Xác định hàm lượng axit amin trong một số loài nấm tự nhiên ở vùng núi bắc trung bộ bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (hplc)

Từ đó phân tích và định lượng được các loại axit amin trong các mẫu nấm tự nhiên... Xuất phát từ thực tế đó, ch ng tôi lựa chọn đề tài : “Nghiên cứu xác định hàm lượng các axit amin tro

HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Giáo viên hướng dẫn: TH.S HOÀNG VĂN TRUNG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN DUY TRỌNG

VINH, THÁNG 01/ 20

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự do -Hạnh phúc

2 Nội dung nghiên cứu:

- Tổng quan về nấm, các axit amin và phương pháp định lượng axit amin

- Xác định các điều kiện tách và định lượng axit amin bằng HPLC

- Xây dựng đường chuẩn của các axit amin

- Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp

- Định lượng axit amin bằng phương pháp HPLC

Cán bộ hướng dẫn : ThS Ho ng Văn Trung

Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày tháng năm 2014

Ngày hoàn thành đồ án : Ngày tháng năm 2014

Ngày tháng năm 2014

Sinh viên đã hoàn thành và nộp đồ án vào ngày tháng năm 2015

Người du ệt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập –Tự do –Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Ngu n Du Tr ng Msv: 105204 3902

Ho ng Th Ng Msv: 1052040676 Khóa: 51 Ngành: Công nghệ thực phẩm Cán bộ hướng dẫn: ThS Ho ng Văn Trung Cán bộ duyệt:

1 Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………

………

………

2 Nhận xét củ cán bộ hướng dẫn: ………

………

………

………

………

………

…

Ngày tháng năm 2015

Cán bộ hướng dẫn

3

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập –Tự do –Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Ngu n Du Tr ng Msv: 105204 3902 Ho ng Th ng Msv: 1052040676

Khóa: 51 Ngành: Công nghệ thực phẩm Cán bộ hướng dẫn: ThS Ho ng Văn Trung Cán bộ duyệt:

1 Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………

………

………

2 Nhận xét củ cán bộ du ệt: ………

………

………

………

………

……… ………

Ngày tháng năm 2015

Cán bộ du ệt

Với lòng ính trọng và biết ơn sâu s c, ch ng tôi xin chân thành g i lời

cảm ơn đến thầy giáo Th.S Hoàng Văn Trung - Khoa Hóa học - Trường Đại học

Vinh đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều iện thuận lợi trong suốt quá

trình nghiên c u và hoàn thành đề tài

Ch ng tôi xin chân thành cảm ơn ThS Chu Thị Thanh Lâm – Trung tâm

iểm định An toàn thực phẩm và Môi trường – T.T Thực hành thí nghiệm - Trường Đại học Vinh đã tạo điều iện thuận lợi và gi p đỡ ch ng tôi trong quá trình làm thí

nghiệm

Đề tài được hoàn thành nhờ sự hỗ trợ inh phí từ đề tài Nghị định thư hợp

tác Việt Nam – Đài Loan của PGS.TS Trần Đình Thắng – Khoa Hóa học, trường

Vinh, ngày tháng năm 2015

Sinh viên thực hiện

Ngu n Du Tr ng

Ho ng Th Ng

Để thực hiện phân tích ch ng tôi tiến hành x lí mẫu và s dụng máy s c í

l ng cao áp HPLC của Trung tâm iểm định an toàn thực phẩm và môi trường - Trường Đại học Vinh

Nh ng ết quả đạt được:

Ch ng tôi xác định được các điều kiện tách và định lượng axit amin bằng HPLC Xây dựng được đường chuẩn của các axit amin Khảo sát được giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp

Từ đó phân tích và định lượng được các loại axit amin trong các mẫu nấm tự nhiên

iii

BẢNG KÍ HIỆU CÁC TỪ VIẾT TẮT

AOAC Hiệp hội các nhà hoá học phân

tích chính thống

Association of Official Analytical Chemists

N-hydroxysuccinimidyl cacbamat

Aminoquinolil- hydroxysuccinimidyl carbamate

FMOC 9-florenylmetyl cloroformat 9-florenylmethyl cloroformate

ortho-phthaldialdehyd

phthalaldehyd/ phthaldialdehyd

RP-HPLC S c ký l ng hiệu năng cao pha

ngƣợc

Reverse phase - High performance liquid chromatography

iv

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên c u 2

3 Đối tượng nghiên c u 2

4 Nhiệm vụ nghiên c u 2

CHƯƠN 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Nấm 4

1.1.1 Giới thiệu về nấm 4

1.1.2 Phân loại nấm 5

1.1.3 Đ c điểm dinh dưỡng của nấm 5

1.1.4 Vai trò của nấm trong tự nhiên và trong đời sống con người 10

1.2 Axit amin 14

1.2.1 Định nghĩa và cấu trúc 14

1.2.2 Phân loại 15

1.2.3 Tính chất hóa lý của axit amin 17

1.2.4 Vai trò của các axit amin 18

1.2.5 Axit amin trong nấm 22

1.3 Các phương pháp tách và xác định đồng thời axit amin 24

1.3.1 Các phương pháp s c ký cổ điển 24

1.3.2 Phương pháp s c ký khí 25

1.3.3 Phương pháp điện di mao quản 26

1.3.4 Phương pháp s c ký l ng hiệu năng cao HPLC 27

CHƯƠN 2: PHƯƠN PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 29

2.1 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 29

2.1.1 Thiết bị và dụng cụ 29

2.1.2 Hóa chất 29

2.2 Thực nghiệm 31

2.2.1 Thu thập mẫu nấm 31

2.2.2 X lí mẫu 31

2.2.3 Tiến hành phân tích trên máy 32

CHƯƠN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Xây dựng đường chuẩn 34

v

3.2 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp 39

3.3 Khảo sát các điều kiện thủy phân mẫu 41

3.3.1 Khảo sát nồng độ axit HCl 41

3.3.2 Khảo sát thời gian thủy phân mẫu 44

3.5 Độ thu hồi của phương pháp 47

3.6 Xác định hàm lượng các axit amin trong các mẫu nấm 49

3.6 Kết quả phân tích hàm lượng axit amin thủy phân 49

KẾT LUẬN 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Cấu trúc của 20 axit amin tiêu chuẩn 15

Bảng 2.2: Trị số ước lượng về lượng đòi h i các axit amin cần thiết (mg/kg cân n ng/ngày) 21

Bảng 2.3: Đối chiếu các loại axit amin thiết yếu 22

Bảng 2.4: Thành phần axit amin thiết yếu trong một số loài nấm hoang (g/100g protein thô)[10, 36] 22

Bảng 2.5: Hàm lượng axit amin tự do trong loài nấm Calvatia gigantea ở phía Nam Thỗ Nhĩ Kỳ Kết quả cho số mg axit amin tự do trong 100g nấm khô (mg/100 g ± SD) [33] 23

Bảng 2.6: Thành phần axit amin thiết yếu trong hai loài nấm ở Hàn Quốc (g/100g) định lượng bằng phương pháp HPLC [35] 24

Bảng 2.7: Thành phần axit amin thiết yếu trong hai loài nấm ở Hàn Quốc (g/100g) định lượng bằng phương pháp HPLC [35] 24

Bảng 3.1: Sự phụ thuộc của diện tích pic s c ký vào nồng độ (pmol/l) của axit amin 35

Bảng 3.2: Giá trị LOD và LOQ của axit Aspartic 40

Bảng 3.3: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 40

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi 43

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi 46

Bảng 3.6: Hiệu suất thu hồi của axit amin trong nấm Thượng Hoàng 48

Bảng 3.7: Hàm lượng axit amin trong nấm Thượng hoàng 50

Bảng 3.8: Hàm lượng axit amin trong các mẫu nấm 54

Bảng 3.9.Hàm lượng các axit amin trong mẫu nấm theo các phương pháp x lí mẫu hác nhau 55

vii

DANH MỤC HÌNH

H1: Mẫu nấmPL1 2

H2: Mẫu nấm PL2 Phellinus igniarius 2

H3: Mẫu nấm PL3 2

H4: Mẫu nấm TH Phellinus linteus 2

H5: Mẫu nấm Linh Chi Ganoderma lucidum 2

H6: Nấm Linh Chi Đen Amauroderma subresinosum 2

Hình 3.1: S c đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 10pmol 34

Hình 3.2: S c đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 25pmol 34

Hình 3.3: S c đồ chạy hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 100pmol 35

Hình 3.4: Đường chuẩn định lượng His 36

Hình 3.5: Đường chuẩn định lượng Thr 36

Hình 3.6: Đường chuẩn định lượng Tyr 36

Hình 3.7: Đường chuẩn định lượng Ile 36

Hình 3.8: Đường chuẩn định lượng Glu 37

Hình 3.9: Đường chuẩn định lượng Ser 37

Hình 3.10: Đường chuẩn định lượng Gly 37

Hình 3.11: Đường chuẩn định lượng Ala 37

Hình 3.12: Đường chuẩn định lượng Asp 37

Hình 3.13: Đường chuẩn định lượng Leu 37

Hình 3.14: Đường chuẩn định lượng Cys – SS – Cys 38

Hình 3.15: Đường chuẩn định lượng Val 3838

Hình 3.16: Đường chuẩn định lượng Met 38

Hình 3.17: Đường chuẩn định lượng Phe 3838

Hình 3.18: Đường chuẩn định lượng Lys 38

Hình 3.19: Đường chuẩn định lượng Pro 3838

Hình 3.20: S c đồ tách axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm Thượng hoàng tại nồng độ HCl 4M 41

Hình 3.21: S c đồ tách axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm Thượng hoàng tại nồng độ HCl 6M 42

Hình 3.23: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào nồng độ HCl 43

Hình 3.24: S c đồ các axit amin của mẫu nấm Thượng hoàng tại thời gian thủy phân 20h 44

Hình 3.24: S c đồ các axit amin của mẫu nấm Thượng hoàng tại thời gian thủy phân 22h 44

viii

Hình 3.26 : S c đồ các axit amin của mẫu nấm Thƣợng hoàng tại thời gian thủy

phân 24h 45

Hình 3.27: S c đồ các axit amin của mẫu nấm Thƣợng hoàng tại thời gian thủy phân 26h 45

Hình 3.28: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào thời gian thủy phân 46

Hình 3.29: S c đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm Thƣợng hoàng 48

Hình 3.30: S c đồ tách axit amin trong dịch thủy phân nấm Thƣợng hoàng thêm chuẩn 48

Hình 3.31: S c đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL1 51

Hình 3.32: S c đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL2 51

Hình 3.33: S c đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL3 52

Hình 3.34: S c đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm PL4 52

Hình 3.35: S c đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm Linh Chi 533

Hình 3.36: S c đồ tách axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm Linh Chi Đen 53

c u đưa vào ng dụng trong thực tế là sản phẩm của các loài nấm

Từ xa xưa, nấm được biết đến như là nguồn thực phẩm giàu chất dinh dưỡng

(Termitomyces albuminosus, Macrocybe gegantea), là nguồn th c ăn qu được nhân

dân ưa chuộng, ch a nhiều protein, các chất khoáng và vitamin (A, B, C, D, E ) Nhiều loài nấm được ng dụng trong công nghiệp dược phẩm, là nguồn nguyên liệu

để điều chế các hoạt chất điều trị bệnh như: Laricifomes officinalis là nguyên liệu để

chiết aragicin dùng trong ch a bệnh lao ho c dùng làm thuốc nhuận tràng hay chất

thay thế cho quinine Các chế phẩm từ nấm Linh chi (Ganoderma được dùng để hỗ

trợ điều trị nhiều bệnh như bệnh gan, tiết niệu, tim mạch, ung thư, AI S Các hoạt

chất từ Ganoderma applanatum có hiệu lực chống khối u cao, ch ng được s dụng

trong điều trị ung thư: ung thư phổi, ung thư v , ung thư dạ dày Các dẫn xuất

adenosine có trong Ganoderma capense và G amboinense có tác dụng giảm đau,

giãn cơ, c chế kết dính tiền tiểu cầu Nhiều hoạt chất từ linh chi có khả năng đào thải phóng xạ, hạn chế và loại trừ nh ng tổn thương do phóng xạ ở mô và tế bào

Nấm là sinh vật không thể thiếu trong đời sống, không có nấm chu trình tuần hoàn vật chất sẽ bị mất một m t xích quan trọng trong việc phân hủy chất bã h u cơ Nấm còn đem lại nguồn thực phẩm giàu đạm, đầy đủ các axit amin thiết yếu, hàm lượng chất béo ít và là nh ng axit béo chưa bão hòa, do đó tốt cho s c kh e, giá trị năng lượng cao, giàu khoáng chất và các vitamin

Protein trong nấm có giá trị dinh dưỡng cao hơn so với hầu hết các protein thực vật (Belitz & Grosch, 1999) [15] Axit amin cung cấp cho cơ thể từ thực phẩm giàu protein Protein hi đi vào cơ thể được chuyển hóa thành 20 axit amin, trong đó

có 8 axit amin thiết yếu (b t buộc phải được cung cấp từ th c ăn, th c uống) Axit amin là thành phần quan trọng thực hiện các ch c năng đa dạng của cơ thể sống, là tiền thân của nhiều sinh chất quan trọng trong cơ thể sống Axit amin tạo nên tế bào, phục hồi mô, tạo nên các kháng thể chống lại vi khuẩn và virut, là một phần của enzym và hệ thống hormone Nó tạo nên ARN, AND vận chuyển oxi đi h p cơ thể

và tham gia vào hoạt động của các cơ Sự thiếu hụt axit amin dẫn đến cơ thể mệt

m i, hạ đường huyết, dị ng [63]

2

Để hiểu sâu s c hơn về công dụng có được của các loại nấm, đã có nh ng đề tài nghiên c u về Vitamin, kim loại… của các loài nấm lớn ở vùng B c Trung Bộ Cùng với sự phát triển của kỹ thuật phân tích, phương pháp s c ký l ng hiệu năng cao HPLC là phương pháp phân tích đơn giản, nhanh, có độ tin cậy cao Trong

nh ng năm gần đây, HPLC được ng dụng rộng rãi trong phân tích, đánh giá chất lượng thực phẩm như axit amin, vitamin, háng sinh, phụ gia thực phẩm Xuất

phát từ thực tế đó, ch ng tôi lựa chọn đề tài : “Nghiên cứu xác định hàm lượng các

axit amin trong một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao HPLC”

2 Mục đích nghiên cứu

Xây dựng phương pháp tách và định lượng đồng thời các axit amin trong các loại nấm khác nhau, cung cấp số liệu về thành phần dinh dưỡng (axit amin) trong

một số loại nấm được nghiên c u

3 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên c u xác định các axit amin trên loại nấm tự nhiên được thu thập từ rừng Quốc gia Pù Mát, Phong Nha Kẻ Bàng thuộc vùng B c Trung Bộ gồm:

3

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Tổng quan về nấm, các axit amin và phương pháp định lượng axit amin

- Xác định các điều kiện tách và định lượng axit amin bằng HPLC

- Xây dựng đường chuẩn của các axit amin

- Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp

- Đánh giá thống ê phương pháp phân tích:

+ Hiệu suất thu hồi

- Định lượng axit amin bằng phương pháp HPLC

4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Nấm

Thuật ng ― Nấm‖ được s dụng rộng rãi bao trùm tất cả các loại nấm lớn,

ho c tất cả các loại nấm với thân và mũ, ho c tất cả nấm thịt lớn Một cách s dụng hạn chế hơn chỉ bao gồm nh ng loại nấm lớn đó là có thể ăn được ho c có giá trị

ch a bệnh Nấm được định nghĩa theo nghĩa rộng như sau: ―Nấm là nấm lớn với quả thể phân biệt rõ mà có thể là mọc trên m t đất ho c dưới đất và đủ lớn để thấy được bằng m t thường và được thu hoạch bằng tay‖ Chang và Miles, 1992 Theo định nghĩa này, nấm không cần phải là lớp nấm đảm, ho c trên không, ho c có thịt,

ho c ăn được Nấm có thể là lớp nấm túi hay nấm nang, mọc từ dưới lên, có một kết cấu không nhiều thịt và không nhất thiết ăn được Định nghĩa này hông phải là hoàn hảo nhưng có thể chấp nhận được, nhưng có thể dùng để đánh giá số lượng nấm trên trái đất (Hawksworth,2001)

Ở Việt Nam, từ lâu nhân dân đã biết dùng nấm làm thực phẩm và dược phẩm Nhà bác học Lê Qu Đôn 1726 - 1784 trong tác phẩm ―Vân đài loại ng ‖

và ―Kiến văn tiểu lục‖ đã đánh giá ―Linh chi là một sản vật qu hiếm của đất rừng Đại Nam‖ với các tác dụng lớn như: iện não tráng iện , bảo can bảo vệ gan , cường tâm mạch tim , iện vị gi p tiêu hoá ở dạ dày , cường phế gi p phổi , giải độc, giải cảm và gi p con người sống lâu, tăng tuổi thọ

Nấm được ng dụng rộng rãi trong đời sống lẫn sản xuất, nhiều loài được s dụng trong công nghệ thực phẩm, s dụng làm th c ăn ho c trong quá trình lên men Nấm còn được s dụng làm chất háng sinh, hooc môn trong y học và nhiều loại enzym Tuy vậy, nhiều loài nấm lại có ch a các chất hoạt động sinh học được gọi là mycotoxin, như ancaloit và poly etit, là nh ng chất độc đối với động vật và con người Một số loại nấm được s dụng để ích thích ho c trong các nghi l truyền thống với vai trò tác động lên trí tuệ và hành vi của con người Vài loại nấm

5

có thể gây ra các ch ng bệnh cho con người và động vật, cũng như bệnh dịch cho cây trồng, mùa màng và có thể gây tác động lớn đến an ninh lương thực và inh tế

1.1.2 Phân loại nấm

Nấm là một giới riêng biệt khoảng 1,5 triệu loài, trong đó đã mô tả được

69000 loài (Hawksworth, 1991)[30], sống kh p nơi trên trái đất từ hốc tường đến thực vật, động vật và con người: bao gồm nấm men, nấm mốc và các loài nấm lớn Nấm là các sinh vật có nhân thực được xếp vào nhóm eukaryote) có vách tế bào bao bọc bên ngoài thường ch a chitin polysaccharide, chất béo và protein Nấm không có chất diệp lục và do đó hông thể thực hiện quá trình quang hợp o đó, nấm phải hấp thu chất dinh dưỡng từ các nguồn khác nhau Nấm sinh sản h u tính

ho c vô tính và có bộ máy sinh dưỡng thường là dạng sợi có cấu trúc phân nhánh gọi là sợi nấm

Năm 1969 nhà hoa học người Mỹ R.H Whittaker [61] đã đưa ra hệ thống phân loại sinh vật thành năm giới sau đây:

- Giới khởi sinh: Bao gồm vi khuẩn và tảo lam

- Giới nguyên sinh: Bao gồm một số loài đơn bào, một số nấm đơn bào có roi

và nhóm các động vật nguyên sinh

- Giới thực vật

- Giới nấm

- Giới động vật

1.1.3 Đặc điểm dinh dưỡng của nấm

1.1.3.1 Chất khô, giá trị năng lượng

Hàm lượng chất khô trong nấm tươi là rất thấp, thường trong khoảng 140g/kg và chủ yếu bao gồm carbohydrate, protein, chất xơ và hoáng chất Thông thường, hàm lượng chất hô 100 g/ g đã được s dụng để tính toán nếu giá trị thực

60-tế là hông rõ Hàm lượng nước cao và như vậy có ảnh hưởng đến kết cấu và tham gia vào tuổi thọ ng n của quả thể

Hàm lượng lipid và chất khô thấp dẫn đến giá trị năng lượng thấp của nấm Các giá trị 86,4; 165; 126; 101 và 112 kJ/100g nấm tươi đã được báo cáo cho các

loài A bisporus, Lactarius deliciosus, Leucopaxillus giganteus, Sarcodon imbricatus

và T portentosum (Barros et al., 2007a) [12] Các giá trị 118; 87,3; 131 và 159 J đã được tìm thấy cho các loài Cantharellus cibarius, L nuda, Lycoperdon perlatum và

6

Ramaria Botrytis (Barros, Venturini, Baptista, Estevinho, & Ferreira, 2008) [13] Colak, Kolcuoglu, Sesli, và alman 2007 xác định giá trị 155 kJ là của loài A rubescens và 259 kJ cho loài L Nuda [20] o đó, nấm là một nguồn thực phẩm có

giá trị năng lượng thấp

1.1.3.2 Protein và axit amin

Nấm là một nguồn tuyệt vời của protein Giá trị dinh dưỡng của nấm chủ yếu liên quan đến hàm lượng protein của chúng Protein nấm được coi là có chất lượng dinh dưỡng cao hơn so với protein thực vật (FAO, 1991) [27] Hàm lượng protein của nấm không chỉ phụ thuộc vào yếu tố môi trường và các giai đoạn trưởng thành của quả thể, mà còn phụ thuộc vào các loài khác nhau (Colak , Faiz , & Sesli , 2009) [19]

Các giá trị đã được công bố về hàm lượng protein trong 4 loài nấm ăn phổ

biến: agaricus bisporus (nấm mỡ), lentinula edodes (nấm hương , pleurotus spp (nấm sò), và volvariella volvacea (nấm rơm , đây là các loài nấm trồng thương mại

ở các nước khác nhau, chiếm từ 1,75-3,63% trọng lượng tươi của nấm [17] Hàm lượng protein trong nấm hoang, nhìn chung, cao hơn 2 lần so với măng tây và cải

b p, gấp 4 lần và 12 lần so với cam và táo tương ng Với trọng lượng khô thì nấm thường ch a 19-35% protein, so sánh với 7,3% trong gạo, 13,2% trong lúa mì, 39,1% trong đậu tương và 25,2% trong s a Như vậy, hàm lượng protein thô của nấm xếp hạng thấp hơn so với hầu hết thịt các loài động vật nhưng cao hơn hầu hết các loài thực phẩm khác bao gồm s a, th được sản xuất từ động vật [32]

Hàm lượng protein thô trong các loài nấm hác nhau cũng được báo cáo bởi

Bauer-pettrovska (2001) [14] Tác giả đã xác định được hàm lượng protein thô trung

bình là 32,6% dm (dry matter: chất khô) của 47 loài nấm hoang ở Hy lạp Hàm

lượng cao nhất là 48,8% dm và 51,2% dm có trong loài Calocybe gambosa và Macrolepiota mastoidea và thấp nhất chỉ 16,2% dm là trong loài C Cibarius

Hàm lượng protein trong chất khô, hầu như hông thay đổi trong suốt quá trình sấy khô nấm ở 40°C ho c làm lạnh đến -20°C; còn hi đun sôi nấm tươi gây

ra sự giảm đáng ể (Barros, Baptista, Correia, Morais, & Ferreira, 2007b)

Trong "Nấm", Chang và Miles xếp hạng thực phẩm theo axit amin thiết yếu của ch ng liên quan đến các yêu cầu chế độ ăn uống dành cho người lớn trong một chỉ số định lượng trên thang điểm từ 0 đến 100 Nấm xếp hạng chỉ dưới thịt và cao hơn rau bina Đ c biệt có sự hiện diện hầu như đủ các loại axit amin, trong đó có 8 loại axit amin cần thiết cho con người Thành phần axit amin trong nấm gần bằng

amin hạn chế là leucine và lysine có trong L edodes và P ostreatus (nấm sò tím) và

P eryngii (nấm sò vua Điều thú vị là hai loại axit amin không phổ biến : axit γ

-amino butyric và ornithine đã được phát hiện, hai chất này thể hiện các ch c năng sinh lí quan trọng [42]

Hàm lượng của axit amin tự do trong nấm là thấp, chỉ khoảng 1% dm Vì thế,

sự đóng góp thành phần dinh dưỡng của chúng là bị hạn chế Tuy nhiên, chúng tham gia vào hương vị của nấm Axit glutamic và alanin được báo cáo là axit amin

tự do phổ biến trong T portentosum and T terreum (Díez & Alvarez, 2001) [23]

1.1.3.3 Lipid (chất béo)

Nấm ăn cung cấp một lượng chất béo thấp Nói chung, các axit béo không bão hòa chiếm ưu thế hơn các axit béo bão hòa đ c biệt là axit panmitic, axit oleic và axit linoleic, trong hi đó các axit béo còn lại chỉ được tìm thấy với lượng nh ,

ngoại trừ trường hợp loài Lactarius deliciosus nó có ch a một lượng lớn của axit

stearic Axit linolenic là tiền thân cho 1-octen-3-ol (còn gọi là nấm rượu), là hợp chất thơm chủ yếu có trong hầu hết các loại nấm, nó là thành phần đ c trưng và đ c s c góp phần vào hương vị nấm [25]

Hàm lượng lipid tổng (chất béo thô dao động chủ yếu từ 2% đến 6 % hàm lượng chất khô Trong thành phần axit béo, axit linoleic hông bão hòa đa C18 : 2 , axit oleic hông bão hòa đơn C18 : 1 và axit palmitic bão hòa C16 : 0 là phổ biến Tỷ lệ dinh dưỡng của axit bão hòa stearic C18 : 0 , và đ c biệt là axit α -linolenic mong muốn (C18 : 2) thì thấp Hàm lượng các axit béo khác chỉ ở m c độ thấp Hàm lượng của axit chuỗi nhánh và các axit béo hydroxyl là hông đáng ể ( Nedelcheva et al., 2007) [50]

Giá trị dinh dưỡng của chất béo trong nấm hoang là hạn chế vì hàm lượng lipid tổng là thấp và axit béo mong muốn n-3(axit béo omega-3) chiếm tỉ lệ thấp

8

1.1.3.4 Cacbohydrat và chất xơ

Cacbohydrat thường chiếm một lượng phổ biến trong quả thể Cacbohydrat tiêu hóa được tìm thấy trong nấm là mannitol (0,3-5,5 % dm) (Vaz et al., 2011) [58], glucozơ 0,5-3,6% dm) (Kim et al., 2009) [34] và glycogen (1,0-1,6% dm ) (Díez & Alvarez, 2001) Cacbohydrat không tiêu hóa chiếm một phần lớn trong tổng cacbohydrat của nấm, và các hợp chất chính là oligosaccarit và polysaccarit không tinh bột như chitin, β -glucan và mannan [60]

Chất xơ thô là nhóm cacbohydrat hó tiêu hóa Nó làm giảm m c cholesterol

và lượng đường trong máu thấp hơn Lượng chất xơ hòa tan và không hòa tan trong

nấm Boleztus tương ng khoảng 4-9% và 22-30% dm (Manzi, Marconi, Aguzzi, &

Pizzoferrato, 2004) [43] Một số nấm được tìm thấy là ít chất xơ thô, ví dụ như loài

Craterellus aureus và Sarcodon aspratus là 5% dm, trong hi đối với nhiều loài hác, lên đến 40% dm như loài Lactarius volemus (Yin and Zhou (2008) Trong

nấm thì hàm lượng chất xơ hông hòa tan cao hơn so với chất xơ hòa tan β-glucan chiếm từ 4-13% tổng lượng chất xơ và sự dao động này phụ thuộc vào các loài nấm khác nhau

1.1.3.5 Vitamin

Nấm ch a nhiều vitamin chính bao gồm thiamin (vitamin B1 , riboflavin (vitamin B2), niacin (vitamin B3), tocopherol and vitamin D (Cheung, 2010; Kalac, 2013) Một số tác giả đã xem nấm như một nguồn cung cấp vitamin dựa trên hàm lượng cao của riboflavin (vitamin B2), niacin và của vitamin C, vitamin B1, vitamin , β-caroten (tiền vitamin A), vitamin E và vitamin B12 Nấm giống như là nguồn

th c ăn hông động vật ch a vitamin D, và vì thế chúng là nguồn vitamin D tự nhiên cho người ăn chay Hàm lượng vitamin D2 là đáng ể trong một số loài nấm hoang dã, nhưng nó gần như v ng m t trong các loài nấm trồng [45]

Quá trình nấu và chế biến công nghiệp đã được phát hiện là có ảnh hưởng đến hàm lượng vitamin trong sản phẩm Vitamin B1 và B2 bị mất trong quá trình chế

biến công nghiệp đóng hộp) của loài Boletus ở m c 21-57% và 8-74%, tương ng

(Zhou and Yin, 2008)

1.1.3.6 Thành phần khoáng chất

Nấm là một nguồn tốt của các nguyên tố khoáng Nguyên tố khoáng có hàm lượng cao nhất là kali, tiếp theo là photpho, natri, canxi và magie Ch ng được coi là thành phần nguyên tố hoáng chính, và đồng, kẽm, s t, mangan, cadimi là nh ng nguyên tố khoáng phụ

9

Tính toán nồng độ thành phần của K, P, Na, Ca và Mg chiếm khoảng 56-70% tổng hàm lượng tro [36] K là phong phú và chiếm khoảng gần 45% tổng hàm lượng tro Hàm lượng tro trong nấm thường chiếm từ 5-12% trọng lượng khô Nhìn chung, hàm lượng tro của nấm có phần cao hơn ho c tương đương với hầu hết các loại rau Nấm ch a hàm lượng cao của photpho, ali và tương đối cao của magiê Tuy nhiên, một số nguyên tố còn lại sẵn có trong nấm vẫn chưa được biết hàm lượng

Điểm lưu đ c biệt là sự tích tụ trong nấm vết kim loại n ng, đ c biệt là các nguyên tố độc hại như cadimi, chì và thủy ngân, thường có m t trong các chất nền

nuôi cấy Thật vậy, loài L edodes được ch ng minh là tích tr một lượng cadimi hiệu quả, trong khi loài A bisporus, P ostreatus, L edodes và một số loài thuộc chi Boletus tự nhiên giàu selen [26]

1.1.3.7 Thành phần hương vị

Hương vị đ c trưng của nấm được đánh giá cao bởi nhiều người tiêu dùng Hàng trăm hợp chất có mùi đã được xác định Theo cấu trúc hóa học của các hợp chất này thì chúng có thể được phân loại là chất dẫn xuất của octan và octen, tecpen, dẫn xuất của benzandehit, hợp chất của lưu huỳnh và nh ng chất khác (Gross và Asther, 1989) [28]

Hương vị đ c trưng của nấm hoang có thể được phân thành: thành phần hông bay hơi vị) và các thành phần d bay hơi mùi Các hợp chất d bay hơi hác nhau như tecpen, các dẫn xuất của octan, 1- octen và 2 -octen, rượu và este của chúng với các axit béo d bay hơi, xeton là nh ng hợp chất thơm chính trong nấm, hình thành nên hương vị rất đ c trưng của nấm Vai trò chính được gán cho" nấm rượu " 1- octen -3 -ol Vị độc đáo của nấm được gán cho axit amin tự do, 5’-nucleotit

và đường hòa tan Hàm lượng các axit amin và 5’-nucleotit trong nấm cục lần lượt

là 1,5–7,1 và 0,6–1,2 mg/g Cả hai loại thành phần này đều thấp hơn so với sợi nấm sau khi lên men ( Liu , Li , & Tang, 2012) [37]

1.1.3.8 Thành phần chất chống oxi hóa

Ngoài thành phần dinh dưỡng của nấm, một số loài nấm ăn rất giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học, có khả năng chống oxi hóa cao Hàm lượng của các hợp chất hoạt tính sinh học có thể thay đổi đáng ể trong nấm ăn được, vì nồng độ của các chất bị ảnh hưởng bởi sự khác biệt trong chất nền, điều kiện trồng trọt và điều kiện đậu quả, giai đoạn phát triển, tuổi của nấm tươi, điều kiện bảo quản, chế biến…

Các hợp chất phenolic có thể là phần đóng góp quan trọng nhất cho khả năng chống oxy hóa của nấm ăn uo et al., 2012 [29] Barros et al báo cáo rằng nồng

dm) (Liu, Sun et al., 2012) [38]

Ergothionin là một hợp chất thiol hòa tan trong nước, là một chất chống oxy hóa tuyệt vời trong cơ thể Hàm lượng ergothionin từ 48 đến 2851 mg/kg dm cho 29 loài nấm (Chen, Ho, Hsieh, Wang, & Mau, 2012) [18] Vì vậy, nấm ăn được từ tự nhiên có vẻ phong phú về ergothionin và có thể cải thiện khả năng chống oxy hóa trong các b a ăn

1.1.3.9 Thành phần có hại và kháng dinh dưỡng của nấm ăn

Các thành phần nguy hiểm của nấm độc đã được nghiên c u rộng rãi Tuy nhiên, một số hợp chất tự nhiên gây hại cũng có ở các loài nấm ăn Sự quan tâm đã được tập trung vào các hiđrazin với hoạt tính gây ung thư, hợp chất agaritin có trong

loài nấm Agaricus spp (Andersson & Gry, 2004) và gyromitrin trong loài Gyromitra esculenta ( Karlson - Stiber & Persson, 2003) Hoạt tính c chế của trypsin được

quan sát thấy ở nhiều loài nấm phát triển hoang dã với sự khác biệt đáng ể trong các loài khác nhau (Vetter, 2000) [59]

Nicotin là một ankaloit dồi dào có trong thuốc lá Tuy nhiên, nicotin là lần đầu tiên ngẫu nhiên được chiết xuất từ các mẫu nấm với nước dưới tác động của năng lượng vi sóng Theo cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) tuyên bố,

m c dư lượng tối đa tạm thời (MRLs) của nicotine là 0,036 cho nấm hoang dã tươi

và 1,17 mgkg-1 cho nấm hoang dã khô (Cavalieri, Bolzoni, & Bandini, 2010) [16]

1.1.4 Vai trò của nấm trong tự nhiên và trong đời sống con người

Một định nghĩa được thừa nhận rộng rãi về thực phẩm ch c năng cung cấp bởi Viện Khoa học đời sống quốc tế ở Châu âu ( ILSI Europe) phát biểu rằng "một loại thực phẩm có thể được coi là "ch c năng " nếu nó được ch ng minh là có tác động có lợi cho một ho c nhiều ch c năng trong cơ thể, ngoài tác dụng cung cấp đầy

đủ dinh dưỡng, còn liên quan đến việc cải thiện tình trạng s c kh e và giảm nguy cơ

m c bệnh" [24] Nấm từ lâu đã được ưa chuộng như một loại thực phẩm ngon và giàu chất dinh dưỡng Nấm ăn có lợi trong việc cải thiện điều kiện dinh dưỡng của chế độ ăn hi ch ng được dùng như một loại rau trong cuộc sống hàng ngày Các nghiên c u rộng rãi đã cho thấy rằng các loài nấm khác nhau có giá trị trong việc ngăn ngừa và điều trị một số bệnh của con người Vì vậy, các loại nấm được coi là

công bố rằng loài nấm Calvatia gigantean (nấm tr ng , được thu hoạch để s dụng

như một chất cầm máu cho bất kì vết thương nào, đ c biệt là dùng cầm máu cho rốn trẻ sơ sinh Sự quan tâm của các nhà khoa học trên loài nấm là đang được phát triển

vì chúng là nguồn chính của dược phẩm mới tiềm năng và bổ sung vào chế độ ăn uống

Nhiều chất kháng sinh quan trọng được chiết rút từ nấm Chẳng hạn như penicilium được phát hiện và sau đó được phát triển như chất điều trị y tế chống nhi m khuẩn Penicillin có lẽ là nổi tiếng nhất của tất cả các loại thuốc kháng sinh,

có nguồn gốc từ một loại nấm thông thường gọi là Penicillium Nhiều loại nấm khác

cũng sản xuất các chất kháng sinh, mà hiện nay được s dụng rộng rãi để kiểm soát bệnh trong người và động vật Việc phát hiện ra kháng sinh là một cuộc cách mạng chăm sóc s c kh e trên toàn thế giới

Nhiều đ c tính có lợi của nấm dùng phòng ngừa và điều trị một số bệnh đã

được mô tả bao gồm: chống oxi hóa, háng u , điều hoà mi n dịch , kháng virut, kháng khuẩn, ký sinh trùng và hiệu quả trong trị đái tháo đường; nấm còn có tác dụng ngăn ngừa các bệnh như cao huyết áp, tăng cholesterol máu, xơ v a động mạch

và ung thư do các thành phần hóa học cụ thể của nấm và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau Sản phẩm ch a bệnh quan trọng có thể được phân lập từ nấm ăn được và nấm hông ăn được Ngày nay khoảng 7000 loài nấm là ăn được ở m c độ khác nhau Ngoài ra, 2000 loài đã được đề xuất có đ c tính ch a bệnh [44]

Ví dụ, hiện nay sự quan tâm lớn đó là β-glucan trong nấm vì nh ng ảnh hưởng tích cực của nó đến s c kh e [51] β-glucan trong nấm được coi là hợp chất

ch c năng bởi vì chúng xuất hiện để điều chỉnh mi n dịch dịch thể và tế bào, và có tác dụng có lợi trong việc đấu tranh chống lại nhi m trùng, bên cạnh đó nó cũng làm giảm cholesterol trong máu Gần đây, chất này đã được ch ng minh có đ c tính háng độc tế bào, háng đột biến, là ng c viên đầy h a hẹn trong dược phẩm [41] Nhiều loại nấm ăn chất lượng retin cao là yếu tố làm chậm sự phát triển tế bào ung thư, gần đây Nhật Bản còn phát hiện nhiều hợp chất trích từ nấm như glucan thành phần cấu tạo tế bào vách của nấm), chất leutinan (từ nấm đông cô có hả năng ngăn

ch n sự phát triển của khối u – chống ung thư

12

Ở Việt Nam, các loài nấm có thể dùng làm dược liệu có khoảng hơn 200 loài trong đó có rất nhiều loài là dược liệu qu như: linh chi một năm, linh chi sò, linh chi nhiều năm, nấm lỗ phấn nhiều năm, nấm vân chi, nấm hương, nấm kim châm, mộc nhĩ,…Nh ng nghiên c u bước đầu về các chất có hoạt tính sinh học của một số nấm lớn Việt Nam cho thấy chúng rất giàu các chất có trọng lượng phân t lớn như polysaccarit, lectin…và các chất có trọng lượng phân t nh như flavonoid, steroid…có tác dụng chống viêm, tăng cường đáp ng mi n dịch, hỗ trợ điều trị các bệnh hiểm nghèo như ưng thư, suy giảm mi n dịch, tiết niệu, tim mạch… Trịnh Tam Kiệt, 2011)[5]

 Nấm là nguồn thực phẩm

Nấm là thực phẩm phổ biến từ thời cổ đại không chỉ vì hương vị , mà còn vì giá trị dinh dưỡng cao Nấm đã được s dụng trong nhiều năm như thực phẩm dinh dưỡng và hương liệu thực phẩm trong các món s p và nước sốt , do hương vị độc đáo và tinh tế của chúng

Từ rất lâu nấm được coi là một loại thực phẩm đ c biệt Người Hy lạp đã tin tưởng rằng nấm cung cấp s c mạnh cho các chiến binh trong các trận chiến Các vị vua tự hào nấm như một món ăn, các vị La mã coi nấm như ― thực phẩm của các vị thần‖ và ch ng chỉ phục vụ vào các dịp l hội Người Trung quốc coi nấm như là nguồn thực phẩm s c kh e, ― thuốc trường sinh của cuộc sống‖ Người Ấn độ Mexico s dụng nấm như là chất gây ảo giác trong nghi l tôn giáo và ma thuật tốt như là trong mục đích ch a bệnh [54]

Thường được nhóm với các loại rau, nấm cung cấp nhiều thuộc tính dinh dưỡng, cũng như các thuộc tính thường được tìm thấy trong thịt, đậu ho c các loại ngũ cốc Nấm là ít calo, không có chất béo, cholesterol và natri rất thấp, nhưng chúng cung cấp một số chất dinh dưỡng mà thường được tìm thấy trong các loại thực phẩm động vật ho c các loại ngũ cốc [56] Giống như tất cả các loại trái cây và rau quả, nấm tự nhiên không có gluten, nên bổ dưỡng với một chế độ ăn hông có gluten Nấm có đủ các chất h u cơ cần cho nhu cầu dinh dưỡng của người như protein, gluxit, lipit, vitamin, muối khoáng và nhiều loại enzim rất lợi cho tiêu hoá

và có giá trị dinh dưỡng cao

Nấm ăn Việt Nam có hơn 200 loài trong đó hoảng 50 loài là nấm ăn qu Tuyệt đại đa số nấm ăn Việt Nam thuộc các đại diện của nấm Đảm Basidiomycota

và một số ít thuộc nấm túi Ascomycota Có thể kể một số ví dụ như: mộc nhĩ, nấm hương, nấm rơm, ngân nhĩ, nấm thong, nấm chàm, nấm bào ngư, nấm kim châm,

13

nấm ngọc châm… Trịnh Tam Kiệt, 2011)

 Ngoài ra, các loài nấm có khả năng ứng dụng trong công nghệ sinh học và bảo vệ môi trường

Nh ng loài nấm có khả năng sinh enzim và một số hoạt chất quý có thể được

ng dụng trong công nghệ sinh học và bảo vệ môi trường

Nấm là bộ phận quan trọng trong công nghệ lên men Các loài nấm men như saccaromyces được dùng để oxi hóa đường thành etanol và khí cacbonic Quá trình này gọi là sự lên men rượu Và ng dụng trong làm rượu vang, bia và bánh mỳ, phomat và một số các sản phẩm đậu nành…

Các loài nấm hoại sinh đóng vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất và năng lượng trong thiên nhiên Nấm hoại sinh s dụng hệ men của ch ng để phân giải các chất h u cơ, các cành lá hô của thực vật thành chất mùn, chất khoáng Nấm có thể phân giải các chất h u cơ ph c tạp thành các chất đơn giản, đ c biệt là các chất khó phân giải như cellulose, lignin thành chất vô cơ; và có thể đồng hoá các chất đơn giản thành các chất ph c tạp o đó, nó là yếu tố quan trọng làm tăng độ phì nhiêu của đất

Các nấm cộng sinh hình thành r nấm (mycorrhiza) cộng sinh với thực vật có thể ng dụng trong lâm nghiệp, đ c biệt trong việc trồng rừng, như

loài P.tinctorius hình thành r nấm cộng sinh ch t chẽ với r cây thông, giúp cây

tăng cường sự hấp thụ vận chuyển các yếu tố dinh dưỡng như: N, P, K, Ca nên nó được ng dụng trong các dự án tái sinh ho c trồng mới các rừng thông nhựa, bạch đàn ở các vùng đất nghèo dinh dưỡng hay đất cát

 Ngoài lợi ích của nấm, có một số loài gây hại

Một số loài nấm độc có thể gây ngộ độc, đôi hi gây chết người như: Amanita muscaria, A phalloides hình thành các chất độc amanitin, phalloidin rất độc, nếu ăn

khoảng vài miligam (0,003 - 0,005g) có thể làm chết một người

Một số nấm ký sinh gây bệnh ở thực vật, đ c biệt ở một số cây trồng, cây rừng làm thay đổi tính chất l hoá và cơ học của cây, làm cho cây chết ho c bị yếu

và gãy đổ, tác hại đến các ngành nông - lâm nghiệp Nấm ký sinh gây bệnh mục lõi

heart rot pathogens như: Phellinus conchatus, P.punctatus, Laricifomes officinalis; nấm ký sinh gây bệnh mục r root rot pathogens như Phaeolus schweinitzii gây

bệnh mục r ở r cây thông

Các loài nấm độc ở Việt Nam cũng há phong ph Nh ng nghiên c u bước

14

đầu đã chỉ ra danh lục của hơn 30 loài Trịnh Tam Kiệt, 2008)[6] Trong số đó, nhóm nguy hiểm nhất là các loài gây ngộ độc chết người như: nấm độc xanh đen, nấm độc tán tr ng, nấm độc tr ng hình nón Một số loài nấm độc khác gây ngộ độc thần kinh, tiêu hóa, gây ảo giác hác cũng rất nguy hiểm, như: nấm ruồi, nấm độc

đ , nấm độc nấu, nấm độc rỉ s t, nấm ô phiến xanh…

1.2 Axit amin

1.2.1 Định nghĩa và cấu trúc

Axit amin (amino axit) là loại hợp chất h u cơ tạp ch c mà phân t ch a đồng thời nhóm amin (NH2) và nhóm cacboxyl (COOH) Trong hóa sinh,thuật ng này còn dùng để chỉ alpha axit amin: nh ng axit amin mà trong đó nhóm amin và nhóm cacboxyl g n vào cùng một nguyên t cacbon, nên gọi là α–cacbon

Vì nhóm COOH có tính axit, nhóm NH2 có tính bazơ nên ở trạng thái kết tinh axit amin tồn tại ở dạng ion lưỡng cực Trong dung dịch, dạng ion lưỡng cực chuyển một phần nh thành dạng phân t :

Dạng phân t dạng ion lưỡng cực

Tất cả các axit amin có ít nhất 2 nhóm ion hóa, điện tích chuẩn của axit amin phụ thuộc vào giá trị pH Nhóm COOH của nguyên t Cα có pka vào khoảng 1,8 – 2,8 do đó nó có độ axit mạnh hơn các monocacboxylic thông thường khác Tính bazơ của NH2 ở nguyên t Cα cũng thay đổi, pka vào khoảng 8,8 – 10,6 tùy thuộc vào từng axit amin

Trong tự nhiên axit amin tồn tại chính ở dạng α-axit amin, phần lớn các axit amin có bốn phần t khác nhau có khả năng thay thế ở vị trí C-2 (Cα) Nguyên t Cα hông có trung tâm đối x ng nên các axit amin có đồng phân quang học là L - và D - axit amin, chỉ có glycin là hông có đồng phân quang học (R = H) Trong tự nhiên chủ yếu tìm thấy ở dạng L – axit amin, D – axit amin chỉ tìm thấy trong vi khuẩn, vách tế bào vi khuẩn

C

N H

H

 H C

O

O _

15

Bảng 2.1: Cấu trúc của 20 axit amin tiêu chuẩn

1.2.2 Phân loại

Có hơn 100 axit amin đã được tìm thấy trong tự nhiên Trong đó có 20 loại axit amin được mã hóa bởi mã di truyền chuẩn và được gọi là proteinogenic hay axit amin tiêu chuẩn Việc kết hợp các axit amin tiêu chuẩn này tạo ra protein thiết yếu cho việc cấu thành cơ thể người Axit amin là đơn vị cấu tr c cơ bản xây dựng nên các khối protein

Có nhiều cách để phân loại axit amin: các axit amin có thể phân loại theo hai quan điểm: Quan điểm hoá học và quan điểm sinh vật học

 Quan điểm hoá học : ( Xét về mặt cấu tạo phân tử và các hoá tính)

Có thể phân loại dựa vào cấu trúc của mạch bên (nhóm R):

16

- Nhóm kị nước (Hydrophobic), gồm: glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin

tất cả đều ch a mạch bên là ankyl (trừ glycin mạch bên là nguyên t hidro Như vậy, mạch bên của ch ng đều không phân cực và do đó ị nước Các axit amin nhóm này được gọi là axit amin kị nước

- Nhóm ưa nước (Hydrophilic), gồm: serin và threonin ch a nhóm hydroxyl

ở mạch bên Vì các nhóm hydroxyl là phân cực và có khả năng liên ết hydro, nên các axit amin này là ưa nước

- Nhóm ch a lưu huỳnh: gồm cystein, methionin Axit amin cystein trong điều kiện thích hợp có thể liên kết với một phân t cystin khác qua mạch bên của

nó Kết quả là tạo liên kết gi a hai nguyên t lưu huỳnh của hai phân t cystein và được gọi là cầu disunfua Phân t mới hình thành được gọi là cystin Khả năng của cystein để tạo cầu disunfua sẽ tạo ra nghĩa quan trọng trong việc duy trì cấu trúc của một số protein

- Nhóm axit cacboxylic: nhóm này bao gồm các axit amino có một nhóm axit cacboxylic th hai như là một phần của mạch bên, gồm axit aspartic và axit glutamic Do tính axit của nhóm axit cacboxylic mạch bên, các axit amin không chỉ phân cực mà còn có thể trở nên tích điện âm bởi vì, trong dung dịch, các proton axit được chuyển cho một phân t nước, để lại một ion carboxylat mang điện tích âm

- Nhóm amit: hai axit amin rất giống với nhóm ở trên, nhưng mạch bên ch a các nhóm amit thay vì nhóm axit cacboxylic Nhóm amit là -CONH2 trong cấu trúc

đ c Các amit hình thành từ axit glutamic được gọi là glutamin và amit hình thành từ axit aspartic được gọi là asparagin

- Nhóm amin: nhóm này bao gồm ba axit amin có ch a một hay nhiều nhóm amin trong mạch bên: lysin, arginin và histidin Vì các nhóm amin có thể nhận proton, ch ng là bazơ và các axit amin này được coi là axit amin bazơ Trong dung dịch chúng có thể nhận một proton từ nước trở nên mang điện tích dương

- Nhóm thơm: gồm ba axit amin có mạch bên ch a các cấu tr c vòng thơm: phenylalanin, tyrosin và tryptophan Bởi vì có nhóm hydroxyl nên tyrosine là phân cực Tryptophan là không phân cực m c dù có các nguyên t nitơ trong vòng của nó Điều này là do ích thước lớn của hai vòng kết hợp Phenylalanin cũng hông phân cực

- Nhóm imido là axit amin cuối cùng, prolin, điểm hác thường là mạch bên uốn lại để tạo thành một vòng bằng cách liên kết với nhóm amin Trên thực tế, phân

t này là một axit imodo hơn là một axit amin

17

 Quan điểm sinh vật học [1, 62]

Dựa trên cơ sở sự tăng trưởng hay sự cân bằng nitơ là tổng hợp protein trong toàn bộ cơ thể) các axit amin có truyền thống được phân loại là chất dinh dưỡng thiết yếu (không thể thiếu) ho c không thiết yếu đối với người và động vật:

- Axit amin thiết yếu (essential amino acid -EAA) hay còn gọi là axit amin không thể thay thế được là nh ng axit amin có bộ hung cacbon hông được tổng hợp bởi các tế bào của người và động vật, do đó, phải được cung cấp từ chế độ ăn uống Trong số 20 axit amin tiêu chuẩn, có chín axit amin thiết yếu: valin, leucin, isoleucin, lysin, threonin, methionin, histidin, phenylalanin và tryptophan, trong đó histidin là axit amin thiết yếu cho trẻ em

- Axit amin không thiết yếu (nonessential amino acid -NEAA) hay gọi là axit amin thay thế được: t c là loại axit amin mà cơ thể người và động vật có thể tự tổng hợp được từ các nguyên liệu sẵn có (các axit béo, amiac, amit ) Axit amin không thiết yếu bao gồm: alanin, arginin, axit aspartic, cytin, axit glutamic, glycin, serin, prolin, tyrosin, glutamine, asparagin

Các axit amin không thiết yếu tuyệt đối hông được hiểu lầm là không cần,

mà chỉ vì chúng có thể được tổng hợp được trong cơ thể, nếu trong th c ăn có thiếu cũng hông quan trọng l m

1.2.3 Tính chất hóa lý của axit amin

1.2.3.1 Tính chất lưỡng tính

Axit amin có tính chất lưỡng tính t c là vừa có tính axít vừa có tính bazơ Phân t axit amin có nhóm amin và nhóm cacboxyl trong phân t Ở pH trung tính axít amin tồn tại ở dạng ion lưỡng cực và trạng thái ion phụ thuộc vào pH của môi trường Khi đ t axít amin trong điện trường thì tuỳ thuộc vào pH mà di chuyển về catôt hay anôt, ở một pH nào đó thì axít amin hông di chuyển về bên nào, đó là điểm đẳng điện của axít amin

H2N-R-COOH + H+ H3N+-R-COOH

H2N-R-COOH + OH- H2N-R-COO- + H2O

1.2.3.2 Tác dụng với ancol tạo hợp chất chứa nhóm chức este

H2N-R-COOH + R’OH khí HCl bão hòa H2N-R-COOR’ + H2O

18

1.2.3.3 Amino axit tham gia phản ứng trùng ngưng, đồng trùng ngưng tạo đipeptit, tripeptit,…, polipeptit

Nh ng peptit có nhiều hơn 50 axit amin được xếp loại là protein

 Ngoài ra axit min còn c một số tính chất riêng như s u:

- Axit amin có khả năng kết tinh

- Bền với nhiệt độ khoảng 100°C đến 200°C trong 2 giờ

- Khá bền trong môi trường axit, không bền trong môi trường kiềm (trong môi trường axit chỉ có trytophan bị phá hủy)

- Tính chất đồng phân quang học (hoạt quang)

- Tất cả các axit amin đều có đồng phân quang học (trừ glyxin)

- Đa số các axit amin tự nhiên đều tồn tại ở dạng L - axit amin (chỉ ở dạng này thì các axit amin có giá trị dinh dưỡng cho con người và động vật)

1.2.4 Vai trò của các axit amin

Các axit amin là cơ sở của sự sống bởi vì chúng đóng vai trò trung tâm trong việc xây dựng khối protein và còn là hợp chất trung gian của các quá trình trao đổi chất Axit amin đóng vai trò quan trọng trong chế độ dinh dưỡng của con người, động vật và trong việc duy trì s c kh e Để hiểu được axit amin quan trọng như thế nào, chúng ta cần biết protein cần thiết như thế nào cho cuộc sống Đó là protein cung cấp cấu trúc cho tất cả các sinh vật sống Mọi sinh vật sống, từ động vật lớn nhất cho tới vi khuẩn nh nhất, đều ch a protein Nhờ quá trình tiêu hoá protein th c

ăn được phân giải thành axit amin Các axit amin từ ruột vào máu và tới các tổ ch c, tại đây ch ng được s dụng để tổng hợp protein đ c hiệu cho cơ thể [52, 62]

Người ta đã phân loại được nhiều axit amin khác nhau và nh ng axit amin này sẽ gi p cơ thể kh e mạnh hi ch ng được hấp thu vào cơ thể Trên thực tế, có 8 loại axit amin liên kết ch t chẽ với nhau, ích thích cơ thể phát triển mạnh mẽ Nếu thiếu 1 trong 8 loại quan trọng này có thể dẫn đến một số bệnh nguy hiểm đáng tiếc

xảy ra

Vai trò của các axit amin không chỉ giới hạn ở sự tham gia của chúng vào tổng hợp protein trong cơ thể mà chúng còn có nhiều ch c năng ph c tạp và quan trọng hác, sau đây là vai trò của các axit amin thiết yếu:

Lysin là một trong các axit amin quan trọng nhất Đây là một trong bộ ba

axit amin được đăc biệt ch hi đánh giá chất lượng dinh dưỡng của khẩu phần

19

(lysin, tryptophan, methionin) Nó là cần thiết cho sự phát triển xương ở trẻ em; nó giúp hấp thu canxi và duy trì một sự cân bằng nitơ thích hợp ở người lớn Amino axit này hỗ trợ trong việc sản xuất các kháng thể, kích thích tố và các enzym, và giúp trong việc hình thành collagen và phục hồi mô.Thiếu lysine trong th c ăn dẫn đến rối loạn quá trình tạo máu, hạ thấp số lượng hồng cầu và hemoglobin Ngoài ra khi thiếu lysine cân bằng protein bị rối loạn, cơ suy mòn, quá trình cốt hoá bị rối loạn và có hàng loạt các biến đổi ở gan và phổi, không có khả năng tập trung, d cáu g t, thiếu năng lượng, chán ăn, rối loạn sinh sản, tăng trưởng chậm, và giảm cân

Nguồn cung cấp lysin là nh ng thực phẩm giàu protein như tr ng, thịt đ c biệt là thịt đ , thịt cừu, thịt lợn và gia cầm), đậu nành , đậu và đậu Hà Lan, pho mát,

và một số loại cá như cá tuyết và cá mòi )[57]

Tryptophan một loại chất dẫn truyền thần kinh quan trọng có thể tạo ra

trong não người, chất 5- hydroxytryptamin có tác dụng trung hoà adrenalin và norađrenalin, đồng thời cải thiện được thời gian liên tục của giấc ngủ Khi chất 5-hydroxytryptamin trong não động vật giảm, sẽ có biểu hiện hành vi không bình thường, kể cả mất ngủ, Ngoài ra, chất 5- hydroxytryptamin còn có trong các tổ

ch c tiểu cầu và tế bào niêm mạc ruột, có tác dụng làm co mạch máu rất mạnh Con người khi bị thương trong cơ thể sẽ phóng thích chất 5-hydroxytryptamin để cầm máu Tryptophan giúp chống lại trầm cảm và mất ngủ và để ổn định tâm trạng, tốt cho tim và tăng cường sự giải phóng của hormone tăng trưởng[49]

Các nguồn thực phẩm tốt nhất của tryptophan bao gồm gạo l c, phô mai, thịt, đậu phộng, và protein đậu nành

Methionin là một axit amin thiết yếu mà hỗ trợ trong quá trình phân hủy

chất béo, từ đó gi p ngăn ch n sự tích tụ của chất béo trong gan và động mạch có thể gây cản trở lưu lượng máu đến não, tim và thận Quá trình tổng hợp các axit amin cystin và taurin có thể phụ thuộc vào sự sẵn có của methionin Axit amin này

sẽ giúp hệ tiêu hóa; giúp giải độc các tác nhân có hại như chì và các im loại n ng khác; giúp giảm suy nhược cơ b p, ngăn ngừa tóc giòn, và bảo vệ chống lại b c xạ; và có lợi cho nh ng người bị loãng xương ho c dị ng hóa học Cơ thể có thể chuyển đổi methionin thành cystin, một tiền chất của glutathion Khi glutathion là một chất trung hòa quan trọng của chất độc trong gan, nó bảo vệ gan kh i tác hại của các hợp chất độc hại

20

Nguồn thực phẩm tốt methionine bao gồm đậu, tr ng, cá, t i, đậu lăng, thịt, hành tây, đậu nành, hạt và s a chua

Phenylalanin: trong cơ thể, nó có thể được chuyển đổi thành axit amin

tyrosin, chất này lần lượt được s dụng để tổng hợp hai dẫn truyền thần kinh quan trọng th c đẩy sự tỉnh táo: dopamine và norep-inephrine Do mối liên quan với các hoạt động của hệ thống thần inh trung ương, axit amin này có thể nâng cao tinh thần, giảm đau, trợ giúp trong bộ nhớ và học tập, và ngăn ch n sự thèm ăn Nó có thể được s dụng để điều trị viêm khớp, trầm cảm, đau bụng inh, đau n a đầu, béo

phì, bệnh Parkinson và tâm thần phân liệt

Phenylalanine có trong s a, hạnh nhân, bơ, lạc, các hạt vừng

Isoleucin, leucin và valin: cả 3 loại này đều là các axit amin thiết yếu

Trong kết cấu của ch ng đều là mạch nhánh (mạch bên ho c phần nhánh); gọi là các axit amin mạch nhánh

Các axit amin mạch nhánh chủ yếu là các axit amin tiến hành sự oxy hóa ở

cơ xương, còn các axit amin hác phần nhiều là ôxy hóa ở gan Trong các trạng thái kích ng như phẫu thuật, chấn thương, thì sự hợp thành và phân giải protein có vai trò quan trọng riêng biệt Các axit amin mạch nhánh có thể làm nguyên liệu để tổng hợp protein cơ b p và sẽ bị cơ b p dùng làm nguồn cung ng ôxy hóa cho các chất là nguồn năng lượng; ngoài ra, người ta còn phát hiện thấy leucin cơ thể kích thích sự tổng hợp riêng protein, đồng thời khống chế sự phân giải nó, nh ng năm gần đây đã hiến cho rất nhiều học giả phải chú ý tới trong nghiên c u về dinh dưỡng ngoại khoa và dinh dưỡng cho vận động viên

Nguồn tự nhiên của leucine bao gồm gạo l c, đậu, thịt, các loại hạt, bột đậu nành và lúa mì Nguồn thực phẩm của valin bao gồm các sản phẩm s a ngũ cốc, thịt, nấm, đậu phộng, và protein đậu nành

Threonin là một axit amin thiết yếu giúp duy trì sự cân bằng protein thích

hợp trong cơ thể Nó quan trọng cho sự hình thành collagen và elastin Threonine có

ở tim, hệ thống thần inh trung ương, và cơ xương, và gi p ngăn ngừa chất béo tích

tụ trong gan Nó tăng cường hệ thống mi n dịch bằng cách trợ giúp trong việc sản xuất các kháng thể

Nguồn thực phẩm ch a nhiều threonin: thịt, cá, tr ng, lạc, hạt điều

Histidin là một axit amin thiết yếu quan trọng trong sự tăng trưởng và phục

hồi các mô Nó còn có tác dụng hình thành màng ch n myelin, một chất bảo vệ bao

21

quanh dây thần kinh và giúp tạo ra dịch vị, kích thích tiêu hóa Histidin cũng bảo vệ

cơ thể kh i tác hại của b c xạ, và có thể gi p đỡ trong công tác phòng chống AIDS Histidin ở m c quá cao có thể dẫn đến căng thẳng và thậm chí rối loạn tâm l như lo

âu và tâm thần phân liệt, nh ng người bị tâm thần phân liệt đã được tìm thấy có hàm lượng histidin cao trong cơ thể Thiếu histidin có thể góp phần cho viêm khớp mãn tính và có thể liên quan với điếc thần kinh Methionin có khả năng làm giảm nồng độ histidin

Nguồn tự nhiên của histidin bao gồm cá, gạo, lúa mì, và lúa mạch đen

Lượng nhu cầu của các axit amin cần thiết được chỉ ra trong bảng 2.2

Bảng 2.2: Tr số ước lượng về lượng đòi hỏi các axit amin cần thiết (mg/kg cân nặng/ngày)

Axit amin Dưới 1 tuổi 2 tuổi 10-12 tuổi Người lớn Tỷ lệ

* Tính theo người lớn: trị số ước lượng về lượng nhu cầu axit amin được tổ

ch c Y tế thế giới (WHO) và tổ ch c Nông nghiệp và Lương thực thế giới (FAO) đưa ra căn c theo các tài liệu nghiên c u khác nhau, xem bảng 2.2

22

Bảng 2.3: Đối chiếu các loại axit amin thiết yếu

amin thiết yếu ở người lớn

1.2.5 Axit amin trong nấm

Như đã trình bày ở mục 1.1.2.2 nấm là một nguồn tốt của axit amin Từ sự ước tính protein thô là một khảo nghiệm gián tiếp để tính hàm lượng axit amin tổng được thực hiện bởi m c khác nhau của phi protein thì việc xác định định lượng của tổng số axit amin có m t sau khi thủy phân protein ch c ch n cung cấp cho một đánh giá chính xác hơn

Bảng 2.4: Thành phần axit amin thiết yếu trong một số loài nấm hoang

(g/100g protein thô)[10, 36]

Axit amin

Agaricus Bisporus (nấm mỡ)

Lentinula edodes (nấm hương)

Pleurotus florida

Pleurotus ostreatus (nấm sò tím)

Pleurotus Sajor-caju

Hen’s egg

7,9 4,9 3,7

- 3,9 5,9 5,9 1,9 1,9 36,0

7,5 5,2 6,9 1,1 9,9 6,1 3,5 3,0 2,8 46,0

6,8 4,2 5,1 1,3 4,5 4,6 3,7 1,5 1,7 33,4

7,0 4,4 5,3 1,2 5,7 5,0 5,0 1,8 2,2 37,6

8,8 6,6 7,3 1,6 6,4 5,1 5,8 3,1 2,4 47,1 Chú thích: tr ng dùng để so sánh

23

Ta biết rằng tr ng là một nguồn thực phẩm cung cấp lượng axit amin cao Từ bảng 2.4 cho thấy nấm có đầy đủ các axit amin thiết yếu, hàm lượng axit amin thiết

yếu trong nấm có thể được so sánh với tr ng (loài Pleurotus florida có lượng axit

amin thiết yếu tổng cao nhất 46,0% gần bằng 47,1% trong tr ng)

Tỷ lệ axit amin thiết yếu (EAA) trên tổng số axit amin (TAA) cho một ý tưởng về chất lượng dinh dưỡng của protein trong thực phẩm Một tập hợp số liệu về thành phần và hàm lượng axit amin được công bố gần đây cho 41 loài nấm từ Vân

Nam Trong nghiên c u này, loài Dictyophora indusiata (nấm lưới tr ng) thì thấp

với 8000mgkg-1 trọng lượng tươi và loài Tuber indicum thì cao hơn với 32000mgkg

-1 trọng lượng tươi về axit amin, và tỉ lệ EAA/TAA là 0,27-0,51 (Sun, Lin, Wan, Liu,

& Xu, 2012) [56] Tỉ lệ EAA/TAA là 0,53-0,7 cho loài Russula (nấm xốp) và 0,77 cho loài nấm Boletus (Yin & Zhou, 2008)

0,45-Bảng 2.5: H m lượng axit amin tự do trong loài nấm Calvatia gigantea ở phía Nam Thỗ Nhĩ Kỳ Kết quả cho số mg axit amin tự do trong 100g nấm khô (mg/100 g ± SD) [33]

Axit amin thiết

Alanin Arginin aragin Axit Aspartic Cystein Axit Glutamic Glutamin Glycin Prolin Serin Tyrosin

4,38 ± 0,52 16,51 ± 1,08 1,23 ± 0,21 0,40 ± 0,08

<LOD 1,32 ± 0,05 3,46 ± 0,13 6,57 ± 0,23 10,03 ± 0,07 6,56 ± 0,11 17,95 ± 0,39 LOD: giới hạn phát hiện

Từ kết quả nghiên c u mẫu nấm C gigantean ở bảng 2.5 cho thấy rằng có

đầy đủ 20 axit amin tự do trong loài nấm này Tổng hàm lượng axit amin thết yếu và axit amin không thiết yếu trong nấm này lần lượt là 113,69 mg/100 g và 85,96 mg/100 g, axit amin thiết yếu chiếm hơn 56% tổng axit amin Như vậy, nấm là một

nguồn l tưởng của các axit amin thiết yếu, nấm C gigantea có một lượng giá trị

axit amin thiết yếu

1.3.1.2 Phương pháp sắc ký cột

Phương pháp s c ký cột là một phương pháp s c cơ bản đơn giản, nó là nền tảng của phương pháp s c ký l ng hiệu năng cao HPLC sau này

Phương pháp s c ký cột với dẫn xuất sau cột dùng ninhydrin đã được áp dụng

xác định axít amin từ nh ng năm 1940 bởi Moore, S., Stein, W, H [46, 47, 48] và

sau này được nhiều tác giả áp dụng và cải tiến và được áp dụng trong xác định axit

amin ở nhiều đối tượng khác nhau

25

Nguyên l cơ bản là axit amin được tách ra bằng cột trao đổi ion, phản ng

với ninhydrin tạo ph c chất màu vàng, đo độ hấp thụ quang của ph c màu thu được bằng quang kế có bước sóng 440 nm và 570 nm cho giới hạn xác định đến 10 pM với hầu hết các axit amin và 50 pM với prolin M c dù phương pháp s c ký l ng

hiệu năng cao đã thực sự phát triển và áp dụng xác định axit amin ở nhiều đối tượng,

nhưng phương pháp s c ký cột với dẫn xuất sau cột ninhydrin vẫn được áp dụng và tiếp tục hoàn thiện cho tận đến ngày nay do s dụng thiết bị rẻ tiền, thuận tiện cho phân tích lượng lớn [53]

Phương pháp s c ký cột với dẫn xuất sau cột là o-phthalaldehyd (OPA), các axit amin sau hi được tách ra kh i cột trao đổi ion được dẫn xuất bằng OPA tạo

ph c chất có tính chất phát huỳnh quang, đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích 348nm và bước sóng phát xạ là 450 nm Phương pháp có thể tách và xác định đồng thời các axit amin bậc 1 với giới hạn phát hiện đạt tới 20 pM Dẫn xuất OPA có hạn chế lớn là không phản ng được với các axit amin bậc 2

Phương pháp tách s c ký cột cổ điển là phương pháp đơn giản có thể áp dụng cho bất kỳ phòng thí nghiệm nào Tuy nhiên, do thời gian tách lâu, khả năng tách không cao so với các kỹ thuật hiện đại nên nó chỉ được áp dụng trong các đối tượng tách đơn giản

1.3.1.3 Phương pháp chuẩn độ điện thế

Trong phương pháp này, sau quá trình x lý mẫu để tách các axit amin ra

kh i nền mẫu và loại các chất ảnh hưởng, các axit amin sẽ được tách trên cột s c ký:

500 - 22 mm, 30 ml, Dovvex 50W-X8 (dạng H+) và chuẩn độ điện thế theo từng phân đoạn tách Ser, Thr, Asp sẽ được r a giải với HCl 0,8M với tốc độ dòng qua cột là 0,5ml/ph t, sau hi HC1 0,8M đi ra h i cột Thêm HCl 1M và điều chỉnh tốc

độ dòng đến 25-30 giọt/ph t để r a giải Glu và Gly Các phần dịch r a giải ở các phân đoạn hác nhau được được cho vào các cốc thuỷ tinh và điều chỉnh pH=7 với NaOH 0,1M Dung dịch HCHO 37% cũng được điều chỉnh về pH=7 với NaOH 0,1M Sau đó phần mẫu th và dung dịch HCHO được trộn với nhau theo tỷ lệ 1:9 bằng máy khuấy từ 10 phút Chuẩn độ hỗn hợp trên bằng phương pháp đo điện thế với NaOH 0,1M Song song mẫu tr ng được tiến hành bằng việc chuẩn độ tới pH = 8,9 hỗn hợp của HCHO với HC1 IM 1:9 đã được trung hòa tới pH= 7 [7]

Từ lượng NaOH 0,1 M tiêu tốn để chuẩn độ mẫu th và mẫu tr ng tính ra được hàm lượng các axit amin bằng bảng quy đổi

1.3.2 Phương pháp sắc ký khí

S c ký khí (Gas chromatography: GC) là một kỹ thuật tách và phân tích đồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu ở trạng thái hí, phương pháp này rất phát triển

26

trong nh ng năm gần đây s dụng để phân tích định tính và định lượng các chất h u

cơ trong một hỗn hợp mẫu ph c tạp

Tác giả Y c Fiamegos, c Stali as đã tách và xác định được 19 axit amin trong nước tiểu, nước hoa quả và bột mì bằng phương pháp s c ký khí với detector khối phổ (GC/MS) và detector ion hóa ngọn l a C/FI Theo phương pháp này, các axit amin tự do được chuyển thành dạng pentaflorobenzyl nhờ xúc tác chuyển pha tetrabutylamoni bromua, được dẫn xuất hóa thành dạng d bay hơi với pentaflorobenzyl bromid, chiết bằng diclorometan rồi phân tích bằng phương pháp GC/MS và GC/FI Còn đối với các axit amin liên kết với protein sẽ được phân tích sau bước thủy phân bằng NaOH 5M Giới hạn phát hiện của phương pháp nằm trong khoảng 0,7 - 2,3 pM với GC/MS và từ 1,7 - 6,9 pM với GC/FID [64]

Phương pháp s c ký khí là một phương pháp tách rất phát triển và cũng đã được nhiều tác giả trên thế giới áp dụng để tách và xác định axit amin trong một số đối tượng hác nhau, nhưng để áp dụng phân tích axit amin thông dụng là rất ph c tạp và giá thành cao do axit amin là hợp chất không d bay hơi và hông tan tốt trong các dung môi h u cơ nên quá trình thực hiện khá ph c tạp và tốn dung môi Ngoài ra khí mang là Heli là rất tốn ém nên phương pháp s c hí hông được áp dụng rộng rãi trong tách và xác định axit amin

1.3.3 Phương pháp điện di mao quản

Phương pháp điện di mao quản hiệu năng cao, hay còn gọi là điện di mao quản thế cao là một kỹ thuật tách và xác định đồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu dựa theo nguyên lý của sự điện di của các chất trong ống mao quản nh có ch a dung dịch đệm điện di với giá trị pH nhất định và được điều khiển bởi cưòng độ điện trường E do nguồn điện thế cao một chiều V (14-30 KV đ t vào hai đầu mao quản Phương pháp này tách các chất là các ion ho c các chất hông ion nhưng có mối liên

hệ ch t chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp đ t trong điện trường, do điện tích và linh độ điện di của các chất khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau

3-(4-carboxybenzoyl)-2-quinolin-kV Độ biến động của phương pháp trong giới hạn từ 0,3 – 0,9% trong một ngày và

từ 0,7 – 1,5% gi a các ngày Các tác giả đã ng dụng phương pháp này để theo dõi

sự thay đổi nồng độ axit amin trong quá trình chuyển hóa vi khuẩn [40]