Sản xuất vaccine dịch tả từ vi khuẩn Vibrio Cholerae

Tim hiều vi khuẩn tả vibrio cholerae, Xây dựng dây chuyền nhà máy sản xuất vaccine, thiết kế và bố trí thiết bị trong nhà máy

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG

KHÓA HÓA

BÁO CÁO ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 2

ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG NHÀ MÁY SẢN XUẤT VACCINE DỊCH TẢ NĂNG SUẤT 20 TRIỆU

LỜI CẢM ƠN

Sau hơn bốn tháng thực hiện đồ án công nghệ 2 với đề tài “ Xây dựng nhà máy sản xuất vaccine dịch tả với năng suất 20 triệu liều/năm”, đến nay em cơ bản đã hoàn thành được đề tài của mình so với mục tiêu đề ra

Để đạt được như vậy là nhờ vào sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình và sự động viên của các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè Đặc biệt, em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết

ơn sâu sắc đến cô TS Nguyễn Thị Minh Xuân, giảng viên bộ môn Công nghệ Sinh học

- Đại học Bách Khoa Đà Nẵng, người đã trực tiếp hướng dẫn và theo sát em trong suất quá trình thực hiện đề tài này cũng như tận tình truyền đạt và chỉ dạy lại cho em những kiến thức và kinh nghiệm vô cùng quý báu

Em xin trân trọng gởi lời cảm ơn đến toàn thể quý thầy, cô giáo bộ môn ngành Công nghệ Sinh học – Đại học Bách khoa Đà Nẵng đã chỉ dạy cho em những kiến thức

về các môn đại cương cũng như các môn chuyên ngành, giúp em có được nền tảng kiến thức lý thuyết vững chắc và tạo điều kiện giúp đỡ để em hoàn thành đề tài

Quá trình làm đồ án đã tạo cho em cơ hội được ứng dụng các kiến thức đã học vào thực tiễn, hiểu thêm về vaccine dịch tả cũng như cách tính toán và lựa chọn, bố trí thiết bị trong phân xưởng, nhà máy sao cho phù hợp, kinh tế nhất Đồng thời đây cũng

là cơ hội để em ôn lại và củng cố các lỗ hỏng kiến thức một cách hiệu quả, nhận ra các vấn đề sai khác trong lý thuyết so với xu hướng phát triển thực tế hiện nay

Mặc dù đã cố gắng và nổ lực để hoàn thành đồ án một cách tốt nhất, tuy nhiên do kiến thức bản thân còn hạn chế, quá trình làm đồ án khó tránh khỏi thiếu sót Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của quý thầy cô và các bạn

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn !

Đà nẵng, ngày 25 tháng 8 năm 2021

Sinh viên thực hiện

Lê Hồng Diễm

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1:Cơ chế gây bệnh tả 3

Hình 1.2: Vi khuẩn Vibrio cholerae 4

Hình 2.1: Hệ thống sản xuất WFI dựa trên cơ chế thẩm thấu ngược RO 12

Hình 2.2: Cơ chế tiệt trùng và làm nguội 15

Hình 2.3: Thiết bị len men 16

Hình 2.4: Hệ thống lọc dòng chảy tiếp tuyến TFF 17

Hình 2.5: Thiết bị gia nhiệt 2 lớp vỏ 18

Hình 2.6: Nồi khuấy trộn có cánh khuấy 19

Hình 2.7: Thiết bị chiết rót vaccine 20

Hình 2.8: Kiểm tra trực quan vaccine 21

Hình 4.1: Thùng chứa 46

Hình 4.2: Tủ cấy TL-NCLF×V 48

Hình 4.3: Bình tam giác thể tích 100ml và 150ml 49

Hình 4.4: Bình tam giác thể tích 1000ml và 2000ml 50

Hình 4.5: Hệ thống bioreactor 10 lít và 15 lít 52

Hình 4.6: Bioreactor 100 lít và bioreactor 150 lít 54

Hình 4.7: Thiết bị tiệt trùng và làm nguội 57

Hình 4.8: Cấu tạo của bioreactor 58

Hình 4.9: Hệ thống lọc tiếp tuyến Sartoflow Beta 62

Hình 4.10: Nguyên lý làm việc của thiết bị lọc tiếp tuyến 63

Hình 4.11: Thiết bị lọc tiếp tuyến Mini T01 68

Hình 4.12: Thiết bị khuấy trộn gia nhiệt 10 lít 69

Hình 4.13: Bơm ly tâm 73

Hình 4.14: Bơm định lượng 73

Hình 4.15: Băng tải 75

Hình 4.16: Hệ thống thẩm thấu ngược RO 5m3 76

Hình 4.17: Sơ đồ nguyên lý của hệ thống RO 76

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1-1: Các type huyết thanh của Vibrio cholerae 6

Bảng 2-1:Thành phần môi trường APW 13

Bảng 3-1: Kế hoạch sản xuất của nhà máy 23

Bảng 3-2: Thành phần của một liều vaccine 24

Bảng 3-3: Hao hụt dự kiến qua các công đoạn 25

Bảng 3-4: Thành phần môi trường 35

Bảng 3-5: Tổng kết nguyên liệu và các sản phẩm phụ qua từng giai đoạn 42

Bảng 3-6: Khối lượng các nguyên liệu phụ 44

Bảng 4-1: Thông số kĩ thuật tủ cấy vi sinh dòng khí thổi đứng TL-NCLF×V 47

Bảng 4-2: Thông số kỹ thuật của bình tam giác 100ml và 150ml [12] 49

Bảng 4-3: Thông số kĩ thuật của bình tam giác 1000ml và 2000ml [12] 51

Bảng 4-4: Thông số kĩ thuật lần lượt của bioreactor 10 lít và bioreactor 15 lít [12] 52

Bảng 4-5: Thông số kĩ thuật của bioreactor 100 lít và bioreactor 150 lít [12] 54

Bảng 4-6: Thông số kĩ thuật của cân định lượng OKS-LC 56

Bảng 4-7: Thông số kỉ thuật của thiết bị tiệt trùng và làm nguội 56

Bảng 4-8: Thông số kỹ thuật thiết bị lên men 1600 lít 59

Bảng 4-9: Thông số thiết bị lên men 1000 lít 60

Bảng 4-10: Thông số kỹ thuật của hệ thống lọc tiếp tuyến SARTOFLOW Beta 61

Bảng 4-11: Thông số kỹ thuật thiết bị lọc tiếp tuyến Mini T01 67

Bảng 4-12: Thông số thiết bị khuấy trộn gia nhiệt 68

Bảng 4-13: Thông số kĩ thuật BN-10 71

Bảng 4-14: Thông số kĩ thuật thiết bị đóng lọ 72

Bảng 4-15: Tổng số bơm cần sử dụng 74

Bảng 4-16: Thông số kĩ thuật của băng tải 75

Bảng 4-17: Tổng kết thiết bị chính trong quy trình sản xuất 77

Bảng 4-18: Tổng các thiết bị thùng chứa qua các công đoạn 78

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Quy trình công nghệ sản xuất vaccine tả bất hoạt toàn tế bào 11

Sơ đồ 3.1: Quá trình lên men 26

Sơ đồ 3.2: Giai đoạn cấy giống 30

Sơ đồ 3.3: Giai đoạn làm nguội 34

Sơ đồ 3.4: Giai đoạn tiệt trùng 35

Sơ đồ 3.5: Giai đoạn lọc 36

Sơ đồ 3.6: Giai đoạn hoàn nguyên 37

Sơ đồ 3.7: Giai đoạn bất hoạt 38

Sơ đồ 3.8: Giai đoạn lọc TFF loại formalin 39

Sơ đồ 3.9: Giai đoạn phối trộn 40

Sơ đồ 3.10: Giai đoạn rữa 40

Sơ đồ 3.11: Giai đoạn làm giàu 41

Sơ đồ 3.12: Giai đoạn hấp phụ 41

Sơ đồ 3.13: Giai đoạn đóng lọ 42

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC HÌNH ẢNH ii

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

MỤC LỤC v

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

Giới thiệu về bệnh tả 2

1.1.1 Nguyên nhân gây bệnh 2

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh 3

Giới thiệu vi khuẩn Vibrio cholerae 4

1.2.1 Nguồn gốc 4

1.2.2 Cấu trúc, phân loại 4

1.2.2.1 Cấu trúc 4

1.2.2.2 Phân loại 4

1.2.3 Đặc tính sinh hóa 5

1.2.4 Tính chất nuôi cấy 5

1.2.5 Cấu tạo kháng nguyên 6

Các loại vaccine phòng bệnh tả 6

1.3.1 Vaccine tiêm 6

1.3.2 Vaccine uống tự nhiên 7

1.3.2.1 Vaccine chết toàn tế bào (WCK) 7

1.3.2.2 Vaccine tiểu đơn vị 7

1.3.2.3 Các vaccine sống, giảm độc lực 7

1.3.2.4 Vaccine lai tạo 8

1.3.3 Tình hình phát triển vaccine tả tại Việt Nam 8

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực vaccine 8

1.3.4.1 Chất lượng vaccine 8

1.3.4.2 Liều lượng sử dụng 9

1.3.4.3 Quá trình bảo quản 9

CHƯƠNG 2 QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VACCINE DỊCH TẢ 10

Sơ đồ quy trình công nghệ 10

Thuyết minh quy trình công nghệ 12

2.2.1 Xử lý nước trong sản xuất vaccine 12

2.2.2 Chuẩn bị giống 13

2.2.3 Nhân giống 13

2.2.4 Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng 14

2.2.5 Tiệt trùng và làm nguội môi trường 14

2.2.6 Lên men 15

2.2.7 Lọc TFF 16

2.2.8 Hoàn nguyên 17

2.2.9 Bất hoạt 17

2.2.10 Phối trộn 18

2.2.11 Lọc TFF 19

2.2.12 Rữa 19

2.2.13 Làm giàu 19

2.2.14 Hấp phụ 19

2.2.15 Đóng lọ 20

2.2.16 Kiểm vaccine thành phẩm 20

CHƯƠNG 3 TÍNH CÂN BẰNG VẬT CHẤT 23

Kế hoạch sản xuất của nhà máy 23

Các số liệu ban đầu 23

Hao hụt dự kiến qua các công đoạn 24

Cân bằng vật chất 25

3.4.1 Lên men 26

3.4.2.1 Nhân giống chủng V Cholerae O1, Phil 6973 31

3.4.2.2 Nhân giống chủng V.Cholerae O139, 4260B 32

3.4.2.3 Nhân giống chủng V Cholerae O1, Cairo 50 32

3.4.2.4 Nhân giống chủng V Cholerae O1, Cairo 48 34

3.4.2.5 Nhân giống chủng V Cholerae O1, E1 Tor, 638 34

3.4.3 Làm nguội 34

3.4.4 Tiệt trùng 35

3.4.5 Pha chế môi trường 35

3.4.6 Lọc 36

3.4.7 Hoàn nguyên 37

3.4.8 Bất hoạt 38

3.4.9 Phối trộn 40

3.4.10 Rữa 40

3.4.11 Làm giàu 41

3.4.12 Hấp phụ 41

3.4.13 Đóng lọ 42

Tổng kết 42

CHƯƠNG 4 TÍNH TOÁN VÀ CHỌN THIẾT BỊ 45

Cách chọn và tính toán thiết bị 45

4.1.1 Nguyên tắc và chọn thiết bị 45

4.1.2 Tính toán thiết bị 45

4.1.3 Công thức tính thể tích thùng chứa hình trụ đứng 46

Tính toán và chọn thiết bị 47

4.2.1 Tủ cấy giống 47

4.2.2 Hoạt hóa giống 48

4.2.3 Nhân giống cấp I 50

4.2.4 Nhân giống cấp 2 51

4.2.5 Nhân giống sản xuất 53

4.2.6.1 Cân định lượng 56

4.2.6.2 Thùng chứa môi trường 56

4.2.7 Thiết bị tiệt trùng và làm nguội 56

4.2.8 Lên men 58

4.2.9 Lọc TFF và hoàn nguyên 61

4.2.9.1 Thùng chứa dịch lên men được đưa vào hệ thống lọc TFF 64

4.2.9.2 Thùng chứa dịch lên men loại bỏ sau lọc 65

4.2.9.3 Thùng chứa muối dung dịch NaCl 0,9% 65

4.2.10 Thiết bị bất hoạt bằng Formalin 65

4.2.10.1 Thùng chứa dung dịch formalin 65

4.2.10.2 Thùng chứa dịch ủ bất hoạt 66

4.2.10.3 Thiết bị lọc TFF 67

4.2.11 Thiết bị bất hoạt bằng nhiệt độ 68

4.2.12 Thiết bị phối trộn 69

4.2.13 Thiết bị rữa 69

4.2.13.1 Thùng chứa dịch kháng nguyên sau lọc có bổ sung thêm đệm 70

4.2.13.2 Thùng chứa dung dịch đệm WHO – Buffer 70

4.2.13.3 Thùng chứa dịch loại bỏ sau lọc và nước sau làm giàu 70

4.2.14 Thiết bị làm giàu 71

4.2.15 Thùng hấp phụ 71

4.2.16 Thiết bị đóng lọ 71

4.2.16.1 Thiết bị chiết rót và đóng nắp 71

4.2.16.2 Thiết bị rữa, sấy lọ vaccine 72

4.2.16.3 Cân kiểm tra trọng lượng 72

4.2.16.4 Thiết bị dán nhãn 72

4.2.17 Thiết bị vận chuyển 73

4.2.17.1 Bơm 73

4.2.17.2 Băng tải 75

Tổng kết 77

4.4.1 Thiết bị chính trong quy trình sản xuất 77

4.4.2 Thiết bị thùng chứa 78

KẾT LUẬN 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, việc sử dụng vaccine trong phòng chống dịch bệnh cho người và động vật đã không còn xa lạ Vaccine đã xuất hiện từ lâu và ngày càng phát triển mạnh mẽ trong thời đại công nghệ tiến bộ Vào thế kỷ XVII, Louis Pasteur đã phát hiện ra vi khuẩn tả trên đàn gà của mình từ đó mở đường cho ngành miễn dịch học hiện đại phát triển Nhiều công ty dược phẩm trong và ngoài nước đã ra đời và tìm ra nhiều loại vaccine phòng chống các bệnh từ vi khuẩn, vi rút như uốn ván, bạch hầu, ho gà, trong

đó phải kể đến là những thành tựu nổi bật trong việc tìm kiếm vaccine phòng bệnh dịch

tả

Trên thế giới, còn có hai loại vắc-xin đang được dùng là vắc-xin của Thụy Điển

và của Mỹ Cả hai loại vắc-xin này đều có giá thành cao (15USD và 20USD), nên không được áp dụng rộng rãi trong y tế công cộng Tại nước ta, công việc nghiên cứu vaccine

tả bắt đầu từ những năm cuối thập niên 80, nhóm nghiên cứu do cố GS Đặng Đức Trạch, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương chủ trì Nhóm đã phát triển thành công vaccine tả có hiệu lực cao, có thể sản xuất được ở quy mô lớn trong điều kiện trang thiết bị có sẳn, với giá thành ổn định có thể được sử dụng rộng rãi trong y tế công cộng, có tính bền vững cao để có thể bảo quản, vận chuyển dễ dàng và cách đưa vào cơ thể đơn giản dễ gây miễn dịch Loại vaccine này được sản xuất bằng công nghệ lên men, có thể sản xuất

5 - 6 triệu liều/năm và cách đơn giản để sử dụng là uống

Theo các báo cáo thống kê tỷ lệ sử dụng vaccine tả thường xuyên đạt từ 80% tới trên 95% số trẻ trong diện đối tượng Tại Việt Nam, vaccine dịch tả được sử dụng trên thị trường thường ở dạng huyền dịch với giá thành 115,000 VNĐ

Tuy nhiên, đến nay dịch tả hiện vẫn còn xảy ra hằng năm trên 50 nước với mức

độ hậu quả mà nó mang lại là vô cùng nghiêm trọng, có thể dẫn đến tử vong Nguyên nhân phần lớn là do thực phẩm bẩn xuất hiện ngày càng nhiều, nguồn nước bị ô nhiễm hoặc do hệ thống xử lý chất thải ở các nước chưa tốt Điều này là cơ hội vô cùng thuận lợi cho loại dịch bệnh này phát triển nên việc xây dựng thêm các nhà máy để sản xuất

vaccine tả là rất cần thiết Chính vì vậy em lựa chọn đề tài “ Thiết kế nhà máy sản xuất

vaccine dịch tả từ vi khuẩn Vibrio Cholerae với năng suất 20 triệu liều/năm”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Giới thiệu về bệnh tả

Bệnh tả hoặc thổ tả ( Cholera) là một bệnh nhiễm trùng đường ruột cấp tính do vi

khuẩn tả Vibrio cholerae gây ra Bệnh dễ lây lan, gây ra thành dịch dưới các hình thức:

dịch lẻ tẻ, dịch lưu hành và đại dịch

Người bệnh có triệu chứng tiêu chảy tháo nước dữ dội; phân trắng đục như nước

vo gạo; có thể nôn, đau bụng, sốt nhẹ Ngoài ra, còn có dấu hiệu mất nước: Da nhăn, mắt trũng, khát nước Bệnh dễ lạy lan qua nguồn nước Vi khuẩn tả tồn tại lâu trong nước, thậm chí cả trong nước biển và cả trong nước đá Đường lây thứ hai là thức ăn, nhất là các loại hải sản tươi sống như tôm, cá, sò

Bệnh rất hiếm thấy ở các nước phát triển nơi mà nước sinh hoạt thường đảm bảo

vệ sinh Ở các nước đang phát triển, những nơi đông dân cư, điều kiện vệ sinh đặc biệt

là vệ sinh nước uống và thực phẩm kém là những điều kiện để lây bệnh tiêu chảy

1.1.1 Nguyên nhân gây bệnh

Vi khuẩn Vibrio cholerae là nguyên nhân gây ra bệnh tả ở người Độc tố cholerae

do vi khuẩn tả sản sinh trong ruột non chính là nguyên nhân quan trọng nhất gây ra bệnh Độc tố này liên kết với thành ruột, cản trở dòng chảy bình thường của natri và clorua, làm cho cơ thể tiết ra một lượng nước khổng lồ, dẫn đến tiêu chảy và nhanh chóng mất một lượng lớn nước và điện giải

Người nhiễm vi trùng tả có thể không mắc bệnh nhưng vẫn có vi trùng này trong phân và lây cho người khác khi phân của họ nhiễm vào nước hay thức ăn

Người ta dễ bị nhiễm vi trùng tả từ những nguồn sau:

- Nước uống từ giếng, sông, nước máy không được xử lý kỹ

- Đồ biển, nhất là nghêu sò, từ những vùng nhiễm vi trùng

- Rau sống và trái cây Ở những nước đang phát triển, phân thú vật chưa oải và nước cống dùng tưới cây có thể là nguồn nhiễm bệnh

- Gạo nấu chín và để ngoài trời dễ là môi trường cho vi trùng sinh sôi

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh

Hình 1.1:Cơ chế gây bệnh tả

Vi khuẩn tả gây bệnh ở người bằng cách xâm nhập qua hệ tiêu hóa Dịch tiêu hóa

ở dạ dày có tính acid là hàng rào bảo vệ cơ thể đầu tiên trước vi khuẩn tả Một khi chúng sống sót và đi qua khỏi dạ dày vào đến ruột non thì sẽ bám dính vào tế bào niêm mạc ruột nhờ có các yếu tố bám dính như kháng nguyên Toxin- coregulated pilus (TCP), kháng nguyên ngưng kết hồng cầu nhạy cảm với mannose Tại đây, vi khuẩn tả nhân lên và tiết ra độc tố ruột tuy nhiên chúng không xâm nhập vào trong các tế bào niêm mạc ruột

Độc tố ruột của vi khuẩn tả (CTX hay CT) là một protein gồm 2 tiểu phần A (Active) và B (Binding) có chức năng riêng biệt Tiểu phần A có hai tiểu đơn vị A1 và A2, tiểu phần B có 5 tiểu đơn vị B1, B2, B3, B4 và B5 Tiểu phần B có chức năng gắn độc tố ruột vào thụ thể ganglioside GM1 ở trên màng của tế bào niêm mạc ruột, còn tiểu phần A mà chủ yếu là A1 xâm nhập vào bên trong tế bào hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm tăng nồng độ AMP vòng nội bào làm cho tế bào niêm mạc ruột giảm hấp thu Na+, tăng tiết nước và Cl-, gây ra tiêu chảy cấp tính Nếu không được điều trị tích cực bệnh nhân sẽ chết vì kiệt nước và mất các chất điện giải

Độc tố tả còn gây nên ức chế miễn dịch tế bào bằng cách tác động trực tiếp lên macrophage và tế bào lympho T

Trong quá trình sinh bệnh tả, độc tố tả và vi khuẩn tả không gây nên thương tổn niêm mạc ruột Vì vậy cơ chế hấp thụ lại muối, nước và glucose vẫn nguyên vẹn Đây

là cơ sở sinh lý cho việc bù dịch bằng đường uống dung dịch có điện giải và glucose có tác dụng tốt

Giới thiệu vi khuẩn Vibrio cholerae

Chi (genus) : Vibro

Loài (species): V.cholera

V.cholerare được nhà giải phẫu học người Ý Filippo Pacini xác định gây ra bệnh

tả vào năm 1854, tuy vậy khám phá của ông không được công nhận rộng rãi đến khi Robert Koch nghiên cứu độc lập sau đó ba mươi năm và công bố thông tin về bệnh cũng như phương pháp phòng chống

1.2.2 Cấu trúc, phân loại

1.2.2.1 Cấu trúc

Vi khuẩn tả là những vi khuẩn Gram âm hình que giống như những chiếc roi, chiếc gậy uốn cong Tế bào vi khuẩn có thể xếp liên tiếp nhau thành hình chữ S hay hình xoắn Chúng di động nhanh nhờ đơn mao ở 1 đầu, không sinh nha bào, phản ứng oxidase dương tính, có thể tăng trưởng trong điều kiện hiếu khí

1.2.2.2 Phân loại

Vibrio cholerae được phân loại thành 3 nhóm chính:

Vibrio cholerae O1: thuộc nhóm huyết thanh O1 có khả năng sinh độc tố ruột và

gây ra bệnh dịch tả Vibrio cholerae O1 bao gồm type sinh học cổ điển và type sinh học

El Tor

Vibrio cholerae O139: là tác nhân gây ra bệnh dịch tả được phát hiện lần đầu tiên

vào năm 1992 tại Ấn Độ và Bangladesh Độc lực của nó là độc tố ruột và kháng nguyên pili đồng điều hòa độc tố (Toxin coregulated pili - TCP)

Vibrio cholerae không phải O1/O139: bao gồm các nhóm huyết thanh từ O2 -

O138 không có khả năng gây dịch tả

Ngoài ra còn có các Vibrio khác: V mimicus, V parahaemolyticus,

V.furnissii,…[1]

Hình 1.2: Vi khuẩn Vibrio cholerae

1.2.3 Đặc tính sinh hóa

Vi khuẩn tả có oxidase, trong quá trình lên men không sinh hơi H2S với nguồn đường glucose, saccharose, D-mannitol, maltose, không lên men arabinose Phản ứng indol dương tính, phản ứng Voges-Proskauer âm tính đối với sinh tuýp cổ điển và dương tính đối với sinh tuýp El Tor Đồng thời cho phản ứng oxydaza (+), đây là test phân biệt quan trọng vi khuẩn tả với các vi khuẩn đường ruột Gram (-) khác

1.2.4 Tính chất nuôi cấy

Vi khuẩn tả hiếu khí, nhiệt độ thích hợp 370C nhưng có thể phát triển ở 16-420C

Dễ nuôi cấy trên môi trường thông thường, đặc biệt phát triển tốt trong môi trường peptone kiềm (pH 8,5 -9,5) và nồng độ muối cao (3%)

Hiện nay môi trường thông dụng thường được sử dụng để phân lập phẩy khuẩn tả

là môi trường TCBS (Thiosunfat, Citrate Bile Salts, Saccharose) và môi trường dùng để tăng sinh phẩy khuẩn tả là môi trường peptone kiềm APW (Ancalin peptone water) Kiểm tra chủng sản xuất vaccine tả trên thạch TCBS:

Lắc đều tuýp chứa canh khuẩn tả, nhỏ 0,1 ml canh khuẩn vào đĩa thạch TCBS, dùng que cấy cấy ria trên đĩa thạch, ủ các đĩa thạch ở nhiệt độ (35 ± 1,0)°C trong 48h Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc và sự chuyền màu của môi trường nuôi cấy

tạ thời điểm 24h và 48h Đọc kết quả sau 48h

Tiêu chuẩn chấp thuận: Khuẩn lạc trong, môi trường TCBS từ màu xanh lá cây chuyển màu vàng

Kiểm tra tính chất sinh vật hóa học của chủng sản xuất: Lắc đều tuýp (ống) chứa canh khuẩn tả, cấy 0,1 ml canh khuẩn vào tìm 2 ống môi trường (arabinose, mannose, saccharose) Ủ các ống môi trường ờ nhiệt độ (35 ± 1,0) °C trong 48 h, theo dõi sự chuyển màu của môi trường Đọc kết quả sau 48 h

+ Dương tính (+): Môi trường chuyển sang màu vàng

+ Âm tính (-): Môi trường giữ nguyên màu ban đầu

Tiêu chuẩn chấp thuận: Tính chất sinh vật hóa học của tất cả các chủng sản xuất vaccine tả: arabinose (-), mannose (+), saccharose (+)

Ngoài ra còn có một số môi trường khác cũng được sử dụng như: Môi trường đặc chứa pepton 1% (thạch kiềm), môi trường Macconkey, [2]

1.2.5 Cấu tạo kháng nguyên

Vibrio cholerae là một loài bao gồm các vi khuẩn gây bệnh tả và cả những vi khuẩn

không gây bệnh tả nhưng có sự giống nhau về cấu trúc của ADN, do đó có sự giống nhau về tính chất sinh vật hoá học Phẩy khuẩn tả có 2 loại kháng nguyên:

- Kháng nguyên H (kháng nguyên lông) : Là kháng nguyên chung cho tất cả các loại vi khuẩn tả, dễ bị phá huỷ ở 1000C/2 giờ

- Kháng nguyên O (kháng nguyên thân): Là một lipopolysaccharid, có tính đặc hiệu cao, bị phá huỷ ở 1000C/1 giờ Căn cứ vào sự khác nhau của kháng nguyên

O, Vibrio cholerae được chia thành hơn 200 nhóm, các chủng gây dịch tả trước

đây đều thuộc nhóm kháng nguyên O1

Vibrio cholerae O1 chia ra 3 typ huyết thanh, các kiểu huyết thanh này được phân

biệt trong các xét nghiệm kháng thể ngưng kết và diệt vi khuẩn trên cơ sở các kháng nguyên soma lipopolysaccharide (LPS):

Bảng 1-1: Các type huyết thanh của Vibrio cholerae

Typ huyết thanh Thành phần kháng nguyên

Hikojima A,B,C Nhóm bệnh tả có một loại kháng nguyên chung là A, và các typ huyết thanh được phân biệt bởi các loại kháng nguyên đặc hiệu là B (Ogawa) và C (Inaba) Đối với cả hai

biotype (E1 Tor và cổ điển) của Vibrio cholerae O1 thì đều chứa hai kiểu huyết thanh

chính là Inaba và Ogawa

Ngoài ra, năm 1992 xuất hiện một nhóm kháng nguyên mới là O139 gây dịch tả ở nhiều nước trên thế giới Nhóm này có nguồn gốc từ biotype El Tor đại dịch nhưng đã mất đi kháng nguyên soma đặc trưng O1 và giữ lại khả năng gây dịch của các chủng này

Miễn dịch kháng vi khuẩn chủ yếu do LPS, nhưng các kháng thể kháng các protein khác của tế bào vi khuẩn tả cũng có vai trò quan trọng Vì LPS là kháng nguyên thống trị của bệnh tả, điều này dẫn đến khả năng bảo vệ giữa các type huyết thanh chéo không hoàn hảo và ít hoặc không có sự bảo vệ giữa các nhóm huyết thanh chéo Do đó, để bảo

vệ các cá nhân khỏi tất cả các thách thức liên quan đến bệnh tả về mặt lâm sàng, vaccine

tả nên bao gồm các kháng nguyên O1 Inaba, O1 Ogawa và O139 LPS

Các loại vaccine phòng bệnh tả

1.3.1 Vaccine tiêm

Vaccine tả tiêm được phát triển và thử nghiệm lần đầu tiên vào những năm 1960

Đó là vaccine bất hoạt toàn tế bào (Whole cell killed, WCK) O1 Inaba hoặc Ogawa đơn giá đã được tiêm cho trẻ em Bangladesh Kết quả cho thấy vaccine Inaba không hiệu

quả cho những trẻ bị nhiễm trùng bởi Ogawa và ngược lại dẫn đến việc phát triển vaccine

đa giá gồm cả 2 chủng trên Vaccine dịch tả tiêm toàn tế bào đã chết (WCK) đã được

sử dụng trong thế kỷ 19 và vẫn còn cho đến năm 1970 Tuy nhiên, loại vaccine này có thời gian bảo vệ ngắn và khả năng gây phản ứng của vaccine tả ngoài đường tiêu hóa, cộng với yêu cầu về dụng cụ tiêm và nhân viên được đào tạo, cho đến nay nhiều nước

đã không còn sử dụng loại vaccine cổ điển này

1.3.2 Vaccine uống tự nhiên

Hiện đang được sử dụng rộng rãi vì dễ sử dụng hơn, dễ chấp nhận hơn đối với người nhận và giảm nguy cơ lây truyền các bệnh nhiễm trùng qua đường máu

1.3.2.1 Vaccine chết toàn tế bào (WCK)

Vaccine WCK hay còn gọi là vaccine tả uống bất hoạt là một chế phẩm sinh hoc được điều chế từ vi khuẩn tả toàn tế bào đã bị bất hoạt bằng formaldehyde hoặc nhiệt

độ Bao gồm các vi khuẩn tả thuộc type cổ điển, E1 Tor và O139 Vaccine này đã được phát triển từ những năm 1990 và được chứng minh là có hiệu quả cao trong việc phòng chống dịch tả.[3]

1.3.2.2 Vaccine tiểu đơn vị

Vaccine WC/rBS: vaccine gồm có tiểu đơn vị B đã tỉnh chế từ độc tố tả, và các vi khuẩn tả thuộc type cổ điển và type El Tor (Inaba và Ogawa) Tiểu đơn vị B hoàn toàn không độc, nhưng có khả năng sinh kháng thể trung hòa như độc tố toàn vẹn

Môt thử nghiệm đã được thực hiện ở Bangladesh, Peru, cho hiệu quả bảo vệ người uống phòng tới 85% trong 6 tháng đầu theo dõi Thời gian bảo vệ của vắc xin thay đổi tùy theo tuổi và kéo dài 6 tháng ở trẻ em và 2 năm ở người lớn Hiệu quả bảo vệ giảm nhanh sau 6 tháng ở trẻ nhỏ nhưng vẫn còn khoảng 60% ở trẻ lớn và người lớn sau 2 năm Thử nghiệm lâm sàng cho thấy thuốc dùng an toàn Tuy nhiên vaccine này cũng không được sủ dụng phổ biến do chế độ hai liều, không sử dụng được cho trẻ em dưới

1 tuổi thời hạn sử dụng ngắn, chi phí cao và cần phân phối theo dây chuyền lạnh

1.3.2.3 Các vaccine sống, giảm độc lực

Vaccine CVD 103-HgR: Vaccine sống giảm độc lực uống một liều duy nhất (Biệt dược Orokol) do Bema Biotek (Thụy Sỹ) sản xuất Thuốc đã được thử nghiệm trên người lớn tình nguyện uống 1 liều duy nhất ở Mỹ cho thấy hiệu quả bảo vệ cao (95%) chống lại V cholerae cổ điển và 65% bảo vệ chống được V cholerae El Tor 3 tháng sau khi uống phòng

Một thử nghiệm rộng lớn ở Indonesia không chứng minh một cách thuyết phục hiệu quả bảo vệ cho quần thể phơi nhiễm lâu với bệnh tả sau khi uống phòng Tuy vậy, một phân tích hậu cứu trong một chiến dịch uống phòng trong cộng đồng do Chính phủ Indonesia thực hiện đã chứng tỏ có hiệu quả bảo vệ khi vắc xin được dùng để kiểm soát dịch đang bùng nổ trong điều kiện của thực địa kèm theo các biện pháp kiểm soát thông thường [4]

1.3.2.4 Vaccine lai tạo

Đó là trường hợp vaccine tả lai: cài các gen mã hóa sự tổng hợp các kháng nguyên LPS của V cholerae O1 trên bề mặt của chủng Samonela typhi Ty21a sống

Chủng lai này đã được thử trên 500 người tình nguyện Nhận xét đầu tiên là chỉ có xảy ra rất ít phản ứng nhẹ Cho người tình nguyện uống 3 liều 2 x 1010 vị khuẩn sống, thấy 50% có đáp ứng kháng thể với LPS của V cholerae O1 và 30% có đáp ứng kháng độc tố trong huyết thanh Trái lại, 90-100% các người tình nguyện không có kháng thể kháng LPS của S typhi Trong thí nghiệm có thử thách, cho người tình nguyện uống 3 liều 1010 vị khuẩn đông khô, nhưng chỉ bảo vệ được có 25% số người không mắc bệnh

tả, tuy nhiên những trường hợp mắc bệnh tả thì nhẹ hơn nhiều so với đối chứng

1.3.3 Tình hình phát triển vaccine tả tại Việt Nam

Ở Việt Nam vaccine tả uống (mORCVAX) do Công ty TNHH một thành viên vaccine và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH, Bộ Y tế) sản xuất đang được Tổ chức Y tế thế giới xem xét đưa vào dự trữ toàn cầu Vaccine tả uống này do công ty sản xuất sử dụng công nghệ lên men được chuyển giao từ Thụy Điển, sản xuất trên dây chuyền hiện đại, quy mô lớn với công suất 8-10 triệu liều/năm do Chính phủ vay vốn ODA của Hàn Quốc đầu tư Loại vaccine này được điều chế từ các chủng vi khuẩn tả toàn tế bào chết, gồm type sinh học cổ điển và type sinh học El Tor và chủng vi khuẩn tả O139, có chứa

những phần bằng nhau của các chủng Ogawa và Inaba của vi khuẩn tả V cholerae [5]

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực vaccine

1.3.4.1 Chất lượng vaccine

Chất lượng vaccine phụ thuộc phần lớn vào công nghệ và trình độ của công ty sản xuất Nếu vaccine không chất lượng thì cho dù có tiêm chủng đầy đủ thì vẫn có thể nhiễm bệnh như thường Vì vậy khi lựa chọn vaccine nên chọn những nhà cung cấp có thương hiệu và uy tín lâu năm trên thị trường

1.3.4.2 Liều lượng sử dụng

Liều lượng quá thấp không đủ kích thích cơ thể sinh miễn dịch Ngược lại, nếu liều lượng quá cao sẽ dẫn đến tình trạng dung nạp miễn dịch (nghĩa là khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên, nó không chống lại mà chấp nhận kháng nguyên đó như là một phần của bản thân mình)

Tùy từng loại mầm bệnh cũng như tình hình thực tế của từng khu vực, địa phương

mà cân nhắc chọn liều lượng vaccine cho thích hợp

1.3.4.3 Quá trình bảo quản

Vaccine được bảo quản tốt ngay từ lúc sản xuất cho tới khi được tiêm vào cơ thể con người Thường quy bảo quản các vaccine không giống nhau, nhưng đều cần được bảo quản trong điều kiện khô, tối và lạnh

Nhiệt độ và ánh sáng phá hủy tất cả các loại vaccine, nhất là những vaccine sống Đông lạnh phá hủy nhanh các vaccine giải độc tố

Đối với vaccine tả cần:

Bảo quản và vận chuyển ở 20C đến 80C

Không sử dụng khi vaccine bị đóng băng

Tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp [6]

CHƯƠNG 2 QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VACCINE DỊCH TẢ

Sơ đồ quy trình công nghệ

Đối với Việt Nam, vaccine tả nào thích hợp ? Một vaccine lý tưởng, để có thể dùng

ở quy mô lớn, phải là một vaccine an toàn có mức độ hiệu lực có thể chấp nhận được Ngoài ra, vaccine đó phải không có giá thành cao, có thể sản xuất được ở quy mô lớn với công nghệ không quá phức tạp, có tính bền vững qua quá trình bảo quản và vận chuyển Một vaccine lý tưởng như vậy hiện nay không có được, nhưng vaccine WCK (vaccine chết, toàn tế bào) rất đáng được chú ý, vì nó có thể đáp ứng một số những yêu cầu nói trên

Đồng thời dựa trên bài báo khoa học “Culture Conditions for Stimulating Cholera

Toxin Production by Vibrio cholerae O1 El Tor Microbiology and Immunology” của

nhóm tác giả Iwanaga, M.Yamamoto, K.Higa, N Ichinose, Y Nakasone, N & Tanabe;

đề tài 64B-07- 0301 “Nghiên cứu vaccine uống phòng bệnh tả” của Viện vệ sinh dịch

tễ học và bài báo “Vaccine tả uống bất hoạt” của dược điển Việt Nam Tôi quyết định

lựa chọn xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vaccine tả uống chết, toàn tế bào, không đắt tiền như sau:

Thuyết minh quy trình công nghệ

2.2.1 Xử lý nước trong sản xuất vaccine

Các chỉ tiêu yêu cầu (water for injection (WFI)

Hình 2.1: Hệ thống sản xuất WFI dựa trên cơ chế thẩm thấu ngược RO

Nước cấp từ bồn chứa nước sẽ được vận hành đưa đến khu vực xử lý nước trong nhà máy Tại bình lọc cơ khí (sử dụng 3 lớp phương tiện để lọc gồm than antraxit, cát

và granat) để loại bỏ các căn bẩn ở dạng thô có kích thước >10μm

Nước tiếp tục qua bình trao đổi cation nhằm loại bỏ các ion dương như Ca2+, Mg2+, Fe2+, Fe3+,… làm cho nước có hàm lượng các chất hòa tan ở mức độ thấp nhất, đảm bảo làm mềm nước

Nước được xử lí mùi, các hợp chất hữu cơ, Clo, Florua thông qua bình lọc than hoạt tính Than hoạt tính với cấu trúc xốp, diện tích bề mặt lớn sẽ hấp phụ những phân

tử mùi, vị có trong nước

Sau khi đã qua cột lọc than, nước được bơm tăng áp đến thiết bị lọc cartridge với lõi cartridge có đường kính 5μm, lõi lọc polyethylene 20 inch để tiếp tục tách cặn có kích thước lớn hơn 5μm nhằm bảo vệ màng lọc RO

Nước sau khi đã xử lý sơ bộ tiếp tục được bơm cao áp qua hệ thống thẩm thấu ngược RO hút và đẩy qua màng lọc với áp suất lên đến 10-15kg/cm2, màng lọc RO chỉ cho các phần tử nước đi qua Phần nước còn lại với hàm lượng chất hòa tan cao sẽ bị loại ra ngoài Nước RO đi qua cột siêu lọc như một bước lọc cuối cùng để loại bỏ bất kỳ chất hữu cơ nào có thể còn sót lại trong hệ thống

Đối với hệ thống này, ozone được dùng để bảo quản nước sản phẩm trong khi tia

UV được dùng để khử ozone Hệ thống đang được đánh giá với công suất là 1.500 l /giờ

và tiêu thụ 9 kW trong điều kiện hoạt động bình thường.[7]

2.2.2 Chuẩn bị giống

Các chủng trên được nhận từ Khoa vi sinh miễn dịch – viện Pasteur TP.HCM

- V cholerae typ sinh học E1 Tor, typ huyết thanh Inaba (chủng Phil 6973)

- V cholerae typ sinh học E1 Tor, typ huyết thanh Ogawa (638)

- V cholerae, O139 typ sinh học mới (chủng 4260B)

- V cholerae typ sinh học cổ điển, typ huyết thanh Ogawa (chủng Cairo 50)

- V cholerae typ sinh học cổ điển, typ huyết thanh Inaba (chủng Cairo 48)

Natri clorua (NaCl) 10.0

Điều kiện hoạt hóa giống, nhân giống cấp I và cấp II, nuôi cấy trong thời gian 8h,

370C, 600 v/p

Điều kiện nhân giống sản xuất: 24h, 370C, 600 v/p Nhân giống sản xuất đến khi nồng độ tế bào đạt 108-10 tb/ml thì tiến hành cấy giống vào bể lên men

Thiết bị: Ống nghiệm, bình tam giác

Thiết bị nhân giống sản xuất được kết nối với máy tính thông qua phần mền giúp kiểm soát và điều chỉnh tự động các thông số của quá trình nhân giống Lượng giống cấp vào môi trường lên men là 10%

2.2.4 Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng

Mục đích:

Phân phối toàn bộ hỗn hợp môi trường gồm pepton và các muối khoáng thành một dịch môi trường đồng nhất, thuận lợi cho quá trình tiệt trùng và lên men ở các công đoạn tiếp theo Sau khi pha chế dịch môi trường ta điều chỉnh pH của dịch lên men tại pH = 7.3 - 7.5 Rồi sau đó tiến hành hấp khử trùng

Cách tiến hành:

Hỗn hợp bột môi trường APW đã có sẵn và nước sau khi định lượng theo tỷ lệ đã thiết lập sẽ được phối trộn trong thùng pha chế môi trường có cánh khuấy Môi trường được điều chỉnh pH bằng HCl/ NaOH 1N [8]

Theo thành phần môi trường APW như môi trường nhân giống ở trên thì tổng lượng chất khô trong môi trường lên men là 30 g/l

2.2.5 Tiệt trùng và làm nguội môi trường

Thiết bị: thiết bị tiệt trùng dạng bản mỏng

Hình 2.2: Cơ chế tiệt trùng và làm nguội

2.2.6 Lên men

Mục đích:

Chuyển lượng giống sản xuất đạt yêu cầu sản xuất sang môi trường lên men đã tiệt trùng và làm nguội, phân bố đều môi trường và giống sản xuất Bắt đầu quá trình lên men sản xuất chế phẩm vaccine Đây là giai đoạn chính trong công nghệ sản xuất vaccine, cũng là giai đoạn quyết định đến chất lượng, năng suất của chế phẩm vaccine Chính vì vậy quá trình lên men phải được theo dõi và điều khiển chặt chẽ các điều kiện công nghệ đã thiết lập

Cách tiến hành:

Giống sau khi được nhân giống sản xuất sẽ được bơm vào thiết bị lên men chứa

môi trường đã được tiệt trùng và làm nguội về nhiệt độ tối ưu cho chủng Vibrio cholerae

phát triển Tỷ lệ giống cấy vào so với môi trường lên men là 10%

Kể từ lúc đưa mẫu và nồi đến ngày len men cuối cùng luôn có các test hằng ngày

- Sau 24h: ngoài các test thông thường như trên còn có thêm 1 test là kiểm tra đậm

độ vi khuẩn Khi lượng sinh khối đã đủ thì ngừng quá trình lên men bằng cách làm lạnh nhanh xuống còn 250C

Điều kiện lên men [8]:

- pH môi trường lên men: 7.5

- Nhiệt độ lên men: 370C

- Thời gian lên men: 24 giờ

Hình 2.3: Thiết bị len men

2.2.7 Lọc TFF

Mục đích:

Quá trình này nhằm tách sinh khối sau lên men chứa tế bào vi khuẩn Sinh khối chứa tế bào vi khuẩn sẽ được bơm sang thùng chứa sau đó đưa đến thiết bị hoàn nguyên Phần dịch sẽ được loại bỏ

Cách tiến hành:

Để thực hiện lọc trong người ta sử dụng công nghệ màng lọc dòng chảy tiếp tuyến TFF (Tanental Flow Filtration) Hệ thống lọc sử dụng các màng lọc có kích thước lỗ

xuyên màng là 0,45µm, hổn hợp dịch đưa vào sẽ được phân thành hai pha khác nhau khi đi qua màng tiếp tuyến

2.2.9 Bất hoạt

Mục đích:

Làm bất hoạt vi khuẩn điều này có nghĩa là đã loại bỏ khả năng gây bệnh của nó Tuy nhiên, các chủng bất hoạt vẫn giữ được khả năng gây ra phản ứng miễn dịch ở người được sử dụng vaccine

Cách tiến hành:

Xác định phương thức bất hoạt phù hợp cho các chủng như sau: chủng Inaba El

Tor (Phil 6973); V cholerae O139 (4260B) và chủng Ogawa cổ điển (Cairo 50) bằng

formalin như sau [5]:

- Hàm lượng formalin: 37%

- Nhiệt độ bất hoạt : 25℃

- Thời gian bất hoạt : 1 giờ

Xác định phương thức bất hoạt phù hợp cho chủng Inaba cổ điển (Cairo 48) và chủng Ogawa E1 Tor (638) bằng nhiệt độ :

- Nhiệt độ bất hoạt : 60℃

- Thời gian bất hoạt: 1 giờ

Thiết bị: nồi gia nhiệt 2 lớp vỏ

Hình 2.5: Thiết bị gia nhiệt 2 lớp vỏ

Hình 2.6: Nồi khuấy trộn có cánh khuấy

khả năng sẽ mang nhiều vi trùng từ bên ngoài xâm nhập vào nên việc bổ sung thimerosal

Vaccine sau khi được thu nhận sẽ được đưa vào thiết bị chiết rót Người vận hành

sẽ cài lượng vaccine cần chiết rót vào hệ thống được kết nối với máy chiết để đảm bảo lượng vaccine được chiết xuống các lọ là đều nhau

Hình 2.7: Thiết bị chiết rót vaccine

2.2.16 Kiểm vaccine thành phẩm

Chỉ tiêu trực quan:

Vaccine sau khi được đóng lọ sẽ được chuyển đến bộ phận đánh giá trực quan nhằm loại bỏ các lọ có chứa các chất cặn bẩn, các mảnh vỡ thủy tinh, lọ được chiết rót không đúng liều lượng hay đóng nắp không đạt yêu cầu,

Các chỉ tiêu bao gồm:

- Màu sắc: không có màu sắc lạ

- Không có có cặn bẩn, liều lượng chiết rót đúng

- Nhãn mác và lọ đạt yêu cầu mĩ quan,

Hình 2.8: Kiểm tra trực quan vaccine Chỉ tiêu hóa lý:

Bộ phận KCS và QC sẽ lấy mẫu vaccine để kiểm tra chất lượng của sản phẩm trước khi đóng gói vận chuyển nhằm đảm bảo độ an toàn cho việc sử dụng

Các chỉ tiêu bao gồm:

- Vô khuẩn: Phải đạt yêu cầu về vô khuẩn

- pH: Nằm trong khoảng từ 6,8 – 7,4

- Protein toàn phần: Không được quá 5 %

- Formaldehyde: Không được quá 0,02 %

- Thimerosal: Không được quá 0,02 %

- Thử nghiệm công hiệu:

Thử nghiệm công hiệu được tiến hành trên thỏ không có kháng thể kháng vi khuẩn

tả Mỗi loạt vaccine tả uống cần 3 thỏ có khối lượng từ 2 kg đến 2,2 kg vaccine tả uống được pha loãng trong dung dịch PBS 0,01 M (pH 7,2) hoặc nước muối sinh lý để đạt 4

tỷ vi khuẩn/ml Gây miễn dịch cho thỏ bằng cách tiêm vào bắp chân sau, mỗi thỏ 1 ml vaccine đã được pha loãng như trên Mỗi thỏ được tiêm ba mũi, mỗi mũi cách nhau 1

tuần (vào các ngàv 0, 7 và 14) Sau tiêm, thỏ được chăm sóc, theo dõi hàng ngày Đến ngày thứ 24, thỏ được lấy máu và tách huyết thanh trong điều kiện vô khuẩn Tiến hành phản ứng ngưng kết trong ống nghiệm giữa huyết thanh thỏ và các vi khuẩn tả mẫu Huyết thanh của mỗi thỏ được pha loãng bậc 2 thành các độ pha: 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 và 1/640 Kháng nguyên vi khuẩn tả gồm 3 chủng: Cairo 48, Cairo 50 và E1 Tor (Phil 6973) được đo đậm độ vi khuẩn và pha loãng để có 1 tỷ vi khuẩn/ ml Tiến hành phản ứng ngưng kết từng loại kháng nguyên đặc hiệu với huyết thanh thỏ ở các bậc pha loãng khác nhau Đọc kết quả sau 48 h

Hiệu giá huyết thanh được tính ở độ pha loãng thấp nhất vẫn có hiện tượng ngưng kết

Công hiệu của vaccine tả uống đạt yêu cầu khi hiệu giá trung bình từng loại kháng nguyên nhỏ hơn 1/80 (< 1/80)

CHƯƠNG 3 TÍNH CÂN BẰNG VẬT CHẤT

Kế hoạch sản xuất của nhà máy

Nhà máy làm việc liên tục 3 ca/ngày, 8 giờ/ca để theo dõi quá trình lên men Nhà máy làm việc liên tục 12 tháng, các ngày nghỉ bố trí theo tiêu chuẩn của bộ luật lao động năm 2019, các công nhân sẽ làm thay ca và nghỉ bù sau đó

Nhà máy nghỉ hoạt động 12 tháng và các ngày nghỉ để bảo dưỡng thiết bị và vệ sinh nhà máy

Bảng 3-1: Kế hoạch sản xuất của nhà máy

Các số liệu ban đầu

Theo đề tài năng suất làm việc theo yêu cầu của nhà máy là 20.000.000 (liều/năm) Theo tiêu chuẩn của WHO, một liều vaccine 1,5ml gồm [10] :

V Cholerae O1, El Tor, Phil.6973 (bất hoạt bằng formaldehyde) 5.10 10 tế bào

V Cholerae O139, 4260B (bất hoạt bằng formaldehyde) 5.10 10 tế bào

V Cholerae O1, Cairo 50 (bất hoạt bằng formaldehyde) 2,5.10 10 tế bào

V Cholerae O1, Cairo 48 (bất hoạt bằng nhiệt độ) 2,5.10 10 tế bào

V Cholerae O1, 638 (bất hoạt bằng nhiệt độ) 2,5.10 10 tế bào

Thimerosal .≤ 0,02 % (w/v) Dung dịch WHO-Buffer vừa đủ 1,5ml Tổng số tế bào thu được trong 1 liều:

Tliều = 5.1010 + 5.1010 + 2,5.1010 + 2,5.1010 + 2,5.1010 = 17,5.1010 (tế bào/liều) Theo nghiên cứu thì trong 1 tế bào vi khuẩn có khối lượng trung bình là 10-12g (tài liệu nghiên cứu)

Khối lượng tế bào trong 1 liều = 17,5.1010 × 10-12 = 0,175 (g)

Khối lượng Thimerosal = 0,02%× 1,5 𝑚𝑙 = 0,0003 (g)

Bảng 3-2: Thành phần của một liều vaccine

P = 18832 ×1,6753

1000 = 31,55 kg/ca

Năng suất của nhà máy 28248 31,55

Hao hụt dự kiến qua các công đoạn

Hao hụt khối lượng do vận chuyển qua các công đoạn Giả sử hao hụt khối lượng qua các công đoạn được cho ở bảng sau:

Bảng 3-3: Hao hụt dự kiến qua các công đoạn

Hoạt hóa và nhân giống

3.4.1 Lên men

Khối lượng tế bào trong 1 liều = 17,5.1010 × 10-12 = 0,175 (g)

=> Khối lượng tế bào trong 1 ca = 0,175 × 18832 = 3295,6 (g) = 3.296 (kg/ca) Khối lượng sinh khối tế bào qua các công đoạn (bao gồm hao hụt của từng công đoạn):

Trước khi bất hoạt:

- Chủng V Cholerae O1, Phil 6973

- Chủng V Cholerae O1, Phil 6973

Tổng khối lượng sinh khối của các chủng cho quá trình lên men là:

Gsk,lm = 1,24 × 2 + 0,616 × 3 = 4,274 (kg/ca)

Số tế bào trong lên men:

Tlm = 1000 × 4,274 ÷ 10-12 = 4,274× 1015 (tế bào) Trong 1 ml dung dịch canh trường thu được 109 tế bào vi khuẩn

Thể tích canh trường trong quá trình lên men:

Vlm = 4,274 × 1015 ÷109 = 4274000 (ml/ca) = 4274 (l/ca) Giả sử khối lượng riêng của canh trường lên men là 1,03 (kg/l) và thay đổi không đáng kể qua các công đoạn

Khối lượng dịch canh trường lên men:

Khối lượng canh trường sau lên men cho mỗi chủng V Cholerae O1, Cairo 50; V

Cholerae O1, Cairo48 và V Cholerae O1, 638 là:

G5 = 4402,2 × 𝟏/𝟕 ×𝟏𝟎𝟎−𝟏

𝟏𝟎𝟎 = 616,4 (kg/ca) Trong một liều vaccine các tế bào có nguồn gốc từ 5 chủng khác nhau và được phân chia theo 2 phương pháp bất hoạt nên cần thiết kế 5 tank để lên men thu sinh khối

5 chủng:

V Cholerae O1, Phil 6973 : V Cholerae O139, 4260B : V Cholerae O1, Cairo

50 : V Cholerae O1,Cairo48 : V Cholerae O1,638 = (5.1010 tế bào) : (5.1010 tế bào) :

(2,5.1010 tế bào) : (2,5.1010 tế bào) : (2,5.1010 tế bào) = 2 : 2 : 1: 1: 1

Khối lượng canh trường lên men cho mỗi chủng V Cholerae O1, Phil 6973 và V

Cholerae O139, 4260B là:

Glm1 = 2/7 × Glm = 2/7 × 4402,2 = 1257,8 (kg/ca)

Khối lượng canh trường lên men cho mỗi chủng V Cholerae O1, Cairo 50; V

Cholerae O1, Cairo48 và V Cholerae O1, 638 là:

Glm2 = 1/7 × Glm = 1/7 × 4402,2 = 628,8 (kg/ca)

Cấy giống vào bioreactor để lên men

Hao hụt vận chuyển ở công đoạn cấy giống là 0,2%

a) Cấy giống 2 chuẩn V Cholerae O1, Phil 6973; V Cholerae O139, 4260B

Khối lượng môi trường khi lên men: Glm1 = 1257,8 (kg/ca)

Lượng giống sản xuất cấy vào thiết bị lên men bằng 10% lượng môi trường trước khi cấy giống

Lượng môi trường trước khi cấy giống:

Vậy lượng giống của mỗi chủng V Cholerae O1, Phil 6973 và V Cholerae O139,

4260B cần cho sản xuất là : 114,5 (kg/ca)

b) Cấy giống 3 chủng V Cholerae O1, Cairo 50; V Cholerae O1,Cairo48 và V Cholerae O1,638

Khối lượng môi trường khi lên men: Glm2 = 628,8 (kg/ca)

Lượng giống sản xuất cấy vào thiết bị lên men bằng 10% lượng môi trường trước khi cấy giống