nam bộ (Lê Đình Khả, 1999) [6] Năm 1995, diện tích trồng Keo lai mới 160 ha thì đến cuối năm 2004 cả nước đã trồng hơn 100.000 ha (dẫn theo Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng, 2011) [18]

Cây Keo lai BV32 hiện nay đang được trồng tại vườn ươm cây đầu dòng của Trung tâm sản xuất cây giống chất lượng cao Bắc Trung Bộ - Công ty TNHH Thanh Thành Đạt tại xã Thanh Tùng, huyện Thanh Chương, tỉnh Nghệ An được mua từ Viện nghiên cứu giống và công nghệ sinh học lâm nghiệp (Địa chỉ: Phường Đức Thắng, quận Từ Liêm, Hà

Nội (đơn vị đã cho lai tạo tự nhiên thành công tại huyện Ba Vì, Hà Nội)) Mục đích của vườn ươm cây đầu dòng này là lấy mẫu (chồi) để tạo cây con bằng phương pháp nuôi cấy

mô và giâm hom

Riêng địa bàn tỉnh Nghệ An mỗi năm theo kế hoạch của UBND tỉnh giao, thì trồng khoảng 15.000 ha, trong đó trồng bằng cây keo lai là 50%, và trồng bằng cây keo hạt ngoại

là 50% Dòng keo lai BV32 được các tổ chức và hộ trồng rừng ưa thích, vì ngoài những đặc tính nổi trội chung của dòng keo lai, thì còn phù hợp với nhiều dạng lập địa khác nhau ở Nghệ An và thích ứng được với điều kiện khô hạn, đất đai bị xói mòn, rừng nghèo kiệt 1.1.2 Giá trị sử dụng

Keo lai không những cung cấp nguồn nguyên liệu đầu vào chủ yếu cho công nghiệp gỗ dăm, bột giấy mà với xu hướng trồng rừng kinh doanh cây gỗ lớn nó lại trở thành nguồn nguyên liệu “đầu vào” đắt giá cho ngành chế biến gỗ Khoảng 30% gỗ Keo lai dùng cho công nghiệp chế biến gỗ, đóng đồ mộc mỹ nghệ, hàng hóa xuất khẩu, xây dựng; Với yêu cầu của ngành công nghiệp chế biến gỗ cần chọn lọc những cây gỗ thẳng, kích thước lớn Phần còn lại các “phụ phẩm” như cành nhánh, cây nhỏ, cong queo thì tận dụng

để sản xuất bột dăm, bột giấy Ngoài ra, Keo lai còn được sử dụng để làm sàn gỗ, đóng và sản xuất pallet gỗ với các kích thước, độ dài ngắn khác nhau Sử dụng để giát giường, làm phản kê, copha, giàn giáo trong xây dựng, thanh chống lò than…

Là một loài cây trồng có năng suất cao, giá trị kinh tế lớn, Keo lai đang là mục tiêu trồng rừng cho đồng bào các dân tộc sống và kinh doanh từ rừng Ngoài tác dụng chính là lấy gỗ phục vụ lợi ích kinh tế; Keo lai còn có khả năng cải tạo đất, chống xói mòn, chống cháy rừng Giúp cải thiện được tiểu khí hậu, đất đai nơi trồng, che chắn hạn chế dòng chảy, trả lại 1 lượng cành khô lá rụng cho đất, có khả năng cố định đạm khí quyển trong đất nhờ các nốt sần ở hệ rễ

Bể chứa cácbon: Cũng như các loài cây khác; Keo lai BV32 cũng là loài thân gỗ nên nó cũng là một yếu tố để lưu giữ các bon trong các thành phần của cây Với cách tính của FCPF – Quỹ đối tác Cacbon trong lâm nghiệp (Dự án hỗ trợ chuẩn bị sẵn sang thực hiện REDD+ ở Việt Nam) thì 1ha rừng trồng có thể hấp thụ được 90 tấn CO2; với đơn giá cacbon hiện hành của Ngân hàng thế giới mua được là 5 USD; Mỗi năm tỉnh Nghệ An trồng 15.000 ha Trong đó, có 5.000 ha trồng mới và 10.000 ha trồng lại sau khai thác thì, tỉnh Nghệ An mỗi năm ngoài giá về gỗ, môi trường, phủ xanh đất trống đồi núi trọc … thì còn có thể đem về 5000 x 90 x 5= 2.250.000 USD

Cây Keo lai BV32 phát triển nhanh, độ bền cơ học dẻo dai, có thể thích nghi với thời tiết khắc nghiệt, độ cong vênh thấp hơn so với một số loại gỗ khác nên rất được ưa chuộng Các sản phẩm từ gỗ Keo lai BV32 đã trở nên quen thuộc với người dân Việt Nam Những đặc tính ưu việt và tác dụng của dòng Keo lai với đời sống người dân là nguyên nhân, điều kiện để mở rộng diện tích dòng Keo lai BV32 hiện nay

Bảng 1 Số liệu trung bình vỏ, giác, lõi (Viện khoa học LN Việt Nam) [28]

Bảng 2 Đặc điểm cây gỗ đứng [27]

1.2 Đặc điểm sinh học và phân loại của keo lai BV32

1.2.1 Đặc điểm hình thái:

 Thân, tán , lá: Cây gỗ cao đến 25-30m, đường kính 60-80cm Thân gỗ thẳng, tròn đều, tán phát triển cân đối, màu vàng trắng có vân, có giác lõi phân biệt Lá có 3-4 gân mặt chính, hình mác

 Hoa, quả, hạt: Hoa lưỡng tính mọc cụm, màu trắng hơi vàng, mọc ở nách lá [8]

1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh thái :

 Tốc độ sinh trưởng: nhanh, là cây ưa sáng, chủ yếu trồng trên đất xám, đất feralit Chịu được khô hạn, nhiệt độ trung bình Độ cao khoảng từ 500-800m so với mực nước biển, độ dốc thấp

 Cây keo lai BV32 thuộc:

Họ đậu (Fabaceae) Phân họ trinh nữ (Mimosoideae) Chi (Acacia)

Loài (Acacia auriculiformis x Acacia mangium)

 Cây có khả năng cải tạo đất, chống xói mòn, chống cháy rừng Gỗ thẳng, có tác dụng nhiều mặt: kích thước nhỏ làm nguyên liệu giấy, kích thước lớn sử dụng trong xây dựng, đóng đồ mộc mỹ nghệ, hàng hóa xuất khẩu

 Là chi thực vật thuộc họ đậu, rễ có nhiều nốt sần cố định đạm, lá rụng xuống nhanh phân giải, có tác dụng cải tạo và nâng cao độ phì cho đất rừng [8]

Hình 1.1 Cây keo trong vườn ươm và khi khai thác

1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ Keo lai trong và ngoài nước

Với đặc tính nổi bật: sinh trưởng, phát triển nhanh, phù hợp nhiều loại lập địa, có tính năng cải tạo đất nhờ hệ rễ có nốt sần, chu kỳ kinh doanh ngắn nên hiện nay trên thế giới các giống keo; đặc biệt là các dòng Keo lai đang rất được ưa chuộng trong kinh doanh nghề rừng

Keo chủ yếu kinh doanh với chu kỳ ngắn nên gỗ keo được sử dụng để chế biến sơ cấp và tiêu thụ cho công nghiệp như bột giấy và giấy, gỗ xẻ, gỗ dán, ván nhân tạo, cũng như gỗ tròn dùng trong xây dựng và nông nghiệp Tuy nhiên hiện nay với xu hướng kinh doanh cây gỗ lớn thì Keo đang là một trong những mục tiêu để xây dựng rừng cây gỗ lớn phục vụ cho ngành công nghiệp chế biến các sản phẩm từ gỗ nguyên khối

1.3.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ Keo lai trên thế giới

Hiện nay trên thế giới gỗ keo được chế biến sơ cấp và tiêu thụ cho công nghiệp như gỗ dăm, bột giấy và giấy, gỗ xẻ, ván nhân tạo…

Nhu cầu Thế giới về gỗ dăm cũng như tiêu thụ giấy ngày càng tăng mạnh, ít nhất trong vòng 45 năm nữa Nhu cầu tăng, nhưng khả năng đáp ứng gỗ dăm từ rừng tự nhiên bị giảm, phải thay thế bằng rừng trồng Tình hình này tạo ra cơ hội lớn cho các nước có thị trường gỗ và sản phẩm gỗ rừng trồng Công nghiệp bột giấy sẽ là ngành sử dụng chính gỗ rừng trồng, nhưng các ngành công nghiệp gỗ xẻ, ván nhân tạo cũng sẽ sử dụng nguồn nguyên liệu này rất nhiều [27]

* Thị trường bột và giấy

Thị trường bột giấy của Châu á năm 2009 là 3,2 triệu tấn/năm Có rất nhiều dự án được xây dựng ở châu lục này, có khả năng năng suất tăng lên đến 11 triệu tấn Các nhà sản xuất Indonexia là những người sản xuất bột giấy lớn nhất trong vùng, nhờ bảo đảm về nguyên liệu và có chi phí sản xuất thấp nhất trong vùng [28] Tuy nhiên chi phí gỗ nguyên liệu ở Indonexia sẽ tăng lên do nguồn gỗ tự nhiên cạn kiệt, phải chuyển sang gỗ rừng trồng đắt hơn hoặc phải nhập khẩu gỗ dăm, đó là cơ hội cho các nhà máy bột giấy của Việt Nam

(có quy mô thế giới) cạnh tranh Trung Quốc và Nhật Bản là 2 nước lớn trong vùng cần phải nhập khẩu bột giấy; đặc biệt, Nhật Bản cần nhập khẩu một khối lượng lớn gỗ dăm cho ngành sản xuất bột giấy trong nước; ngoài ra các nước châu á còn lại đều tự cân đối được [22]

* Thị trường gỗ dăm (gỗ cứng)

Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan chiếm 98% thị phần buôn bán gỗ dăm (gỗ cứng)

ở vùng châu á- Thái bình dương [19]

Nhật Bản đã nhanh chóng chuyển hướng sang chính sách đa dạng các nhà cung cấp

gỗ dăm Tỷ trọng thị phần của Úc trong thị trường dăm gỗ Nhật Bản đã sụt giảm thảm hại,

Mỹ cũng đã bị giảm thị phần do có giá bán cao Điều này cũng chứng tỏ rằng các công ty Nhật Bản muốn mua dăm gỗ nhiều hơn từ các nguồn khác nhau (16 nước xuất khẩu gỗ dăm vào Nhật năm 2000) Tổng mức tiêu thụ giấy của Nhật Bản tăng lên từ 30,3 triệu tấn năm 1999 lên 38,3 triệu tấn vào năm 2010 [28] Gỗ dăm nhập khẩu là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất bột giấy và nhu cầu nhập khẩu bột giấy cũng sẽ tăng Các nhà sản xuất bột và giấy Nhật Bản đã ưu tiên cho dăm gỗ cứng từ rừng trồng vì có chất lượng cao và không nhạy cảm với vấn đề môi trường như dăm gỗ rừng tự nhiên [27]

Trung Quốc: Nhu cầu về bột gỗ tăng mạnh vì sự tăng trưởng nhu cầu nói chung và

xu hướng thay thế gỗ bằng ván sợi Tuy nhiên, một phần lớn sự tăng trưởng này phải dựa vào nhập khẩu trực tiếp bột giấy và phần còn lại dựa vào rừng trồng trong nước Trung Quốc vẫn kỳ vọng trở thành nhà xuất khẩu dăm gỗ [27]

Đài Loan: Trong tương lai việc gia tăng sản lượng bột giấy của Đài Loan là không thuận lợi do sự hạn chế về môi trường, bất kỳ sự mở rộng nào cũng kém hấp dẫn Trong thập kỷ sau nhu cầu bột gỗ cứng không có hy vọng tăng nhiều, do đó việc nhập khẩu gỗ dăm vẫn tiếp tục để cung cấp cho nhu cầu khổng lồ về gỗ bột giấy của Đài Loan [28]

Indonexia: Sản lượng sản xuất bột giấy tiếp tục tăng, mặc dầu đã chậm lại trong

những năm 1990 và giá trị của việc sử dụng hỗn hợp bột gỗ cứng rừng nhiệt đới sẽ giảm dần Sự cần thiết nhập khẩu của In-đô-nê-xia sẽ phụ thuộc vào tính hiệu quả của chương trình trồng rừng keo, nếu đáp ứng nhu cầu Sự thiếu hụt cũng xảy ra như trong vùng và sẽ phải nhập khẩu bột gỗ Đó là nguyên nhân làm cho chi phí sản xuất bột của họ tăng, làm giảm tính cạnh tranh về chi phí hiện nay trong xuất khẩu [28]

1.3.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ keo lai ở việt nam

Rừng trồng Việt Nam đang ngày càng có xu hướng Keo hóa Khoảng 80% diện tích rừng trồng hàng năm là Keo các loại trong đó có khoảng 40%

là Keo lai Như vậy diện tích Keo lai khá lớn Tuy nhiên việc sử dụng giống Keo lai sản xuất bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào là rất hạn chế do chi phí thiết bị công nghệ để nuôi cất mô cao, nên giá thành cây con cao không phù hợp với nhu cầu của người dân trồng rừng Hiện nay, tỉnh Nghệ An chỉ mới xây dựng được một mô hình trồng rừng kinh doanh cây gỗ lớn 5 ha tại huyện Thanh Chương Đồng thời chỉ mới sử dụng dòng Keo lai mô BV32 để trồng vườn đầu dòng làm nguyên liệu tạo giống

Về tình hình tiêu thụ gỗ nguyên liệu từ cây Keo: Theo kinh nghiệm của các nước

đã có ngành sản xuất gỗ nhân tạo phát triển, sản xuất ván dán có chiều hướng giảm mạnh

do khó khăn về nguyên liệu Nhưng sản xuất các loại ván dăm, ván sợi ngày càng gia tăng Loại ván này có nhiều thuận lợi hơn về mặt nguyên liệu, nếu sản xuất đồ mộc, mức hao phí chỉ từ 5%-20% nên tỷ lệ thành khí cao hơn gỗ tự nhiên

Sản phẩm ván dăm có mặt ở Việt Nam (dạng sản phẩm sản xuất thử) có

từ năm 1994 nhưng không tiêu thụ được, mặt khác chưa có cơ sở nào có máy móc thiết bị để chế biến Đến những năm 1995, 1996 việc sử dụng ván dăm làm nguyên liệu để sản xuất đồ mộc, trang trí nội thất bắt đầu tăng nhanh và ngày càng sử dụng rộng rãi Trong tổng số sản phẩm chế biến gỗ năm 2009, sản phẩm chế biến từ ván dăm chưa được chú ý nhiều nên chỉ chiếm 25% [3] Năm 2009 Việt Nam hiện có 5 nhà máy sản xuất ván dăm quy mô nhỏ với tổng công suất thiết kế 23.000 m3SP/năm, thực tế mới chỉ đạt trên 50% công suất Đến nay nhiều nhà máy đã mọc lên trên nhiều miền quê của cả nước, thị trường sản phẩm ván dăm gồm nhiều thành phần kinh tế tham gia Đặc biệt từ khi có chủ trương đóng cửa rừng tự nhiên của Chính phủ, sản phẩm ván dăm

đã tận thu được nguyên liệu phế thải Sản xuất sản phẩm ván dăm đã thúc đẩy

sự phát triển của ngành chế biến đặc biệt là các làng nghề, tạo công ăn việc làm và tăng thu nhập cho người lao động Các cơ sở sản xuất đồ gia dụng sử

dụng đa dạng các loại sản phẩm trong nuớc cũng như nước ngoài Nhu cầu sử dụng gỗ ván dăm của các cơ sở tăng lên qua các năm Người tiêu dùng đã chấp nhận sản phẩm ván dăm trong sản xuất và gia công sản phẩm, 82% cơ sở

đã có ý kiến là ưa thích loại sản phẩm này, số ý kiến không ưa thích chỉ có 18% Các sản phẩm bàn máy tính, bàn học sinh, bàn làm việc và các loại tủ chiếm được niềm tin của người tiêu dùng bởi tính thích ứng về giá cả, sự tiện

nghi và thuận tiện trong hoạt động của cơ quan và sinh hoạt gia đình [3]

Khối lượng ván dăm cung cấp cho nhu cầu tiêu dùng tại Việt Nam gồm hai nguồn chính là sản xuất trong nước và nhập từ nước ngoài

* Tình hình sản xuất ván dăm trong nước

Khối lượng ván dăm sản xuất ở Việt Nam chủ yếu của 13 công ty (Hà Nội 6 công

ty, Bình Dương 1 công ty; Hải Phòng 2 công ty, Đồng Nai 2 công ty, TP Hồ Chí Minh 2 công ty) Ngoài ra còn có một số dây truyền sản xuất với công suất nhỏ chiếm một tỷ lệ không nhiều của các cơ sở tư nhân

* Tình hình xuất khẩu ván dăm

Xuất khẩu dăm gỗ bạch đàn và gỗ keo lai Việt Nam đã tăng gấp hơn 10 lần trong một thập kỷ vừa qua Năm 2001, cả nước chỉ xuất khẩu 400.000 tấn dăm gỗ nhưng đến năm 2011, đã tăng thêm 5 triệu tấn so với khởi điểm Lượng xuất khẩu trong năm 2011 cao hơn 36% so với năm 2010 và tăng gấp

ba lần kể từ năm 2007 Đây là một bước tiến lớn trong ngành công nghiệp chế biến xuất nhập khẩu nguyên liệu gỗ của Việt Nam [3]

1.4 Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào và ứng dụng trong nhân giống vô tính cây trồng

1.4.1 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là lĩnh vực nuôi cấy các nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các Vi sinh vật trong môi trường nhân tạo, trong điều kiện vô trùng Cở sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20 nhà sinh lý thực vật người Đức Haberlandt (1902)

đã phát biểu tính toàn năng của tế bào như sau:

Mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh [4]

Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Cho đến nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh

từ một tế bào riêng rẽ Trong nuôi cấy in vitro, tế bào thực vật thể hiện tính toàn năng

thông qua sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) [1] Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, các cơ quan có chức năng khác nhau Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau Tế bào phôi sinh -> tế bào giãn -> tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với dự phân hóa tế bào

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân

tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa [1]

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô

+ Ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng

Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy cây lâm nghiệp Chúng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực

vật in vitro Hiệu quả tác động của các chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ

sử dụng, hoạt tính vốn có của chất điều hoà sinh trưởng, loại mẫu nuôi cấy, [10]

Các chất điều hoà sinh trưởng bao gồm hai nhóm chính là Auxin và Cytokinin Tỷ

lệ, hàm lượng hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng này trong môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ định hướng cho sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy khác nhau.[15]

- Nhóm Auxin: Được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng

và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích

sự hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh sinh phôi vô tính

Một số loại Auxin thường dùng trong nuôi cấy: IAA ( Indole acetic acid); IBA (Indole butyric acid); 2.4-D (2.4 - Dichlorophenoxy acetic acid); α-NAA (α-Naphthaleneacetic acid) [9]

Các Auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, phạm vi sử dụng từ 0,1 - 1mg tuỳ theo mục đích và vật liệu nuôi cấy Auxin được thêm vào sẽ kết hợp với các auxin nội sinh để điều khiển chiều hướng và cường độ các quá trình sinh trưởng Tuỳ theo loại Auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của Auxin là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo [14]

- Nhóm Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng

của chồi in vitro Các Cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sinh trưởng của mô sẹo,

nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy Vì thế, trong giai đoạn đầu của phát sinh phôi soma, sự có mặt auxin là cần thiết nhưng trong giai đoạn sau của phôi phải được nuôi cấy trong môi trường có Cytokinin để biệt hóa chồi [3]

Một số loại Cytokinin thường dùng trong nuôi cấy: Zeatin; Kinetin; BAP,…Hàm lượng sử dụng các loại Cytokinin giao động từ 0,1-2,0mg/l Ở những nồng độ cao hơn, Cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy Ngược lại, ở nồng độ thấp hơn, Cytokinin biểu hiện hiệu quả kích thích kém, dẫn đến sự tạo chồi và sinh trưởng của chồi giảm [12]

Trong nuôi cấy các loại mẫu chỉ cần Auxin hoặc Cytokinin, hoặc không cần cả hai Còn đa số các trường hợp phải sử dụng phối hợp cả Auxin và Cytokinin ở những tổ hợp tỉ

lệ khác nhau [3] Theo Bhojwani(1980) ở một số loài, môi trường nuôi cấy chỉ có một loại Cytokinin cũng cho hệ số tạo chồi cực đại Với các cây ngũ cốc sự phối hợp của hai hay nhiều loại Cytokinin cho kết quả tốt hơn khi sử dụng Cytokinin riêng rẽ Tuy nhiên, muốn

có tương quan sinh trưởng tối ưu thì phái có cân bằng hormone thích hợp Sự biệt hóa cơ

quan thực vật in vitro là kết quả tác động qua lại giữa hai nhóm Auxin và Cytokinin Tỷ lệ

Auxin/Cytokinin cao sẽ kích thích sự tạo thành rễ, ngược lại sẽ đẩy mạnh sự biệt hóa chồi, còn nếu tỷ lệ đó là trung bình thì mô sẹo được hình thành Vì thế mỗi loại mô ở từng giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì tổ hợp nồng độ giữa Auxin và Cytokinin là rất quan trọng [3]

Ngoài hai nhóm chính là Auxin và Cytokinin, trong nuôi cấy người ta còn sử dụng thêm các chất điều hoà sinh trưởng khác như GA (thông dụng nhất là GA3), ABA, Etylen,…Sự có mặt của GA3 trong môi trường nuôi cấy sẽ tăng cường quá trình vươn thân của chồi và tạo cây hoàn chỉnh ở một số loài thực vật Tuy nhiên đối với một số đối tượng thì việc bổ sung GA3 là không cần thiết vì nó ảnh hưởng xấu đến sự hình thành chồi bất định, sự tạo rễ và phát sinh phôi ABA chỉ được sử dụng trong nuôi cấy nhằm kìm hãm sự

sinh trưởng của chồi, tham gia bảo quản lương thực và quỹ gen in vitro Trong nuôi cấy

phôi, việc bổ sung ABA vào môi trường nuôi cấy là cần thiết vì ABA giúp phôi chống lại

sự khô hóa [16]

+ Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy lên khả năng tái sinh cây

Mẫu dùng cho nuôi cấy mô keo lai BV32 và các dòng cây keo lai nói chung, phổ biến và thuận lợi nhất, là mô nuôi cấy lấy ở thân, cành, chồi non Nên sử dụng mô ở đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách, hoặc có thể là đoạn thân non Để chọn mẫu mô nuôi cấy còn phải quan tâm chú ý vào, trạng thái sinh lý hay tuổi của mẫu mô non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh mô non trẻ mới hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn

Bên cạnh đó, chất lượng của mẫu cấy phụ thuộc vào chất lượng của cây cho mẫu, thường người ta lấy mẫu từ những cây có những đặc điểm ưu việt cần quan tâm: Sinh trưởng, phát triển mạnh, chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi (hạn, lạnh, mặn,…), không bị sâu bệnh Mẫu cấy phải được khử trùng trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy

1.4.3 Kỹ thuật nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô

a Giai đoạn chuẩn bị:

Đây là bước đầu tiên của quy trình nhân giống Tùy theo điều kiện, giai đoạn này kéo dài từ 3-6 tháng Giai đoạn này gồm các khâu như:

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy cơ bản: Môi trường nuôi cấy cơ bản được sử dụng

là môi trường Murashige – Skoog, 1962 (MS) Thành phần môi trường cơ bản MS được sử dụng trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật:

ZnSO4.7H2O

H3BO3

KI NaMoO4.2H2O CuSO4.5H2O CaCl2.6H2O

37,26 27,80 16,90 8,60 6,20 0,83 0,25 0,025 0,025

Vitamin

Glycine Myo_inositol Nicotinic acid Pyridocine Thiamine

2

100 0,5 0,5 0,4

Các chất hữu cơ Saccarose

Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao trong ống nghiêm, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của cây mẹ

- Chọn chế độ khử trùng thích hợp đảm bảo mẫu cấy bị nhiễm là thấp nhất, đồng thời khả năng sinh trưởng và phát triển tốt Phương pháp vô trùng mẫu cấy dùng để khử trùng là cồn 70%, HgCl2 Nồng độ chất khử trùng được chọn trên cơ sở thực tiễn thí nghiệm Thời gian khử trùng được xác định tùy vào loại mô, loài cây Tuy nhiên, thời gian khử trùng đối với mô non ngắn hơn so với mô già

b Giai đoạn khởi động mẫu cấy

Sau khi khử trùng, người ta đưa mẫu cấy vào nuôi cấy in vitro trên môi trường dinh

dưỡng nhân tạo thích hợp để tái sinh mô cấy Môi trường này được xác lập cho từng loại cây, loại mô nuôi cấy Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc vi rút sẽ được lưu giữ ở phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy ban đầu sẽ xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chỗi, rễ) hoặc các phôi vô tính gần như phôi hữu tính Đây sẽ là những vật liệu khởi đầu để cho quá trình nhân nhanh tiếp đó

c Giai đoạn nhân nhanh

Khi mẫu cấy sạch bệnh đã được tạo ra và từ đó nhân được các cụm chồi, các phôi

vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn nhân nhanh Người ta cần thu được tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu này Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường kéo dài trong khoảng 1-2 tháng tùy mỗi loại cây

d Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Các chồi hình thành trrong quá trình nuôi cấy có thể tự phát sinh rễ, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ Ở giai đoạn này phải tạo cây trong ống nghiệm phát triển cân đối về thân, lá, rễ để đạt tiêu chuẩn của một cây giống [4]

e Giai đoạn ra cây

Đây là giai đoạn đánh giá tính hiện thực của quá trình nhân giống in vitro khi

chuyển cây từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên Khi đưa ống nghiệm ra ngoài vườn ươm, nhằm giảm đi hiện tượng “sốc’’ do thay đổi môi trường cần có giai đoạn thích nghi Quá trình thích nghi với điều kiện ngoại cảnh của cây yêu cầu phải chăm sóc đặc biệt, do đó ở giai đoạn này cần chủ động để điều khiển được quá trình chiếu

sáng, dinh dưỡng và giữ nước cũng như lựa chọn các giá thể thích hợp vào trong điều kiện cách ly sạch bệnh để cây con đạt tỷ lệ sống cao

1.4.4 Ưu điểm và hạn chế của nhân giống in vitro

* Ưu điểm

- Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kỳ đều có thể tạo

ra một quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền

- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây trong vòng 1-2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây

- Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp

- Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống

- Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp

hữu hiệu để loại trừ virus, nấm, vi khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh

Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15 - 30% so với giống gốc

- Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm

khác nhau có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống như cây con in vitro (trong

ống nghiệm) hoặc trong bầu đất Các cây giống có thể được bán ở dạng cây,

củ bi hay là thân củ

- Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển

đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng

được xác nhận là sạch bệnh Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các qui định

- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen Nhiều vấn

đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn

chưa được giải đáp

- Chi phí sản xuất cao: Phải có đủ cơ sở vật chất kỷ thuật; nguồn giống đầu dòng, phòng thí nghiệm đảm bảo đầy đủ trang thiết bị; Có đội ngũ cán bộ khoa học kỷ thuật, am hiểu lĩnh vực chuyên môn về nuôi cấy mô Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt

- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền

1.5 Tình hình nuôi cấy mô cây Keo

1.5.1 Một số công trình nghiên cứu nuôi cấy mô Keo ở nước ngoài

Cho tới nay, đã có rất nhiều loài Keo đã được nghiên cứu nuôi cấy mô thành công

Có thể kể đến một số công trình của các tác giả: A albida (Duhoux E và cộng sự, 1985;

Ahee J và cộng sự, 1994; Gassama Y K và cộng sự, 1986, 1987, 1989, 1992; Ruredzo và

cộng sự, 1993; .); A bivenosa (Jones và cộng sự, 1990); A catechu (Rout và cộng sự, 1995; Kaur và cộng sự, 1997;); A ligulata (Williams và cộng sự, 1985), A senegal (Kathju

và Tewari, 1973; Badji và cộng sự, 1993; Palma và cộng sự, 1994, 1996; ); A nicolata

(Marthur và Chandra, 1983; Dewan và cộng sự, 1992; Gupta và cộng sự, 1992; Singh và

cộng sự, 1993; Garg và cộng sự 1996 ); A hybird (Crawford và Hartney, 1987; Darus -

Haji và cộng sự, 1992; Nor Asmah H và cộng sự, 2012; ); [21]

Năm 1989, Mittal và cộng sự [20] đã nuôi cấy mô cho Keo lá tràm (Acacia

Những chồi này được cấy chuyển sang môi trường bổ sung (10-7M) IAA hoặc (10-6

- 10-7M) NAA để thử nghiệm ra rễ Kết quả cho thấy môi trường nhân chồi thích hợp cho Keo lá tràm là B5 bổ sung 5% nước dừa và (10-6

M) BAP (tỷ lệ hình thành chồi đạt 76%, có 2-3 chồi/cụm) Hiệu quả ra rễ với NAA là tốt hơn so với IAA Mẫu được nuôi trong môi trường B5 bổ sung (10- 6

M)NAA sau 75 ngày cho tỷ lệ ra rễ cao nhất với 24%, rễ khỏe

Năm 1999, Gerard và cộng sự đã nghiên cứu tái sinh chồi Keo tai tượng bằng cách nuôi cấy mô từ hạt, kết quả cho thấy môi trường DKW bổ sung BAP và thidiazuron hoặc N-(2-chloro-4-pyridyl)-N-phenylurea thích hợp cho quá trình nhân chồi Đồng thời, tác giả cũng khẳng định môi trường ra rễ thích hợp khi bổ sung 3 hoặc 6% đường và 30,0 mg/l 2,4-D [19]

Shukor (2000) đã khẳng định chỉ cần nồng độ BAP rất thấp (0,1 - 0,5 mg/l) đã có

thể hình thành chồi ở Keo lá tràm (Acacia auriculiformis), và môi trường nhân nhanh chồi

cho Keo lá tràm thích hợp là MS bổ sung 0,5 mg/l GA3 và 0,02 mg/l NAA cùng 0,25 mg/l

BAP, trước khi tiến hành ra rễ in vitro, các chồi được nuôi trong môi trường MS bổ sung

2,0 mg/l IBA và 1,0 mg/l NAA [25]

Năm 2000, Deyu Xie và Yan Hong đã nghiên cứu nhân giống Keo tai tượng bằng nuôi cấy mô bằng các bộ phận: phôi mầm, lá non, cuống lá, thân Môi trường nuôi cấy cơ bản phù hợp là môi trường MS bổ sung 9,05 µM 2,4-D và 13,95 µM Kn Môi trường nhân chồi thích hợp

là môi trường MS bổ sung 4,55 µM TDZ và 1,43 µM IAA Môi trường nâng cao chất lượng chồi trước khi tiến hành ra rễ thích hợp là môi trường MS bổ sung 0,045 µM TDZ và 7,22 µM GA3

Môi trường ra rễ thích hợp là môi trường MS có bổ sung 10,75 µM NAA và 2,33 µM Kinetin [26]

Năm 2002 - 2003 Rashmi Nanda và cộng sự cũng đã nghiên cứu và thấy môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l BAP, 1,0 mg/l GA3 và 0,05 mg/l IAA là môi trường nuôi cấy cơ bản cho Keo tai tượng; Khi bổ sung vào môi trường MS 1,5 mg/l BAP, 0,05 mg/l IAA và 100 mg/l Adenine sulfate (Ads) thì tỷ lệ chồi thu được tăng cao (1 đến 8 chồi phụ thuộc vào nồng độ được điều chỉnh) Môi trường ra rễ thích hợp là ½ MS có bổ sung 0,5 mg/l IBA hoặc 0,5 mg/l IAA và 20g/l đường sau chu kỳ nhân chồi 13 - 14 ngày [21]

Rashmi Nanda và các cộng sự (2004) đã nghiên cứu nhân giống mô cho cây Keo tai tượng 10 tuổi và đã thành công trong điều kiện nuôi cấy ở 16 h sáng / 8 h tối bằng ánh sáng đèn Neon ở cường độ ánh sáng 50 μE m–2 s–1 trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 2 °C, và độ ẩm 55% Kết quả cho thấy hệ số nhân có thể đạt 8 lần và ra rễ trong 13-14 ngày Môi trường cơ bản trong nhân giống mô Keo tai tượng đã được các tác giả này xác định là môi trường MS + BAP (1,0 mg/L) + GA3 (1,0 mg/L) + IAA (0,05 mg/L), môi trường nhân chồi

MS + BAP (1,5 mg/L) +IAA (0,05 mg/L) + 100 mg/L adenine sulfate (Ads)

và môi trường ra rễ là 1/2MS + IBA hoặc IAA (0,5 mg/L) + 20 g/L đường sucrose [22]

Mullin và cộng sự (1997) đã thành công trong việc tái sinh chồi từ lá

cây Bạch đàn E camaldulensis, môi trường được tác giả sử dụng là môi

trường cải tiến từ môi trường của Muralidharan và Mascarenhas (1987) có bổ sung 1,0 g/l Casein, 16,2 µmol/l NAA, 0,44 µmol/l BAP, 50g/l đường và 0,5% Phytagar Theo Ho và cộng sự (1998), môi trường MS bổ sung 16,2 µmol/l NAA và 4,44 µmol/l 6-BAP có thể kích thích tạo mô sẹo và tái sinh

chồi ở Bạch đàn E camaldulensis (dẫn theo Roberson Dibax và cộng sự,

2005) [23]

Theo Sascha L Beck and Robert W Dunlop, 2001 Cho tới nay, đã có rất nhiều loài Keo đã được nghiên cứu nuôi cấy mô thành công Có thể kể đến

một số công trình của các tác giả: A albida (Duhoux E và cộng sự, 1985;

Ahee J và cộng sự, 1994; Gassama Y K và cộng sự, 1986, 1987, 1989, 1992;

Ruredzo và cộng sự, 1993; .); A bivenosa (Jones và cộng sự, 1990); A

catechu (Rout và cộng sự, 1995; Kaur và cộng sự, 1997;); A ligulata

(Williams và cộng sự, 1985), A senegal (Kathju và Tewari, 1973; Badji và cộng sự, 1993; Palma và cộng sự, 1994, 1996; .); A nicolata (Marthur và

Chandra, 1983; Dewan và cộng sự, 1992; Gupta và cộng sự, 1992; Singh và

cộng sự, 1993; Garg và cộng sự 1996 .); A hybird (Crawford và Hartney,

1987; Darus - Haji và cộng sự, 1992; Nor Asmah H và cộng sự, 2012; ); [24]

1.5.2.Một số công trình nghiên cứu nuôi cấy mô Keo ở Việt Nam

Keo lai là một trong những loài cây trồng rừng chính ở Việt Nam Không chỉ trồng rừng tập trung mà cả trồng cây phân tán, trồng cây trong các hộ gia đình Để tạo giống keo cho năng suất cao, phù hợp với điều kiện sinh thái vùng trồng rừng các nhà khoa học đã nghiên cứu, chọn tạo, khảo nghiệm và nghiên cứu phương thức nhân giống phù hợp nhất

Năm 1992, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã phối hợp với một số cơ sở sản xuất khác tiến hành chọn lọc những dòng keo lại tốt nhất, nhân giống sinh dưỡng và khảo nghiệm tại Ba Vì và Đông nam Bộ

Năm 1995, Hội đồng khoa học của bộ lâm nghiệp (cũ) đã tổ chức đánh giá các dòng keo lai vô tính tại Ba Vì Hội đồng đã khuyến nghị đưa một số dòng vào trồng khảo nghiệm ở một số vùng sinh thái trong nước Các dòng khảo nghiệm gồm: BV5, BV10, BV16, BV32, BV33 Kết quả cho thấy các dòng này đều sinh trưởng và phát triển tốt trên các vùng sinh thái khác nhau [3]

Hiện nay ở Việt Nam, nuôi cấy mô phân sinh phối hợp với giâm hom tạo thành công nghệ mô-hom đang được dùng để nhân nhanh giống cho một số loài cây trồng rừng chủ yếu Đến nay có nhiều cơ sở nuôi cấy mô và giâm hom cho cây rừng đang hoạt động

có kết quả, đã xây dựng các công nghệ nhân giống và trực tiếp sản xuất hàng triệu cây hom

và cây mô một số loài làm vật liệu trồng rừng Những cơ sở này bao gồm cả các cơ quan

nghiên cứu và cơ quan sản xuất như Trung tâm Nghiên cứu Giống cây Rừng (Bạch đàn lai, Lát hoa, Bao đồng, Tếch, Trầm hương…) Trung tâm Khoa học và Sản xuất Lâm nghiệp Đông Nam Bộ (Keo), Xí nghiệp giống Thành phố Hồ Chí Minh (Bạch đàn, Keo), Nông lâm trường thực nghiệm Yên Lập – Quảng Ninh (Bạch đàn, Keo) Ngoài ra, nhiều cơ sở sản xuất lâm nghiệp ở các tỉnh đã nhân giống hom hàng loạt cho các dòng Keo lai và đang bước đầu nuôi cấy mô có hiệu quả

Riêng Trung tâm nghiên cứu Giống cây rừng thuộc Viện KHLN Việt Nam, sau khi nhân giống cho các dòng Keo lai tự nhiên và Bạch đàn cao sản bằng công nghệ mô- hom thành công, đã chuyển giao công nghệ này và giống gốc cho một số cơ sở trong nước và trao đổi với nước ngoài Trung tâm đã nuôi cấy mô thành công cho một số cây rừng chủ lực khác như: Phi lao, Keo tai tượng, Keo lá tràm, Bao đồng, Tếch, Trầm hương, Lát hoa…và cũng là đơn vị đầu tiên nhân giống thành công cho Keo dậu lai KX2, Chè đắng, cũng như các loài cây kinh tế, các loài qúy? hiếm khác như: Thông Caribe, Sao, Dầu, Bách xanh, Bách tán…[3]

Các tác giả Đoàn Thị Mai, Nguyễn Thị Mỹ Hương, Vũ Thị Ngọc, Trần Thanh Hương, Văn Thu Huyền thuộc Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã tiến hành nhân giống các dòng keo lai BV71, BV73, BV75 mới chọn tạo bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào Công thức được áp dụng giống như các dòng keo lai khác Hoá chất để khử trùng thích hợp là HgCl2 nồng độ 0,1% Thời gian khử trùng là 8 phút Môi trường nhân chồi:MS*(cải tiến) + BAP 1,5 mg/l cho cả 3 dòng, hệ số nhân đạt 7,5 đến 8,2 chồi/ cụm Môi truờng ra rễ:1/2 MS* (cải tiến) + IBA 1,5 mg/l tỷ lệ ra rễ đạt từ 89,45% đến 92,27% Trong giai đoạn nhân chồi có thể phối hợp giữa IBA 1,5 mg/l +NAA 0,5mg/l để nâng cao chất lượng chồi Tỷ lệ sống của cây đạt trên 90% cho cả 3 dòng [13]

Đoàn Thị Mai và cộng sự nhân nhanh một số giống keo lai nhân tạo Công thức khử trùng thích hợp cho dòng Keo lai nhân tạo là HgCl2 với nồng độ 0,1% và thời gian khử trùng 10 -12 phút Theo cách này, thu được 48,15% mẫu sạch và 19% số mẫu có chồi Môi trường nhân chồi thích hợp cho dòng Keo lai nghiên cứu là MS* có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l Môi trường tiền ra rễ hay môi trường nâng cao chất lượng chồi cho các dòng nghiên cứu là môi trường MS2* có bổ sung BAP nồng độ 1,5mg/l kết hợp với NAA nồng

độ 0,5mg/l Môi trường tạo rễ thích hợp cho các dòng Keo lai nhân tạo nghiên cứu là ½ MS2* bổ sung IBA với nồng độ 1,5mg/l Các chồi ra rễ được chăm sóc theo các kết quả về nghiên cứu về nhân giống Keo lai nhân tạo trước đây cho tỷ lệ sống cao trên 85%, cây con

sinh trưởng tốt, khoẻ mạnh [11] Riêng các nghiên cứu về nuôi cấy mô trên cây Keo lai

BV32 tại Việt Nam hiện đang còn rất ít

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là giống Keo lai (Acacia hybrid) BV32 tại huyện Thanh

Chương - Nghệ An Đây là giống Keo lai BV32 có nhiều đặc tính quý được người tiêu dùng ưa chuộng

2.2 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu là đỉnh sinh trưởng của cây Keo lai BV32 tốt, được trồng trong vườn đầu dòng của Trung tâm sản xuất cây giống chất lượng cao Bắc trung Bộ, huyện Thanh Chương, tỉnh Nghệ An

Chất điều tiết sinh trưởng: Auxin và Cytokinin tổng hợp

2.3 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm và điều kiện tiến hành nghiên cứu:

* Quá trình nuôi cấy in vitro được tiến hành trong môi trường nhân tạo, vô trùng và

có thể thay đổi các điều kiện phòng nuôi cấy với điều kiện:

+ Số giờ chiếu sáng trong ngày: 10h/ngày

+ Cường độ ánh sáng khoảng 2000 – 3000 Lux

+ Nhiệt độ phòng nuôi : 25 – 28o

C

+ pH của các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh ở 5,8

* Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Trung tâm sản xuất cây giống chất lượng cao Bắc trung Bộ, huyện Thanh Chương, tinh Nghệ An

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 10/2015 – 6/2016

2.4 Nội dung nghiên cứu

2.4.1 Đối với mẫu nuôi cấy

+ Thí nghiệm 1: Xác định ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng sống của mẫu nuôi cấy (Thủy ngân clorua – HgCl2, nồng độ 0,1%)

Công thức Thời gian (phút) Số mẫu nghiên cứu

1.1 6 10 bình (1 bình 2 chồi)

2.4.2 Xác định ảnh hưởng nồng độ Cytokinin đến khả năng nhân chồi nhanh

+ Thí nghiệm 2: Xác định ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân chồi nhanh

Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Số mẫu thí nghiệm

3.6 2,5 10

2.4.3 Xác định nồng độ Auxin thích hợp của giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

+ Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ

+ Thí nghiệm 5: Xác định ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra rễ

2.4.4 Xác định giá thể thích hợp cho giai đoạn ra cây ngoài vườn

+ Thí nghiệm 6: Xác định ảnh hưởng của giá thể đến sức sống của cây in vitro

ngoài vườn ươm

+ Giá thể: Đất + phân NPK (50:1)

Cát

Đất + Điều kiện của môi trường huấn luyện ngoài vườn ươm:

 Chất lượng nước tưới: Nước ngọt, độ pH 6,5-7,0, hàm lượng muối NaCl < 0,2%

 Độ thoát nước: Sau cơn mưa nước tiêu thoát ngay

 Mầm mống sâu bệnh hại của đất: Không có mầm mống sâu bệnh hại Không phải

2.5 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau:

- Các thí nghiệm trong kỹ thuật nuôi cây mô

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp 10 bình, mỗi bình cấy đồng đều 2 mẫu

Các bình nuôi cấy in vitro được đặt trong phòng nuôi cấy có chế độ:

+ Số giờ chiếu sáng trong ngày: 10h/ngày

+ Cường độ ánh sáng khoảng 2000 – 3000 Lux

+ Nhiệt độ phòng nuôi : 25 – 28o

C

+ pH của các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh ở 5,8

2.5.1 Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu

a Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro

- Sử dụng môi trường muối MS (Muraskige & Skoog, 1962) có chứa 30g/l đường Sacaroza và 8g/l agar, pH = 5,8

- Các chất điều tiết sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm Auxin, Cytokinin; Than hoạt tính

Giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu (PP

khử trùng mẫu cấy)

Mẫu: đỉnh sinh trưởng cây Keo lai

BV32 khử trùng bằng HgCl2 0,1%

Thí nghiệm: TN1

Giai đoạn nhân nhanh chồi

Mẫu: chồi in vitro Thí nghiệm: TN2, TN3

Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

(giai đoạn ra rễ) Mẫu: chồi in vitro Thí nghiệm: TN4, TN5

Giai đoạn huấn luyện thích nghi

Mẫu: cây con in vitro

Thí nghiệm: TN6

Cây Keo lai bv32

- Giá trị pH của môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng là 5,8

- Thể tích dung dịch dinh dưỡng (môi trường nuôi cấy) trong bình nuôi cấy là 50 ml/bình

- Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,1atm trong 30 phút

b Phương pháp vô trùng mẫu nuôi cấy

+ Chọn mẫu: Mẫu cấy được chọn là đỉnh sinh trưởng lấy từ các cây Keo lai BV32 trưởng thành, sạch bệnh, sinh trưởng tốt trồng ở trong vườn cây đầu dòng

+ Xử lý mẫu: Mẫu được cắt bằng dao sắc rồi được đem vào rửa sạch bằng nước xà phòng loãng dưới vòi nước chảy và tráng lại 3 lần bằng nước cất Khử trùng sơ bộ bằng cồn 700C Tiếp đó đưa mẫu vào tủ cấy để tiến hành các bước khử trùng bằng HgCl2 0,1% theo 2 phương thức khử trùng là khử trùng đơn và khử trùng kép

mÉulÖ

bÖnhs¹chsèngMÉubÖnh

s¹chsèngmÉulÖ

û

 MÉu nu«icÊy

chÕtMÉuchÕt

mÉulÖ

û

2.5.2 Giai đoạn nhân nhanh chồi

*Phương pháp nhân nhanh

- Mẫu: Mẫu nuôi cấy ở giai đoạn nhân nhanh là các đỉnh sinh trưởng của các cây Keo lai BV32 trồng trong vườn đầu dòng sau khi đã khử trùng với thời gian khử trùng tối

ưu ở thí nghiệm 1 Và được cấy lên môi trường muối MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng là BAP, Kinetin, α- NAA với các hàm lượng theo thí nghiệm 2, 3, dưới đây:

- Các công thức thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, được tiến hành trên 10 bình, mỗi bình cấy 2 mẫu

- Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu phát sinh chồi, hệ số nhân chồi (hệ số nhân

nhanh), chiều dài chồi, số lá/chồi, Trạng thái chồi





cÊymÉuSè

chåit¹omÉuSè(%)

chåisinhph¸t MÉu





cÊychåiSè

thµnht¹ochåiSè(lÇn)

chåin nhsè

Chồi kém: Chồi gầy, lá xanh nhạt, hoặc chồi bị dị dạng

2.5.3 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh (giai đoạn ra rễ)

* Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh

- Mẫu nuôi cấy: Sau giai đoạn nhân nhanh, các chồi chiều cao 4- 5 cm, có trạng thái sinh trưởng và phát triển bình thường được cấy vào môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh

- Môi trường ra rễ là môi trường nền: MS (Murashige&Skoog, 1962) bổ sung 30g/l saccarose, 8g agar/l, pH = 5,8 Chất điều tiết sinh trưởng sử dụng là IBA và NAA

- Các công thức thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 3 lần nhắc lại, tiến hành trên 10 bình, mỗi bình cấy 5 chồi