Áp dụng sắc khí lọc gel tách tinh chế các alkaloid từ cây dừa cạn(catharanthus roseus (l ) g don) ở việt nam

gây độc tế bào hoặc gây ức chế phân bào bạch cầu ác tính, các alkaloid có hoạt tính như vinblastin, vincristin, vindesin và vinorelbin đã được phát hiện hoặc bán tổng hợp để ứng dụng tro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

PHAN THỊ THANH

ÁP DỤNG SẮC KHÍ LỌC GEL TÁCH TINH CHẾ CÁC MONOMER

VÀ DIMER ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Vinh, tháng 8/ 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

PHAN THỊ THANH

ÁP DỤNG SẮC KHÍ LỌC GEL TÁCH TINH CHẾ CÁC ALKALOID TỪ

CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON) Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

VINH - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

PHAN THỊ THANH

ÁP DỤNG SẮC KHÍ LỌC GEL TÁCH TINH CHẾ CÁC ALKALOID

TỪ CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON) Ở

VIỆT NAM

Chuyên ngành : HOÁ HỮU CƠ

Mã số: 60.44.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS TRẦN ĐÌNH THẮNG

Vinh, tháng 8/ 2017

mọi điều kiện trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS TS Hoàng Văn Lựu, PGS TS Lê Đức Giang đã tạo điều kiện thuận lợi, nhận xét và góp ý cho luận văn của tôi được

hoàn thiện hơn

Tôi xin được cảm ơn TS Đỗ Ngọc Đài đã giúp thu mẫu Dừa cạn, giúp định

danh mẫu Dừa cạn, cùng anh chị em trong phòng thí nghiệm chuyên đề Hoá hữu cơ

đã tận tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình thực nghiệm

Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, cán bộ bộ môn Hoá Hữu cơ, Viện sư phạm tự nhiên, Phòng đào tạo Sau đại học, các bạn đồng nghiệp, học viên cao học, sinh viên, gia đình và người thân đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Vinh, ngày 21 tháng 8 năm 2017

Phan Thị Thanh

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề Error! Bookmark not defined 2 Đối tượng nghiên cứu 1

3 Mục đích nghiên cứu 1

4 Phương pháp nghiên cứu 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về alkaloid 3

1.1.1 Lịch sử phát hiện 3

1.1.2 Khái quát về nhóm alkaloid 3

1.1.3 Tác dụng và độc tính của một số alkaloid 6

1.1.4 Indol alkaloid 6

1.2 Giới thiệu về cây Dừa cạn 8

1.3 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Dừa cạn 9

1.4 Các công nghệ chiết xuất - phân tách các alkaloid 14

1.5 Các phương pháp công nghệ tổng hợp vinblastin và các dẫn xuất 17

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 22

2.1 Phương pháp nghiên cứu 22

2.1.1 Phương pháp lấy mẫu 22

2.1.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các chất phân lập được 22

2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất 22

2.2 Hóa chất và thiết bị 22

2.2.1 Hoá chất 22

2.2.2 Thiết bị 23

2.2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 23

2.2.2.2 Sắc ký cột (CC) 23

2.2.2.3 Sắc ký lỏng điều chế Prep HPLC 23

2.2.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 25

2.3 Nghiên cứu các hợp chất từ hoa và lá mẫu Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) 25

2.3.1 Mẫu Dừa cạn 25

2.3.2 Phân lập các chất 25

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Phân lập các hợp chất 32

3.2 Mẫu cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) 32

3.2.1 Mẫu Dừa cạn 32

3.2.3 Phân lập các hợp chất từ lá và hoa Dừa cạn 33

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Sơ đồ bán tổng hợp vinorelbin và dẫn xuất theo Magnus ………21

Hình 2 1 Thiết bị miniPilot Prep.HPLC, cột tách ID 100 × L 800 mm 24

Hình 2.3 Thiết bị cô quay Laborota 20 eco Heidolph ………26

Hình 2.2 Sơ đồ hệ thiết bị Prep.HPLC miniPilotLabomatic HD-3000 24

Hình 3.1 Phổ 1H-NMR của hợp chất Catharanthin……….………37

Hình 3.2 Phổ 1H-NMR của hợp chất Catharanthin (phổ dãn 5-8ppm) 37

Hình 3.3 Phổ 1H-NMR của hợp chất Catharanthin ( phổ dãn 2,7-4,0 ppm)….… 38

Hình 3.4 Phổ 1H- NMR của hợp chất Catharanthin (phổ dãn 1,0-2,5 ppm) 38

Hình 3.5 Phổ 13C-NMR của hợp chất Catharanthin………39

Hình 3.6 Phổ DEPT của Catharanthin……….39

Hình 3.7 Phổ 1H-NMR của hợp chất Vindolin 42

Hình 3.8 Phổ 1H-NMR của hợp chất Vindolin (phổ dãn phần 5-7ppm)………….42

Hình 3.9 Phổ 1H-NMR của hợp chất Vindolin (phổ dãn phần 2-5ppm)…………42

Hình 3.10 Phổ DEPT của hợp chất Vindolin……… 42

Hình 3.11 Phổ 13C – NMR của hợp chất Vindolin………42

Hình 3.12 Phổ 13C-NMR của hợp chất Vindolin (phổ dãn 80-170 ppm)……… 42

Hình 3.13 Phổ 13C – NMR của hợp chất Vindolin (phổ dãn 10-80 ppm)…… 42

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Khối lượng và nội dung phân đoạn rửa giải 34

Bảng 3.2: Các hợp chất phân lập từ lá và hoa Dừa … ……… 34

Bảng 3.3 Phổ cộng hưởng từ của hợp chất 1 ……….35

Bảng 3.4 Phổ cộng hưởng từ của hợp chất 2………40

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1 Phương pháp chiết tách trong nghiên cứu và sản xuất các alkaloid….15 Sơ đồ 2.1 Sơ đồ chiết cao tổng Dừa cạn 27

Sơ đồ 2.2 Quy trình tách alkaloid tổng trên sắc ký lọc gel Sephadex LH 20 29

Sơ đồ 2.3: Sơ đồ phân lập các hợp chất .29

DEPT Distortionless Enhancement

by Polarisation Transfer Phổ DEPT

ESI-MS Electron Spray

VLB vinblastine

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cây Dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G Don hoặc Vinca rosea L thuộc

họ Trúc Đào (Apocynaceae) là một trong những loài cây cảnh phổ biến đồng thời

cũng là một loại thảo dược dân gian Theo kinh nghiệm sử dụng trong y học dân tộc của một số nước, rễ cây Dừa cạn có tác dụng tẩy giun, chữa sốt Thân và lá có tính chất săn da (astringent), lọc máu (dépuratif), dùng chữa một số bệnh ngoài da

và nhất là chữa tiểu đường Kinh nghiệm dùng cây Dừa cạn chữa bệnh tiểu đường cũng được ghi nhận ở Ấn Ðộ, châu Úc, Nam châu Phi, quần đảo Antilles Y học Ayurvedic dùng cây Dừa cạn để chữa bệnh đái tháo đường Typ II

Người ta đã khám phá ra được khả năng chữa bệnh của loài cây này là nhờ

có chứa nhiều hợp chất alkaloid Từ cây Dừa cạn người ta chiết được chất chữa ung thư như vinblastine, vincristine, catharanthin, vindolin và chữa cao huyến áp như ajmalicin, sperpentin Cho đến nay, có khá nhiều nghiên cứu về cây Dừa cạn trên thế giới và trong nước tuy nhiên những nghiên cứu đó chủ yếu liên quan tới điều kiện trồng chăm sóc và thành phần hóa học của Dừa cạn Những nghiên cứu về tách, tinh chế ankaloid từ cây Dừa cạn còn ít và chưa được kết quả cao Chính vì

vậy, chúng tôi chọn đề tài :“Áp dụng sắc khí lọc gel tách tinh chế các alkaloid từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) ở Việt Nam”

2 Đối tượng nghiên cứu

- Dịch chiết từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) ở Việt Nam

3 Mục đích nghiên cứu

- Nghiên cứu tách, tinh chế alkaloid từ cây Dừa cạn

4 Phương pháp nghiên cứu

4.1 Nghiên cứu về lý thuyết

- Tìm hiểu và đánh giá tình hình nghiên cứu cây Dừa cạn trong nước cũng như trên thế giới

- Tìm hiểu cây Dừa cạn về hình thái thực vật, phân bố, thành phần hóa học, hoạt tính sinh học, ứng dụng…

4.2 Phương pháp thực nghiệm

- Phương pháp tách chất bằng sắc ký lọc gel

- Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc của các alkaliod

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về alkaloid

1.1.1 Lịch sử phát hiện

Năm 1804- 1805, các nhà hóa học Pháp và Đức đã phân lập được morphin

và điều chế được dạng muối của nó Đồng thời đã chứng minh được morphin là hoạt chất chính của cây thuốc phiện có tác dụng sinh lý rõ rệt Năm 1980, từ vỏ cây canhkina, đã chiết và kết tinh được một chất đặt tên là “cinchonino” sau đó hai nhà hóa học Pháp đã xác định cinchonino là hỗn hợp của hai alkaloid là quinin và cinchonin [9]

Năm 1918, phát hiện ra alkaloid của hạt mã tiền là strychnin và brucin; phát hiện ra cafein trong chè, cà phê Sau đó tiếp tục phát hiện ra nicotin trong thuốc lá, atropin trong cà độc dược, theobromin trong cacao, codein trong thuốc phiện, cocain trong lá coca Giữa năm 1973, người ta đã xác định được 4959 alkaloid khác nhau trong đó có 3293 chất đã xác định được công thức hóa học Hiện nay đã phát hiện ra được rất nhiều alkaloid và cũng đã được đưa vào ứng dụng trong y học ngày một tăng [3, 7]

1.1.2 Khái quát về nhóm alkaloid

1.1.2.1 Khái niệm

Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả Rập là kiềm Alkaloid là:

- Những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thường gặp ở trong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật

- Có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh

- Có hoạt tính sinh học rất quan trọng

- Có một số phản ứng chung là tạo “tủa“ cần thiết cho sự xác định chúng Chúng là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt Đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo [7] [28]

1.1.2.2 Cấu tạo hóa học

Về mặt hóa học, sự phong phú và đa dạng của alkaloid đã trở thành một chuyên nghành, chiếm một vị trí quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và trong tạp chí thông tin về hóa học Về mặt cấu trúc hóa học, chúng có ít nhất 1 nguyên tử N trong phân tử, chủ yếu nằm trong vòng Sự có mặt của nguyên tử của N trong cấu trúc quyết định tính bazơ của alkaloid và là chỗ dựa rất quan trọng cho các nhà hóa

học trong nghiên cứu alkaloid [7]

1.1.2.3 Phân loại

Các alkaloid đã biết có đến trên 250 dạng cấu trúc khác nhau với hơn 5.500 hợp chất alkaloid trong tự nhiên Vì vậy cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản trước đây (khoảng 20 nhóm cấu trúc) chưa đáp ứng được nên ngày càng có xu hướng chia chúng thành những nhóm nhỏ: nhóm alkaloid ecgotamia, harmin, yohimbin, strychnin, echitamin Nhóm alkaloid có nhân isoquinolin được chia thành các nhóm: Benzyliaoquinolin, Apocphin, Protobecberin, Benzophenanthridin…

Có ý kiến xếp các hợp chất có N ngoài vòng như Colchicin, Hordenin, là các protoalkaloid [7] [43]

1.1.2.4 Sự phân bố

Cromwell (1995) ước tính alkaloid phân bố trong khoảng 1 phần 7 loài thực vật có hoa Một ước tính khác (Hegnauer, 1963) cho rằng alkaloid có từ 12%-20% trong tổng số cây có nhựa Còn Willaman và Schubert (1955) thì cho rằng trong hơn

300 họ của nghành hạt kín thì 1/3 họ có chứa alkaloid Nhiều tổng kết cho thấy đại

đa số cây có chứa alkaloid là cây hai lá mầm Chỉ có một số ít cây chứa alkaloid là cây 1 lá mầm và nghành hạt trần Theo thống kê đến nay thì cây thuộc thảo và cây bụi có nhiều alkaloid hơn cây gỗ, và trọng lượng phân tử của alkaloid trong cây gỗ thường bé hơn trọng lượng phân tử cây thuộc thảo Cây một năm có nhiều alkaloid hơn cây lưu niên (Levin, 1976) Alkaloid không có trong loài sống ở nước ngoại trừ

họ sen (Nympheaceae) (Mc.Nair.1943) Thực ra rất nhiều loài có alkaloid nhưng chỉ

ở mức độ dạng vết hoặc ở tỷ lệ phần vạn, mười vạn Để giới hạn với ý nghĩa thực tiễn, một cây được xem là có alkaloid phải chứa ít nhất là 0.05% alkaloid so với

dược liệu khô Mối liên quan giữa alkaloid với các chất khác trong 1 cây cũng đã được nghiên cứu Cây có chứa alkaloid đều vắng mặt tinh dầu và ngược lại (Trelibs,1955) [43]

1.1.2.5 Tính chất

Alkaloid là các bazơ yếu, do sự có mặt của nguyên tử N Nhưng độ kiềm của alkaloid không giống nhau do ảnh hưởng khác nhau của lớp điện tích nguyên tử N gây ra và ảnh hưởng của các nhóm chức khác Nói chung tính bazơ giảm dần theo thứ tự amoni bậc 4, amoni bậc 1, amoni bậc 2, amoni bậc 3 Hầu hết các alkaloid bazơ thực tế không tan trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ như CHCl3, eter và các ancol bậc thấp (methanol, ethanol, butanol) Một số nhóm alkaloid có thêm các nhóm phân cực nên tan được một phần trong nước hoặc trong kiềm Ví dụ: Morphine, Cephalin, do có nhóm OH phenol nên tan trong dung dịch kiềm và các bazơ của chúng thì gần như là không tan trong eter Ngược lại với bazơ, các muối alkaloid nói chung tan được trong nước và cồn nhưng hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: CHCl3, eter, benzene Có một số trường hợp ngoại lệ như Ephedrin, Cochicin, Ecgovonin, các bazơ của chúng tan được trong nước nhưng cũng khá tan trong dung môi hữu cơ và các muối của chúng thì ngược lại [3]

Alkaloid có N–Bậc 4 và N–oxide bazơ của alkaloid có N– Bậc 4 và N – oxide khác tan trong nước và trong kiềm ít tan trong dung môi hữu cơ Các muối của chúng có độ hòa tan khác nhau tùy thuộc vào gốc acid tạo ra chúng Vì vậy có thể chiết chúng bằng dung dịch kiềm và kết tủa dưới dạng muối có độ hòa tan thấp nhất Đối với các alkaloid N – oxide thì dùng phản ứng khử Oxy bằng bột kẽm trong môi trường HCl để chúng chuyển thành alkaloid dạng thường sau đó kết tủa bằng kiềm và chiết bằng dung môi hữu cơ [5, 6]

1.1.3 Tác dụng và độc tính của một số alkaloid

Các chất trong nghiên cứu này thuộc nhóm alkaloid chúng có tác dụng lên hệ thần kinh, tim mạch và hô hấp [2] [4], [5] Khi dùng với hàm lượng nhỏ chúng có tác dụng chữa bệnh nhưng khi dùng với hàm lượng lớn gây ngộ độc có thể dẫn đến

tử vong vì đây đều là các alkaloid độc

1.1.4 Indol alkaloid

Indol ankaloid là loại ankaloid có cấu trúc chứa nhân indol, cũng bao gồm cả nhóm isopren và vì thế gọi là terpen indol ankaloid Nhóm này có hơn 4.100 hợp chất khác nhau, đây là một trong những nhóm lớn nhất của ankaloid Nhiều hợp chất trong nhóm này có hoạt tính sinh học cao và được sử dụng trong y học

Là nhóm ankaloid có nhiều loại thuốc quý giá như các thuốc hạ huyết áp, các thuốc điều trị loạn nhịp rung tim, các thuốc điều trị các bệnh ung thư Nhiều ankaloid thuộc nhóm này có độc tính rất cao như strychnin có trong hạt mã tiền, gelsemin có trong lá ngón thường gây ra nhiều vụ ngộ độc dễ tử vong Trong phần này sẽ trình bày các ankaloid chính là strychnin, reserpin, vincamin, vinacaleucoblastin, vincaleucocristin [10], [11]

Vincaleucoblastin Vincaleucocristin

Bộ phận dùng để chiết xuất các ankaloid làm thuốc điều trị ung thư vincaleucoblastin, vincaleucocristin và các nguyên liệu bán tổng hợp vincaleucoblastin là vindolin và catharanthin đều từ lá Dừa cạn

Rễ để chiết ankaloid hạ huyết áp - ajmalixin và sản xuất cao rễ để điều trị bệnh tăng huyết áp Trong Dừa cạn có khoảng hơn 150 ankaloid nhân indol được chia ra các nhóm chính như sau:

Các ankaloid indol monome có chứa 1 vòng indol như vindolin, catharanthin Các ankaloid indoldim có chứa 2 vòng indol trong phân tử như vincaleucoblastin, vincaleucocristin

Cây Dừa cạn sinh tổng hợp các ankaloid indol từ axit mevalonic qua nhiều phản ứng sinh tổng hợp sẽ tạo thành các ankaloid monome như vindolin và catharanthin Hai ankaloid monome này sẽ gắn với nhau để tạo thành vincaleucoblastin

Tỷ lệ vincaleucoblastin và vincaleucocristin ở trong lá rất thấp Còn hàm lượng vindolin và catharanthin trong lá lại cao Vì vậy, hiện nay người ta đã tách riêng 2 ankaloid này rồi ngưng tụ chung với nhau dưới tác dụng của men để tạo thành vincaleucoblastin và từ vincaleucoblastin bằng phương pháp hóa học - oxy hóa hay

sử dụng enzym sẽ chuyển hóa ankaloid này thành vincaleucocristin có tác dụng và hoạt tính tốt hơn vincaleucoblastin [17], [25]

Từ vindolin và catharanthin sẽ bán tổng hợp được các ankaloid chống ung thư như sau:

Vinblastin (tên gọi ngắn của vincaleucoblastin) sử dụng trong y học dưới dạng muối vinblastin sulfat tinh thể hình kim là thuốc thiết yếu để điều trị ung thư, bệnh

hodgkin, u lympho bào lưới, u sùi dạng nấm, ung thư phổi, ung thư da, tinh hoàn, buồng trứng

Vincristin (tên thu ngắn của vincaleucocristin) dùng dưới dạng muối vincristin sulfat dùng điều trị bệnh bạch cầu limpho và u tủy cấp tính ở trẻ em, tế bào thần kinh, sarcom lưới và bệnh hodgkin [18], [26]

1.2 Giới thiệu về cây Dừa cạn

Apocynaceae là một họ thực vật có từ 3700 đến 5100 loài, phân bố gần như trên toàn thế giới, chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Khoảng 90 chi

và 850 loài Apocynaceae xuất hiện nhiều ở Braxin, nơi sinh sống của nhiều loại thực vật Ở Việt Nam họ Trúc đào phân bố rải rác từ Bắc đến Nam, và tập trung nhiều nhất ở vùng Bắc Trung Bộ

Cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae) phân bố rộng rãi trên nhiều nước nhiệt đới, đặc biệt ở Việt Nam và

Madagasca, ở các nước phương Tây cây này thường được biết đến dưới tên gọi là Madagascan periwinkle

Đặc điểm thực vật: Dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40-60 cm, phân nhiều cành, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phân trên, mọc thành bụi dày Lá mọc đối, thuôn dài đầu lá hơi nhọn, dài 4-6 cm, rộng 2-3 cm, hai mặt nhẵn bóng, mặt dưới nhạt Hoa màu trắng hoặc hồng, có mùi thơm, hoa mọc rieng lẻ ở kẽ lá gần ngọn Quả gồm hai đại, dài 2-4 cm, rộng 2-3 cm, mọc thẳng đứng, hơi ngả sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù, trong quả chứa 12-

20 hạt nhỏ màu nâu nhạt Cây có hoa hầu như quanh năm [9]

Ở Việt Nam, cây Dừa cạn mọc tự nhiên suốt từ Bắc vào Nam và cũng được trồng làm cảnh vì cho hoa đẹp Đây là một giống cây có khả năng chịu hạn cao và

có thời gian canh tác ngắn Các kết quả thử nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu

giống và chế biến cây thuốc Đà Lạt cho thấy cây Dừa cạn (Catharanthus roseus

(L.) G.) có thể phát triển tốt trên đất cát khô hạn, chỉ sau 5 tháng cây đã trưởng thành và tích lũy đủ hàm lượng alkaloid đạt tiêu chuẩn xuất khẩu Trung tâm Nghiên cứu giống và chế biến cây thuốc Đà Lạt, Công ty cổ phần Y dược phẩm Vimedimex đã thử nghiệm canh tác cây Dừa cạn trên các vùng đất cát ven biển các tỉnh miền Trung để thu hoạch rễ và lá phục vụ xuất khẩu với sản lượng hàng trăm tấn một năm

1.3 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Dừa cạn

Trong dân gian, cao sắc nước của lá và hoa Dừa cạn được sử dụng để chữa mắt, tiêu viêm, cầm máu và làm dịu vết đốt của côn trùng Đặc biệt, theo y học cổ truyền ở Ấn Độ, Madagasca và Việt Nam, các thầy lang còn dùng lá Dừa cạn để trị bệnh tiểu đường [1], [8], [31], [32]

Năm 1952, khi nghiên cứu tác dụng của các alkaloid từ lá Dừa cạn lên chuột,

R Noble và C Noble đã phát hiện ra các hợp chất này có khả năng làm giảm số lượng bạch huyết cầu trong máu chuột Từ đó, theo định hướng nghiên cứu các chất

gây độc tế bào hoặc gây ức chế phân bào bạch cầu ác tính, các alkaloid có hoạt tính như vinblastin, vincristin, vindesin và vinorelbin đã được phát hiện hoặc bán tổng hợp để ứng dụng trong điều trị ung thư, đặc biệt là các bệnh ung thư máu và Hodgkin [54]

Vindolin và catharanthin được phân lập từ cây Dừa cạn Ngoài ra các nghiên cứu bán tổng hợp vinblastin và các dẫn xuất từ vindolin và catharanthin

đã được phát triển mạnh mẽ và đưa vào áp dụng trên thế giới từ cuối những năm

1970 [13], [39], [50]

Hóa học y học của các alkaloid Dừa cạn đã được nghiên cứu rất sâu Sau khi hoạt tính chống ung thư của các hợp chất này được phát hiện, nhiều dẫn xuất đã được tổng hợp trong ngành công nghiệp dược với mục đích tăng cường các hoạt tính dược học nhằm xác định các loại thuốc có hiệu quả lâm sàng phổ rộng [41], [45], [46]

Năm 1978, Barnett và cộng sự bằng các phản ứng hidrazin hóa và hidro hóa

đã chuyển hóa vinblastin thành vindesin, ngay lập tức chất này đã được áp dụng trong hóa trị liệu các bệnh ung thư vú và ung thư phổi dưới tên biệt dược là Eldisine® [14]; và trong một thời gian dài, vinblastin được chiết xuất từ lá Dừa cạn

đã được dùng làm nguyên liệu đầu vào Nhưng dấu mốc quan trọng nhất mở ra hướng mới cho việc sản xuất vinblastin và các dẫn xuất từ cây Dừa cạn là thành công của Mangeney và cộng sự vào năm 1979, khi cải tiến phản ứng Polonovski để

tổng hợp vinblastin và vincristin từ các alkaloid chủ yếu của (Catharanthus roseus

(L.) G Don là vindolin và catharanthin [47], [48], [52], [53]

Vinblastin và vincristin là các dime có chứa vòng indol (mảnh velbanamin)

và một nhân vindoline dihidroindol Vinblastin (Velban® hay Velbe®) chứa nhóm

chức N-methyl còn vincristin (Oncovin®) lại mang nhóm N-formyl đính vào nguyên

tử Nitơ của mảnh velbanamin Hai chất này tuy ít khác biệt về mặt cấu trúc hóa học nhưng hoạt tính kháng u và độc tính lâm sàng của chúng lại rất khác nhau [51] Vindesin (Eldesine®) và vinorelbin (Navelbine®) là các chất bán tổng hợp từ Vinca

alkaloid đã được thông qua làm thuốc chống ung thư và đã có mặt trên thị trường [48] Chất bán tổng hợp mới nhất có hoạt tính chống ung thư là vinflunin hiện đang được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 3 ở châu Âu [15], [56]

Với các kết quả nghiên cứu về cơ chế gây bệnh ung thư và điều trị trong y học lâm sàng hiện đại và trong lĩnh vực sinh học phân tử, vinblastin, vincristin và các dẫn xuất lại đã được khẳng định một lần nữa là các hoạt chất có tác dụng chống ung thư thực thụ, không chỉ với vai trò là các tác nhân gây độc tế bào (cytotoxicity)

như đã biết, mà còn đóng vai trò là các chất ức chế hoạt tính của NF-κB (nuclear factor κB) - tác nhân chủ yếu trong quá trình gây ra các bệnh viêm và phát sinh tế

bào ung thư Vì thế, việc khám phá ra vinblastin đã đặt viên gạch nền móng cho việc phát triển các hóa trị liệu điều trị ung thư, khởi nguồn cho những nghiên cứu không ngừng về mặt hóa học, tính chất sinh y học và những khám phá về các hoạt

tính chống ung thư mới của các Vinca alkaloid [13], [55], [59]

Vinfosiltin được phân lập từu cây Dừa cạn có hoạt tính gây độc tế bào như

có hoạt tính chống u in vivo cao nhưng ở liều điều trị, kết quả trị liệu lại thấp, ngược

lại vinflunin biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào thấp đáng kinh ngạc lại cho hiệu quả

cao nhất trong các thử nghiệm in vivo trên chuột [36] và các mô ghép trên người

[28], [63]

Gần đây cấu trúc tinh thể của ,-tubulin dime đã được phân lập từ cây Dừa cạn và ứng dụng nghiên cứu làm thuôc [16], [20], [65]

N N

H

H

H3CO

N H

N

N N

H3C

H

H

OAc COOCH3HO

H

CH3

E F

H3COOC

H3CO

N H

N

N N

H3C

H

H

OAc COOCH3HO

OH

CH4

H3COOC

H3CO Vindesin

Thành phần hóa học của cây Dừa cạn có Vinblastin còn gọi là vincaleukoblastine là chất ức chế đặc hiệu pha M của chu kỳ phân chia tế bào Vinblastin bám vào các sợi tubulin, ngăn chặn sự tập hợp của các tubulin tạo thành các vi ống và tâm động Hợp chất muối sunfat của vinblastin đã được áp dụng rộng rãi trong các trị liệu hóa học chữa ung thư mô bào bạch huyết, ung thư tinh hoàn và ung thư vú và bệnh Hogkin [30], [54], [66]

Trong các năm 1959 đến 1962, Johnson và Svoboda đã phân lập được vincristin - một alkaloid hàm lượng thấp trong cây Dừa cạn Vincristin đã được Cục quản lý Dược và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) thông qua năm 1963 với tên thương mại là Oncovin Người ta cũng kết hợp vincristin với prednisone để điều trị bệnh máu trắng ở trẻ em Ngoài ra vincristin cũng được dùng làm chất ức chế miễn dịch

trong điều trị hội chứng xuất huyết do vỡ tiểu cầu gây nghẽn mạch [30], [51], [54]

Vinorelbin là Vinca alkaloid bán tổng hợp đầu tiên nhận được bằng cách bán

tổng hợp các alkaloid thu được trong quá trình tách chiết Dừa cạn Pháp đã thông qua sử dụng hoạt chất này làm thuốc điều trị ung thư phổi từ năm 1989 với tên thương mại là Navelbin Hiện nay bản quyền sản xuất thuốc này do nhóm Pierre Fabre Group sở hữu Tại Mỹ, vinorelbin được FDA thông qua năm 1994 Ở châu

Âu, thuốc này được sử dụng rộng rãi trong điều trị ung thư phổi, ung thư vú Ở một

số nước, người ta còn chỉ định Vinorelbin trong điều trị ung thư tuyến tiền liệt Từ năm 2004, vinorelbin đã được bán ở châu Âu dưới dạng thuốc uống Các nghiên cứu đã cho thấy rằng vinorelbin dạng uống cho hiệu quả tốt hơn và an toàn hơn vinorelbin dạng tiêm truyền [48]

Hợp chất Vindesin được phân lập từ cây Dừa cạn có tác dụng để điều trị ung

thư mô bào bạch huyết, ung thư da, ung thư vú và ung thư phổi [22], [64]

Vinflunin: Đây là hợp chất tổng hợp mới nhất của họ alkaloid Dừa cạn chứa

Flo có hoạt tính chống ung thư cao Vinflunin, phát triển bởi Javlor (Pierre Fable Medicament Laboratories), được bán tổng hợp từ Catharanthin theo phương pháp hóa học siêu axit (superacidic chemistry) định hướng hai nguyên tử Flo vào vị trí

20 Việc thế thành công 2 nguyên tử Flo vào vị trí được cho là không thể theo các phương pháp hóa học cổ điển đã đem lại một hoạt chất có phổ kháng khuẩn rộng và biểu hiện hoạt tính khác với các alkaloid Dừa cạn đã biết là vinblastinvà vinorelbin Kết quả thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II điều trị các bệnh ung thư đường tiết niệu, ung thư phổi và ung thư vú cho thấy vinflunin có hoạt tính rất ưu việt Hiện nay ở châu Âu, vinflunin đang được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III làm thuốc điều trị

ung thư phổi Vinflunin có ái lực với tubulin yếu hơn các Vinca alkaloid khác, vì

thế các sợi tơ vô sắc được hình thành nhỏ hơn và ít hơn, qua đó mà giảm được hiệu

ứng gây độc thần kinh Vinflunin cũng dễ tách ra khỏi tubulin hơn các Vinca

alkaloid khác, thể hiện ở sự ức chế thuận nghịch sự phân chia trung thể và sự duy trì các khối phân bào được cảm ứng bằng thuốc [15]

Trong nỗ lực tổng hợp toàn phần các Vinca alkaloid, năm 1990, các tác giả

Phan Đình Châu (Đại học Dược Hà Nội), Csaba Szántay (Đại học kỹ thuật

Budapest - Hungary) và các cộng sự đã điều chế thành công các dẫn xuất Vinca

alkaloid monomeric như vincadifformin, (+/-)-3-oxominovine và tabersonin Tuy nhiên, ngoài tabersonin thể hiện hoạt tính làm giảm nhẹ huyết áp (khoảng 25 % khi

so sánh với reserpin), các chất này đều chưa tìm được ứng dụng trong điều trị lâm sàng

Cũng trong những năm 1990, các tác giả Mai Ngọc Tâm (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Bogomil Pyuskyulev (Viện Hàn lâm khoa học Bungari) và các cộng sự đã sử dụng sắc ký lỏng hiệu lực cao phân tích xác định sự biến đổi hàm lượng vindolin, catharanthin và vinblastin trong lá Dừa cạn vào các thời kỳ sinh trưởng khác nhau Đóng góp vào các hiểu biết về bán tổng hợp, chuyển hóa và cấu

trúc của các Vinca alkaloid kiểu vinblastin, tác giả Mai Ngọc Tâm cùng các cộng sự

cũng đã thực hiện những biến cải hóa học ở các vị trí C-16, C-17 và C-20’ của vinblastin tạo ra dẫn xuất mới ∆15(16)-17-deaxetoxy-20’-deoxy-vinblastin và dẫn xuất tri-O-axetylguanosin ở C-17 của hợp chất này

Một dimer alkaloid chủ yếu của Dừa cạn là anhydrovinblastin -là nguồn gốc sinh học của các dimeric alkaloid khác và cũng được bán tổng hợp hóa học từ vindolin và catharanthin, đã được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I năm 1999 và hiện nay hoạt chất này đang được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II làm thuốc chống ung thư phổi ở Mỹ (NSCLC) [60]

1.4 Các công nghệ chiết xuất - phân tách các Vinca alkaloid

Vinblastin và vincristin là các alkaloid dimeric indol-indolin, tích tụ trong lá

và hoa của cây Dừa cạn với hàm lượng thấp (10-5 - 10-4 %), do đó việc phân lập tinh khiết các chất này thường rất phức tạp và đòi hỏi kỹ thuật chiết tách ở trình độ cao Mặc dầu vậy, hiện nay các quy trình công nghệ chiết Dừa cạn vẫn được xây dựng dựa theo phương pháp chung chiết xuất alkaloid, sử dụng kỹ thuật chiết phân bố bằng các dung môi hữu cơ khác nhau cùng với việc thay đổi pH phù hợp với từng giai đoạn cụ thể [23], [24], [30], [47], [50], [55]

Sơ đồ 1.1 Phương pháp chiết tách trong nghiên cứu và sản xuất các Vinca alkaloid

Theo Noble và cộng sự, lá Vinca rosea L được chiết bằng hỗn hợp etanol

với axít axetic theo tỷ lệ thích hợp Cao dịch chiết thu được sau khi cất loại dung môi được hòa vào dung dịch HCl 2 % và lọc loại sạch tạp chất không tan Dịch lọc được điều chỉnh tới pH 4 và chiết rửa bằng benzen để loại bỏ các tạp chất màu và các chất ít phân cực không có tính kiềm Dịch nước axít còn lại được trung hòa bằng NH4OH rồi đem chiết lấy hỗn hợp “alkaloid tổng số” (Total alkaloids) bằng benzen và clorofoc [54]

“Alkaloid tổng số” được phân tách bằng sắc ký cột trên chất hấp phụ là nhôm ôxit hoạt độ 4 - 5 (Woehlem Al2O3 grade IV-V) với dung môi là hỗn hợp

benzen - diclometan rửa giải theo cách gradient Các phân đoạn sắc ký được sàng lọc bằng cách kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào và được xác định thành phần vinblastin bằng sắc ký lớp mỏng Các phân đoạn sắc ký chứa vinblastin được cô kiệt, sau đó hòa vào dung dịch axít sunfuric/etanol để kết tinh vinblastin sunfat [24], [30], [54]

Svoboda và cộng sự (1959) đã đóng góp vào quy trình của Noble một số cải tiến có ý nghĩa Ở giai đoạn đầu, nguyên liệu thực vật được chiết trực tiếp với dung môi ít phân cực như n-hexan để rửa các chất màu và ancol béo mạch dài trước khi chiết với dung môi axít tartric/etanol Ở giai đoạn sau, các dung môi độc hại như benzen đã được thay thế bằng clorofoc, dicloetan và diclometan “Alkaloid tổng số” vẫn được phân tách bằng sắc ký cột trên ôxit nhôm Phương pháp này đã được áp dụng từ những năm 1960 để sản xuất vinblastin sunfat và vincristin sunfat tại công

ty Eli Lylli, Mỹ [30], [35], [54]

Trong dung môi ancol/nước phối hợp với đệm axít, các Vinca alkaloid có các

giá trị pKa khác nhau, đây chính là gợi ý để phân tách các hợp chất này bằng sắc ký phân bố lỏng - lỏng với các pha dung môi có pH khác nhau Năm 1999, tại CNRS - Cộng hòa Pháp, Renault và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu phân lập các

Vinca alkaloid bằng sắc ký phân bố ly tâm (CPC) với hai pha dung môi có pH biến

đổi dần dần (gradient) “Alkaloid tổng số” của lá Dừa cạn được phân tách trên cột tách HPCPC Sanki series 1000 với pH của một pha gradient từ 2 - 9; pha còn lại có

pH gradient từ 10 - 4 Độ tinh khiết của các alkaloid vindolin, catharanthin, vinblastin và vindolinin phân tách được từ hỗn hợp đạt tới 80 - 90 % Tuy nhiên, do năng suất phân tách thấp hơn so với các phương pháp sắc ký khác nên kỹ thuật CPC chỉ được áp dụng hạn chế ở các nghiên cứu thí nghiệm [61]

Cũng dựa vào sự khác biệt hằng số pKa của các Vinca alkaloidtrong dung

dịch nước/axít, Guanasekera và cộng sự đã phát triển phương pháp chiết phân bố bằng các dung môi dẫn xuất clo ở các pH khác nhau Theo đó, dịch chiết nước/axít của lá Dừa cạn được điều chỉnh môi trường bằng NH4OH tới từng giá trị pH xác định rồi chiết với diclometan, dicloetan hoặc clorofoc để thu nhận

từng phần chiết alkaloid tương ứng Với phương pháp chiết này, tuy tổng cộng lượng alkaloid trong các phần chiết thu được thấp hơn so với các phương pháp

truyền thống; nhưng có thể tập trung từng nhóm Vinca alkaloid vào những phần

chiết xác định và từ đó tiết kiệm được chi phí phân lập tinh khiết những alkaloid mong muốn [50], [55]

Nhìn chung, các phương pháp chiết xuất và phân tách alkaloid đang được áp dụng để nghiên cứu phân lập các alkaloid từ cây Dừa cạn đều có thể thực hiện được trong các pilot và các phòng thí nghiệm Hóa Dược, Hóa Hữu cơ và Hóa Hợp chất thiên nhiên Nhưng các phương pháp này đều có nhược điểm chung là phân chia thành nhiều giai đoạn thực hiện phức tạp, khó kiểm soát, dễ gây thất thoát sản phẩm, điều này mang ý nghĩa tiêu cực đối với triển khai ở quy mô công nghiệp

chiết xuất các hoạt chất có hàm lượng thấp như các Vinca alkaloid [30], [48], [51],

[55]

Do vậy, để có thể đưa công nghệ ra sản xuất, các quy trình chiết và phân tách nên được xây dựng thành các chu trình công nghệ hoàn chỉnh khép kín; thay thế các dung môi độc hại như benzen bằng các dung môi tương đương ít độc và ít ảnh hưởng môi trường; tối ưu hóa và hiện đại hóa các phép đo kiểm soát quá trình chiết

và tách sắc ký

1.5 Các phương pháp công nghệ tổng hợp vinblastin và các dẫn xuất

Sự sẵn có của các hợp chất tự nhiên thường là vấn đề chính khi chúng được sản xuất thương mại Như đã biết vinblastin, vincristin và các dẫn xuất là các alkaloid dimeric có hàm lượng thấp, trong khi alkaloid chủ yếu của Dừa cạn là vindolin - một trong hai phần monomer cấu thành vinblastin - có hàm lượng trong

lá Dừa cạn lớn hơn 4 đến 5 lần so với vinblastin Trong quá trình phân tách

“alkaloid tổng số” của Dừa cạn bằng sắc ký hấp phụ, thông thường vindolin và catharanthin được rửa giải ra trước so với vinblastin Để hạ giá thành thuốc, tận

dụng phụ phẩm vindolin, catharanthin cũng như các Vinca alcaloid khác, các nghiên

cứu bán tổng hợp vinblastin và các dẫn xuất từ vindolin và catharanthin đã được phát triển mạnh mẽ và đưa vào áp dụng trên thế giới từ cuối những năm 1970 Hiệu

suất tách chiết vincristin chỉ đạt 0,0003% từ lá khô Vinblastin có hiệu suất cao hơn (~ 0,01 % trong lá Dừa cạn khô), vì thế hoạt chất này được dùng để sản xuất vincristin bằng cách ôxi hóa nhóm metyl đính với Nitơ của vòng indol Dù vậy, sự linh động trong cấu trúc của các hoạt chất này là một thử thách trong tổng hợp hữu

cơ [13], [37], [57], [61]

Năm 1974, tại CNRS - Pháp, Potier cùng các cộng sự đã nghiên cứu điều chế

các dimeric alkaloid kiểu vinblastin dựa trên cơ sở ôxy hóa catharanthin thành N boxid-catharanthin và ghép đôi với vindolin theo phản ứng Potier-Polonovski Theo hướng này, Mageney cùng với nhóm nghiên cứu của Potier đã điều chế thành công

-5’-nor-anhydovinblastin (vinorelbin), vinblastin, leurosidin, leurosin và vincristin

[15], [21], [55] Các chất này đều có hoạt tính tốt và các quy trình bán tổng hợp được áp dụng tại công ty Pierre Fabre để sản xuất thuốc chống ung thư vào năm

1979 Theo quy trình sử dụng vào thời kỳ đó, hiệu suất tạo thành vinblastin và đồng

phân 20’-epimer của nó là leurosidin khá thấp (~ 2 %), chi phí các chất phản ứng cao, do đó công ty Pierre Fabre chỉ điều chế đến 5’-nor-anhydrovinblastin để sản

xuất vinorelbin tartrat và đăng ký độc quyền sản phẩm này làm thuốc tiêm và viên nén NAVELBINE [21] Từ phát kiến của Potier và Mageney, các nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất điều chế vinblastin, tổng hợp chọn lọc lập thể vinblastin và các dẫn xuất được đẩy mạnh ở CNRS cũng như các nhóm nghiên cứu khác trên thế giới

Năm 1979, Langlois và cộng sự đã nghiên cứu các phản ứng sử dụng ôxy không khí làm tác nhân ôxy hóa Dạng enamin được khử bằng hydro với xúc tác Pd/C hoặc bằng NaBH4 Sau này, Kutney (1988) đã công bố quy trình one-pot điều chế vinblastin và leurosidin với phản ứng ôxy hóa sử dụng peroxid, ôxy không khí hoặc FeCl3; tác nhân khử là các dẫn xuất dihydronicotinamid Với tỷ lệ nồng độ các chất phản ứng phù hợp, hiệu suất vinblastin có thể đạt tới hơn 40 % (Hình 1.4) [42]

3’,4’-Anhydrovinblastin được tạo ra với hiệu suất 18 % trong quá trình pot tổng hợp vinblastin từ catharanthin và vindolin Trong khi đó, nếu chọn lọc thực hiện phản ứng khử - 1,2 hợp chất trung gian hoạt động iminium bằng tác nhân

one-NaBH4, hiệu suất tạo thành 3’,4’-anhydrovinblastin đạt tới trên 80 % (Xem Hình 1.4) Do đó các nghiên cứu bán tổng hợp vinblastin từ 3’,4’-Anhydrovinblastin cũng được đẩy mạnh nhằm tận dụng sản phẩm này và nâng cao năng suất vinblastin [40] Như đã đề cập ở trên, sự cải tiến phản ứng Polnovski-Potier để cải biến Nb-oxid của catharathin và vindolin đã nhận được một alkaloid dạng vinblastin có chứa cấu hình cần thiết để biểu hiện hoạt tính sinh học C18S Vậy nên khi xử lý catharanthin Nb-oxide và vindolin với trifluoroacetic andehit, sau khi khử hóa bằng sodium borohydrit, sẽ cho anhydrovinblastin có cấu hình tự nhiên 18S [40], [58]

Sakamoto và các cộng sự (1990) đã phát triển phương pháp ôxy hóa Anhydrovinblastin bằng FeCl3/amoni oxalat và phương pháp này đã được áp dụng tại Công ty Công nghệ Hóa dầu Mitsui để sản xuất vinblastin Hiệu suất chuyển hóa 3’,4’-anhydrovinblastin ~ 90 %, hiệu suất tạo thành vinblastin đạt tới hơn 40 %

3’,4’-[61] Sau này người ta biết rằng anhydrovinblastin là Vinca alkaloid tự nhiên có thể

thu nhận được bằng cách chiết tách từ cây Dừa cạn [62] Gần đây, một peroxidaza

có hoạt tính anhydrovinblastin synthetaza đã được tinh sạch từ lá Dừa cạn và đã được chứng minh có chức năng sản sinh ra dimeric từ catharanthin và vindolin [62]

Nếu anhydrovinblastin là một chất trung gian quan trọng trong bán tổng hợp một loạt các alkaloid dimeric thì nó cũng là tiền chất của hai loại thuốc chống ung

thư không có trong tự nhiên của họ Dừa cạn: vinorelbin và vinflunin Tổng hợp vinorelbin bắt nguồn từ việc áp dụng phản ứng Polonovski-Portier với anhydrovinblastin vị trí Nb-oxít Xử lý với triflouroaxetic anhydrid dẫn đến muối amoni bậc 4 không bền, muối này sẽ bị phân hủy thành muối bisiminium Thêm nước và tiếp đó là mất formaldehyd sẽ tạo thành một amin bậc 2 nucleophilic, chất trung gian này sẽ chuyển thành vinorelbin sau khi bẫy nội phân tử (intramolecular trapping) nhóm iminium [48] Cải tiến trong tổng hợp vinorelbin có thể nhận được bằng cách sử dụng chloro hay bromo-indolenin của anhydrovinblastin [12], [27]

Theo hướng sử dụng xúc tác nguồn gốc sinh học làm tác nhân chiral, năm

2006, Tatsuya và các cộng sự đã công bố kết quả sử dụng kháng thể monoclon vinblastin MAb-10-A9 làm xúc tác, oxy không khí và NaBH3CN được sử dụng làm các tác nhân oxy hóa - khử hóa; sau 24 giờ, hiệu suất chuyển hóa 3’,4’-anhydrovinblastin tạo thành vinblastin đạt tới 82,2 %, trong sản phẩm hoàn toàn

anti-không có mặt 20’-epi-vinblastin (leurosidin) Tuy nhiên, việc tổ hợp MAb-10-A9

trên động vật hiện vẫn còn đang ở trong giai đoạn nghiên cứu và phát triển cho tương lai [29]

Kuehne và cộng sự (1990) phát triển nghiên cứu theo hướng tổng hợp chọn lọc mảnh cấu trúc cacbometoxivelbanamin trong phân tử vinblastin Hợp chất tetracyclic amin acrylat (tổng hợp toàn phần từ 2-etyl-2-propenol và tryptamin) được ghép đôi với vindolin khi có mặt xúc tác AgBF4 rồi khử với KBH4 để tạo ra sản phẩm trung gian kiểu indoloazonin với hiệu suất tới 80 - 85 % Các giai đoạn tiếp theo được thực hiện chọn lọc về mặt lập thể để hoàn tất quá trình tổng hợp phần cấu trúc cacbometoxivelbanamin Hiệu suất tạo thành vinblastin hoặc các chất tương tự đạt tới 60 % Như vậy, có thể chủ động điều chế vinblastin và các dẫn xuất chỉ đi từ vindolin (chất này có hàm lượng chiếm tới 0,05 - 0,07 % lá Dừa cạn khô)

mà không phụ thuộc vào lượng catharanthin (chỉ có hàm lượng trong lá Dừa cạn ~ 0,03 %; bằng khoảng hơn hai lần so với vinblastin) [38]

Cũng trong những năm 1980 và 1990, dựa trên các nghiên cứu của Potier, Kutney và Kuehne, Philip Magnus và các cộng sự đã phát triển phương pháp ghép

đôi không ôxy hóa để cải tiến quy trình tổng hợp vinorelbin (Hình 1.4), vinblastin

và vincristin [44]

Mặc dầu quy trình tổng hợp phức tạp và đi qua nhiều giai đoạn, nhưng các phương pháp của Kuehne và Magnus vẫn được áp dụng tại Công ty Eli Lilly, Mỹ ngay từ những năm 90 để tận dụng vindolin [38], [44]

Hình 1.1: Sơ đồ bán tổng hợp vinorelbin và dẫn xuất theo Magnus