NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SINH KHỐI SỢI NẤM VÂN CHI (TRAMETES VERSICOLOR (L.) PILAT) TRÊN MÔI TRƯỜNG DỊCH THỂ VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SỢI NẤM

TÀI LIỆU THAM KHẢO VỀ HƯƠNG NGHIÊN CỨU NẤM VÂN CHI, NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SINH KHỐI SỢI NẤM VÂN CHI (TRAMETES VERSICOLOR (L.) PILAT) TRÊN MÔI TRƯỜNG DỊCH THỂ VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SỢI NẤM CÓ ĐẦY TỦ TÀI LIỆU THAM KHẢO

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN SINH KHỐI SỢI NẤM VÂN CHI

(TRAMETES VERSICOLOR (L.) PILAT) TRÊN

MÔI TRƯỜNG DỊCH THỂ VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH

GIÁ CHẤT LƯỢNG SỢI NẤM

\\

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1.Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

3.1 Ý nghĩa khoa học 3

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 4

1.1 Giới thiệu chung về nấm vân chi và sợi nấm vân chi 4

1.1.1 Giới thiệu về nấm vân chi 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo của nấm vân chi 4

1.1.3 Đặc tính sinh học của nấm vân chi 5

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm vân chi 6

1.2 Giá trị dược tính của nấm vân chi cũng như sợi nấm 7

1.2.1 Tính chất dược học 7

1.2.2 Thành phần dược tính chính trích từ nấm vân chi 7

1.3 Các giá trị khác của vân chi 9

1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm vân chi 10

1.4.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất trên thế giới 10

1.4.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ở Việt Nam 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.2.1 Nghiên cứu đặc tính sinh học sợi nấm vân chi trên môi trường đặc 13

2.2.2 Ngiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh khối sợi nấm vân chi 13

2.2.3 Khảo sát hoạt tính sinh học và định lượng một số hợp chất có trong sợi nấm vân chi 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Khảo sát tốc độ sinh trưởng sợi nấm vân chi trên môi trường đặc 13

2.3.2 Khảo sát sự tăng trọng của sợi tơ nấm vân chi trong các môi trường dinh dưỡng lỏng khác nhau 14

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH 14

2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 14

2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy 15

2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thu sinh khối 15

3.3.7 Xác định sinh khối khô sợi nấm vân chi 15

2.4 Thực hiện kiểm tra sinh hóa để định tính các dược chất có trong tơ nấm vân chi 15

2.4.1 Phương pháp định tính alkaloid 15

2.4.2 Phương pháp định tính hợp chất saponin 16

2.4.3 Phương pháp định tính acid hữu cơ 17

2.4.4 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết sợi nấm vân chi bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn 17

2.4.5 Xác định khả năng kháng oxi hóa của nấm vân chi 18

2.5 Thực hiện kiểm tra sinh hóa để định lượng các dược chất có trong tơ nấm vân chi 18

2.5.1 Phương pháp định lượng polysaccharides 18

2.5.2 Xác định hàm lượng PSP thô có trong sợi nấm vân chi 19

2.5.3 Xác định hàm lượng PS ngoại bào có trong dịch môi trường nuôi cấy lắc nấm vân chi 19

2.5.4 Xác định hàm lượng khác trong sợi nấm vân chi 20

2.6 Phương pháp xử lý số liệu 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Khảo sát tốc độ sinh trưởng sợi nấm vân chi trên môi trường đặc 21

3.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự tăng trưởng sinh khối của sợi nấm vân chi 22

3.3 Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của sợi nấm vân chi trong môi trường dịch thể 24

3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của sợi nấm vân chi 25

3.5 Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy đến sự sinh trưởng của sợi nấm vân chi 26

3.6 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lắc đến sự sinh trưởng sợi nấm vân chi 27

3.7 Định tính một số dược chất có trong sợi nấm vân chi 30

a Định tính alkaloid 30

b Định tính saponin 30

c Định tính acid hữu cơ 32

3.8 Định lượng PSP, polysaccarides nội bào, polysaccharides ngoại bào trong sợi nấm vân chi 32

3.9 Khả năng kháng oxy hóa của sợi nấm vân chi 33

3.10 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết sợi nấm vân chi 34

3.11 Hàm lượng một số thành phần khác trong sợi nấm vân chi 35

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 45

MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay nhiều loài nấm được sử dụng làm thực phẩm giàu dinh dưỡng, một

số được sử dụng làm dược phẩm để chữa trị một số bệnh nguy hiểm như tim mạch,béo phì, giải độc và bảo vệ tế bào gan, phòng và điều trị loãng xương Trên thế giới

có khoảng 2000 loại nấm có thể ăn và làm thuốc, ngoài nguồn nấm thu hái từ thiênnhiên, người ta đã trồng được hơn 60 loại theo phương pháp thủ công, bán côngnghiệp, công nghiệp với hiệu quả và năng suất cao [22], [26] Nhiều nhà khoa họccho rằng nấm sẽ là một trong những thực phẩm rất quan trọng và thông dụng củacon người trong tương lai [6]

Ở nước ta vài năm trở lại đây, nghề trồng nấm dược liệu được xem là hướngphát triển kinh tế tốt, vừa có thể cung cấp được cho thị trường nguồn dược liệuphong phú, vừa tận dụng được các phế phẩm trong nông nghiệp Từ việc sản xuấtchỉ mang tính tiêu dùng tại chỗ, đến nay nấm dược liệu đã đi vào sản xuất ở quy môlớn, mang lại hiệu quả kinh tế cao

Xã hội ngày càng phát triển, chất lượng môi trường sống ngày càng giảm,nguồn thực phẩm hằng ngày không đảm bảo an toàn, ảnh hưởng đến sức khỏe.Chính vì thế con người cần cung cấp nguồn thực phẩm an toàn, sản phẩm chứanhiều hợp chất có hoạt tính sinh học Nấm vân chi là loài nấm được sử dụng phổbiến trên thế giới như là một nguồn dược liệu giúp chống lại ung thư Các loại thuốcchống ung thư hiện có trên thị trường không nhằm mục tiêu cụ thể mà gây ra nhiềutác dụng phụ và biến chứng trong điều trị lâm sàng của các dạng ung thư khác nhau,

do đó phương pháp điều trị mới hiệu quả và ít độc hại là vô cùng cấp thiết Hiệnnay, một số nấm được đánh giá cao và rất được quan tâm do có đặc tính chống ungthư và có các hợp chất hoạt động Trong nấm vân chi có chứa các hợp chấtpolysaccharid liên kết với protein, gồm hai loại chính: PSP (polysaccharide peptide)

và PSK (polysaccharide krestin) Hai hợp chất này được các nhà nghiên cứu Trung

Quốc và Nhật Bản phát hiện và chứng minh có đặc tính dược học quý giá PSP vàPSK có tác dụng với nhiều loại tế bào ung thư như các tế bào ung thư biểu mô(carcinoma) và các tế bào ung thư máu (leukemia) Ngoài ra nấm vân chi còn có tácdụng với nhiều loại ung thư khác như ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư gan,ung thư hệ bạch huyết [21] Hơn nữa, PSP còn giúp cải thiện chất lượng cuộc sốngcủa bệnh nhân ung thư trước và sau điều trị thông qua trọng lượng cơ thể và chỉ sốkarnotsky tăng [38]

Nấm vân chi được sử dụng phổ biến khắp thế giới, đặc biệt là Nhật Bản,Trung Quốc, Mỹ, các nước châu Âu Tại Nhật Bản các biệt dược bào chế từ nấmnày đứng đầu trong 10 loại thuốc chống ung thư được tiêu thụ mạnh nhất [14] Tạinước ta, nhu cầu sử dụng nấm vân chi ngày càng cao và như là một thực phẩm chứcnăng không chỉ đối với các bệnh nhân ung thư mà còn đối với người khỏe mạnh Docác dược chất trong nấm vân chi không chỉ có tác dụng đối với các loại ung thư màcòn giúp giải nhiệt, tăng cường sức khỏe, tăng cường hệ miễn dịch cho cơ thể [34],[38], [40]

Hiện nay trên nước ta hầu hết đều sử dụng quy trình trồng nấm truyền thốngtrên môi trường rắn Theo phương pháp này không những rất tốn thời gian để thuhoạch, mà còn chỉ có thể trồng vào mùa đông do nấm vân chi có đặc tính là nấmlạnh Do đó, sản lượng thu được không thể đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng Việcnuôi cấy nấm vân chi trên môi trường lỏng có khả năng khắc phục hầu hết cácnhược điểm khi trồng trên môi trường rắn, như rút ngắn thời gian sinh trưởng, chấtlượng tốt, không phụ thuộc vào khí hậu thời tiết Và đặc biệt là quá trình chiết táchhợp chất sinh học trong nấm dễ dàng hơn, và rất thích hợp sản xuất theo quy môcông nghiệp [24] Nhằm khắc phục các hạn chế khi nuôi trồng trên môi trường rắn,tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh khối sợi

nấm vân chi Trametes versicolor (L.:Fr) trên môi trường dịch thể và bước đầu đánh

giá chất lượng sợi nấm”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu chung về nấm vân chi và sợi nấm vân chi

1.1.1 Giới thiệu về nấm vân chi

Vân chi có nhiều tên gọi rất khác nhau Tên tiếng Anh là Turkey tail (đuôi gà tây) Ở Trung Quốc, người ta gọi là “Yunzhi” có nghĩa là loại nấm có hình dạng như mây Người Nhật thì gọi là “Karawatake” do người ta hay tìm thấy chúng ở những

nơi gần bờ sông [1]

Vân chi có tên khoa học phổ biến hiện nay là Trametes versicolor sau một thời gian dài được nghiên cứu và đặt tên khác nhau Trametes versicolor (L.:Fr) Pilát, tức là loài Coriolus versicolori (L.:fr) Quesl, được chính Carl von Linnaeus tìm ra và đặt tên đầu tiên: Boletus versicoler L.

Vân chi là một loài nấm lớn thuộc phân lớp Basidiomycetes gồm 22000 loài

đã biết Nấm vân chi gây hoại sinh cây bệnh, cư trú trên gỗ đã chết, thuộc loại nấmgây mục trắng mạnh nhất, có thể phá hủy đồng thời tất cả các cấu tử gỗ(hemicellulose, cellulose, lignin), giúp phá vỡ các gốc cây già, cây chết, vì thế chấtdinh dưỡng của cây sẽ trở về đất để tái sử dụng [1], [11]

Vị trí phân loại nấm vân chi [5], [13], [18]:

Giới nấm : Fungi

Ngành nấm thật : Eumycota

Ngành phụ nấm đảm : Basidiomycotina

Lớp nấm đảm : Basisiomycetes

Phân lớp nấm đảm đơn bào : Holobasidiomycetidae

Nhóm bộ : Hymenomycetes

Bộ nấm lỗ : Aphyllophorales

Họ nấm nhiều lỗ : Polyporaceae

Chi : Trametes

Loài : Tramestes versicolor

1.1.2 Đặc điểm hình thái cấu tạo của nấm vân chi

Vân chi là loại nấm hàng năm, trưởng thành dạng quả giá, chất da, hóa gỗ,không cuống Mặt trên tán phủ lông dày, mịn, rất dễ biến đổi về mặt màu sắc Đảmquả khi non dạng u lồi tròn, sau phân hóa thành dạng bán cầu, khi già đảm quả códạng thận, dạng quạt, thót dần lại ở phần gốc hay cũng có khi trải sát giá thể hay trảicuộn lại thành dạng vành với mép tán màu trắng – trắng kem [14] Nấm thường mọcthành tán dạng ngói lợp Mặt tán dễ thay đổi về màu sắc, đặc trưng bởi những vòngđồng tâm với màu sắc khác nhau, màu sắc từ trắng đến vàng nhạt, nâu nhạt, nâu rỉ

có sắc thái xanh đến đen

Kích thước thay đổi với đường kính tán trung bình cỡ 2 – 7 cm, dày cỡ 2,5 –

4 mm Thịt nấm mỏng, màu kem – hơi vàng, dày 0,6 – 2,5 mm, trên lát cắt hiển vithấy rõ lớp sắc tố đen xanh đặc trưng bên dưới lớp lông [19]

1.1.3 Đặc tính sinh học của nấm vân chi

Chu trình sống của nấm vân chi:

Đảm bào tử nảy mầm cho sợi sơ cấp Hai sợi sơ cấp khác phối hợp cho sợithứ cấp Sợi thứ cấp phát triển thành mạng sợi Trong điều kiện thuận lợi mạng sợi

sẽ kết hạch tạo tiền quả thể (nụ nấm) Nụ nấm tiếp tục lớn dần cho tai nấm trưởngthành, các phiến dưới mũ mang các đảm và sinh ra bào tử Đảm bào tử được phóngthích và chu trình lại tiếp tục [3], [12]

Giai đoạn phát triển của sợi nấm: Chu trình sống của nấm bắt đầu từ bào tửđảm nảy mầm cho sợi nấm, sợi nấm lúc đầu nhỏ có đường kính khoảng 1,5–1,0

mm, về sau lớn dần lên đến kích thước đường kính 1,0 – 2,0 mm Sau quá trình tiếphợp giữa hai sợi nấm sơ cấp đơn nhân sẽ hình thành nên các sợi nấm thứ cấp songnhân Các sợi nấm tăng trưởng theo kiểu tạo ra các móc (clamp) và để lại dấu vếtgiữa các tế bào Khi gặp điều kiện bất lợi các sợi nấm song nhân có thể tạo ra cácbào tử màng dày (bào tử áo – chlamydospore) giúp sợi nấm sống sót qua các trườnghợp bất lợi Bào tử màng dày, khi điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm tạo ra những sợinấm mới Khi sợi nấm thứ cấp đã phát triển dày đặc trên cơ chất sẽ bắt đầu quá trìnhphân hóa để tạo ra quả thể Trước khi ra quả thể thì sợi nấm phát triển sinh khối đếnmức tối đa chuẩn bị cho quá trình ra quả thể Nhưng điều đặc biệt là trong sợi nấm

có đầy đủ về lượng cũng như về chất giống như quả thể, nó có thể phòng và chữabệnh cho người, được sử dụng như một món ăn hay một chế phẩm sinh học [21].Trong giai đoạn phát triển sợi, nấm cần các nguồn dinh dưỡng môi trường đảm bảocác nguồn cung cấp về C, N và khoáng [2]

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm vân chi

Trong quá trình sinh trưởng phát triển của nấm vân chi chịu ảnh hưởng củanhiều yếu tố Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, độ pH, nồng độ

CO2; các chất dinh dưỡng cần thiết; vai trò điều khiển của các hoocmon, sự hiện diện

và hoạt động đóng mở của các gen thông qua hệ thông tin chuyển hóa cũng như cácchất trao đổi trong quá trình trao đổi chất ở nấm [6], [15]

*Dinh dưỡng

Trong tự nhiên nấm sinh trưởng trên các loại phế thải có nguồn gốc thực vật,nấm có khả năng phân huỷ các chất hữu cơ Đa số nấm ăn là sinh vi sinh vật dịdưỡng nên nấm cần được cung cấp carbon và nitơ.

- Carbon: khoảng một nửa trọng lượng khô của tế bào nấm được tạo thành từ

carbon Nấm cần một lượng lớn carbon nhiều hơn bất cứ nguyên tố nào khác.Nguồn carbon thường là muối carbonat, muối của acid hữu cơ (Trịnh Tam Kiệt,2012)

- Đạm: nitrogen là yêu cầu cơ bản trong môi trường sợi nấm sinh trưởng, nó

cần thiết cho sự tổng hợp các axit amin, tổng hợp protein là những nguyên liệu cầnthiết đòi hỏi cho việc tạo thành tế bào chất Không có protein, sự sinh trưởng khôngdiễn ra [6]

Nguồn nitrogen thường là peptone, nước luộc ngũ cốc, bột đậu tương, caonấm men, (NH4)2SO4, asparagine, alanine, glycin Cao nấm men là nguồn nitơ tốtnhất để kích thích tăng trưởng sợi nấm [30]

*Không khí

Nấm là sinh vật hiếu khí, sử dụng oxi, nhả khí cacbonic Thành phần củakhông khí, đặc biệt là nồng độ khí cacbonic có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởngcủa nấm [15].

1.2 Giá trị dược tính của nấm vân chi cũng như sợi nấm

1.2.1 Tính chất dược học

Theo y học cổ truyền Trung Quốc, nấm vân chi đen có tính hàn, có vị ngọt,

có tác dụng tốt đối với gan và lá lách Ngoài ra nấm vân chi được sử dụng làm giảmtrầm cảm, giảm đờm, chữa lành rối loạn phổi, tăng cường vóc dáng và năng lượng.Một số nghiên cứu khác cho thấy nấm vân chi giúp xua tan nhiệt, loại bỏ độc tố,tăng cường thể lực, tăng năng lượng và tinh thần, và nâng cao chức năng miễn dịchcủa con người [41]

Tại Trung Quốc có rất nhiều nghiên cứu chứng minh dịch chiết xuất nấm vân

chi có tác dụng ức chế 40 - 95% đối với sự tăng trưởng của tế bào ung thư, trong khi

đó lại không thấy có tác dụng phụ nào đáng kể [8]

Ngoài tác dụng chống ung thư, nấm vân chi còn có hiệu quả đối với các bệnhnhân dương tính với HIV Bằng cách sử dụng sản phẩm từ nấm vân chi, giúp conngười có biểu hiện tích cực như tăng cân, cảm thấy khỏe khoắn hơn, giải tỏa ức chếtâm lý Đặc biệt số lượng virus trong cơ thể họ đều giảm một cách đáng kinh ngạc(từ vài chục nghìn xuống vài nghìn) và số lượng các tế bào trình diện kháng thểCD-4 đều tăng [45]

1.2.2 Thành phần dược tính chính trích từ nấm vân chi

Vào khoảng năm 1965, ở Nhật, một kỹ sư hoá học đã khám phá ra thànhphần trị ung thư của nấm vân chi sau khi ông quan sát thấy người hàng xóm mắcbệnh ung thư hiểm nghèo đã được chữa khỏi sau khi sử dụng vân chi Điều này đãdẫn đến sự khám phá ra PSK (polysaccharide Kureha) Hợp chất PSP

(polysaccharide peptide) - chất có cấu tạo gần giống PSK cũng đã được phân lập lầnđầu tiên tại Trung Quốc năm 1983

PSK và PSP được sản xuất từ các dòng CM-101 và Cov-1 của nấm vân chi

Cả hai sản phẩm thu được bằng quá trình lên men theo lô Các polyme PSP / PSKtan trong nước nhưng không hòa tan trong methanol, pyridin, chloroform, benzen,

và hexane Lên men PSK kéo dài đến 10 ngày, trong khi sản xuất PSP thu được sau

64 giờ PSK và PSP đều được chiết tách dễ dàng bằng dung môi là nước nóng, PSKthu được từ dịch chết nước nóng bằng cách tủa bằng muối amoni sunfat, trong khiPSP được thu hồi bởi cồn [24]

Polysaccharides được nghiên cứu để tách chiết tạo thương phẩm từ nhiều loàinấm Năm 2001, Reshernikov và Cộng sự đã liệt kê 650 loài chứa polysaccharides

có hoạt tính sinh học có thể tách chiết từ quả thể, sợi nấm lên men và dịch thể nuôicấy [42]

Dịch trích polysaccharide peptide từ nấm (thuật ngữ gọi là proteoglycan) lànhững chuỗi polypeptide hay những phân tử protein nhỏ gắn kết chặt với các chuỗipolysaccharide β-D-glucan, là thành phần hiệu quả trong chữa trị các chứng ungthư: dạ dày, thực quản, ruột kết và ung thư vú… Polysaccharides được tìm thấytrong các vách tế bào không tiêu hoá được của vân chi có cấu trúc 3 chiều với cácchuỗi bên (chuỗi đường mạch thẳng) mọc nhánh xung quanh cấu trúc trục chính (lõiprotein hay polypeptide), các chuỗi bên có chức năng sinh học hay hoạt tính miễndịch cho phép sự tương tác giữa các chuỗi nhánh bên với các thụ thể trên các tế bàomiễn dịch khác nhau Thụ thể cho β-glucan được tìm thấy trên nhiều tế bào khácnhau: Tế bào tự sát thương (NK), tế bào bạch cầu trung tính, tế bào bạch cầu đơnnhân to, đại thực bào và tế bào lympho B, lympho T Nhiều nghiên cứu báo cáorằng β-1,3-glucan là chất kích hoạt hệ miễn dịch chống ung thư tự nhiên ở người vàphần glucan có thể kích ứng sự co lại của khối u [3], [12] Theo các nhà khoa họcthì chỉ có polysaccharide nối với peptide mới tạo ra hiệu quả kháng ung thư

*PSK

Ở Nhật Bản từ năm 1970, PSK từ nấm vân chi đã được chứng minh có khả

năng kéo dài thời gian sống thêm 5 năm hoặc hơn cho các bệnh nhân ung thư thuộcnhiều thể loại: ung thư dạ dày, ung thư đại tràng, ung thư vòm họng, ung thư thựcquản, ung thư phổi và ung thư vú (P.M.Kidd, 2000)

PSK cũng có tính kháng sinh mạnh, hiệu quả trên Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Cryptococcus neoformans, Psedomonas aeruginosa, Candida albicans và một số loại vi trùng khác gây bệnh ở người.

*PSP

PSP có một số tác dụng chính bao gồm: tăng cường miễn dịch bằng cách tạo

ra interleukin - 6, interferon, immunoglobulin - G, đại thực bào, và tế bào lympho T.PSP còn có tác dụng chống lại tác dụng ức chế miễn dịch của hóa trị liệu, xạ trị vàtruyền máu gây ra bởi khối u PSP còn giúp ức chế sự phát triển của các loại ungthư khác nhau bằng cách sản xuất superoxide dismutase (SOD), peroxidaseglutathione, và miễn dịch nói chung Theo các nghiên cứu khác, PSP còn giúp cảithiện sự ngon miệng và chức năng gan, làm dịu tâm hệ thần kinh, có thể điều trị rốiloạn đường ruột và có lợi trong điều trị các bệnh nhiễm trùng cơ hội cơ bản có thểngăn chặn đáp ứng miễn dịch Ngoài ra, PSP có thể có lợi cho sức khoẻ nói chungbằng cách kích thích các enzyme giải phóng các gốc tự do và giảm thiểu sự oxyhoá

PSP được phân lập từ sợi nấm có tác dụng khác như kháng u, hepatoprotective

và các hoạt động giảm đau [24]

Ngoài ra, PSP còn có tác dụng trị đái tháo đường tiềm năng như các chất ứcchế α-glucosidase (Lin et al, 2008; Yang et al) [52].

Ngoài hai chất PSK và PSP đã tách chiết được một loại peptide khác từ dịchchiết thô của polysaccharopeptide từ nấm vân chi [39] Chất peptide này có hoạttính chống ung thư cao hơn so với PSK và PSP và có tác dụng tiềm năng với hệmiễn dịch (tăng cường số lượng bạch cầu và lượng IgG ở chuột)

1.3 Các giá trị khác của vân chi

Giống nấm vân chi (T versicolor) ngoài mục đích thu sinh khối và quả thể

để làm thuốc nó còn được sử dụng trong nghiên cứu xử lý sinh học, sản xuất enzym(Walter và cộng sự, 2005)

Nấm vân chi sản xuất ra các enzyme phá gỗ như: laccaza, manganperoxidaze (MnP), lignin peroxidaze (LnP) Các enzyme này đang được nghiên cứuứng dụng trong lĩnh vực tẩy trắng bột cellulose Laccaza từ nấm vân chi có thể dùngtrong xử lý chất thải, khử màu chất thải từ khâu tẩy trắng [28], [38]

1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm vân chi

1.4.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất trên thế giới

Theo Liu và cộng sự (2010), phương pháp nuôi cấy truyền thống, giống nấm

ăn và nấm dược liệu đã được sản xuất trong các môi trường rắn sử dụng nguyên liệutổng hợp có chứa nhiều lignocellulose, quá trình này thường kéo dài 2 -3 tháng đểsản xuất ra đến quả thể Nuôi cấy trong môi trường dịch thể khác hẳn với nuôi cấytrên các cơ chất rắn vì nó đưa đến tiềm năng sản xuất giống nấm cao hơn trong mộtthời gian ngắn hơn với mức độ nhiễm bệnh ít hơn [50]

Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra rằng, sợi nấm sinh trưởng trong môitrường dịch thể là phương pháp thay thế nhanh chóng để thu sinh khối sợi nấm vớichất lượng phù hợp hơn [36]

Năm 1993 các nhà sinh học ở Đại học Sư phạm Thượng Hải đã dùng phương

pháp nuôi cấy chìm để thu nhận sợi nấm vân chi và phối hợp với Xí nghiệp Dược

phẩm Tân Khang để sản xuất ra thuốc Polysaccharopeptide PSP ứng dụng trong

lâm sàng, phối hợp với các biện pháp phẫu thuật hoặc hóa trị để điều trị ung thưphổi, ung thư đường tiêu hóa và ung thư vú

Năm 1981, Viện nghiên cứu kháng sinh Tứ Xuyên đã dùng sản phẩm nuôi

cấy chìm sợi nấm vân chi để chiết xuất polysaccharides nội bào và ngoại bào và

phối hợp với Xí nghiệp Dược phẩm Trùng Khánh để sản xuất ra thuốc Vân Tinhdùng để điều trị viêm gan do virut HBV và ung thư gan nguyên phát, đã đạt đượchiệu quả tốt

Adebayo và Ugwu (2011) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng

bổ sung tới sinh khối sợi nấm vân chi, thành phần môi trường cơ bản gồmMgSO4.7H2O (0,2 g); K2HPO4 (1,0 g); NH4SO4 (5,0 g); glucose (9,75 g); Cao nấmmen (CNM) (3,0 g); peptone (1,0 g) và 1l nước cất, được bổ sung 9,75 g của mỗinguồn carbon gồm: lactose, glucose, sucrose, mannitol, maltose, galactose, fructose,xylose, sorbitol và tinh bột Kết quả chỉ ra rằng nguồn carbon có ảnh hưởng lớn đếnsinh khối sợi nấm vân chi, bổ sung các nguồn lactose, mannitol, maltose sinh khốithấp hơn các nguồn carbon còn lại, sự biến thiên của sinh khối sợi khi bổ sung cácnguồn carbon này cũng rất khác so với các nguồn carbon cùng nghiên cứu Khi bổsung các nguồn lactose, glucose, mannitol, maltose sinh khối tăng cực đại ở ngàythứ 4, giảm xuống cực tiểu ở ngày thứ 7, sau đó đến ngày thứ 14 sinh khối lại tănggần như ngày thứ 4 Còn khi bổ sung nguồn carbon: sucrose, galactose, fructose,sorbitol và tinh bột, sinh khối tăng cực đại ở ngày thứ 7, sau đó giảm gần hết ở ngàythứ 14 Kết quả của các tác giả cho thấy nguồn nitơ và nguồn carbon ảnh hưởng lớnđến sinh khối sợi, đường cong sinh trưởng của giống không phải lúc nào cũng tuântheo quy luật tự nhiên mà nó phụ thuộc nhiều vào nguồn dinh dưỡng bổ sung [50]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ở Việt Nam

Ở nước ta hiện nay cũng có rất nhiều công trình nghiên cứu về nấm vân chi

và khả năng ứng dụng của nó

Lê Thị Hoàng Yến và cộng sự (2003) đã phân lập quả thể vân chi từ TrungQuốc, sau đó thử nghiệm trên môi trường lỏng cho kết quả thu được nấm vân chisinh trưởng tốt nhất trên môi trường 20 g bột đậu tương; 20 g đường kính; 2,5 g(NH4)2SO4; 2 g CaCO3; 1 g MgSO4; sinh khối đạt 16,68 g/l Tác giả cũng nghiêncứu khả năng sinh trưởng của nấm vân chi trên môi trường xốp, kết quả chỉ ra nấmvân chi sinh trưởng tốt trên môi trường 80 g bã rượu; 18 g cám gạo; 1 g thạch cao;1g CaCO3, sau 10 ngày sợi vân chi đã sinh trưởng kín bình nguyên liệu, nhanh hơn

so với môi trường khác từ 1 - 10 ngày [21]

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Thùy cho thấy sinh trưởng của sợinấm vân chi trên môi trường PDA cải tiến, nhiệt độ thích hợp là 300C, với pH tối ưu

là 6,5 và tốc độ lắc là 140 vòng/phút sẽ thu được sinh khối cao nhất [17]

Nghiên cứu của Lê Xuân Thám cho thấy sợi nấm vân chi trên môi trườngdịch thể cần các nguyên tố Kali, photpho Trong đó, Nồng độ Kali tối ưu cho sự

phát triển tơ nấm Trametes versicolor là 3o/oo, Nồng độ Photpho thích hợp nhất cho

sự tăng sinh khối của Trametes versicolor là 1o/oo [14]

Ở nước ta, nghiên cứu về tác dụng của nấm vân chi cũng được tiến hành,nấm vân chi là loại nấm có giá trị dược liệu cao, có hoạt tính chống khối u đạt tới77,5%, đặc biệt có tác dụng tốt ngăn ngừa các loại ung thư đường hô hấp, đườngtiêu hóa, ung thư vú, ung thư tử cung Ngoài ra nấm vân chi còn có tác dụng chốngviêm gan B mãn tính, tăng hệ thống miễn dịch cơ thể Thêm vào đó, vân chi còn cótác dụng thu gọn gốc oxi tự do và trung hòa chất độc (kể cả gốc dioxin), ngăn ngừađột biến gen [1]

Nhìn chung, ở nước ta có một số nhà khoa học tập trung nghiên cứu sâu vềnấm dược liệu (nấm linh chi, hắc chi, vân chi, nấm đầu khỉ, đông trùng hạ thảo,…),

việc nuôi trồng nấm để thu quả thể chủ yếu sử dụng nguồn giống thể rắn nên chothời gian thường kéo dài hơn Chính vì thế mà việc nuôi cấy nấm trong môi trườngdịch thể sẽ giúp rút ngắn thời gian nuôi trồng, đem lại hiệu quả kinh tế cao

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát tốc độ sinh trưởng sợi nấm vân chi trên môi trường đặc

Môi trường thí nghiệm là môi trường thạch PGA được đổ trên các đĩa petri

có cùng đường kính Môi trường được hấp khử trùng bằng hơi nước nóng ở

121oC/30 phút và sau đó đổ vào các đĩa petri Cấy giống từ môi trường thạch, mỗiđĩa cấy miếng thạch bằng nhau cắt từ ống nghiệm giống cấp 1 Ủ ở nhiệt độ phòng

Tiến hành đo độ dài tơ qua các khoảng thời gian 2, 3, 4, 5, 6 ngày sau khi cấy giống.

Xử lí số liệu để xác định tốc độ lan tơ của sợi nấm vân chi trên môi trường đĩathạch

2.3.2 Khảo sát sự tăng trọng của sợi tơ nấm vân chi trong các môi trường dinh dưỡng lỏng khác nhau

Các môi trường thí nghiệm là môi trường lỏng không có agar:

+ Môi trường tự nhiên: PG (khoai tây + đường)

+ Môi trường bán tổng hợp (BTH): khoai tây + muối khoáng + đường

+ Môi trường tổng hợp: Crapek, Raper

+Môi trường PG cải tiến: Khoai tây + đường + cao nấm men + peptone

Cho 50 ml môi trường vào chai thủy tinh cùng đường kính Mỗi môi trườngthực hiện 10 bình, hấp khử trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC/30 phút Để nguộimột ngày, cấy giống từ môi trường thạch, mỗi chai cấy 1 miếng thạch 0,5 cm3 cắt từống nghiệm giống cấp 1 Ủ ở nhiệt độ phòng, tiến hành thu và cân sinh khối sau 15ngày Xử lý số liệu để chọn ra môi trường tạo sinh khối nhiều nhất

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH

Tiến hành điều chỉnh môi trường về các pH khác nhau: 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8 Điều chỉnh pH acid dung dịch HCl 0,1N và pH kiềm dung dịchNaOH 0,1N Khử trùng môi trường 121oC/30 phút Sau 24h, cấy giống từ môi trường thạch, mỗi chai cấy 1 miếng thạch 0,5 cm3 cắt từ ống nghiệm giống cấp 1 Ủ ở nhiệt độ khảo sát tốt nhất ở trên, tiến hành thu và cân sinh khối sau 15 ngày Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Môi trường và pH sử dụng là môi trường và pH đạt hiệu quả cao nhất từ khảosát trên

Tiến hành khử trùng môi trường 121oC/30 phút Sau 24 giờ, cấy giống từ môitrường thạch, mỗi chai cấy 1 miếng thạch 0,5 cm3cắt từ ống nghiệm giống cấp 1

Nuôi ở 2 mức nhiệt độ 22 ± 2oC và nhiệt độ phòng (30 ± 2oC), tiến hành thu và cânsinh khối sau 15 ngày Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy

Khử trùng môi trường 121oC/30 phút Sau 24 giờ, cấy giống từ môi trườngthạch, mỗi chai cấy 1 miếng thạch 0,5 cm3 cắt từ ống nghiệm giống cấp 1 Nuối cấy

ở nhiệt độ phòng (30 ± 2oC) trong 2 điều kiện: không lắc, lắc với tốc độ 120vòng/phút (15 ngày)

2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thu sinh khối

Khử trùng môi trường 121oC / 30 phút Sau 24 giờ, cấy giống từ môi trườngthạch, mỗi chai cấy 1 miếng thạch 0,5 cm3 cắt từ ống nghiệm giống cấp 1 Nuối cấy

ở nhiệt độ phòng (30 ± 2oC) Sau các khoảng thời gian: 5, 7, 9, 12, 15 ngày tiếnhành thu sinh khối và cân sấy, tiến hành xử lí số liệu để tìm thời gian thu sinh khốitốt nhất

3.3.7 Xác định sinh khối khô sợi nấm vân chi

Khối lượng tươi: Sinh khối sợi nấm được lọc qua giấy lọc, sau đó cân để xácđịnh sinh khối tươi

Khối lượng khô: Khối lượng tươi của sợi nấm được sấy khô ở 50oC đến khốilượng không đổi, cân để xác định khối lượng khô

2.4 Thực hiện kiểm tra sinh hóa để định tính các dược chất có trong tơ nấm vân chi

Chuẩn bị mẫu thử:

Mẫu nguyên liệu khô được chiết với ethanol 700 trong 24 giờ Sau đó tiếnhành cô quay chân không, thu được dịch chiết nấm

2.4.1 Phương pháp định tính alkaloid [10], [17]

Chuẩn bị dịch sợi nấm vân chi để thử nghiệm.

* Áp dụng nguyên tắc thử của Webb với cách thử gồm 2 phần như sau:

Phần 1: Bột nấm xay nhuyễn (10 – 20 g) và dung dịch H2SO4 1% được chovào - erlen, đun nhẹ trong 1 giờ Lọc lấy dịch để thử nghiệm với cả 2 loại thuốc thử:Mayer và Dragendorff

Quan sát kết tủa, nếu có kết tủa theo qui định là dương tính Tuy nhiên, nếukhông có kết tủa, chưa thể kết luận là không có alkaloid mà phải tiếp tục thửnghiệm phần 2

- Phần 2: bột xay nhuyễn (10 – 20 g) ngâm nguội trong dung dịch prolliustrong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn

- Lọc và đun dung môi đến cạn, thu được cặn Hòa tan cặn trong dung dịchHCl 1% đun ấm cho dễ tan Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử:Mayer Dragendorff

Dung dịch prollius là hỗn hợp gồm: chloroform: ethanol 95% : NH4OH đậmđặc, theo tỉ lệ là 8 : 8 : 1 (môi trường phải có tính bazơ)

* Thuốc thử định tính alkaloid

- Thuốc thử Mayer:

Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nước cất và 5 g KI trong 10 ml nước cất.Thu hỗn hợp 2 dung dịch này lại và thêm nước cất cho đủ 100ml Nhỏ vài giọtthuốc thử Mayer và dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuấthiện kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt Cần lưu ý vì tủa tạo thành có thể hòa tan trởlại trong lượng thuốc thử hoặc hòa tan bởi ethanol có sẵn trong dung dịch thử

- Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff (KBiI 4 - Kali tetraiodobismutat ) vàodung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu

cam – nâu

2.4.2 Phương pháp định tính hợp chất saponin [4], [7]

Chiết 10 g sinh khối sợi nấm vân chi với cồn 70% bằng cách ngâm trong 24giờ rồi lọc Cô dịch lọc bốc hơi đến cắn khô Dùng cắn để làm các phản ứng địnhtính

-Thí nghiệm tạo bọt

Saponin có tính tạo bọt, nên đây là một trong những phương pháp chính xác

để định tính sự hiện diện của saponin

Phương pháp tiến hành: hòa tan một lượng cắn tương ứng với 1 g dược liệuvào 5 ml nước nóng Lọc vào một ống nghiệm 1,6 – 16 cm và để nguội, thêm nướccho đủ 10 ml, lắc mạnh dọc theo chiều ống nghiệm trong 1 phút Để yên ốngnghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả:

+ Bọt bền trong 15 phút: +

+ Bọt bền trong 30 phút: ++

+ Bọt bền trong 60 phút: +++

-Thử nghiệm Fontan – Kaudel

Lấy một lượng cắn tương ứng với 1 g bột dược liệu, đun nóng nhẹ trên cáchthủy để hòa tan với 10 ml nước Chia đều 2 ống nghiệm

2.4.3 Phương pháp định tính acid hữu cơ [4], [7]

Lấy 2 ml dịch chiết cồn cho vào một ống nghiệm Thêm vào dung dịch một íttinh thể natri Na2CO3, hơ nhẹ qua ngọn lửa Nếu có các bọt khí sủi lên từ các tinhthể Na2CO3 thì kết luận là có acid hữu cơ

2.4.4 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết sợi nấm vân chi bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn [10]

Cấy ria tạo khuẩn lạc trên môi trường đĩa thạch LB

- Chuẩn bị dịch vi khuẩn (Escherichia coli):

Cấy ria tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch LB, vi khuẩn được tồn trữ trongống thạch nghiêng và bảo quản lạnh ở 4oC Từ ống tồn trữ, chọn 2 - 3 khuẩn lạc đưavào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LB đã khử trùng, nuôi cấy tĩnh ở 37oC trong

16 - 18 giờ

-Tiến hành:

+ Dùng pipet man hút 100 μl vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bào 106 CFU/ml), sau đóchang đều trên mặt đĩa thạch (50 ml môi trường LB/đĩa thạch) đã khô ổn định, chờkhô bề mặt Sau đó tiến hành cho dịch chiết nấm đầy giếng thạch đã được đục lỗsau khi cấy vi khuẩn Chuyển các đĩa petri vào tủ lạnh (4oC) khoảng 4 – 8 giờ đểdịch chiết nấm khuếch tán ra thạch Sau đó đem nuôi ở 37oC trong 16 – 18 giờ Đọckết quả và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn Đường kính vòng vô khuẩn (D - d)được xác định bằng đường kính vòng ngoài trừ đi đường kính đục lỗ thạch (1 cm)

2.4.5 Xác định khả năng kháng oxi hóa của nấm vân chi

Sử dụng phương pháp Reducing power để kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa:lần lượt lấy (50 -500 μg) bột chiết pha trong 1 ml nước cất, 2 ml dung dịch ethanol96%, 2 ml dung dịch đệm phosphate (0,2M; pH 6,6) và 2 ml kali ferricyanide (1%)vào các ống nghiệm và ủ ở 30oC trong 30 phút Tiếp đó, thêm vào hỗn hợp 2 mltrichloroacetic acid 10% rồi đem li tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút Cuốicùng lấy 3 ml phần dung dịch trên bề mặt pha với 2 ml ethanol 96% và 0,5 ml ferric

chloride 0,1% Đo độ hấp thụ của dung dịch trên với thiết bị UV - Vis ở bước sóng

700 nm Thực hiện tương tự với mẫu kiểm chứng

Công thức tính chỉ số chống oxy hóa:

AAI = Rcontrol RsampleAAI: chỉ số chống oxy hóa

Rsample: mật độ quang của mẫu

Rcontrol: mật độ qua mẫu kiểm chứng

2.5 Thực hiện kiểm tra sinh hóa để định lượng các dược chất có trong tơ nấm vân chi

2.5.1 Phương pháp định lượng polysaccharides

Polysaccharides có nhiều dạng và nhiều qui trình chiết khác nhau Chiết PS ở

100oC trong 16 giờ, cho năng suất ly trích cao, nhưng làm biến đổi cấu trúc sinh họccác polysaccharides có trong nấm vân chi Qui trình chiết xuất polysaccharides từnấm vân chi (Yihuai gao và cộng sự, 2001):

Tơ nấm đã sấy khô nghiền đem ngâm nước ở 70oC trong 3 giờ, tiến hànhchiết thu được dịch chiết lần 1 và bã chiết lần 1 Lặp lại quá trình ngâm và chiết với

bã chiết lần 1 ta thu được dịch chiết và bã chiết lần 2 Bã chiết lần 2 ngâm với cồn

80o ở 70oC trong hai giờ thu được dịch chiết lần 3 Thu nhận được 3 dịch chiết vàtủa bằng cồn 70o Thu phần cặn và bổ sung vào 1ml nước cất và 3 ml phenol Hỗn hợpđược bổ sung 7 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc và đun nóng tại 400C trong 30 phút,sau đó đem mẫu để nguội ở nhiệt độ phòng trong 20 phút, tiến hành so màu tại bướcsóng 492 nm Làm mẫu đối chứng tương tự, dùng 3 ml nước cất thay mẫu Từ hiệu

số giá trị OD (λ = 485 nm) giữa dịch mẫu và đối chứng sẽ tính được hàm lượngpolysaccharides có trong mẫu bằng cách so sánh với giá trị OD (λ = 485 nm) củaglucose (4 - 20 mg/ml) được dùng làm chất chuẩn

2.5.2 Xác định hàm lượng PSP thô có trong sợi nấm vân chi

Hàm lượng PSP thô được xác định bằng phương pháp của Ueno S và cộng sự [49].

Tiến hành thí nghiệm:

Mẫu tơ nấm được đem đi ngâm nước nóng ở nhiệt độ 800C - 980C trong 2 - 3 h.Sau đó đem đi làm lạnh và lọc, bã được đem đi chiết bằng nước nóng như trên để cóthể chiết hết lượng PSP có trong tơ nấm Dịch đem đi cô quay cho bay bớt hơinước, sau đó tiến hành tủa PSP bằng cồn 70o, tiến hành lọc là thu tủa, đem đi sấytrong vòng 24 giờ ở 50oC và cân trọng lượng (trừ đi trọng lượng của giấy lọc saukhi sấy khô cùng điều kiện) Từ đó đánh giá được hàm lượng PSP có trong sợi nấmvân chi

2.5.3 Xác định hàm lượng PS ngoại bào có trong dịch môi trường nuôi cấy lắc nấm vân chi

Hàm lượng PS ngoại bào thô được xác định thông qua phương pháp của Wu

2.5.4 Xác định hàm lượng khác trong sợi nấm vân chi

- Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Biure

- Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet.

- Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp nung đến khối lượng không đổi

- Định lượng vitamin B1 bằng phương pháp huỳnh quang

Ngày thứ 8 Ngày thứ 6

3.1 Khảo sát tốc độ sinh trưởng sợi nấm vân chi trên môi trường đặc

Giống cấp 1 được cấy trên trên môi trường đĩa thạch PGA Sau khoảng thờigian nuôi cấy sợi phát triển có độ dài tơ được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1 nhưsau:

Bảng 3.1 Độ dài tơ nấm vân chi trên môi trường đĩa thạch PGA theo thời gian

Tốc độ lan tơtrung bình(μm/h)

Độ dài tơ

Qua bảng 3.1 cho thấy sợi nấm phát triển trên môi trường thạch nhanh, từchỗ cấy ban đầu tơ nấm lan đều ra bên ngoài theo các hướng của đĩa thạch Ở 2ngày đầu tiên, tơ nấm phát triển tương đối chậm (độ dài tơ từ 0,5 - 1,1 cm) và mảnh

Ở ngày thứ 4, tơ nấm bắt đầu lan mạnh với độ dài tơ nấm 3,4 cm Ở ngày thứ 5 và

6, tơ nấm phát triển lan hết đĩa thạch (độ dài tơ từ 5,7 - 7,5 cm) và có màu trắngđục, mật độ tơ nấm dày Khi tơ nấm già, tơ nấm chuyển sang màu vàng và dừngsinh trưởng ở ngày thứ 8

Theo bảng, tốc độ lan tơ trung bình của sợi nấm vân chi đạt 375 μm/h Kếtquả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Guerrero cộng sự (2011) chỉ ra rằng tốc

độ lan tơ trên môi trường thạch PGA của sợi nấm vân chi là 380 μm/h [29]

Hình 3.1 Hình dạng sợi nấm phát triển trên môi trường đĩa thạch

3.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự tăng trưởng sinh khối của sợi nấm vân chi

Dinh dưỡng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng củanấm Trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau, tốc độ tăng trưởng của sợi là khácnhau

Nhu cầu dinh dưỡng cho sinh tổng hợp các chất tạo sinh khối sợi phụ thuộcvào mỗi loại nấm và điều kiện nuôi cấy Nguồn dinh dưỡng carbon khác nhau cóảnh hưởng trực tiếp đến khả năng phân giải và hấp thụ dinh dưỡng của tế bào.Nguồn dinh dưỡng nitrogen được sử dụng cho sự tăng trưởng sợi nấm là amoniac,muối amoni, axit amin và nitrogen hữu cơ phức tạp [47]

Kết quả thí nghiệm về sự sinh trưởng của sợi nấm vân chi trong các môitrường dịch thể có thành phần dinh dưỡng bổ sung khác nhau được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Lượng sinh khối trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau

Chú thích: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa

thống kê với độ tin cậy 95%.

Từ kết quả bảng 3.2 cho thấy môi trường PG cải tiến thu được sinh khối caonhất đạt 0,4917 g sinh khối khô Trong môi trường PG cải tiến có đầy đủ nguồnđạm cung cấp cho sợi nấm để tổng hợp các chất hữu cơ: protein, purin cho vách tếbào đảm bảo sợi phát triển tốt Tại các môi trường BTH và Agaricus cũng tạo ralượng sinh khối khô tương đối cao, lần lượt là 0,4093 g và 0,4005 g Ở môi trườngRaper và Czapek không chứa các nguồn dinh dưỡng tổng hợp và các nguồn dinh

dưỡng tự nhiên nên sợi phát triển kém, sinh khối thu được rất thấp Sinh khối khôthu được ở hai môi trường này lần lược là 0,0763g và 0,0459 g.

Theo nghiên cứu Bolla và cộng sự (2010) bổ sung vào môi trường nuôi cấysinh khối sợi nấm vân chi 8 nguồn đạm, kết quả chứng minh casein và cao nấm men

là nguồn đạm cho sinh khối sợi nấm vân chi cao đáng kể sau 7 ngày nuôi cấy Từkết quả này cho thấy ở hàm lượng nhất định thì cao nấm men và pepton là nguồnđạm giúp sinh khối sợi tăng trưởng đáng kể, và các nguồn dinh dưỡng bổ sung tựnhiên từ khoai tây cũng cũng rất thích hợp cho sợi nấm phát triển [23] Nitrogenhữu cơ được sử dụng rộng rãi nhất cho hầu hết các loại nấm và cho hiệu quả sinhtrưởng của sợi nấm trong môi tường dịch thể cao hơn nguồn vô cơ

Nghiên cứu khác của Shil và cs (2007), Vladimir (2012) khẳng định nitrogenhữu cơ phù hợp cho sinh trưởng của sợi nấm

0.10.20.30.40.50.6

Hình 3.2 Lượng sinh khối nấm vân chi trong các môi trường dinh dưỡng