Xác định Aflatoxin bằng phương pháp HPLC đầu dò huỳnh quang

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCMKHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨMMÔN: PHÂN TÍCH HÓA LÝ THỰC PHẨM 2XÁC ĐỊNH AFLATOXIN BẰNGPHƯƠNG PHÁP HPLC ĐẦU DÒHUỲNH QUANGNỘI DUNGTỔNG QUAN ĐỘC TỐ AFLATOXINTỔNG QUAN SẮC KÝ HPLCHÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG ĐẬU PHỘNG.PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝLỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

PHÂN TÍCH HÓA LÝ THỰC PHẨM 2

XÁC ĐỊNH AFLATOXIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐẦU DÒ

HUỲNH QUANG

Nhóm: 4

STT TÊN THÀNH VIÊN MSSV NỘI DUNG ĐÁNH GIÁ

1 NGUYỄN THỊ HUYỀN 2022180119 Độc tố nấm mốc

Nguồn gốc Aflatoxin

2 ĐOÀN HƯƠNG LAN 2022180027 Các dạng Aflatoxin

Chuyển hóa của Aflatoxin 8

TỔNG QUAN ĐỘC TỐ AFLATOXIN

01 02

03

TỔNG QUAN SẮC KÝ HPLC

HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG ĐẬU PHỘNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

NỘI DUNG

TỔNG QUAN ĐỘC TỐ

ĐỘC TỐ NẤM MỐC

 Aflatoxin là một trong những nhóm chất độc mạnh nhất hình thành trong tự nhiên.

 Aflatoxin thường có trong các loại hạt có dầu như lạc, đậu nành, hạt điều, hạt hướng dương,…hay trên các hạt ngũ cốc, bột sinh dưỡng, thức ăn gia súc có nguồn gốc từ hạt ngũ cốc.

 Aflatoxin gây ung thư, tổn thương gan, gây giảm sức đề kháng cơ thể.

 Aflatoxin B1 được coi là chất độc nguy hiểm nhất.

NGUỒN GỐC AFLATOXIN

 Aflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh tự

nhiên bởi một số loại Aspergillus, là

một loại nấm mốc.

 Aspergillus flavus và aspergillus

parasiticus thuộc họ nấm cúc, là loại

nấm sản sinh ra aflatoxin trong tự

nhiên và trong môi trường nuôi cấy

nhân tạo

 Loại nấm mốc này phát tiển trên nhiều

loại cơ chất, các loại hạt có dầu thậm

chí có trên bột cá thịt giàu protein.

CẤU TẠO CỦA AFLATOXIN

 Aflatoxin G1 có màu huỳnh quang xanh lá cây.

 Aflatoxin G1 có chứa 2 vòng lacton

CẤU TRÚC PHÂN TỬ

AFLATOXIN

CÁC DẠNG AFLATOXIN

VÀ CHUYỂN HOÁ

CỦA CHÚNG

Có ít nhất 16 dạng aflatoxin khác nhau có trong tự nhiên Aflatoxin

B1 là dạng độc nhất Sự có mặt của Aspergillus trong các sản phẩm thực phẩm không phải lúc nào cũng là chỉ thị về mức aflatoxin có hại mà nó biểu thị cho rủi ro đáng kể khi sử dụng

thực phẩm.

• Aflatoxin B1 & B2: được sinh ra

bởi Aspergillus flavus và A parasiticus.

• Aflatoxin G1 & G2: chỉ được sinh ra

bởi Aspergillus parasiticus.

Tuy nhiên Aflatoxin M1 cũng có mặt trong sản phẩm lên

men bởi Aspergillus parasiticus.

• Aflatoxin M1: chất chuyển hóa của aflatoxin

CÁC DẠNG

AFLATOXIN VÀ DẠNG CHUYỂN HÓA CỦA

AFLATOXIN

TÁC HẠI

CỦA ĐỘC

TỐC

AFLATOXIN

Đối với nông sản :

Gây nên tình trạng nấm mốc không thể sử dụng được gây thiệt hại về kinh tế cho con người

Đối với gia súc, gia cầm :

Nhìn chung, Aflatoxin làm giảm khả năng hấp thụ dinh dưỡng nên làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của động vật nuôi cụ thể như sau :

Gây ra tình trạng như tốc độ tăng trưởng chậm, tiêu tốn thức

ăn, khả năng chống bệnh, dịch bệnh kém

Phá hủy các mô gan và tế bào sống

Ảnh hưởng đến hệ miễn dịch, Ăn mòn thành ruột và dạ dày

Đối với người:

Nếu ăn phải thịt chứa chứa Aflatoxin thì sẽ có các triệu chứng sau:Thường là sốt, nôn mửa, chán ăn

Vàng da, bụng trướng nước, phù chi dưới và các triệu chứng khácTác động vào hệ tuần hoàn gây ra xuất huyết mãn tính, ngưng kết hồng cầu, giảm lượng kháng thể

Trong trường hợp nặng có thể gây suy gan và tử vong

TÁC HẠI CỦA ĐỘC TỐC

AFLATOXIN

TỔNG QUAN SẮC KÝ HPLC

HPLC là gì?

 HPLC tên viết tắt của phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao (tên tiếng Anh là: High-performance liquid chromatography), hay còn được gọi là Sắc ký lỏng áp suất cao.

 HPLC là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để

tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp.

Cấu tạo HPLC:

2 Bơm - Bộ phận phân phối dung môi

Bơm pittong hút pha động từ bình dung

môi đẩy vào hệ thống qua các bộ phận

tiêm mẫu, cột và đầu dò sau đó qua

bình đựng dung môi thải Tuỳ thuộc vào

các cấu hình hệ thống (ví dụ kích thước

cột, kích thước hạt của pha tĩnh, tốc độ

chảy và thành phần của pha động) áp

suất vận hành ở 6000psi (413 bar) có

thể lên tới 18 000 psi (1240 bar).

3 Bộ tiêm mẫu:

Bộ phận tiêm mẫu có thể là bộ phận tiêm mẫu tự động hoặc tiêm mẫu bằng tay có bộ phận kim phun Kim phun mẫu cho hệ thống HPLC sẽ cung cấp việc tiêm mẫu chất lỏng trong phạm vi 0,1-100 mL thể tích với độ tái lập cao

và dưới áp suất cao (lên đến 18 000 psi).

4 Cột

Cột phân tích thường được làm bằng thép không gỉ, dài từ 50

- 300 mm và có đường kính trong từ 2 - 5 mm Thông thường,Cột được nhồi bằng các hạt silica / silica lai có kích thước từ2,5 – 10 µm

Trong quá trình hoạt động, nhiệt độ của pha động và cột nênđược giữ ổn định trong quá trình phân tích Vì vậy trong thực

tế, các hệ thống có thêm buồng điều nhiệt cột

5 Đầu dò - Detector

 Detector nằm ở cuối cột có nhiệm vụ phát hiện các chất phântích khi chúng được rửa giải từ cột sắc ký Các đầu dò thườngđược sử dụng là máy UV-VIS, huỳnh quang, khối phổ, tán xạbay hơi…

 Đầu dò huỳnh quang:là detector nhạy nhất (cao hơn 10-1000lần so với detector UV-VIS trong các detector hiện đạu cóHPLC

 Detector huỳnh quang chính xác và có tính chọn lọc hơn cácdetector quang họp khác

6 Thiết bị thu thập dữ liệu

Tín hiệu từ đầu dò có thể được thu thập trên máy ghi biểu đồ hoặc bộ tích hợp điện tử khác nhau với các phần mềm lưu trữ, phân tích và xử

lý dữ liệu sắc ký.

Các ứng dụng của HPLC Thông tin thu thập được qua hệ thống HPLC bao gồm độ phân giải, định lượng hợp chất HPLC cũng hỗ trợ trong việc tách hóa chất và tinh chế.

HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG NGŨ CỐC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7596 : 2007

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH AFLATOXIN B 1 VÀ HÀM LƯỢNG TỔNG SỐ AFTATOXIN B 1 , B 2 , G 1 VÀ G 2 TRONG NGŨ CỐC,

CÁC LOẠI HẠT VÀ CÁC SẢN PHẨM CỦA CHÚNG –

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Phạm vi áp dụng:

 Tiêu chuẩn này qui định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo có cột ái lực miễn nhiễm làm sạch và dẫn xuất sau cột để xác định aflatoxin trong ngũ cốc, các loại hạt và các sản phẩm của chúng Giới hạn định lượng của aflatoxin B1 và tổng hàm lượng aflatoxin B1, B2, G1 và G2 là 8 /kg.

 Phương pháp đã được kiểm tra xác nhận trên ngô chứa 24,5 /kg, trên bơ lạc 8,4 /kg, và trên hạt lạc nguyên liệu chứa 16 /kg aflatoxin tổng số Phương pháp này cũng có thể áp dụng cho các sản phẩm hạt có dầu, quả khô và các sản phẩm của chúng.

Nguyên tắc

Mẫu thử được chiết bằng hỗn hợp metanol và nước Mẫu chiết được lọc, pha loãng bằng nước và cho vào cột ái lực chứa các kháng thể đặc hiệu đối với aflatoxin B 1 , B 2 , G 1 và G 2 Các aflatoxin được tách, làm sạch và cô đặc trên cột sau đó được lấy ra khỏi các kháng thể bằng metanol Các aflatoxin được định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo , phát hiện bằng huỳnh quang và dẫn xuất sau cột.

Nguyên liệu

Áp dụng cho các loại ngũ cốc, các loại hạt Ngoài

ra cũng có thể áp dụng cho các sản phẩm hạt có dầu, quả khô và các sản phẩm của chúng.

Thiết bị

dung dịch aflatoxin trong axit sulfuric trong vài giờ, sau đó

hết hay chưa hết bằng đo pH.

1 Cột ái lực miễn nhiễm (IA)

6 Máy đo quang phổ, có thể đo

ở bước sóng trong khoảng từ 200

nm đến 400 nm.

7 Cuvet thạch anh, có chiều dài

đường quang 1 cm và không hấp

bơm nạp 50 hoặc tương đương

Máy đo quang phổ

9.3 Cột tách phân tích pha đảo

9.4 Hệ thống dẫn xuất sau cột

10 Detector huỳnh quang, có bước sóng kích thích 365 nm và

bước sóng phát xạ 435 nm, có khả năng phát hiện ít nhất 0,05 ng aflatoxin B1 trên một thể tích bơm (trong trường hợp này là 50

Cột tách phân tích pha đảo Hệ thống dẫn xuất sau cột Đầu dò huỳnh quang

Hóa chất

1 Nước

2 Natri clorua.

3 Iôt

4 Aflatoxin, dạng tinh thể hoặc viên nang.

5 Axetonitril, loại dùng cho HPLC.

6 Metanol, loại dùng cho phân tích.

7 Metanol, loại dùng cho HPLC.

8 Toluen, loại phân tích (cần được thực hiện trong tủ hút)

9 Hỗn hợp toluen/axetonitril

Trộn 98 phần thể tích của toluen với 2 phần thể tích của axetonitril.

10 Dung môi chiết: Trộn 7 phần thể tích metanol với 3 phần thể

tích nước.

Hóa chất

11 Pha động: Trộn 3 phần thể tích nước với 1 phần thể tích

axetonitril và 1 phần thể tích metanol Khử khí dung dịch trước khi sử dụng.

12 Thuốc thử dẫn xuất sau cột

Hòa tan 100 mg iôt trong 2 ml metanol Thêm 200 ml nước, khuấy trong 1 giờ, sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm.

13 Dung dịch gốc Aflatoxin B1, B2, G1 và G2

14 Dung dịch gốc của hỗn hợp aflatoxin

Chuẩn bị dung dịch gốc có chứa 500 ng/ml aflatoxin B1, 125 ng/ml aflatoxin B2, 250 ng/ml aflatoxin G1 và 125 ng/ml aflatoxin G2 trong toluen/axetonitril.

15 Dung dịch chuẩn của hỗn hợp aflatoxin

16 Axit sulfuric, c(H2SO4) = 2 mol/l.

Các dung dịch mẫu và dung dịch chuẩn dùng cho phép xác định HPLC phải chứa cùng một loại dung dịch hoặc hỗn hợp dung môi.

Cân 25 g

mẫu

Thêm 5 g natri clorua (4.2) và

125 ml dung môi chiết (4.10)

Kiểm tra để đảm bảo thời gian trộn và tốc độ trộn

Lọc hỗn

15 ml (V2) dịch lọc cho vào bình

nón có nắp đậy

thủy tinh

lọc dịch chiết đã pha loãng qua giấy lọc vi sợi thủy

tinh

Dịch lọc

đồng hóa bằng máy trộn 2phút/tốc độ cao

Dùng pipet

Chiết

Dùng pipet lấy 15 ml (V4) của

Pha loãng bằng nước đến vạch (V5)

nạp lên cột IA, rửa

và rửa giải

chiết mẫu bằng hỗn hợp

metanol và nước, lọc hoặc ly

tâm, pha loãng mẫu

V6 là thể tích của dịch chiết

mẫu (6.7) đã được làm

sạch và bơm

KHỐI LƯỢNG CỦA AFLATOXIN TỔNG SỐ LÀ TỔNG CỘNG KHỐI LƯỢNG CỦA BỐN LOẠI

AFLATOXIN TRÊN

tích bơm, tương ứng với diện tích pic đã đo hoặc chiều cao pic đọc được ở đường chuẩn, tính bằng nanogam

trong phần dịch lọc thứ hai được lấy dùng cho cột IA (V4)

độ chụm của phương pháp đưa ra trong phụ lục A các giá trị được lấy từ thử liên phòng thử nghiệm có thể không áp dụng

Các kết quả thử liên phòng thử nghiệm:

Các dữ liệu sau đây thu được trong phép thử liên phòng thử nghiệm tiến hành năm 1999 và do AOAC và IUPAC tổ chức phù hợp với ISO 5725:1986 Các mẫu ngô, lạc và bơ lạc bị nhiễm bẩn tự nhiên và bị làm biến tính với 10 μg/kg, 20 μg/kg

và 30 μg/kg aflatoxin tổng số, theo tỷ lệ 7:1:3:1 của B1, B2, G1

và G2 tương ứng đã được điều tra đánh giá