NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TỪ BAO PHẤN CÂY MƯỚP ĐẮNG

TÀI LIỆU THAM KHẢO CHO NGHIÊN CỨU INVITRO BAO PHẤN , TỔNG QUAN, PHƯƠNG PHÁP, CÁC THẢO LUẬN, CÓ TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẦY ĐỦ. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHO NGHIÊN CỨU INVITRO BAO PHẤN , TỔNG QUAN, PHƯƠNG PHÁP, CÁC THẢO LUẬN, CÓ TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẦY ĐỦ.

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TỪ BAO PHẤN CÂY

MƯỚP ĐẮNG (MOMORDICA CHARANTIA L.) IN VITRO

MỤC LỤC

Mở đầu 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

4.1 Ý nghĩa khoa học 3

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu chung về cây mướp đắng (Momordica charantia l.) 4

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại 4

1.1.2 Đặc điểm thực vật 4

1.1.3 Điều kiện sinh thái của cây mướp đắng 5

1.1.4 Thành phần dinh dưỡng và công dụng dược liệu của cây mướp đắng (Momordica charantia l.) 7

1.2 Vai trò của cây đơn bội trong chọn tạo giống cây trồng 8

1.3 Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro để tạo cây đơn bội 9

1.3.1 Giới thiệu chung 9

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn 9

1.3.3 Nghiên cứu về kĩ thuật nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội in vitro trên thế giới và trong nước 13

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Vật liệu nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu 18

2.2.2 Phương pháp tạo callus đơn bội cây mướp đắng 20

3.2.3 Bố trí thí nghiệm và xử lí thống kê 22

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 23

3.1 Phương pháp xử lý mẫu 23

3.2 Ảnh hưởng của kiểu gen mướp đắng đến khả năng phát sinh callus 24

3.3 Ảnh hưởng của kích thước nụ hoa mướp đắng đến khả năng phát sinh callus26 3.4 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) đến sự phát sinh callus đơn bội 29

3.5 Ảnh hưởng của tiền xử lý lạnh (4oC) đến khả năng phát sinh callus đơn bội 37

3.6 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy trong tối ở nhiệt độ 25±10C và 32±10C đến khả năng tạo callus đơn bội 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

1 Kết luận 42

2 Kiến nghị 44

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 50

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây mướp đắng (Momordica charantia L.) thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) là

loại dây leo, cây hàng năm [28] Cây có nguồn gốc từ Ấn Độ, Nam Trung Quốc vàđược trồng rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trên khắp thế giới như Philippin, Malaysia,Australia, các nước ở Châu Phi, Tây Á và Mỹ La Tinh [38], [61], [23], [22], [21].Tại Việt Nam, cây được trồng ở hầu hết các tỉnh từ đồng bằng đến trung du [7] TheoTrung tâm Rau màu thế giới, trước đây là trung tâm Rau màu Châu Á (AsianVegetable Research and Development - AVRDC) năm 2007, tổng diện tích trồng mướpđắng ở nước ta là 12.000 ha, Philppines 12.000 ha, Thái Lan 3.000 ha, Indonesia 8.000

ha [8] Tại Pakistan mướp đắng được sản xuất 9,92 tấn/ha, Trung Quốc 18,9 tấn/ha vàtrung nước Châu Á là 13,7 tấn/ha (FAOSTAT 2011) [44]

Mướp đắng là một loại rau ăn quả giàu chất sắt, carbonhydrate, protein,vitamin

C, B1, B2, PP, chất khoáng, protit, lipit, đường, chất xơ, canxi, photpho, caroten [58]

Từ quả mướp đắng có thể chế biến thành nhiều món ăn khác nhau trong bữa ăn bìnhdân đến bữa tiệc ở những khách sạn sang trọng Nó là một trong ngũ vị được conngười ưa thích (đắng-cay-chua-chát-ngọt) [5] Ngoài ra, quả mướp đắng còn có tínhhàn nên trong dân gian thường dùng để trị các bệnh mụn nhọt, giải nhiệt, sáng mắt,cảm nắng, giảm ho Trong mướp đắng có chất Alkaloid có công dụng lợi tiểu, giúplưu thông máu tốt, chống viêm, hạ sốt và tăng cướng sức khỏe thị lực Loại dầu cótrong hạt mướp đắng rất giàu cis(c) 9, trasn(t) 11 và axit linonic t13, Chanrantin,polypeptide-p, và vicine…, những hợp chất này không chỉ làm giảm đường huyết màcòn cải thiện việc dung nạp glucose và giảm cholesterol, triệt tiêu các mầm bệnh gâyung thư tá tràng và nhiều chứng bệnh nan y khác [2], [8], [10], [7]

Mướp đắng là cây vừa có giá trị thực phẩm vừa có giá trị dược liệu nên đang dầnđược người nông dân trồng với diện tích lớn và cho thu nhập cao Nhưng các giốngđang sử dụng hiện nay chủ yếu là giống địa phương tuy có khả năng thích nghi cao,chống chịu sâu bệnh tốt, song năng suất lại thấp Ngoài ra, các giống nhập từ các công

ty nước ngoài tuy là các giống lai F1 có năng suất và độ đồng đều cao, nhưng giáthành hạt giống cao và nhiều giống chưa qua khảo nghiệm tính thích ứng đã ảnhhưởng đến hiệu quả sản xuất Một số giống lai nước ngoài được nhập nội trồng liên tục

qua nhiều năm đã làm suy giảm nguồn gen Vì vậy, việc tạo giống trong nước theo yêucầu của đặc điểm sản xuất và phù hợp với điều kiện sinh thái vùng canh tác, có năngsuất cao ngày càng trở nên cần thiết

Bên cạnh đó, công tác chọn giống lai F1 đòi hỏi phải có các dòng thuần, mà hiệnnay việc tạo ra các dòng này bằng phương pháp truyền thống thường tốn rất nhiều thờigian và công sức Thông qua thụ phấn cưỡng bức và chọn lọc liên tục 7-8 thế hệ mớinhận được các dòng thuần để đánh giá khả năng kết hợp của giống Tuy vậy, phươngpháp này trong nhiều trường hợp vẫn không cho các dòng bố mẹ đồng hợp tử ở cáccặp allen

Vì vậy, việc áp dụng kĩ thuật nuôi cấy in vitro tạo giống cây mướp đắng từ bao

phấn sẽ rút ngắn được thời gian tạo dòng thuần tuyệt đối xuống còn một thế hệ, từ đócho phép giảm chi phí, tăng hiệu quả của quá trình tạo giống mướp đắng có năng suấtcao, khả năng thích nghi và chống chịu với điều kiện tại Việt Nam [31], [29]

Trên thế giới, quá trình tạo cây mướp đắng đơn bội in vitro mới chỉ được nghiên

cứu từ năm 2008, tuy có đạt được một số thành tựu nhưng hiện vẫn chỉ dừng lại ở giaiđoạn tạo callus mà chưa cho phép thu được cây trên thực tế

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây mướp đắng (Momordica charantia l.)

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Cây mướp đắng có tên khoa học là Momordica charantia L có tên nước ngoài là

Bitter melon, bitter ground (Anh), bitter apple, wild cucumber, bitter cucumber,ampalaya (Philipines), balsam pear (Mỹ), karela (Ấn Độ)… [18]; tên việt nam là khổqua, mướp đắng, lương qua, cẩm lệ chi… [18]

Mướp đắng (momordica charantia L.) thuộc Giới (regnum): Plantae Ngành (divisio): Magnoliophyta Lớp (class): Magnoliopsida Bộ (ordo): Cucurbitales Họ (familia): Cucurbitaceae Chi (genus): Momordica [8]

Chi mướp đắng Momordica thuộc họ Cucurbitaceae có khoảng 45 loài đã biết,

chủ yếu tập trung ở Châu Phi, một số loài ở Mỹ, Châu Á chỉ có khoảng 5-7 loài Theo

Phạm Hoàng Hộ (1991) và Nguyễn Hữu Hiến (1994), chi Momordica L ở Việt Nam

có 3 loài là: Momordica charantia L Momordica Cochinchinensis (Louor.) Speng L Momordica subangulata Blume L.

Trong các tài liệu nghiên cứu trên và qua các tiêu bản thu thập ở ác địa phươngtrong nước của Viện Dược Liệu, các tác giả thống nhất cây mướp đắng trồng ở Việt

Nam đều thuộc loài Momordica charantia L., họ Cucurbitaceae [8]

Loài mướp đằng (Momordica Caharantia L.) nhiễm sắc thể 2n=22, được biết đến

như một loại cây trồng đã được thuần hóa từ lâu Theo M.E.C Reyes, B.H Gildemach

và C.J Jansen, 1993 thì loài này tồn tại ở 2 quần thể hoang dại và trồng trọt Dạngtrồng trọt đã trở nên khá phong phú, đây là dạng cây có hoa đơn tính cùng gốc(monoecious) và là cây hàng năm Nếu căn cứ theo hình dạng bên ngoài thì người tachia mướp đắng thành hai chủng loại: [16]

- Momordica charantia L Var charantia L., quả to (đường kính > 5cm), màu xanh

nhạt, gai tù, ít đắng

- Momordica charantia L Var abbreviata Ser., quả nhỏ (đường kính < 5cm), màu

xanh đậm, gai nhọn, vị rất đắng

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cũng giống như các cây họ bầu bí, rễ mướp đắng phát triển rộng nhưng ăn nông

Ở giai đoạn nảy mầm của hạt cây phát triển ngay một rễ cái (rễ cọc), rễ đó ăn sâu trongđất ở độ sâu 90 hoặc 120 tới 180cm Các rễ con hình thanh sau rất nhiều, phát triểnnhanh theo chiều ngang và lang rộng trong đất, tuy nhiên các nhánh này không ăn sâuquá 60cm

Mướp đắng thuộc loại dây leo bằng tua cuốn, thân có cạnh, ở ngọn có mọc lông

tơ, có đời sống khoảng một năm

Lá mọc so le, dài 5-10 cm, rộng 4-8 cm, phiến lá chia làm 5-7 thuỳ, hình trứng,mép khía răng Mặt dưới lá màu nhạt hơn mặt trên, gân lá có lông ngắn [22], [16], [3].Hoa đực và hoa cái mọc riêng ở nách lá, có cuống dài Hoa đực có đài và ống rấtngắn, tràng gồm năm cánh mỏng hình bầu dục, nhụy 5 rời nhau Hoa cái có đài vàtràng hoa giống hoa đực Tràng hoa màu vàng nhạt, đường kính khoảng 2 cm [22],[16], [3]

Quả hình thoi, dài 8-15 cm, gốc và đầu thuôn nhọn, mặt vỏ có nhiều u lồi to nhỏkhông đều Quả khi chưa chín có màu xanh hoặc vàng xanh nhạt, khi chín có màuvàng hồng Vì thế ở Trung Quốc, mướp đắng còn có tên là hồng dương, hồng cônương Khi chín, quả nứt ra dần từ đầu, tách ra làm ba phần để lộ chùm áo hạt màu đỏbên trong [22], [16], [3]

Hạt mướp đắng có dạng dẹp, dài 13-15 mm, rộng 7-8 mm, trông gần giống hạt bíngô Quanh hạt có màng đỏ bao quanh (giống như màng hạt gấc)

1.1.3 Điều kiện sinh thái của cây mướp đắng

1.1.3.1 Nhiệt độ

Mướp đắng có thể trồng quanh năm ở vùng nhiệt đới, ở những vùng cận nhiệt nó

có thể trồng hai vụ trong năm, trong khi đó ở những vùng có khí hậu ôn hòa mướpđắng có thể trồng được trong vụ hè [27]

Cũng như các cây khác thuộc họ bầu bí, mướp đắng rất mẫn cảm với sương giáđặc biệt là nhiệt độ thấp dưới 0oC Vì mướp đắng là cây trồng có nguồn gốc ở vùngnhiệt đới và á nhiệt đới nên sinh trưởng tốt trong điều kiện khí hậu ấm áp, nhiệt độthích hợp (24-27)oC (Desai và Musmade, 1998) Biên độ nhiệt dao động ngày đêm(28-3)oC/(20-25)oC là nhiệt độ thích hợp cho quá trình sinh trưởng, nhiệt độ ban đêm

dưới 16oC sẽ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây (Peter McLaughlin, 1998).

Ở nhiệt độ 5oC hầu hết các giống mướp đắng ngừng sinh trưởng Điều kiện nhiệt độcao sẽ làm cho quả bị ngắn, dị hình, nhiệt độ trên 40oC có thể làm thân bị héo Nhiệt

độ thích hợp cho hạt nảy mầm là (30-32)oC [24], [20], nhiệt độ cho năng xuất cao nhấtdao động trong khoảng (20-30)oC trong thời kì hình thành quả Khi nhiệt độ >30oC câykhông đậu quả được [27] Khung nhiệt độ tốt nhất cho mướp đắng sinh trưởng và pháttriển là từ 25-30oC

1.1.3.2 Ánh sáng

Mướp đắng là cây ưa ánh sáng, độ dài này ngày ngắn và trung Khi ánh sángthiếu và yếu cây sinh trưởng phát triển kém, cây ra hoa cái muộn và dễ bị rụng, năngsuất thấp, chất lượng giảm, hương vị kém Mướp đắng yêu cầu cường độ ánh sángmạnh để sinh trưởng, phát triển và tạo năng xuất cao Do vậy mướp đắng không nêntrồng với mật độ cao, cây thiếu ánh sáng, sinh trưởng chậm và sâu bệnh phát triển.Trong quá trình sinh trưởng, biện pháp kỹ thuật như tỉa lá gốc, các nhánh mọc sát đất

để tạo độ thông thoáng cho giàn mướp đắng là rất cần thiết [19]

1.1.3.3 Đất và dinh dưỡng

Mướp đắng có thể trồng ở nhiều loại đất khác nhau (Cantwell và cs 1996, Reyes

và cs 1994), song để có thể sinh trưởng phát triển tốt nhất, cho năng suất cao khi đượctrồng trên những chân đất thịt nhẹ, giàu dinh dưỡng có tầng canh tác dày, thoát nướctốt Độ pH trung bình 6,0-6,7 (Desai và Musmade 1998) là thích hợp nhất cho sinhtrưởng phát triển của mướp đắng Song mướp đắng cũng có khả năng sinh trưởngđược trên đất kiềm có độ pH tới 8,0 [24]

Mướp đắng đòi hỏi lượng dinh dưỡng cân đối giữa phân bón hữu cơ và phân vô

cơ để sinh trưởng phát triển tốt Song tùy thuộc từng loại đất sẽ có chế đô dinh dưỡngthích hợp khuyến cáo dùng cho mướp đắng Trên thực tế vẫn chưa có nhiều nghiêncứu về chế độ dinh dưỡng, phân bón cho mướp đắng Tuy nhiên khi trồng mướp đắngtrên những chân đất giàu dinh dưỡng và bón đầy đủ phân hữu cơ hoại mục thì yêu cầu

về dinh dưỡng của mướp đắngtheo khuyến cáo của Robinson cà Decker-Walteer(1996) sử dụng phân bón với tỷ lệ N:P:K = 100:50:50 kg/ha [20], [19]

1.1.3.4 Độ ẩm

Mướp đắng có khả năng chịu hạn tốt, nhưng là cây rất mẫn cảm với điều kiện

hình thái học (Liao và Lin 1994) Để đảm bảo cho cây sinh trưởng, phát triển tốt luônluôn phải cung cấp đủ nước cho cây.

Mướp đắng là cây ưa ẩm, cây sinh trưởng tốt trong điều kiện ẩm độ 70-80%.Thời kì ra quả rộ và quả phát triển yêu cầu độ ẩm cao 80-90% vì ở giai đoạn này hàmlượng nước trong thân lá, quả của mướp đắng lên đến trên 90% [20] Tuy nhiên độ ẩmkhông khí cao lại là điều kiện thích hợp cho sự phát triển bệnh cũng như sương mai,đốm lá, thối vi khuẩn gây hại cho mướp đắng

1.1.4 Thành phần dinh dưỡng và công dụng dược liệu của cây mướp đắng

Hợp chất saponin trong vị đắng của cây mướp đắng là vị thuốc có chứa chấtCharantin (như dạng insulin) và Alkaloid Trong mướp đắng người ta tìm ra nhiềudưỡng chất có lợi ích cho cơ thể như: Alkaloid, Charantin, Charine, Cryptoxanthin,Cucurbitins, Diosgenin, Galacturonic acids, Gentisic acid, Goyaglyosides,Goyasaponins, Gypsogenin, Lanosterol, Lauric acid, Linoleic acid, Momorcharasides,Momorcharins, Momordenol, Momordicins, Momordicinin, Momordicosides,Momordin, Oleanolic acide, Oleic acide, Oxalic acide, Peptides, Petroselinic acide,Polypeptides, Rubixathin, chất đạm, chất sợi, các sinh tố A, C, Folic acid… Hiện nayquả mướp đắng được sử dụng như một loại rau cũng như được sử dụng như một loạidược liệu cho việc điều trị bệnh tiểu đường và làm thuốc tẩy giun

Thành phần protein trong mướp đắng có công năng miễn dịch cao, làm cho tếbào miễn dịch có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh, do đó có thể coi thực phẩm cóthể dùng để điều trị ung thư Các nhà khoa học mỹ còn cho rằng có thể chiết xuất từtrong mướp đắng ra được 3 loại protein tiêu diệt được virus gây bệnh AIDS [58]

Trong y học truyền thống cổ xưa của Ấn Độ, Trung Quốc, châu Phi và MỹLatinh Dịch chiết từ mướp đắng chứa loạt các hóa chất thực vật có hoạt tính sinh học,bao gồm t.riterpenes, pisteins và steroid (Grover và Yadav 2004) có khả năng chốngoxy hóa, kháng khuẩn, kháng virus, gải độc gan và chống viêm vừa có khả năng làmgiảm lượng đường trong máu (Welthinda et al 1986; Raman và Lan 1996), điều trịnhiều loại loét khác nhau, tiểu đường, và nhiễm trùng (Gurbuz et al 2000; Scartezzini

và Speroni 2000; Beloin et al 2005) Trong khi nước sắc có tính chất gây sẩy thai,nhưng nước sắc lá và thân cây được sử dụng trong điều trị bệnh lỵ, bệnh thấp khớp, vàbệnh gút (Subratty et al 2005) Ngoài ra, dịch chiết từ lá, hoa quả và thậm chí toàn bộcây thường được sử dụng để điều trị các vết thương, nhiễm trùng, ký sinh trùng (ví dụ,sâu), sởi, viêm gan, sốt (Behera et al 2008) [58]

1.2 Vai trò của cây đơn bội trong chọn tạo giống cây trồng

Hầu hết các loài cây trồng thường có mức bội thể lớn hơn 1, phổ biến là nhị bội(2n) và tứ bội (4n) Như vậy, mỗi đặc điểm di truyền ở những cá thể này đều bị hai haynhiều alen của một gen chi phối Nếu đó là những cá thể dị hợp tử, tức là các gen trongmỗi hệ gen nhị bội hay tứ bội khác nhau thì biểu hiện tính trạng của gen đó hoàn toàntùy thuộc vào tính trạng lặn hay trội của chúng quyết định Trong công tác chọn giốngngười ta không chú ý nhiều tới thể đơn bội (n), bởi lẽ cây trồng ở dạng đơn bội thườngrất khó tồn tại trong tự nhiên Nó chỉ sống được trong điều kiện nhân tạo của conngười Cây đơn bội mang bộ NST (n), vì vậy để cho nó sống được người ta phải tiếnhành nhân đôi bộ nhiễm sắc thể tạo các dòng đồng hợp tử tuyệt đối Những biểu hiệncủa cây đơn bội (kiểu hình) thể hiện chính xác kiểu gen mà nó đang có, kể các gen lặn.Đây sẽ là nguồn vật liệu di truyền vô cùng quý giá trong công tác chọn giống

Giá trị của cây đơn bội trong các nghiên cứu di truyền và chọn giống đã đượcphát hiện từ lâu Karpachenco là người đầu tiên ngay từ năm 1929 đã chỉ ra khả năng

và triển vọng của việc sử dụng đơn bội vào mục đích chọn giống, vì lẽ trong bất kỳmột quần thể nào, một tổ hợp mong muốn của các gen trong giao tử thường là cao hơn

so với trong hợp tử Do đó, về mặt lý thuyết sẽ thường xuyên và rất nhanh nhận đượccác dạng đồng hợp tử có những tổ hợp các dấu hiệu mong muốn bằng cách nhân đôitrực tiếp số lượng nhiễm sắc thể ở các thể đơn bội [4]

Trong công tác chọn tạo giống ở loài tự thụ phấn trong một thời gian dài người tayêu cầu phải có những tái tổ hợp gen mong muốn từ các nguồn đồng hợp tử khácnhau Bằng phương pháp truyền thống thường phải mất 8-10 năm để tạo ra con laiđồng hợp tử ổn định Ở cây thụ phấn chéo thường gặp nhiều khó khăn hơn để cónhững dòng tự phối vì hiện tượng suy giảm sức sống của con lai sau mỗi thế hệ tự thụphấn bắt buộc Những dòng tự phối đồng hợp tử này sẽ được lai với nhau để tạo conlai F1 ưu thế lai Việc nghiên cứu cây đơn bội làm vật liệu nguồn để lưỡng bội hóachúng thành những vật liệu đồng hợp tử đã trở nên hữu dụng cho nhà chọn giống Thờigian cần thiết để tạo ra dòng vật liệu nguồn- dòng đơn bội kép như vậy được rút ngắnrất nhiều, khoảng 3-4 lần, tùy đối tượng cây [1].

1.3 Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro để tạo cây đơn bội

1.3.1 Giới thiệu chung

Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro bao phấn trong có chứa các tiểu

bào tử hoặc hạt phấn chưa chín trong môi trường dinh dưỡng tạo ra cây đơn bội, là mộtlối thoát kỳ diệu đối với lĩnh vực ứng dụng cây đơn bội vào công tác chọn giống câytrồng Thông qua phương pháp này ta có thể rút ngắn thời gian chọn giống, làm tănghiệu quả chọn lọc, tăng tính biến dị cho chọn lọc và giúp giải quyết những khó khăntrong lai xa Các dòng thuần có thể nhanh chóng được tạo ra từ nuôi cấy bao phấn củacon lai F1 hoặc F2 trong thời gian ngắn nhất [51], [30]

Một số ưu điểm của phương pháp này như sau:

- Kỹ thuật khá đơn giản, ở một số loài sự phân chia tế bào có thể xảy ra dễ dàngngay cả khi những tế bào hạt phấn chưa thực sự chín Tỷ lệ hạt phấn có phản ứng tốtvới môi trường nuôi cấy cao (tần suất cảm ứng môi trường cao) và có thể sản xuất thểđơn bội với số lượng lớn trong thời gian ngắn giảm từ 3-4 lần [51]

- Nuôi cấy bao phấn là một phương pháp để tạo ra các dòng đồng hợp tử, trongmột quá trình chỉ vài tháng so với yêu cầu nhiều thế hệ khi sử dụng phương pháptruyền thống [62], [54], [6] Cây đơn bội kép là sản phẩm cuối cùng của nuôi cấy baophấn, chúng có đặc điểm là đồng hợp tử tuyệt đối và được coi là nguồn vật liệu đadạng phong phú cho chọn tạo giống [60], [56], [37] Thông qua phương pháp này ta cóthể rút ngắn thời gian chọn giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc, tăng tính biến dị chochọn lọc và giúp giải quyết những khó khăn trong lai xa Các dòng thuần có thể nhanh

chóng được tạo ra từ nuôi cấy bao phấn của con lai F1 hoặc F2 trong thời gian ngắnnhất.

Như vậy, phương pháp nuôi cấy bao phấn đã góp phần rút ngắn rất nhiều thờigian chọn giống, làm tăng hiệu quả chọn lọc và giúp giải quyết vấn đề hiện tại và tronglai Chính vì vậy mà phương pháp này đang được áp dụng rộng rãi trong chọn tạogiống cây trồng trên thế giới cũng như ở Việt Nam

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả nuôi cấy bao phấn

Nhiều công trình nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn cho chúng ta thấy hiệu quảcủa nuôi cấy bao phấn nói chung và bao phấn mướp đắng nói riêng phụ thuộc vàonhiều yếu tố như: Điều kiện sinh lý của cây mẹ, giai đoạn phát triển của hạt phấn, biệnpháp xử lý nhiệt, đặc biệt là kiểu gen của cây cho phấn và thành phần của môi trườngdinh dưỡng [60], [45], [35], [25]

Ảnh hưởng của cây cho bao phấn

Kiểu gen của cây cho bao phấn nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả nuôicấy không những trong phạm vi một chi mà còn khác nhau giữa các giống trong mộtloài Bao phấn phản ứng trong môi trường nuôi cấy là một đặc điểm có khả năng ditruyền [66], [59]

Zagorska khi nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen cây cà chua đến hiệu quả nuôicấy bao phấn cho thấy: trong số 85 kiểu gen của các giống được đưa vào nuôi cấy,callus chỉ được tạo ra từ bao phấn của 53 giống Sự tái sinh cây chỉ có được từ calluscủa 15 giống Số liệu thu được cho thấy kiểu gen ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả nuôicấy bao phấn [64]

Kiểu gen là nguyên nhân chính và là yếu tố quyết định ảnh hưởng đến sự hìnhthành callus và tái sinh cây khi nuôi cấy bao phấn Niizeki (1983) và Haberlebos(1985) đã chỉ ra tác động có ý nghĩa của kiểu gen và mối tương tác giữa kiểu gen, môitrường đến sự hình thành callus và tái sinh cây Ngoài ra theo một số nhà khoa học thìngoài kiểu gen ra còn có các nhân tố tế bào chất cũng ảnh hưởng đến nuôi cấy baophấn (Heberlebor, 1985) [50] Tuy nhiên trong thời gian gần đây, Quimio và Zapatacho rằng: “Sự hình thành callus và tái sinh cây bị điều khiển bởi các gen lặn mà khôngliên can gì đến các nhân tố tế bào chất” [66]

Điều kiện sinh trưởng và tình trạng sinh lý học của cây cho bao phấn cũng nhưmối tương tác giữa yếu tố di truyền và môi trường bên ngoài đều ảnh hưởng đến phảnứng của bao phấn trong nuôi cấy in vitro Chaleff, (1982) cho rằng: “Nhiệt độ tới hạncủa cây cho bao phấn là 18oC” Hơn nữa, nếu cây sống trong điều kiện nhà lưới cónhiệt độ cao thì sự hình thành callus và tái sinh cây giảm, tỷ lệ bạch tạng sẽ tăng [39].

Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của bao phấn.

Các giai đoạn phát triển của bao phấn nuôi cấy cũng có ảnh hưởng rất quan trọngđến kết quả nuôi cấy Bao phấn càng già thì tỷ lệ tái sinh cây càng thấp, đồng thời tỷ lệcây bạch tạng tăng Tuy nhiên không phải bất cứ loài cây trồng nào cũng có hiệu suấttối ưu ở giai đoạn trước hoặc sau một nhân, các loại hoà thảo có nhiều điểm khácnhau Theo Nizeki và Oono (1968) thì giai đoạn đơn nhân muộn là tốt nhất cho nuôicấy bao phấn lúa, còn theo Claphm (1971) lại cho rằng đại mạch có hiệu suất tạo câycao nhất ở giai đoạn đơn nhân sớm Một số yếu tố khác hỗ trợ có thể gây nên sự thayđổi về giai đoạn phản ứng tối ưu, ví dụ đối với lúa giai đoạn phản ứng tối ưu là trước

và giữa giai đoạn hạt phấn một nhân trong điều kiện nồng độ đường trong môi trườngnuôi cấy tăng từ 6 đến 9% (Chaleff ,1982) [39]

Để đạt được hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn và tạo cây đơn bội, giai đoạn pháttriển của hạt phấn có ý nghĩa quan trọng Chẳng hạn đối với lúa các nhà khoa học ởViện lúa quốc tế (IRRI) đã nghiên cứu 500 bao phấn chọn từ nhiều giống chứa hạtphấn ở các giai đoạn khác nhau, kết quả cho thấy hạt phấn ở giai đoạn từ đơn nhângiữa đến đơn nhân muộn là tốt nhất (Guzman, 2000), có nghĩa là cần lấy hoa khikhoảng cách giữa tai lá cờ và lá đối diện là 2- 4cm (Zapata, 1983) [66] Trên cây thuốclá Reed đã xác định được giai đoạn phát triển của bao phấn tốt nhất khi đài và trànghoa có chiều dài tương đương nhau [51]

Ảnh hưởng của kỹ thuật tiền xử lý vật liệu trước khi nuôi cấy

Việc xử lý lạnh hay xử lý nhiệt đối với bao phấn hoặc cây cho bao phấn trước khinuôi cấy đều có tác động đối với sự hình thành callus và tái sinh cây, nhiệt độ tối thíchphụ thuộc vào từng giống Điều kiện lạnh đã kích thích việc tạo callus sớm và khảnăng tái sinh cây cao, callus hình thành từ bao phấn được xử lý lạnh sẽ tạo ra nhiềucây đơn bội và ít cây lưỡng bội hơn từ bao phấn không xử lý Các giống khác nhau đòihỏi điều kiện xử lý có khác nhau, trạng thái sinh lý và giai đoạn phát triển của hạt phấncũng có ảnh hưởng đến hiệu quả xử lý Phan Hữu Tôn đã khẳng định khả năng hình

thành callus tăng lên gấp đôi khi xử lý lạnh các bao phấn chứa các bào tử ở giai đoạngiữa và cuối một nhân trong 7 -14 ngày, quá 14 ngày tỷ lệ hình thành cây xanh giảm[17].

Năm 1983 Ying đã nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý lạnh sớm lên hiệu quả nuôicấy bao phấn đã cho thấy: Xử lý lạnh làm tăng tỷ lệ tạo mô sẹo được chứng minh ởnhiều loài như thuốc lá, cà độc dược, lúa mạch và lúa nước Tapia và cs cũng cho là

xử lý lạnh làm chậm sự lão hoá của hạt phấn, làm tăng sự phân chia của hạt phấn vàgiúp giải phóng những chất cần cho sự sinh sản đơn tính đực (Tapia, 2000) Sugimotolại cho rằng xử lý lạnh làm tăng lượng axít amin tự do và làm thay đổi tương quangiữa các axit amin tự do dẫn đến tăng tần số tái sinh cây đơn bội [67], [64]

Yamaguchi và cs (1999) nhận xét: thời gian tối ưu để xử lý lạnh tuỳ từng cácgiống cây trồng khác nhau Nếu xử lý ở thời gian dài thì khả năng tạo mô sẹo giảmdần, có thể do hạt phấn bị giảm sức sống do giữ lâu trong tủ lạnh Đối với lúa, Gooal

và cs, (1996) cho biết khi xử lý lạnh ở nhiệt độ ôn hoà 10oC lên bao phấn trong 11ngày đã nâng tỷ lệ tạo mô sẹo từ 12,5% lên 32,8% Ngoài ra Tang và cs cũng cho thấy,

tỷ lệ tạo mô sẹo, tỷ lệ tái sinh cây và tỷ lệ cây xanh phụ thuộc nhiều bởi kiểu gen củacây cho phấn [56]

Như vậy việc xử lý lạnh rất có ý nghĩa trong phản ứng của bao phấn Một sốphương pháp xử lý khác như xử lý ly tâm, chiếu tia gamma, xử lý trong đều kiện yếmkhí tạo ra bởi nitơ phân tử hoặc áp suất nước bão hoà và với khí cacbonic ở 8oC trong

6 ngày đều có lợi cho sự hình thành callus [41]

Ảnh hưởng của điều kiện sau khi nuôi cấy

Nhiệt độ trong phòng nuôi có ảnh hưởng đến khả năng hình thành callus và táisinh cây Nhiệt độ tối thích cho sự hình thành callus là 25oC với biên độ là 25 – 28oC

và cho tái sinh cây là 20 – 25oC Nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối thích chính là nguyênnhân làm tăng cây bạch tạng Chen (1983) cho rằng nếu nhiệt độ phòng nuôi cao hơn

30oC thì hầu như chỉ tái sinh cây bạch tạng Wang và cs (1974) kết luận: việc hìnhthành cây xanh hay cây bạch tạng chủ yếu do nhiệt độ tại thời điểm bắt đầu phát triểnbào tử chứ không phải ở pha phân hoá callus, tuy nhiên quan điểm này vẫn cần phảilàm sáng tỏ thêm [60]

Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy giữ vị trí quan trọng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của nuôicấy bao phấn, nhiều môi trường đã được xây dựng và sử dụng như môi trường White(1953), môi trường Miashige và Skoog (1962), môi trường Nitsch (1969), môi trườngGamborg (1968) Tuỳ theo từng đối tượng nuôi cấy khác nhau những môi trường cơbản này sẽ được cải tiến thành nhiều môi trường khác cho phù hợp Tuy nhiên cũng cómột số quy luật chung: Các cây hoà thảo cần nhiều auxin, đặc biệt là 2,4D ở nồng độcao để khởi động sự phân chia đầu tiên Hàm lượng đường có thay đổi tuỳ đối tượng:Lúa mì 60120g saccaroza/l, cây họ cà chỉ cần 20- 40g/l Dịch chiết khoai tây, nấmmen, nước dừa, dịch thuỷ phân tỏ ra có tác dụng tốt trong nhiều môi trường nuôi cấybao phấn [51], [9].

Mặc dù trong các bao phấn rất giàu các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhưauxin và giberillin nhưng số lượng và chất lượng của các hooc môn và sự cân bằnggiữa auxin – cytokinin đựơc xem là rất quan trọng để xác định phản ứng giữa bao phấnvới môi trường và thay đổi sự biểu hiện di truyền Auxin cao và cytokinin thấp sẽ xúctiến cho quá trình tăng sinh callus, ngựơc lại sẽ thích hợp cho sự hình thành chồi vàcây con Trong một vài trường hợp lại không cần thiết đến sự có mặt của auxin (Evan,1981) [47]

Những auxin được sử dụng rộng rãi trong môi trường nuôi cấy bao phấn làαNAA(naphthalene acetic acid), IAA (indone acetic acid), 2,4-D (2,4dichlorophenoxyacetic acid) và CPA (p-chlorophenoxy acetic acid), 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid) Trong đó, αNAA ở nồng độ 1 – 2 mg/l được coi là có hiệu quả hơn so vớicác auxin đơn lẻ hay kết hợp khác [42], [39]

Theo Phan Hữu Tôn (2004) để tạo mô sẹo đối với cây lúa thì auxin 2,4D ở nồng

độ 2mg/l là thích hợp nhất [17] Nhưng Nguyễn Văn Uyển lại cho rằng phối hợp cả2,4D, αNAA và Kinetin sẽ cho hiệu quả cao nhất, tỷ lệ và các loại chất ĐHST còn phụthuộc vào từng kiểu gen [15]

Sự kết hợp khác nhau của auxin và cytokinin trên các môi trường đã được nghiêncứu rất nhiều nhưng sự kết hợp tối thích cần phải được thiết lập cho từng kiểu gen bởi

vì không có môi trường đơn lẻ nào biểu hiện tốt nhất cho nhiều kiểu gen (Karim,1987) [55]

Các chất chuyển hoá và các chất sinh trưởng khác nhau như DDT,

Actinomicyn-D và 2- deoxyglucose cũng được nghiên cứu, ABA và Actinomicyn-DActinomicyn-DT được coi là ngăn cản sự

phân chia tế bào và kích thích sự hình thành chồi xanh trong nuôi cấy bao phấn lúa.Trong khi đó, Actinomicyn-D và 2- deoxyglucose lại tăng cường sự hình thành callus

ở lúa mì và lúa nước ABA làm tăng sự tái sinh cây xanh nhưng mức tối thích lại tuỳtheo kiểu gen [57]

1.3.3 Nghiên cứu về kĩ thuật nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội in vitro trên

thế giới và trong nước

Các nghiên cứu ngoài nước

Trong nuôi cấy đơn bội, Các bao phấn dùng để nuôi cấy thường được lấy từ cáccây của quần thể F1 hoặc F2 nhằm tạo ra sự đa dạng di truyền tối đa trong quần thểnhững cây đơn bội được tạo thành Nhiễm sắc thể của cây đơn bội thông qua nuôi cấyhạt phấn F1, sau khi lưỡng bội hoá sẽ trở thành cây lưỡng bội thuần chủng, từ các câynày sẽ tạo thành quần thể các dòng thuần, qua đánh giá chọn lọc và cho ra giống mới[53]

Các tác giả Juhasz, Venczel, Balogh đã tạo cây đơn bội thông qua quá trình nuôicấy noãn chưa thụ tinh của cây dưa chuột và cây bí xanh Hoa cái được thu từ cây mẹtrồng trong nhà lưới có chiều dài 2–3 cm đối với cây bí xanh và 0,5 – 1 cm đối với câydưa chuột Cắt thành từng lát cấy vào môi trường có bổ sung 0,02 mg/1 TDZ, môitrường phát si nh phôi có chứa NAA và BA đều có kết quả đối với cả dưa chuột và bíxanh [48]

Năm 1974 Eun và cộng sự khi nuôi cấy bao phấn dưa chuột đã phát hiện calusphát triển từ bao phấn sau khi nuôi cấy 7 ngày trên môi trường có bổ sung 2,4 D Sau

30 ngày rễ và chồi sẽ xuất hiện [54] Theo Lazarte, và Sasser, (1982) bao phấn dưachuột được trên nuôi cấy môi trường Nitsch và Nitsch cải tiến sau đó tạo callus trênmôi trường cơ bản MS Phôi phát triển thành cây con trên môi trường Nitsch andNitsch đặc có chứa 20 g/lit raffinos [57]

Với cây dưa hấu tác giả Xue và cs (1989) cho rằng tiến hành lấy hoa khi baophấn ở giai đoạn một nhân, có kích thước 5 mm và nụ hoa có tràng hoa nhìn rõ sẽ chohiệu quả nuôi cấy tốt nhất Callus phát sinh trên môi trường khoáng MS có bổ sung2mg/l BA + 2mg/l Ki + 3 saccarose + 6-7% agar ở pH 5,8 Sự phát sinh cơ quan thuđược bằng nuôi cấy callus trên môi trường MS muối có bổ sung agar + 5-10 mg/l GA3+ 4mg/l BA + 30-40 mg/l adenine + 500mg/l lactalbumin hydrolysate Sự phát sinh cơ

quan chuyên hoá và sự phát triển chồi thu được trên môi trường nuôi cấy MS + 2mg/lTriaconital Rễ phát sinh trên môi trường agar + ½ MS + 0,2mg/l IBA + 1mg/l IAA +1,5% succarose + pH 5,7 Mặc dù tần suất rất thấp nhưng họ vẫn thu được cây đơn bội

và đơn bôi kép qua quá trình nuôi cấy [62]

Các nghiên cứu khác trên cây bí ngô Metwall cho thấy rằng khi nuôi cấy baophấn cây ở giai đoạn giữa và cuối của giai đoạn hạt phấn đơn nhân được thu vào buổisáng và xử lý ở nhiệt độ 4oC trong 4 ngày, khử trùng nụ hoa bằng ethanol 70% trong 2phút và trong Clorox 20% (5,2% sodium hypochlorite) trong 20 phút cấy trên môitrường MS + 150g succarose + 5mg/l 2,4D cho tỷ lệ tạo cây cao nhất Rễ của 20 câytạo ra được soi ở dưới kính hiển vi cho thấy 50% số cây là lưỡng bội và 50% số cây làđơn bội [46]

Đối với họ bầu bí thì dòng đơn bội kép được tạo ra thông qua nuôi cấy bao phấncòn nhiều hạn chế [48], [43], [33] Những yếu tố như đặc tính di truyền, điều kiệntrồng của cây mẹ, giai đoạn phát triển của tiểu bào tử, xử lý nụ hoa trước khi nuôi cấy,môi trường và điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng đến kết quả của quá trình nuôi cấy baophấn [36] Năm 1996, E.I Metwally và cộng sự đã nghiên cứu thành công tạo đơn bộicây bí ( Eskandarani) Ông tiến hành lấy bao phấn trước một ngày nở, tiếp xúc vớinhiệt độ lạnh ( 4oC) trong 2, 4, 8 ngày Sau đó nuôi cấy trên trên môi trường MS với30g đường sucrose, 8g agar, bổ sung nồng độ 2,4-D: 0,1 0,5 1 và 10 mg/l [35]

Năm 2010, T Yang, J Liu, B Liu, X M Li và H X Li qua nghiên cứu đã tạođược callus từ bao phấn cây mướp đắng, sau khi xử lý lạnh ở 4oC trong 1 ngày trênmôi trường MS có bổ sung 2,4-D 0,5mg/l [63] Sau đó, năm 2015 M Usman và cscũng đã nghiên cứu thành công tạo callus từ bao phấn cây mướp đắng trên môi trường

MS có bổ sung NAA kết hợp với BAP ( 3,22+0,88 µm/l) Bao phấn trước khi nuôi cấytạo callus phải qua 48 giờ xử lý lạnh ở 4oC [44]

Các nghiên cứu trong nước

Ở nước ta, công nghệ đơn bội được ứng dụng với hai mục đích chính:

- Cố định ưu thế lai thông qua việc rút ngắn thời gian tạo giống thuần chủng bằngphương pháp nuôi cấy bao phấn con lai F1

- Tạo dòng thuần có những đặc tính thích nghi với thụ phấn chéo và mang gen kết hợprộng

Sau năm 1975, nuôi cấy tế bào được phát triển, phương pháp nuôi cấy bao phấncũng được nghiên cứu Các kết quả đầu tiên nuôi cấy thành công bao phấn lúa được LêThị Muội công bố năm 1978 [11].

Nghiên cứu vật liệu ban đầu cho nuôi cấy tạo cây đơn bội, tác giả Nguyễn ĐứcThành (2000) cho thấy vật liệu ban đầu cho nuôi cấy có thể là bao phấn hoặc hạt phấntách rời Sử dụng bao phấn để nuôi cấy đơn giản hơn về mặt kỹ thuật và môi trườngnuôi cấy nhưng mô và cây có thể tạo thành từ mô soma của thành bao phấn và như vậyrất khó phân biệt với cây tự lưỡng bội bắt nguồn từ hạt phấn Tuy nhiên thành baophấn lại có vai trò quan trọng trong sự phát triển của hạt phấn Hạt phấn được khởi đầuphân chia trong bao phấn và chỉ những hạt phấn được khởi đầu phân chia mới tiếp tụcphát triển Thành bao phấn cung cấp một số chất dinh dưỡng chủ yếu cho tế bào hạtphấn và đóng vai trò như bể chứa chất trao đổi cho hạt phấn hấp thu, dự trữ và biến đổicác chất từ môi trường nuôi cấy Đối với hạt phấn tách rời sẽ rất khó khăn để nuôi cấy

và môi trường nuôi cấy cần giàu dinh dưỡng hơn Sự ổn định pH là yếu tố duy trì traođổi các chất trong tế bào vì vậy pH môi trường cũng cần được quan tâm Sự bền vững

và hấp thu nhiều chất phụ thuộc vào pH môi trường như αNAA, giberelin, vitamin, sắt,

pH thường là 5,5 - 5,8 trước khi khử trùng, pH mức cao hơn làm hầu hết các muốitrong môi trường có khuynh hướng kết tủa [11]

Trên cây dưa hấu Nguyễn Thị Thanh Dung khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởngđến kết quả nuôi cấy bao phấn của các giống dưa hấu (Hắc Mỹ Nhân, Siêu Nhân 0110,

SG 221) cho biết xử lý nụ hoa ở nhiệt độ 7oC trong 1 ngày và cấy trên môi trường B5

có bổ sung 1mg/l Ki + 1mg/l 2,4D + 3% Saccarose cho tỷ lệ tái sinh callus cao nhất[14]

Năm 2007 Nguyễn Thị Hiệp cho rằng các giống lúa thuộc loài phụ Japonica có tỷ

lệ tạo callus cao hơn các giống lúa thuộc loài phụ Indica Xử lý đòng ở nhịêt độ 7oCtrong 7 ngày cho hiệu quả tạo callus cao nhất và môi trường tái sinh cây thích hợp chonhiều kiểu gen là MS + 1mg/l Kinetin + 1mg/l αNAA + 1mg/l BAP [12] Khi nuôi cấybao phấn của các dòng bất dục đực di truyền nhân cảm ứng với môi trường tác giảNguyễn Thị Hồng Hạnh kết luận điều kiện ngoại cảnh của cây cho bao phấn (ánhsáng, nhiệt độ, chế độ dinh dưỡng ) và đặc biệt là yếu tố mùa vụ có ảnh hưởng rấtlớn đến tỷ lệ tạo callus và tái sinh cây của các dòng EGMS Nuôi cấy các dòng lúa

EGMS khi hạt phấn ở trạng thái hữu dục sẽ đem lại hiệu quả cao hơn nhiều so với nuôicấy ở thời điểm hạt phấn bất dục [13].

Trong chọn tạo giống mướp đắng bằng phương pháp truyền thống, để tạo đượcdòng thuần cho việc thử khả năng kết hợp chung và kết hợp riêng phải mất từ 7- 8 thế

hệ (3- 4 năm), mất rất nhiều thời gian và kinh phí, đồng thời kéo dài thời gian chocông tác chọn tạo giống Bằng phương pháp nuôi cấy hạt phấn mướp đắng sẽ khắcphục nhược điểm của phương pháp chọn tạo giống truyền thống Cây đơn bội kép tạo

ra từ nuôi cấy hạt phấn có độ đồng hợp tử tuyệt đối, hoàn toàn không phân ly trong cácthế hệ sau và có thể tạo ra được trong một thời gian ngắn (1 thế hệ), tiết kiệm được rấtnhiều kinh phí và đặc biệt rút ngắn thời gian cho công tác chọn tạo giống mướp đắng Tuy nhiên, việc ứng dụng kỹ thuật đơn bội phục vụ công tác tạo dòng thuần trongchọn tạo giống cây trồng vẫn còn nhiều hạn chế Hiện nay, kỹ thuật này mới chỉ ứngdụng được một phần rất nhỏ trong chọn tạo lúa, ngô còn các đối tượng cây trồng khácchưa được nghiên cứu nhiều Vì vậy, việc nghiên cứu nuôi cây bao phấn đối với nhiềuloại cây trồng nhằm rút ngắn thời gian tạo giống là rất cần thiết Đặc biệt là trong côngcuộc chuyển đổi cơ cấu cây trồng, để phát triển ngành nông nghiệp cần phát triểnngành công nghiệp chế biến, đẩy mạnh xuất khẩu, vấn đề rút ngắn thời gian tạo dòngthuần phục vụ công tác chọn tạo giống cần được quan tâm nhiều hơn nữa

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu.

Vật liệu nghiên cứu là các bao phấn thu từ các giống cây mướp đắng được trồngtại thôn Bầu Tròn xã Đại An huyện Đại Lôc tỉnh Quảng Nam

Hình 2.1 Nụ hoa mướp đắng và bao phấn hoa mướp đắng (A) Nụ hoa

mướp đắng (B) Bao phấn hoa mướp đắng.

Đặc điểm của giống được sử dụng:

Bảng 2.1 Đặc điểm giống sử dụng để thu hái nụ hoa.

ST

1 Khổ qua mỡ

F1 TN 187

Có dạng hình sinh trưởng bán hữu hạn

Thời vụ gieo trồng: quanh nămThời gian bắt đầu thu hoạch: 35-38 ngày sau khi gieo

2 Khổ qua lai

F1 Diago 26

Có dạng hình sinh trưởng bán hữu hạn

Cây sinh trưởng rất khỏe chống chịu virus rất tốt

Thời vụ mùa mưa

Thời gian bắt đầu thu hoạch: 35-38 ngày sau khi gieo, thuhoạch rộ và rất bền

Trái dài 20-23 cm, có màu xanh bóng cơm dày, gai nở to,không bị nức trái vào mùa mưa, vận chuyển đi xa tốt

Năng xuất trung bình 4,5-5kg/cây

3 Khổ qua lai

F1 Diago 25

Có dạng hình sinh trưởng bán hữu hạn

Cây sinh trưởng rất khỏe chống chịu virus rất tốt

Thời vụ mùa khô

Thời gian bắt đầu thu hoạch: 35-38 ngày sau khi gieo, thuhoạch rộ và rất bền

Trái dài 20-23 cm, có màu xanh bóng cơm dày, gai nở to,không bị nức trái vào mùa mưa, vận chuyển đi xa tốt

Năng xuất trung bình 4,5-5kg/cây

Có dạng hình sinh trưởng bán hữu hạn

Thời vụ: vụ chính đông xuân Trồng vụ mưa đất phải thoátnước tốt

Thời gian bắt đầu thu hoạch: 40-45 ngày sau khi gieo

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Đề tài tiến hành nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật,Khoa Sinh - Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng từ tháng 7/2016– 3/2017

2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu

Thu hái nụ hoa giống khổ qua lai F1 Diago 25 tại huyện Đại Lộc-Quảng Namvào buổi sáng từ 6h đến 7h sáng Theo M.Usman và cộng sự đã nghiên cứu thành côngviệc tạo callus từ bao phấn hoa mướp đắng với kích thước 13-15mm (kích thước trungbình của giống Faisalabad long), qua tiền xử ý 2 ngày (2015) [44] Vì mướp đắnggiống khổ qua lai F1 Diago 25 có kích thước lớn nhất là 10mm nên ta hái nụ hoa cókhích thước trung bình 4-6mm để nghiên cứu Nụ hoa được đặt trong đĩa pestri haytúi polyethylene Khử trùng nụ hoa mướp đắng theo công thức thí nghiệm sau:

- Công thức 1: Nụ hoa được ngâm, lắc trong cồn 70% trong 3 phút, rửa lại 3 lần

bằng nước cất vô trùng, sau đó thấm khô nụ hoa trên giấy thấm vô trùng, tách lấy baophấn đưa vào môi trường nuôi cấy

- Công thức 2: Nụ hoa được ngâm, lắc trong cồn 70% 30 giây, rửa lại bằng nước

cất vô trùng, tiến hành khử trùng bằng NaOCl nồng độ 5% trong 8 phút, rửa lại bằngnước cất vô trùng 5 lần Nụ hoa được thấm khô trên giấy thấm vô trùng, tách lấy baophấn đưa vào môi trường nuôi cấy

- Công thức 3: Nụ hoa được ngâm, lắc trong cồn 70% 30 giây, rửa lại bằng nước

cất vô trùng, tiến hành khử trùng bằng NaOCl nồng độ 5% trong 8 phút, rửa lại bằng

nước cất vô trùng 5 lần Nụ hoa được thấm khô trên giấy thấm vô trùng, tách lấy baophấn đưa vào môi trường nuôi cấy

- Công thức 4: Nụ hoa được ngâm, lắc trong cồn 70% trong 30 giây, rửa lại bằng

nước cất vô trùng Tiếp tục ngâm, lắc trong dung dịch HgCl2 0,1 % trong thời gian 5phút, sau đó rửa 3 lần với nước cất khử trùng Rồi thấm khô nụ hoa trên giấy thấm vôtrùng, tách lấy bao phấn đưa vào môi trường nuôi cấy

- Công thức 5: Nụ hoa được ngâm, lắc trong cồn 70% trong 30 giây, rửa lại bằng

nước cất vô trùng, tiến hành khử trùng bằng NaOCl nồng độ 0,1% trong 3 phút, rửa lạibằng nước cất vô trùng 3 lần Tiếp tục ngâm, lắc trong dung dịch HgCl2 0,1 % trongthời gian 3 phút, sau đó rửa 3 lần với nước cất khử trùng Tiếp tục ngâm, lắc trongdung dịch HgCl2 0,1 % trong thời gian 5 phút, sau đó rửa 3 lần với nước cất khử trùng.Thu nụ hoa vô trùng tách lấy bao phấn cấy trên môi trường MS có bổ sung 3%sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 0.2mg/l BA và 0.6mg/l NAA theo như M.Usman vàcộng sự đã nghiên cứu thành công (2015) [44] Đánh giá khả năng phát sinh callus sau1,2,3 tuần nuôi cấy thông qua các chỉ tiêu đánh giá sau:

Tỷ lệ phát sinh callus (%) = x 100

Số callus/mẫu (%) = x 100

Tỷ lệ sống của hạt phấn (khoanh 3 vùng khác nhau, mỗi vùng đếm 100 hạt phấndưới kính hiển vi) [37]

Tỷ lệ hạt phấn sống (%) = x 100Bao phấn sau 1 tuần nuôi cấy nhuộm bằng acetocarmine 0.1% trong 30 phút rồiquan sát dưới kính hiển vi quang học HSX Pro.Way-BK 5000 – Trung Quốc với độphóng đại 100 lần Hạt phấn sống bắt màu hồng còn hạt phấn chết thì không bắt màu[52]

2.2.2 Phương pháp tạo callus đơn bội cây mướp đắng

a Khảo sát ảnh hưởng của nguồn giống mướp đắng đến khả năng phát sinh callus đơn bội

Chọn trong số những giống cây mướp đắng (Đại Địa; Khổ qua mỡ F1 TN 187;Khổ qua lai F1 Diago 26; Khổ qua lai F1 Diago 25) loại giống có khả năng cho phátsinh callus đơn bội tốt nhất Bao phấn qua khử trùng, tách lấy bao phấn loại bỏ chỉ nhịnuôi cấy mẫu trên môi trường MS có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75

0.2mg/l BA và 0.6mg/l NAA [44] Đánh giá khả năng phát sinh callus sau 1, 2, 3 tuầnnuôi cấy thông qua các chỉ tiêu đánh giá sau:

Tỷ lệ phát sinh callus (%) = x 100

Vật liệu được thu hái từ giống cây mướp đắng cho phát sinh callus tốt nhất qua

xử lý mẫu cho tỷ lệ phát sinh callus tốt nhất, tách lấy bao phấn nuôi cấy mẫu trên môitrường MS có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 0.2mg/l BA và 0.6mg/l NAA[44] Đánh giá khả năng phát sinh callus sau 1,2,3 tuần nuôi cấy thông qua các côngthức:

Tỷ lệ phát sinh callus (%) = x 100

Số callus/mẫu (%) = x 100

c Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) đến sự phát sinh callus đơn bội

Khảo sát khả năng cảm ứng callus đối với các mẫu bao phấn trên môi trường MS

có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 và 2,4-D; KIN; NAA; BAP, trong đónồng độ các chất ĐHST thay đổi trong khoảng từ 0-2 mg/l, các chất này được bổ sungriêng rẽ hoặc kết hợp với nhau Đánh giá khả năng phát sinh callus được đánh giá sau

1 tuần, 2 tuần và 3 tuần nuôi cấy thông qua công thức:

Tỷ lệ phát sinh callus (%) = x 100

Số callus/mẫu (%) = x 100

d Khảo sát ảnh hưởng của tiền xử lý lạnh (4oC) đến khả năng phát sinh callus

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tiền xử lý lạnh ở 4oC trong thời gian 0, 1, 2, 3

và 4 ngày đến khả năng phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng Vật liệu được thuđược từ giống cây mướp đắng cho phát sinh callus tốt nhất được bảo quản ở 4oC trongcác khoảng thời gian khác nhau, sau đó tiến hành khử trùng và cấy vào môi trường chokhả năng phát sinh callus tốt nhất Đánh giá khả năng phát sinh callus sau 1, 2, 3 tuầnnuôi cấy thông qua công thức:

Tỷ lệ phát sinh callus (%) = x 100

Tỷ lệ phát sinh callus (%) = x 100

Tỷ lệ phát sinh callus (%) = x 100

Số callus/mẫu (%) = x 100

3.2.3 Bố trí thí nghiệm và xử lí thống kê

Tất cả các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,75 trước khi khử trùngtrong nồi hấp ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút Mẫu được nuôi trên môi trường thíchhợp ở nhiệt độ 25 ± 1oC, cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 12h/ngày.Mỗi công thức thực nghiệm bao gồm 10 bình nuôi cấy, thí nghiệm được bố trí lặplại 3 lần, trong mỗi bình có chứa 15 bao phấn

Số liệu được xử lý thống kê bằng cách sử dụng phần mềm phân tích thống kêSPSS theo phương pháp Turkey với α = 0,05

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Phương pháp xử lý mẫu

Khử trùng mẫu là khâu quan trọng nhằm loại bỏ các nguồn nấm, vi sinh, viruskhỏi mẫu, thu được nguồn mẫu vô trùng cho các nghiên cứu tiếp theo Có nhiều yếu tốảnh hưởng đến kết quả khử trùng như phương pháp lấy mẫu, thời gian khử trùng, hóachất khử trùng… Nụ hoa sau khi khử trùng mẫu tách lấy bao phấn cấy vào môi trường

MS có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 0.2mg/l BA và 0.6mg/l NAA [44].Sau 1 tuần những mẫu sạch sẽ bắt đầu tái sinh và được sử dụng để đánh giá khả năngsống của hạt phấn Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Các phương pháp xử lý mẫu.

Phương pháp Tỉ lệ nhiễm

(%)

Tỉ lệ hạt phấn sống (%)

Tỉ lệ phát sinh callus (%)

Cồn 70o 3 phút 70.37 b 94.67 a 6.67 cCồn 70o 30 giây; NaOCl 5% 7 phút 29.62 c 80 b 11.11 c

Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê

của trung bình mẫu với p<0,05 Dấu “–“: không có hiện tượng phát sinh callus.

Qua bảng 3.1 cho thấy phương pháp khử trùng cồn 70o 3 phút có tỷ lệ nhiễm caonhất 70,37% tỷ lệ hạt phấn sống cao nhất 94,67% nhưng tỉ lệ phát sinh callus rất thấp6,67% Phương pháp sử dụng H2O2 40% trong vòng 8 phút cũng cho tỷ lệ nhiễm cao85,19% tỷ lệ hạt phấn sống cao 79,33% nhưng không phát sinh callus Ở phương phápcồn 70o 30 giây; NaOCl 5% 3 phút; HgCl2 0,1% trong 3 phút cho phép thu được tỷ lệ

nhiễm thấp 18,5% tỷ lệ hạt phấn sống tương đối cao 81% nhưng tỉ lệ phát sinh calluscao nhất 44.44% Hai phương pháp cồn 70o 30 giây; NaOCl 5% 7 phút và cồn 70o 30giây; HgCl2 0.1% 5 phút thì cho các tỷ lệ trung bình (tương ứng 11.11% và 25,92%).Hoa mướp đắng có nhiều lớp bao hoa dày nên phải khử trùng mạnh bằng NaOCl 5% 3phút kết hợp HgCl2 0,1% 3 phút để thu bao phấn vô trùng, ở các phương pháp khửtrùng cho tỷ lệ hạt phấn sống cao nhưng tỷ lệ phát sinh callus thấp vì phần lớn các mẫu

chưa phát sinh callus đã loại bỏ vì bị nhiễm Vậy phương pháp cồn 70o 30 giây; NaOCl5% 3 phút; HgCl2 0.1% 3 phút được chọn để khử trùng bao phấn.

Hình 3.1 Hình callus phát sinh từ bao phấn và hạt phấn (A) Callus phát sinh từ bao

phấn (B) Hạt phấn chết không bắt màu (bên trái) hạt phấn sống bắt màu đỏ (bên phải)

soi dưới kính hiển vi (100X) Thanh ngang tỉ lệ 0.1cm

3.2 Ảnh hưởng của kiểu gen mướp đắng đến khả năng phát sinh callus

Tỷ lệ bao phấn tạo callus có liên quan đến kiểu gen của cây cho bao phấn, mỗiloại giống có kiểu gen khác nhau nên khả năng phát sinh callus của các giống là khácnhau Những giống tốt cho phản ứng phát sinh callus tốt hơn do có chứa nhiều gen tácđộng lên quá trình này Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 4 loại giốngđược trồng và cho năng suất cao tại Đại Lộc-Quảng Nam Mẫu được cấy lên môitrường MS có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 0.2mg/l BA và 0.6mg/l NAA[44] đánh giá khả năng phát sinh callus của các giống sau 3 tuần nuôi cấy, kết quảđược thể hiện ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Sự ảnh hưởng của kiểu gen mướp đắng đến khả năng phát sinh callus.

Tên giống Tỷ lệ phát sinh

callus (%)

Số callus/bình (%) Hình thái callus

Khổ qua mỡ F1 TN

187

Nhỏ gọn, kết khối,màu vàng

Khổ qua lai F1 Diago

26

Nhỏ gọn, kết khối, màu vàng Khổ qua lai F1 Diago

25

Nhỏ gọn, kết khối, màu vàng