Tài liệu Xác định một số loài nấm hiện diện trên cây lúa (Oryza sativa) nhiễm bệnh đạo ôn và cháy lá thu thập

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- Vũ Thị Tuyết Nhung XÁC ĐỊNH MỘT SỐ LOÀI NẤM HIỆN DIỆN TRÊN CÂY LÚA Oryza sativa NHIỄM BỆNH ĐẠO ÔN VÀ

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Vũ Thị Tuyết Nhung

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ LOÀI NẤM HIỆN DIỆN TRÊN CÂY LÚA

(Oryza sativa) NHIỄM BỆNH ĐẠO ÔN VÀ CHÁY LÁ THU THẬP

TẠI TỈNH AN GIANG VÀ KIÊN GIANG

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

TP.Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2021

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Vũ Thị Tuyết Nhung

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ LOÀI NẤM HIỆN DIỆN TRÊN CÂY LÚA

(Oryza sativa) NHIỄM BỆNH ĐẠO ÔN VÀ CHÁY LÁ THU THẬP

TẠI TỈNH AN GIANG VÀ KIÊN GIANG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Nguyễn Hoàng Dũng

TP.Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2021

LỜI CAM ĐOAN

Người thực hiện đề tài xin cam đoan: Đề tài này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Nguyễn Hoàng Dũng Các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong đề tài là trung thực,

đề tài không trùng với bất kỳ đề tài nghiên cứu khoa học nào Những thông tin tham khảo đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng

Tp.HCM, ngày tháng năm 2021

Người thực hiện

Vũ Thị Tuyết Nhung

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi đi học và đã hỗ trợ toàn bộ kinh phí, máy móc trang thiết bị để tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và tri ân sâu sắc đối với TS Nguyễn Hoàng Dũng Trưởng phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam cũng như phụ trách hướng dẫn đề tài cho tôi

đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề

Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, đặc biệt là các thầy cô giáo trực tiếp giảng dạy các chuyên đề của toàn khóa học đã tạo điều kiện, đóng góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị phòng Vi sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam và các bạn lớp Sinh học thực nghiệm đã luôn đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

Bên cạnh đó, công lao không thể thiếu khi kể đến góp phần không nhỏ trong quá trình tôi thực hiện luận văn thạc sỹ đó chính là nguồn năng lượng sống từ gia đình và bạn bè tôi Tôi muốn nói lời cảm ơn tới gia đình vì đã chăm sóc, động viên tôi cả về thể chất lẫn tinh thần, luôn mang cho tôi những động lực cố gắng

Xin trân trọng cảm ơn!

Người thực hiện

Vũ Thị Tuyết Nhung

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 4

1.1 TÌNH HÌNH NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY LÚA TẠI TỈNH AN GIANG VÀ KIÊN GIANG 4

1.1.1 Tình hình nấm gây bệnh trên lúa tại tỉnh An Giang 4

1.1.2 Tình hình nấm gây bệnh trên lúa tại tỉnh Kiên Giang 5

1.2 MỘT SỐ BỆNH HẠI THƯỜNG GẶP TRÊN CÂY LÚA 5

1.2.1 Bệnh đạo ôn 5

1.2.2 Bệnh cháy lá 8

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ NGOÀI NƯỚC 10

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 14

2.1.1 Thời gian 14

2.1.2 Địa điểm 14

2.2 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 14

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 14

2.2.3 Môi trường và hóa chất 15

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.3.1 Phương pháp thu mẫu 16

2.3.2 Phân lập và làm thuần 16

2.3.3 Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo 17

2.3.4 Định danh nấm bằng phương pháp phân tích hình thái học và bằng phương pháp giải trình tự vùng gen ITS 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 THU MẪU 23

3.1.1 Thu mẫu tại tỉnh An Giang 23

3.1.2 Thu mẫu tại tỉnh Kiên Giang 23

3.2 PHÂN LẬP, LÀM THUẦN VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI 24

3.2.1 Phân lập, làm thuần và quan sát hình thái ở tỉnh An Giang 24

3.2.2 Phân lập, làm thuần và quan sát hình thái ở tỉnh Kiên Giang 30

3.3 TÁI NHIỄM THEO QUY TẮC KOCH 38

3.4 ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG NẤM ĐƯỢC PHÂN LẬP BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ 44

3.4.1 Khuếch đại vùng gen ITS 44

3.4.2 Giải trình tự gene ITS 45

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

4.1 KẾT LUẬN 51

4.2 KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

P:C:I Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol

CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long

DNA Deoxyribonucleotide Acid

EDTA Ethylene Diamin Tetracetic Acid

ETS External Transcribed Spacer

NCBI National Center for Biotechnology Informatic

PCR Polymerase Chain Reaction

PDA Potato Dextrose Agar

RNA Ribonucleic acid

SHPT Sinh học phân tử

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả phân lập làm thuần mẫu ở tỉnh An Giang 24

Bảng 3.2 Kết quả phân lập làm thuần mẫu ở tỉnh Kiên Giang 30

Bảng 3.3 Kết quả phân lập làm thuần mẫu tái nhiễm 40

Bảng 3.4 Trình tự tương đồng trên ngân hàng gen NCBI chủng nấm T 1.3 46

Bảng 3.5 Trình tự tương đồng trên ngân hàng gen NCBI chủng nấm T 2.3 47

Bảng 3.6 Trình tự tương đồng trên ngân hàng gen NCBI chủng nấm T 3.3 48

Bảng 3.7 Trình tự tương đồng trên ngân hàng gen NCBI chủng nấm T 4.3 48

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Bệnh đạo ôn trên lúa 7

Hình 1.2 Bệnh cháy lá trên lá lúa 9

Hình 3.1 Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu được tại tỉnh An Giang 23

Hình 3.2 Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu được tại tỉnh Kiên Giang 24

Hình 3.3 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 26

Hình 3.4 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 27

Hình 3.5 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 28

Hình 3.6 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 28

Hình 3.7 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 29

Hình 3.8 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 29

Hình 3.9 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 30

Hình 3.10 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 34

Hình 3.11 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 34

Hình 3.12 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 35

Hình 3.13 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 35

Hình 3.14 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 36

Hình 3.15 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 36

Hình 3.16 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 37

Hình 3.17 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 38

Hình 3.18 Mẫu lúa BC15 trước và sau khi tái nhiễm 40

Hình 3.19 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 42

Hình 3.20 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 42

Hình 3.21 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 43

Hình 3.22 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu 44

Hình 3.23 Phổ điện di của đoạn ITS được khuếch đại của 4 Chủng nấm 45

Hình 3.24 Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS 49

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Lúa là loài cây lương thực có sản lượng đứng thứ ba trên thế giới sau ngô,

và lúa mì, đứng thứ hai trên thế giới về diện tích gieo trồng chỉ sau lúa mì Lúa được trồng ở 112 nước, là lương thực của hơn 54% dân số thế giới [1], [2] Đặc biệt ở các nước Đông Nam Á, lúa là cây lương thực đứng vị trí hàng đầu do có giá trị dinh dưỡng cao và nhiều công dụng khác, về giá trị kinh tế lúa gạo là mặt hàng xuất khẩu của một số nước trong khu vực [2]

Cây lúa đã và đang là cây trồng số một của nền sản xuất nông nghiệp Việt Nam, là cây lương thực quan trọng nhất đối với vấn đề an ninh lương thực ở nước

ta [3] Trong những năm gần đây Việt Nam đã có nhiều thành tựu trong sản xuất nông nghiệp, nhiều tiến bộ khoa học về giống, cơ cấu sản xuất, biện pháp canh tác,… được áp dụng vào sản xuất đã góp phần nâng cao năng suất lúa gạo Theo Hội nghị lúa gạo vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long tại An Giang năm 2017, vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm hơn 50% sản lượng và hơn 90% lượng gạo xuất khẩu của cả nước [4], [5], [6] Tuy nhiên, cùng với sự gia tăng năng suất và diện tích cây trồng thì tình hình dịch bệnh ngày càng lây lan nhanh

và khó kiểm soát, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành sản xuất lúa [7]

Bệnh đạo ôn và cháy lá là bệnh gây hại nhiều trên cây, bệnh được ghi nhận

ở hầu hết các quốc gia trồng lúa trên thế giới và ngày càng trở nên nghiêm trọng hơn do ảnh hưởng của quá trình thâm canh trong sản xuất nông nghiệp kết hợp với tác động của biến đổi khí hậu tạo điều kiện thuận lợi cho nấm gây bệnh hại

phát triển [7] Bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae gây ra, bệnh gây hại

nghiêm trọng trên cả lá và cổ bông, mức độ tác hại của bệnh liên quan nhiều đến nhiều yếu tố như giống lúa, thời kỳ sinh trưởng của cây lúa Bệnh gây hại trên lá làm cho bộ lá bị lụi, cháy khô, trổ kém, nấm xâm nhập vào cổ bông, cổ gié làm cho bông gãy, hạt bị lép, lửng, làm giảm nghiêm trọng đến năng suất, thậm chí

không cho thu hoạch Bệnh cháy lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây ra là

một trong những bệnh hại phổ biến trong các nước trồng lúa Ở Việt Nam, công tác chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá chưa được coi trọng có thể do khả năng

lây lan thành dịch không cao như các bệnh dịch hại khác như rầy nâu, đạo ôn Tuy nhiên, những bằng chứng cụ thể đã cho thấy dịch bệnh này không hề thua kém những dịch hại khác Theo ước tính của FAO, thiệt hại do bệnh này gây ra làm giảm năng suất lúa trung bình từ 0,7 - 17,5%, những nơi thiệt hại nặng có thể làm giảm đến 80% [8], [9] Ở Việt Nam, bệnh đạo ôn xuất hiện và gây hại các vùng trồng lúa ở cả 3 miền Bắc, Trung và Nam Riêng Đồng bằng sông Cửu Long trước đây bệnh đạo ôn và cháy lá chỉ thường gây hại ở vụ Đông Xuân khi nhiệt độ thấp (16-20oC) kết hợp có sương mù kéo dài, tuy nhiên hiện nay bệnh đạo ôn và cháy

lá thường xuất hiện và gây hại nặng ở tất cả các vụ lúa trong năm [7], [8]

Tại Đồng bằng sông Cửu Long, tỉnh Kiên Giang là tỉnh có diện tích trồng lúa lớn nhất và An Giang hiện đang là tỉnh dẫn đầu về sản lượng lúa, với hệ thống sông ngòi dày đặc và độ ẩm cao rất thuận lợi cho nấm bệnh gây hại phát triển, đặc biệt nghiêm trọng vào các vụ mùa Đông xuân [4], [5], [6] Nấm bệnh làm giảm năng suất chất lượng lúa ảnh hưởng lớn tới tình hình sản xuất và đời sống của người dân trên địa bàn

Do đó, việc phát hiện kịp thời và chính xác các tác nhân gây bệnh trên lúa

sẽ giúp ích cho việc đưa ra các biện pháp phòng ngừa và điều trị sớm, kịp thời và

hiệu quả Xuất phát từ nhu cầu thực tế đề tài: “Xác định các loài nấm hiện diện trên cây lúa (Oryza sativa) nhiễm bệnh đạo ôn và cháy lá thu thập tại tỉnh An Giang và Kiên Giang” được thực hiện

2 Mục tiêu đề tài

Xác định một số loài nấm hiện diện trên cây lúa nhiễm bệnh đạo ôn và cháy

lá thu thập tại tỉnh An Giang và Kiên Giang

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Thu thập mẫu lúa bị nhiễm nấm bệnh tại tỉnh An Giang và Kiên Giang

Nội dung 2: Phân lập, làm thuần và quan sát hình thái

Nội dung 3: Tái nhiễm nhân tạo theo quy tắc Koch

Nội dung 4: Định danh nấm bằng phương pháp phân tích hình thái học và bằng phương pháp giải trình tự vùng gen ITS

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài

Cây lúa là loại lương thực quan trọng được trồng nhiều trên thế giới đặc biệt là ở các nước châu Á, trong đó có Việt Nam Nó có vai trò quan trọng trong sản xuất nông nghiệp, là nguồn cung cấp lương thực chính Tuy nhiên do ảnh hưởng của quá trình thâm canh trong sản xuất nông nhiệp, tình hình dịch bệnh có nhiều biến đổi dẫn đến năng suất và chất lượng lúa đang bị suy giảm do sự tác động của nấm bệnh, đặc biệt là các bệnh như đạo ôn, bệnh đốm nâu,… gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa Triệu chứng ban đầu của các bệnh này trên lá khá giống nhau, vì vậy việc xác định các tác nhân gây bệnh này thường rất mất thời gian và khó khăn Do đó, việc phát hiện kịp thời và chính xác các tác nhân gây bệnh trên lúa sẽ giúp ích cho việc đưa ra các biện pháp phòng ngừa và

điều trị sớm, kịp thời và hiệu quả

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1.1 TÌNH HÌNH NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY LÚA TẠI TỈNH AN GIANG VÀ KIÊN GIANG

Theo Cục Bảo vệ Thực vật (Bộ NN-PTNT) cho biết, hiện nay nông dân các tỉnh ĐBSCL đang vào cao điểm sản xuất vụ lúa hè thu năm 2020, với tổng diện tích hơn 1,5 triệu ha Tính đến thời điểm này, ở các tỉnh Đồng Tháp, Kiên Giang, Hậu Giang, An Giang đã có hơn 1.199 ha lúa bị nhiễm bệnh vàng lùn, lùn xoắn

lá, tăng hơn 665 ha so cùng kỳ năm trước Bên cạnh đó, ở ĐBSCL còn có khoảng 9.422 ha lúa bị đốm nâu; 6.967 ha bị bệnh đạo ôn; 7.143 ha bị bệnh lem lép hạt [5], [6]

1.1.1 Tình hình nấm gây bệnh trên lúa tại tỉnh An Giang

Trước nguy cơ dịch hại bộc phát, Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh An Giang đã đưa ra cảnh báo dịch hại có thể xảy ra trên ruộng lúa trong năm

2019 [5]

Khoảng từ tháng 6 đến tháng 10/2019, trong điều kiện môi trường có ẩm

độ cao như mưa giông, bão kéo dài nhiều ngày, bệnh cháy bìa lá sẽ phát triển mạnh và nặng, bệnh có khả năng gây hại từ nhẹ đến nặng xuất hiện trên lúa giai đoạn làm đồng đến trổ đều và ngập sữa, trên các giống nhiễm như: OM6976, OM4900, Jasmine 85, OM4218 [5]

Bên cạnh đó, ngành nông nghiệp tỉnh An Giang cũng khuyến cáo bệnh đạo

ôn, đạo ôn cổ bông và lem lép hạt cũng có khả năng phát sinh và gây hại mạnh trên các ruộng sử dụng giống nhiễm bệnh, gieo sạ dày, bón thừa đạm, trong điều kiện thời tiết lạnh, ban ngày trời âm u, đêm và sáng sớm có sương mù hoặc là trời

có mưa nắng xen nhau [5]

Bệnh vàng lá (vàng lá chín sớm) có thể phát sinh, bệnh gây hại nặng ở những ruộng lúa sạ dày lại bón quá nhiều phân đạm, trên các giống nếp, giống lúa thơm trong điều kiện biên độ nhiệt chênh lệch lớn giữa ngày và đêm Do đó, khuyến cáo nông dân cần chú ý đến sâu đục thân, bệnh đốm vằn, gây hại cục bộ

để áp dụng các biện pháp quản lý và phòng trị kịp thời [5]

Bên cạnh đó, bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá có khả năng phát sinh tiềm ẩn và lây lan do rầy nâu di trú vẫn có mang virus gây bệnh [5]

1.1.2 Tình hình nấm gây bệnh trên lúa tại tỉnh Kiên Giang

Tổng diện tích bệnh gây trên lúa Đông Xuân 2018-2019 là 39.325 ha, Các

đối tượng gây hại chủ yếu gồm:

- Lem lép hạt: tổng diện tích nhiễm là 9.376 ha, tỉ lệ 5-20%, cấp bệnh

1-3, trong đó có 8.168 ha nhiễm nhẹ tỉ lệ 5-10%, xuất hiện ở các huyện như: Hòn Đất, Giồng Riềng, Gò Quao, Kiên Lương, Giang Thành, Rạch Giá và Châu Thành, diện tích nhiễm trung bình là 1193 ha, tỉ lệ 10-20%, diện tích nhiễm nặng

là 15 ha, tỉ lệ >20%, xuất hiện ở huyện Kiên Lương [6]

- Bệnh đạo ôn: tổng diện tích nhiễm 5.206 ha Trong đó diện tích nhiễm đạo

ôn lá là 637 ha , diện tích chủ yếu nhiễm nhẹ, tỉ lệ 5-10%, cấp bệnh 1-3 Diện tích nhiễm đạo ôn cổ bông là 4.569 ha, tỉ lệ 2,5->10%, cấp bệnh 1-7, trong đó diện tích nhiễm nhẹ là 3.948 ha, tỉ lệ 2.5-5%, diện tích nhiễm trung bình là 618 ha, tỉ

lệ 5-10%, xuất hiện ở các huyện Hòn Đất, Giồng Riềng, Gò Quao, Giang Thành, Kiên Lương, Rạch Giá, Tân Hiệp và Châu Thành, diện tích nhiễm nặng là 3 ha, tỉ

lệ >10%, xuất hiện ở huyện Kiên Lương [6]

- Cháy bìa lá: tổng diện tích nhiễm là 906 ha, diện tích chủ yếu nhiễm nhẹ,

tỉ lệ 10-20%, cấp 1-3, xuất hiện ở huyện Hòn Đất, Giồng Riềng, Giang Thành và Châu Thành [6]

- Thối thân: tổng diện tích nhiễm là 930 ha, trong đó diện tích nhiễm nhẹ là

550 ha, tỉ lệ 5-10%, diện tích nhiễm trung bình là 350 ha, tỉ lệ 10-20%, diện tích nhiễm nặng là 30 ha, tỉ lệ >20%, xuất hiện ở huyện Hòn Đất [6]

1.2 MỘT SỐ BỆNH HẠI THƯỜNG GẶP TRÊN CÂY LÚA

nặng trong vụ đông xuân Điều kiện thời tiết lạnh, độ ẩm cao và sương mù về đêm thời gian qua là điều kiện thuận lợi để bệnh này phát triển

Tác nhân gây hại:

Bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae gây ra, là một trong các loại dịch hại nguy hiểm đối với cây lúa ở Việt Nam và nhiều nước khác trong khu vực [7],

[13] Ở giai đoạn sinh sản vô tính, nấm có tên là Pyricularia oryzae thuộc họ

Moniliaseae, bộ Moniliales, lớp Hyphomycetes, ngành Deuteromycotia Nấm có

giai đoạn sinh sản hữu tính là Magnaporthe oryzae, họ Magnaporthaceae, bộ

Diaporthales, lớp Sordariomycetes, ngành Ascomycota Bào tử gây bệnh có kích

thước rất nhỏ, không thế thấy được bằng mắt thường, hiện diện rất nhiều trong không khí, theo gió bay đi khắp nơi làm lây lan bệnh [7]

Đặc điểm sinh học, sinh thái và sự phát triển bệnh

Sự xâm nhiễm của mầm bệnh bắt đầu tiếp xúc và bám chặt vào biểu bì của

lá lúa, bào tử nảy mầm khi gặp điều kiện ẩm độ cao, nhiệt độ 26-28oC Thời gian nảy mầm từ khoảng 30 phút, đĩa áp hình thành trong khoảng 4-8 giờ và vòi xâm nhiễm hình thành khoảng 24 giờ sau khi tiếp xúc với bề mặt ký chủ Sau khi xâm nhiễm khuẩn ty nhanh chóng phát triển trong mô tế bào, vết bệnh xuất hiện khoảng 76-92 giờ sau khi xâm nhiễm [7] Nấm sinh trưởng trong phạm vi nhiệt độ 8-37oC, sản sinh bào tử trong môi trường từ 10-35oC, nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh sản bào tử là 28oC, ẩm độ tương đối không khí ≥ 93% Một vết bệnh điển hình có thế sản sinh bào tử từ 2.000-6.000 bào tử/ngày trong thời gian 14 ngày, nhiều nhất

là từ ngày thứ 3-8 từ khi có vết bệnh [7]

Triệu chứng gây bệnh:

Trên lá: Bệnh gây hại chủ yếu ở giai đoạn mạ đẻ nhánh Lúc đầu vết bệnh chỉ nhỏ như đầu mũi kim, màu xám xanh giống như bị nước sôi, sau đó chuyển sang màu nâu, rồi lan rộng dần ra thành hình thoi, xung quanh màu nâu đậm, giữa màu xám trắng Nếu nặng, nhiều vết bệnh liên kết lại với nhau làm lá bị cháy khô, cây lúa bị lụi xuống, ruộng lúa sẽ bị thất thu nghiêm trọng [7], [11], [12]

Hình 1.1 Bệnh đạo ôn trên lúa (a: Đạo ôn lá; b: Đạo ôn cổ bông; c: Đạo ôn hạt)

Trên cổ bông, đốt thân, gié lúa: Nấm bệnh tấn công trên đốt thân, trên cổ bông và trên gié lúa Chỗ bị bệnh lúc đầu có mầu xám xanh, sau chuyển dần sang màu nâu, nâu đậm Trên cổ bông, nếu ẩm độ không khí cao, chỗ vết bệnh sẽ mọc một lớp nấm mốc màu xám xanh, nếu trời khô vết bệnh sẽ khô tóp lại Gặp gió to chỗ vết bệnh bị gẫy gập, ruộng lúa trở nên xơ xác Do cản trở việc vận chuyển chất dinh dưỡng từ cây lúa lên nuôi hạt, làm cho hạt lúa bị lép lửng Nếu nặng bệnh có thể làm cho hạt lúa bị lép hoàn toàn [7], [11]

Trên hạt: Vết bệnh có hình đốm tròn, viền nâu, tâm mầu xám trắng, đường kính khoảng 1-2 mm Nếu nặng có thể làm cho hạt lúa bị lem lép lửng [7]

Biện pháp phòng ngừa

a

c

b

Không gieo trồng giống nhiễm bệnh, không lấy lúa ở những ruộng đã bị bệnh đạo ôn ở vụ trước để làm giống cho vụ sau

Chọn giống có gen kháng bệnh đạo ôn

Chọn giống sạch bệnh: xử lý hạt giống bằng nước nóng 54°C trong 10 phút hoặc xử lý bằng thuốc hoá học

Xử lý giống bằng cách trộn giống với nước muối 15%

Điều tra bệnh, phân tích các yếu tố: nguồn bệnh, thời tiết, sinh trưởng của cây, đất đai, phân bón, cơ cấu giống lúa

Để canh tác cho vụ lúa tiếp theo không bị nhiễm bệnh đạo ôn mỗi đồng ruộng phải được dọn sạch tàn dư rơm rạ của mùa vụ trước Mạ lúa được gieo không quá dày, mỗi ha chỉ gieo khoảng 100 – 120 kg mạ giống, nếu dùng máy chỉ cần 70 – 80 kg mạ giống Quá trình bón phân cho cây lúa cần lưu ý không bón quá nhiều phân đạm, nhất là thời kỳ cuối đẻ nhánh và sau khi trỗ Phải bón cân đối giữa phân đạm, lân và phân kali Nên bón theo bảng so màu lá lúa để cây lúa luôn khỏe mạnh, không bị tốt lốp, có sức chống đỡ với bệnh hại cao Thường xuyên kiểm tra ruộng lúa để kịp thời phát hiện và có biện pháp phòng trị bệnh kịp thời Nếu phát hiện cây lúa có bệnh thì phải ngưng bón phân đạm, không để ruộng

bị khô nước và tiến hành phun xịt thuốc kịp thời [7]

1.2.2 Bệnh cháy lá

Bệnh cháy lá là một bệnh mãn tính trên cây lúa, hầu như chưa có giống nào kháng hoặc chống chịu được với bệnh này Bệnh cháy lá phát sinh và phá hại từ thời kỳ mạ đến chín, nhưng triệu chứng điển hình là sau khi lúa đẻ nhánh đến trổ

và chín sữa

Tác nhân gây hại

Bệnh do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây ra [7] Vi khuẩn này có tế bào

hình que với đầu tròn, với chiều dài từ 0,8 đến 1 μm, chiều rộng 0,4 đến 0,7 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vi khuẩn Gram âm và không sinh bào tử, khuẩn lạc hình tròn, lồi, bề mặt nhẵn, màu vàng Vi khuẩn này chủ yếu

xâm nhập vào hệ thống mạch dẫn rồi dẫn đến nhiễm trùng toàn thân cây lúa Ngoài

ra vi khuẩn còn có thể xâm nhập qua lỗ thùy khổng ở mép lá, đầu mút lá dễ dàng gây tổn thương dọc theo gân lá [13]

Triệu chứng gây bệnh

Ở vụ Hè, bệnh thường phát sinh và gây hại giai đoạn cuối vụ Đặc biệt, sau những cơn mưa giông đầu mùa, kèm theo gió lớn vào thời kỳ lúa làm đòng - trổ chín là điều kiện thuận lợi cho bệnh phát sinh lây lan nhanh, gây hại nặng trên các giống mẫn cảm, những chân ruộng sâu, ruộng bón thừa đạm,… Khi độ ẩm không khí ≥90%, nhiệt độ 26-30oC, thời tiết âm u, mưa bão nhiều bệnh rất nặng Vi khuẩn có thể sống trong nước 15-38 ngày, có thể tồn tại trong hạt giống 7-8 tháng

và trong rơm rạ 3-4 tháng [7], [12]

Vết bệnh tạo thành các sọc từ mép lá gần đỉnh, phát triển dần cả chiều dài

và rộng tạo thành vết cháy màu vàng xám nhạt Giữa vết cháy và phần xanh còn lại của lá có ranh giới rõ ràng bởi một đường nâu sẫm Vào sáng sớm hoặc ngày mưa dầm ẩm ướt trên vết bệnh có những giọt keo màu vàng hoặc khô lại thành hạt nhỏ Bệnh nặng làm toàn bộ lá, kể cả lá đòng bị khô nhanh trước khi lúa chín, làm hạt kém mẩy và vỏ trấu bị đen

Hình 1.2 Bệnh cháy lá trên lá lúa

Biện pháp phòng ngừa

Để cây lúa phát triển tốt và đạt năng suất cao, điều đầu tiên cần quan tâm đến là việc chọn giống kháng bệnh để gieo trồng (tham khảo cán bộ khuyến nông của địa phương, hoặc trên tài liệu, trên thông tin của truyền thông) Khi đã chọn được giống lúa thích hợp việc tiếp theo cần làm là vệ sinh đồng ruộng, dọn sạch tàn dư cây bệnh vụ trước (trục và dìm kỹ gốc rạ), dọn sạch cỏ dại quanh bờ Đến giai đoạn gieo sạ, mạ lúa được gieo không quá dày để cây lúa phát triển khỏe mạnh, kháng được bệnh [13]

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ NGOÀI NƯỚC

Do ảnh hưởng của quá trình thâm canh trong sản xuất nông nghiệp, tình hình dịch bệnh có nhiều biến đổi dẫn đến năng suất và chất lượng lúa đang bị suy giảm do sự tác động của nấm bệnh, đặc biệt là các bệnh như đạo ôn, bệnh đốm nâu, cháy lá, gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa Bởi bệnh ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và gián tiếp đến phẩm chất gạo, dẫn đến giảm thị trường xuất khẩu lúa gạo trên thế giới Vì vậy, các nghiên cứu về thành phần nấm gây hại cụ thể ở từng địa phương và biện pháp thân thiện môi trường giúp quản lý bệnh trên cây lúa đang cấp thiết Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là công nghệ sinh học, nhiều kỹ thuật mới nhằm xác định các tác nhân gây bệnh cây trồng, tiết kiệm thời gian và tính chính xác cao, tìm ra được tác nhân gây bệnh ngay ở giai đoạn đầu khi mới nhiễm bệnh sẽ giúp ích rất nhiều trong việc đưa ra các biện pháp phòng trị sớm, kịp thời và hiệu quả

Một số nghiên cứu trong nước

Hiện nay, các loài nấm bệnh gây hại trên cây lúa đang là vấn đề cần thiết được các nhà nghiên cứu quan tâm để đánh giá hiện trạng nấm bệnh gây ra trên các đồng ruộng để đưa ra các giải pháp phòng ngừa và nâng cao sản lượng của cây lúa Để giải quyết tốt vấn đề này, trước hết, cần nghiên cứu thành phần tác nhân nấm gây hại trên cây lúa tại địa phương Các nghiên cứu về nấm đạo ôn hiện nay như nghiên cứu của Hà Viết Cường và cộng sự năm 2015 đã tiến hành đánh

giá đa dạng nấm đạo ôn lúa (Pyricularia oryzae) tại Đồng bằng sông Hồng bằng

kỹ thuật REP-PCR Kết quả cho thấy phản ứng PCR dùng bộ mồi REP đã tạo

nhiều sản phẩm đa hình, phân tích Rep-PCR đã chứng tỏ quần thể nấm đạo ôn Đồng bằng sông Hồng rất đa dạng về di truyền giống như các công bố trước đây, không có mối liên hệ rõ rệt giữa các nhóm nấm được xác định dựa trên phân tích Rep-PCR và các đặc điểm khác của nấm như màu sắc tản nấm, địa điểm thu thập

và chủng nấm [14] Năm 2016, nghiên cứu của Đoàn Thị Hòa và cộng sự đã ứng

dụng phương pháp PCR trong việc xác định nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, xác định nấm đạo ôn bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt nhằm giúp giảm chi phí, thời gian và công sức Kết quả đã chỉ ra được tính chuyên biệt của Pot2 transposon trong việc phát hiện nấm đạo ôn và lá/cổ bông nhiễm đạo ôn trên lúa [15] Năm 2018, nghiên cứu của Lê Minh Trí đã điều tra, phân lập, tình hình gây

hại của bệnh đạo ôn Pyricularia oryzae Cav gây hại trên một số giống lúa ở Thừa

Thiên Huế và kiểm soát tính gây bệnh Kết quả thu được 188 mẫu bệnh, phân lập được 82 mẫu nấm bệnh đạo ôn [16] Nghiên cứu của Đỗ Văn Chủng năm 2019 đã

đánh giá khả năng phòng trừ một số bệnh hại lúa của vi khuẩn Bacillus spp tại huyện Châu Phú tỉnh An Giang Kết quả đã tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus

spp có hiệu quả đối kháng cao đối với một số tác nhân gây bệnh quan trọng trên

lúa trong điều kiện in vitro Đánh giá hiệu quả kiểm soát một số bệnh hại quan

trọng trên lúa ở điều kiện ngoài đồng Xác định thời điểm và số lần xử lý vi khuẩn cho hiệu quả kiểm soát bệnh đạo ôn, bệnh cháy bìa lá lúa và lem lép hạt do nấm [17]

Từ việc xác định các loài nấm gây bệnh thì song song với đó có các nghiên cứu khác đưa ra các giải pháp khắc phục tình trạnh nấm bệnh hiện nay như nghiên

cứu của Nguyễn Thị Phong Lan và cộng sự năm 2015 đã thực hiện tuyển chọn các chủng xạ khuẩn (Streptomyces spp.) đối kháng nấm Pyricularia grisea gây bệnh đạo ôn hại lúa Kết quả đã tuyển chọn được các chủng xạ khuẩn có khả năng kiểm soát các nguồn nấm gây bệnh đạo ôn (P grisea) ở ĐBSCL đã được thực

hiện nhằm phát huy tiềm năng của nguồn vi sinh vật bản địa trong hệ sinh thái cây lúa nước vùng ĐBSCL [18] Năm 2017, nghiên cứu của Nguyễn Thị Phong Lan

và cộng sự đã nghiên cứu các giải pháp quản lý bền vững bệnh đạo ôn hại lúa

vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long để tìm ra được các giải pháp khoa học trong

quản lý bền vững bệnh đạo ôn hại lúa ở vùng ĐBSCL, góp phần xây dựng thành công chiến lược phát triển nông nghiệp bền vững, giúp nhà quản lý có cơ sở khoa học trong định hướng đúng việc quản lý loại dịch hại quan trọng trên lúa và các giải pháp phối hợp nhằm giúp người nông dân có thể quản lý bền vững và hiệu quả bệnh đạo ôn trong điều kiện bất thường của biến đổi khí hậu trên cánh đồng thâm canh cao vùng ĐBSCL Kết quả cho thấy, triển khai 18 ha mô hình ứng dụng qui trình quản lý tổng hợp bệnh đạo ôn giúp giảm 75,11- 82,08% tỷ lệ bệnh đạo

ôn lá; 81,8 - 82,6% bệnh đạo ôn cổ bông [19]

Một số nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới hiện nay, các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu các giải pháp khắc phục tình trạng nấm gây bệnh hại Theo nghiên cứu của Priyanka và cộng sự năm 2017 là nghiên cứu đầu tiên trên cây lúa báo cáo việc xác định

lncRNA trong dòng lúa kháng có và không có chủng M oryzae Kết quả nghiên

cứu đạt được cho thấy sự phân bố đồng đều của lncRNA trên tất cả các nhiễm sắc thể của cây lúa cho thấy rằng không có sự sai lệch trong phân bố nhiễm sắc thể

của các lncRNA liên gen và chống nhiễm trùng trong dòng kháng thuốc giả và M

Streptomyces spp có khả năng được sử dụng làm chất diệt khuẩn hiệu quả cao

chống lại bệnh đạo ôn M oryzae [21]

Năm 2018, nghiên cứu của Sukanyavà cộng sự đã cho thấy chủng vi khuẩn

BAS23 được phân lập từ đất ruộng và được xác định là Bacillus

amyloliquefaciens Dựa trên kết quả phương pháp nuôi cấy kép, vi khuẩn BAS23

thể hiện mạnh mẽ hoạt động ức chế in vitro trên sự phát triển của sợi nấm đối với một loạt các nấm nấm bẩn mầm bệnh của cây lúa (Curvularia lunata, Fusarium

semitectum và Helminthosporium oryzae) [22]

Nghiên cứu của Wen-Ching và cộng sự năm 2019 đã nghiên cứu nhằm mục đích phát triển các công thức diệt nấm sinh học mới bằng cách sử dụng vi khuẩn đối kháng bản địa để giúp cải thiện kiểm soát bệnh đạo ôn Trình tự vi khuẩn có thể được điều khiển bằng cách chỉnh sửa gen để thích nghi với các môi trường lúa khác nhau nhưng đòi hỏi phải đánh giá thêm và hiểu biết toàn diện về hệ thống

mầm bệnh trước khi sửa đổi Kết quả cho thấy thuốc trừ sâu sinh học mới đã ức chế đáng kể cường độ bệnh đạo ôn với tỷ lệ kiểm soát bệnh trung bình cao hơn đối chứng khoảng 31% [23]

Nghiên cứu của Tomoko và cộng sự năm 2019 đã nghiên cứu tác dụng ức

chế của chiết xuất tế bào (CE) phân lập từ vi khuẩn chống lại Magnaporthe oryzae trên cây lúa (Oryza sativa) Sự hình thành appressorium bất thường đã được quan

sát thấy trong sự hiện diện của CE được xử lý nhiệt Kết quả của nghiên cứu này

cho thấy có thể bảo vệ cây lúa khỏi nấm đạo ôn do Magnaporthe oryzae gây ra

[24]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thời gian Thời gian thực hiện: Từ tháng 12/2019 đến tháng 10/2020

2.1.2 Địa điểm

Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới

2.2 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu lúa nhiễm bệnh đạo ôn và cháy lá tập trung ở thân, lá, cổ, bông trên cây lúa được thu tại tỉnh An Giang và Kiên Giang

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị

❖ Dụng cụ:

– Đĩa petri – Đèn cồn – Ống nghiệm – Erlen

– Que cấy – Dao – Ống đong – Lame, lamelle – Micropipet, pipetman – Đầu tip

– Eppendorf

❖ Thiết bị:

– Cân phân tích (A&D HR – 200)

– Nồi hấp khử trùng (TOMY ES – 315) – Máy vortex (GENIE)

– Máy lắc – Bể ổn nhiệt (Cole Parmer BT – 15) – Máy ly tâm thường (Hettich Mikro 20), máy ly tâm lạnh (Hettich Mikro 220R)

– Kính hiển vi quang học – Máy PCR (Sprint Thermo Cycler) – Máy điện di

2.2.3 Môi trường và hóa chất

- Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) bổ sung Chloramphenicol: 0,05g; D-Glucose: 20g; Potatose: 4g; Agar: 15g; Nước cất: 1L

- Hóa chất sử dụng trong định danh + Agarose 1% (BIOLINE-UK) + Dung dịch nạp mẫu Gelred Loading buffer (Việt Nam) + Mồi xuôi (Fw): ITS1F (5’- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’); Mồi ngược (Rv): ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) (Gardes and Burns, 1993)

+ Ethanol absolute, Ethanol 70%

+ (P:C:I)(25:24:1) + Đệm CTAB (0,2M Tris-Cl pH 7,5; 2M NaCl; 0,05M EDTA; 2% CTAB)

+ Isoprophenol + TE buffer (TE 1X-pH 8; 10mM Tris; 1mM EDTA)

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp thu mẫu

Các mẫu lúa bị nhiễm bệnh, tập trung thu các mẫu lúa bị bệnh đạo ôn và bệnh cháy lá lúa, mẫu được thu nhận tại các địa điểm:

+ Tỉnh An Giang: huyện Châu Thành, huyện Tịnh Biên, huyện Châu Phú, huyện Tri Tôn

+ Tỉnh Kiên Giang: huyện Giồng Riềng, huyện Châu Thành, huyện Gò Quao, huyện U minh Thượng, huyện Tân Hiệp, huyện Hòn Đất, Tp.Rạch Giá, đường ven biển phía Nam

+ Thời gian thu mẫu: Tháng 2 năm 2019

Mô tả đặc điểm bệnh trên lá, thân, cổ bông, bông lúa, hạt: xuất hiện các vết bệnh nhỏ màu nâu, các vết bệnh lớn có màu nâu, tâm màu xám, nếu cây bị bệnh nặng các vết bệnh liên kết lại với nhau tạo thành mảng lớn và làm cây bị cháy khô Mẫu được giữ trong túi PE, được dán nhãn để phân biệt và mang đến phòng thí nghiệm để phân lập nấm gây bệnh [25]

2.3.2 Phân lập và làm thuần

- Chuẩn bị môi trường PDA được hấp khử trùng 121oC/ 1atm/ 20phút Đổ môi trường 1/3 đĩa petri đã hấp khử trùng để nguội [25] Các thao tác được thực hiện trong điều kiện vô trùng

+ Mẫu được khử trùng bằng cồn 70o + Cắt mẫu bệnh thành những đoạn nhỏ có kích thước 3 – 5mm sau đó ủ trên môi trường PDA để hạn chế nhiễm khuẩn Ủ 28oC/ 5-7 ngày

+ Dùng dao cấy cắt một miếng thạch có sợi nấm cấy truyền sang đĩa mới để làm thuần

+ Cấy lặp lại đến khi đĩa môi trường chứa khuẩn lạc đặc trưng sau 5-7 ngày

ủ

- Bảo quản giống trên ống thạch nghiêng [25]

+ Chuẩn bị ống thạch nghiêng chứa môi trường PDA được hấp khử trùng + Dùng dao cấy cắt mẫu thạch chứa sợi nấm từ đĩa nấm đã thuần sang ống thạch nghiêng có chứa môi trường PDA

+ Đậy nút bông, quấn parafin, ghi chú tên mẫu và ngày cấy giữ giống

+ Bảo quản mẫu ở ngăn mát tủ lạnh 4oC

- Bảo quản nấm sợi bằng phương pháp lạnh sâu -80oC [25]

+ Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu

+ Pha dịch tế bào với glycerol (chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh để không làm tế bào bị vỡ) đã thanh trùng trước để đạt nồng độ cuối cùng

là 10% và mật độ tế bào là 106

+ Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp, để ở nhiệt

độ phòng trong 30 phút để cân bằng áp suất

+ Hoạt hóa mẫu: Mẫu được hoạt hóa bằng cách làm tan nhanh tới mức có thể (tủ ấm 37oC trong 40 – 60 giây) Tế bào có khả năng sống khoảng 95% sau 10 năm

2.3.3 Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo

Thử nghiệm về khả năng lây bệnh nhân tạo được tiến hành để xác nhận lại nguyên nhân gây bệnh Bệnh có thể được tái tạo bằng cách cấy tác nhân gây bệnh lên bề mặt cây trồng theo cơ chế xâm nhiễm của tác nhân đó, hoặc bằng cách đưa mầm bệnh trực tiếp vào cây [24] Luận văn đã sử dụng giống lúa BC15 để thực

hiện thí nghiệm lây bệnh nhân tạo

Mô hình thí nghiệm

+ Ngâm ủ lúa 48 giờ ở nhiệt độ 30-32oC Sau khi hạt ra mầm đều thì đem gieo vào các chậu đã chuẩn bị trước có đường kính 20cm chiều cao 15cm

+ Giống lúa được gieo vào 15 chậu khác nhau, đến khi cây lúa có chiều cao

từ 10-15cm thì thực hiện tái nhiễm

Chuẩn bị dịch bào tử

+ Dịch bào tử được thu nhận từ nấm đã nuôi cấy 14 ngày tuổi

+ Cho 10 ml nước cất đã hấp khử trùng vào đĩa PDA chứa mẫu nấm cần lây

bệnh

+ Bào tử hòa cùng với nước được thu lại trong ống nghiệm vô trùng

+ Điểu chỉnh mật độ bào tử 106 /ml bằng buồng đếm hồng cầu

Lây bệnh lên lá

Do nấm được phân lập từ mẫu lá lúa bị bệnh cho nên tái nhiễm lên lá lúa

+ Phun 100 µl dịch bào tử lên lá cây được lây bệnh

+ Phun nước vô trùng lên lá cây dùng làm đối chứng

+ Đặt chậu trong tủ ẩm, tránh ánh nắng trực tiếp

+ Kiểm tra và so sánh những cây được lây bệnh với những cây đối chứng Quan sát và ghi nhận các triệu chứng và so sánh những triệu chứng này với các triệu chứng đã quan sát được trên đồng ruộng

+ Sau khi lây bệnh lên lá, ủ cây ở nhiệt độ 25oC – 28oC, độ ẩm đạt 80% trở lên trong vòng 72 giờ dưới bóng tối để bào tử xâm nhập vào cây

+ Các cây phun nước cất vô trùng được dùng làm đối chứng

+ Phân lập lại nấm sau khi tái nhiễm

Việc phân lập lại được thực hiện từ cây đã được phun dịch bào tử nấm để lây bệnh Nấm được phân lập trên môi trường PDA đến khi thuần

2.3.4 Định danh nấm bằng phương pháp phân tích hình thái học và bằng phương pháp giải trình tự vùng gen ITS

2.3.4.1 Phương pháp định danh bằng hình thái học

- Phương pháp phòng ẩm dùng để nghiên cứu sự sắp xếp của tế bào một cách tự nhiên trong khuẩn lạc như hình dạng cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử của nấm Bào tử của nấm khi sinh trưởng sẽ lan sang mép lame

- Chuẩn bị dụng cụ: Lame, lamelle, đĩa petri có lót giấy lọc, thanh thủy tinh chữ U, môi trường PDA Hấp khử trùng 121oC/ 1atm/ 20phút

+ Dùng micropippet hút môi trường và nhỏ vào lame được đặt trong đĩa petri

có chứa giấy lọc sao cho môi trường trang mỏng 2/3 lame, để môi trường đông tự nhiên

+ Dùng que cấy vòng ria tế bào nấm lên lame, đậy lamelle lại

+ Nhỏ nước cất vô trùng sao cho thấm đều giấy lọc, đậy nắp đĩa petri lại, quấn parafin Ủ ở nhiệt độ phòng từ 3-5 ngày

+ Quan sát bảo tử nấm dưới kính hiển vi quang học

2.3.4.2 Phương pháp định danh bằng trình tự ITS

Chuẩn bị mẫu

- Mẫu nấm được nuôi tăng sinh trên môi trường PDA lỏng Tăng sinh đến khi có bào tử nấm

Phá màng tế bào

+ Bước 1: Cho dịch nấm đã tăng sinh vào ống eppendorf, thêm 1 ml nước cất

vô trùng vào, ly tâm 10.000rpm/ 15phút

+ Bước 2: Sau khi ly tâm, thu bỏ dịch, thêm 800µl CTAB buffer, vortex mạnh

Tủa DNA

+ Bước 6: Tủa DNA bằng Isoprophenol tỷ lệ 1:1 Ủ ở -20oC/ 30 phút

+ Bước 7: Ly tâm 14.000rpm/ 15phút/ 4oC Thu tủa màu trắng đục

+ Bước 8: Cho 1ml Ethanol 70% vào trộn nhẹ nhàng và ly tâm ở 14.000rpm/ 15phút/ 4oC Loại hết dịch nổi và làm bay hơi hết Ethanol trong Eppendorf + Bước 9: Cho 50µl nước (nuclease free) trộn đều DNA và bảo quản ở -20oC

Nguyên tắc

- Các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau được tách

ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường

có điện thế và cường độ thích hợp Tốc độ dịch chuyển của các phân tử trong gel phụ thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trường, Điện

di gel agarose được xem là phương pháp tối ưu nhất dùng để phân tích, xác định

và tinh sạch các đoạn DNA Vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp: phát hiện DNA bằng Gel Red có trong Loading buffer và quan sát dưới tử ngoại (UV) [26], [27]

- Nạp mẫu, điện di và đọc kết quả: Dùng micropipette hút lấy 5µl mẫu, trộn đều với 2µl loading buffer 6X, hút tổng lượng thể tích là 6µl bơm vào giếng tương ứng đã bố trí sẵn Lần lượt bơm các mẫu khác đã được trộn đều với thuốc nhuộm vào tất cả các giếng còn lại Tiến hành điện di trên gel agarose 1% trong dung

dịch đệm TAE 1X, hiệu điện thế là 90V, cường độ dòng điện 400mA trong 30 phút Kết thúc quá trình điện di đọc kết quả dưới hộp đèn UV [27]

Khuếch đại gen ITS bằng kĩ thuật PCR

Đoạn gen ITS được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu ITS1F/ITS4 được thực hiện trên máy PCR Techne TC-512 Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR và ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại tạo nên số lượng lớn các bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và điện di trên gel agarose

Chu kì nhiệt của phản ứng PCR

- Giai đoạn 1: 95oC trong 3 phút

- Giai đoạn 2:

+ Bước 1: 95oC trong 30 giây

+ Bước 2: 53oC trong 45 giây

+ Bước 3: 72oC trong 45 giây

Lặp lại 30 chu kỳ

- Giai đoạn 3: 72oC trong 10 phút

Giải trình tự gen và định danh

Sản phẩm đã PCR được gửi để giải trình tự DNA tại công ty TNHH Phát triển Công nghệ ứng dụng Việt Nam (VNDAT)

Kết quả sẽ được gửi về và được xử lý bằng các phần mềm DNAStar Lasergene 14.0 và Ngân hàng gen http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ để định danh đến loài và xây dựng cây phát sinh loài

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 THU MẪU

Mẫu được thu thập từ đồng ruộng ở 2 tỉnh An Giang và Kiên Giang, vào tháng 2 năm 2019 Các mẫu được thu thập tập trung vào nhóm bệnh cháy lá và đạo ôn

3.1.1 Thu mẫu tại tỉnh An Giang

Dựa vào các triệu chứng bệnh đặc trưng ở lúa, kết quả thu được 40 mẫu bệnh thuộc các giống lúa Jasmine, Nàng hoa, OM5451, IR50404, 696, RVT, OM4900 (Phụ lục 1, Bảng 1) Nấm gây ra bệnh ở tất cả các giai đoạn phát triển của cây lúa Trên lá lúa dễ bị bệnh, vết bệnh ban đầu xuất hiện như là các chấm màu xám hoặc nâu, nâu vàng dọc theo rìa lá Sau đó, chúng biến thành các đốm hình elip dài và có hình thoi với đầu nhọn, những đốm này trở nên hoại tử, ở giữa

có màu nâu hoặc nâu đỏ Những chỗ này lan ra và hình thành các vết thương lớn hơn Trên thân, nấm tạo ra các vết thương dài, xám đến đen Bệnh cũng xuất hiện trên các hạt giống lúa như dạng hình thoi màu nâu (Hình 3.1)

Hình 3.1 Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu được tại tỉnh An Giang 3.1.2 Thu mẫu tại tỉnh Kiên Giang

Từ các triệu chứng bệnh đặc trưng ở lúa, thu nhận được 100 mẫu bệnh thuộc các giống lúa Jasmine, Đài thơm, OM5451, Lài thơm, Long Hồ 8, NPT,

OM4900, TBJ3 (Phụ lục 1, Bảng 2) Vết bệnh chỉ nhỏ như đầu mũi kim, màu xám xanh giống như bị nước sôi, sau đó chuyển sang màu nâu, rồi lan rộng dần

ra thành hình thoi, xung quanh màu nâu đậm, giữa màu xám trắng (Hình 3.2)

Hình 3.2 Mẫu lá lúa bị nhiễm bệnh thu được tại tỉnh Kiên Giang 3.2 PHÂN LẬP, LÀM THUẦN VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI

Các mẫu lá, thân, hạt, cổ bông, bông lúa bị bệnh được thu nhận tại hai tỉnh

An Giang và Kiên Giang được phân lập trên môi trường PDA

3.2.1 Phân lập, làm thuần và quan sát hình thái ở tỉnh An Giang

Tại tỉnh An Giang thu nhận được 40 mẫu lúa có dấu hiệu nhiễm nấm bệnh Các mẫu lúa bệnh gồm có: mẫu lá bệnh, mẫu thân bệnh, cổ bông bệnh, bông lúa bệnh Sau quá trình phân lập, 123 chủng nấm được làm thuần và sau

đó tiến hành quan sát hình thái, ghi nhận được 7 nhóm nấm có hình thái giống nhau và dựa vào phân loại nấm mốc ở Việt Nam của tác giả Đặng Vũ Hồng Miên năm 2015 [28] và chọn một chủng nấm đại diện được thể hiện cụ thể ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả phân lập làm thuần mẫu ở tỉnh An Giang

❖ Đặc điểm quan sát hình thái

Hình 3.3 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu (a: mặt

trên, b: mặt dưới, c: hình thái bào tử)

Khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường PDA, nhiệt độ 25oC, tuổi nấm phân loại 7 ngày, tốc độ mọc nhanh, dạng nhung mịn, mặt dưới không màu, nằm sát môi trường thạch, không tiết sắc tố (Hình 3.3a,b) Cơ quan sinh sản: Giá bào

tử trần mang cuống thể bình và màu trong đục, bào tử hình cầu, có màu xanh lục (Hình 3.3c) Dựa vào các đặc điểm hình thái được mô tả cho thấy chủng nấm AG

4.1.3 có khả năng thuộc họ nấm Penicillium sp [28]

Hình 3.4 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu (a: mặt

trên, b: mặt dưới, c: hình thái bào tử)

Khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường PDA, nhiệt độ 25oC, ánh sáng thường, tuổi phân loại 5 ngày, tốc độ mọc chậm, dạng nhung mịn, tâm hơi nhô cao tạo các vong tròn, ngoài cùng là sợi nấm mọc thành cụm theo nhiều hướng; mặt trên có màu vàng, phía đáy có màu đen, tơi xốp và có màu vàng nhạt (Hình 3.4a,b) Cơ quan sinh sản: Trên sợi nấm có nhiều chỗ phình Cơ quan sinh sản phân nhánh ít, sinh sản ở đầu cuống chiếm đa số; bào tử dạng thẳng hình bầu dục

có 1 đến 3 vách ngăn (Hình 3.4c) Chủng nấm AG 6.1.4 có khả năng thuộc họ

nấm gây bệnh đốm nâu Curvularia sp [28]

Hình 3.5 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu (a: mặt

trên, b: mặt dưới, c: hình thái bào tử)

Khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường PDA, nhiệt độ 25oC, ánh sáng thường, tuổi phân loại 5 ngày, tốc độ mọc hơi nhanh, dạng bông hơi xồm; ở tâm

có màu trắng đục sau lan ra ngoài ngoài cùng là sợi nấm mọc thành cụm theo nhiều hướng, tơi xốp và có màu vàng nhạt (Hình 3.5a,b) Cơ quan sinh sản: Tế bào màng trong , đơn độc, bề mặt cuống bào tử nhẵn; bào tử hình oval, kết thành từng cụm, có từ 0 đến 1 vách ngăn; đại bào tử ít, tiểu bào tử chủ yếu mọc từ nhánh bên với cuống sinh sản (Hình 3.5c) chủng nấm AG 3.4.2 có khả năng thuộc họ

nấm Fusarium sp [28]

Hình 3.6 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu (a: mặt

trên, b: mặt dưới, c: hình thái bào tử)

Khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường PDA, nhiệt độ 25oC, ánh sáng thường, tuổi phân loại 7 ngày, tốc độ mọc tương đối nhanh, dạng bông mịn, tâm

có màu xanh, vùng ngoài dạng bột dày có màu xanh xen kẽ trắng đục, mặt dưới

có màu xanh nhạt (Hình 3.6a,b) Cơ quan sinh sản: Sợi nấm dinh dưỡng màu xanh đen, có vách ngăn; cuống không có sự phân nhánh, bào tử tròn, cuống bào tử đính trong suốt, nhẵn (Hình 3.6c) Chủng nấm AG 3.4.2 có khả năng thuộc họ nấm

➢ Nhóm 5, mẫu đại diện AG 3.1.3.1

Hình 3.7 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu (a: mặt

trên, b: mặt dưới, c: hình thái bào tử)

Khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường PDA, nhiệt độ 25oC, ánh sáng thường, tuổi phân loại 7 ngày, tốc độ mọc nhanh, dạng xốp; mặt phải màu trắng hồng; mặt trái màu hồng (Hình 3.7a,b) Cơ quan sinh sản: Sợi nấm trong đục, bào

tử đính trong suốt bào tử đính hình cầu, kết thành từng chuỗi (Hình 3.7c) Chủng

nấm AG 3.1.3.1 có khả năng thuộc họ nấm Aspergillus sp [28]

Hình 3.8 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu (a: mặt

trên, b: mặt dưới, c: hình thái bào tử)

Khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường PDA, nhiệt độ 25oC, ánh sáng thường, tuổi phân loại 5 ngày, tốc độ mọc hơi nhanh; sợi nấm phát triển dày đặc như bông gòn, màu trắng, tơi xốp bao khắp đĩa, và đến thời điểm 7 ngày sợi nấm bắt đầu chuyển sang màu vàng (Hình 3.8a,b) Cơ quan sinh sản: sợi nấm có màu

c

b

a

trắng, bào tử nhẵn, đơn bào, hình cầu, hình thành đơn lẻ (Hình 3.8c) Chủng nấm

AG 3.3.1 có khả năng thuộc họ nấm Neurospora sp [28]

Hình 3.9 Hình thái nấm trên môi trường PDA và hình thái bào tử mẫu (a: mặt

trên, b: mặt dưới, c: hình thái bào tử)

Khuẩn lạc được nuôi cấy trên môi trường PDA, nhiệt độ 25oC, ánh sáng thường, tuổi phân loại 5 ngày, tốc độ mọc nhanh; dạng như sợi bông vải khi còn non và sau đó có màu sậm hơn do hình thành lập thể mang bọc bào tử vách dày (Hình 3.9a,b) Cơ quan sinh sản: Bề mặt cuống nhẵn, không màu, có màu nâu gần sát bọng; bào tử có dạng hình cầu, màu nâu nhạt (Hình 3.9c) Chủng nấm

AG 3.3.1 có khả năng thuộc họ nấm Bipolaris sp [28]

3.2.2 Phân lập, làm thuần và quan sát hình thái ở tỉnh Kiên Giang

Từ 100 mẫu lúa có dấu hiệu nhiễm nấm bệnh được thu nhận tại tỉnh Kiên Giang Sau đó mẫu lá, cổ bông, bông lúa, hạt lúa bị nhiễm bệnh tiến hành phân lập, làm thuần được 263 chủng nấm và chọn lọc được 8 nhóm nấm có hình thái giống nhau và chọn ra một chủng đại diện được mô tả cụ thể ở Bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả phân lập làm thuần mẫu ở tỉnh Kiên Giang