Tài liệu Xác định hiệu suất, trọng lượng phân tử và đặc trưng cấu trúc của polysaccharide thủy phân từ

Trong đó, rong sụn Kappaphycus alvarezii được đặc biệt quan tâm vì thành phần chủ yếu κ-carrageenan, nếu chúng ta thủy phân đưa về dạng oligo κ-oligo carrageenan sẽ tác động tích cực đ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS Phạm Trung Sản và tham khảo thêm các tài liệu đã được công bố trước đó có nguồn gốc rõ ràng Các số liệu nêu trong luận văn là kết quả làm việc của tôi trong suốt quá trình thực nghiệm tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Nha Trang, ngày 23 tháng 10 năm 2020

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Kiều Trinh

LỜI CÁM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phạm Trung Sản

và TS Đào Việt Hà đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn Và tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Hoàng

- Phòng Nghiên cứu ăn mòn và Công nghệ điện hóa - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, người đã giúp tôi hoàn thành tốt phần thực nghiệm của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Phòng Đào tạo, Khoa Hóa học và Quý Thầy Cô giáo đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn cũng như hoàn thành mọi thủ tục cần thiết

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang cũng như các anh chị trong phòng Nghiên cứu ăn mòn và Công nghệ điện hóa đã giúp đỡ và tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân

và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Nha Trang, ngày 23 tháng 10 năm 2020

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Kiều Trinh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CÁM ƠN 2

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC CÁC BẢNG 6

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 7

LỜI MỞ ĐẦU 9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 11

1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG SỤN 11

1.2 TỔNG QUAN VỀ CARRAGEENAN VÀ OLIGO CARRAGEENAN 12 1.2.1 Giới thiệu chung về carrageenan 12

1.2.2 Cấu trúc carrageenan 13

1.2.3 Tính chất lí hóa carrageenan 15

1.2.4 Oligo carrageenan và ứng dụng 18

1.2.4.1 Oligo carrageenan 18

1.2.4.2 Ứng dụng của oligo carrageenan 19

1.2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về phương pháp thủy phân carrageenan thành oligo carrageenan 22

1.2.5.1 Tình hình nghiên cứu oligo carrageenan ở Việt Nam 22

1.2.5.2 Tình hình nghiên cứu oligo carrageenan ở nước ngoài 23

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA RONG SỤN 26

1.3.1 Phân tích protein tổng số bằng phương pháp Kieldahl 26

1.3.2 Phân tích hàm lượng lipid tổng số bằng phương pháp Folch 27

1.3.3 Phương pháp phân tích hàm lượng tro 27

1.3.4 Phương pháp phân tích độ ẩm của rong biển khô 27

1.3.5 Phương pháp phân tích hàm lượng carbohydrat tổng sau thủy phân 27

1.3.6 Phân tích trọng lượng phân tử của oligo carrageenan bằng phương pháp sắc kí thẩm thấu (GPC) 27

1.3.7 Phân tích đặc trưng cấu trúc oligo carrageenan bằng phổ hồng ngoại ( IR) 29

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 30

2.2 DỤNG CỤ-THIẾT BỊ-HÓA CHẤT: 30

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.3.1 Phương pháp phân tích thành phần hóa học rong sụn 31

2.3.1.1 Phân tích protein thô bằng phương pháp Kieldahl 31

2.3.1.2 Phân tích lipid thô bằng phương pháp Folch 32

2.3.1.3 Phân tích hàm lượng tro 33

2.3.1.4 Phân tích độ ẩm 34

2.3.2 Phương pháp thủy phân tạo oligo carrageenan 35

2.3.3 Phương pháp phân tích hàm lượng carbohydrat tổng 35

2.3.4 Phương pháp phân tích trọng lượng phân tử bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) 35

2.3.5 Phương pháp phân tích đặc trưng cấu trúc carrageenan bằng phổ IR 35

2.4 THỰC NGHIỆM 36

2.4.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 36

2.4.2 Thu và xử lý nguyên liệu 37

2.4.3 Thủy phân rong sụn bằng enzym kết hợp axit ở các điều kiện khác nhau 38

2.4.3.1 So sánh hiệu suất thủy phân giữa mẫu xử lí enzym và không xử lí enzym 38

2.4.3.2 So sánh hiệu suất thủy phân trong thời gian xử lí enzym từ 1-2 ngày 39

2.4.3.3 So sánh hiệu suất thủy phân trong thời gian 60-120 phút 40

2.4.4 Thu hồi oligo carrageenan 41

2.4.5 Phân tích hàm lượng carbohydrat tổng 41

2.4.6 Xác định hiệu suất thủy phân và trọng lượng phân tử dịch thủy phân 41

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC RONG SỤN 42

3.2 HIỆU SUẤT THỦY PHÂN CARRAGEENAN 43

3.2.1 Ảnh hưởng của enzym trong quá trình thủy phân 43

3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lí enzym trong quá trình thủy phân 44

3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân 45

3.3 ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC OLIGO CARRAGEENAN 47

3.4 KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ OLIGO CARRAGEENAN 52

3.5 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THỦY PHÂN RONG SỤN KAPPAPHYSUS ALVAREZII BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYM KẾT HỢP AXIT 55

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

4.1 KẾT LUẬN 57

4.2 KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 69

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

3,6 AG 3,6-AnhydroGalactose 3,6-AnhydroGalactose GPC Gel Permeation Chromatography Sắc ký thẩm thấu gel

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của rong sụn 12

Bảng 3.1 Thành phần hóa học của rong sụn – Kappaphycus alvarezii 42

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của enzym trong quá trình thủy phân 43 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian xử lí enzym trong quá trình thủy phân 44 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân carageenan đến carbohydratcủa

mẫu xử lí enzym 45 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân carageenan đến carbohydrat

của mẫu không xử lí enzym 46 Bảng 3.6 Một số dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử và các liên kết

trong phổ hồng ngoại của kappa carrageenan 50

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của carrageenan 13

Hình 1.2 Cấu trúc của κ-carrageenan 14

Hình 1.3 Cấu trúc của ι –carrageenan 14

Hình 1.4 Cấu trúc của λ -carrageenan 15

Hình 1.5 Quá trình chuyển nhóm cấu trúc của các loại carrageenan 17

Hình 1.6 Thuỷ phân axit: liên kết glycoside α- l, 3- bị phá vỡ tạo thành galactobiose 18

Hình 1.7 Thủy phân carrageenan bằng axit đậm đặc 18

Hình 1.8 Neocarrabiose - sản phẩm thuỷ phân carrageenan bằng enzym, trong đó các liên kết glycoside β-1,4- bị phá vỡ 19

Hình 2.1 Rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty 30

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 36

Hình 2.3 Qui trình xử lý rong biển trước khi xử lí enzym 37

Hình 2.4 Qui trình thủy phân mẫu xử lí enzym và mẫu không xử lí enzym 38 Hình 2.5 Qui trình thủy phân xử lí enzym 1-2 ngày 39

Hình 2.6 Qui trình theo thời gian thủy phân 40

Hình 3.1 Phổ hồng ngoại (IR) carageenan mẫu 48

Hình 3.2 Phổ hồng ngoại (IR) oligo carragenaan xử lí enzym Viscozyme L 2% 1 ngày, thủy phân 60 phút 49

Hình 3.3 Phổ hồng ngoại (IR) oligo carrageenan ủ enzym Viscozyme L 2% 1 ngày, thủy phân 120 phút 49

Hình 3.4 Phổ GPC carrageenan mẫu 52

Hình 3.5 Phổ GPC khi thủy phân rong sụn enzyne Viscozyme L 2% kết hợp axit H3PO4 0,15M, 60 phút, ủ 1 ngày, 700C 53

Hình 3.6 Phổ GPC khi thủy phân rong sụn enzyne Viscozyme L 2 % kết hợp

axit H3PO4 0,15M, ủ 1 ngày, 90 phút, 700C) 53

Hình 3.7 Quy trình đề xuất thủy phân rong sụn Kappaphycus alvarezii bằng

phương pháp enzym kết hợp axit 56

LỜI MỞ ĐẦU

Hiện nay, nhiều loài rong biển được sử dụng để nghiên cứu trong lĩnh vực nông nghiệp nhằm phát triển các dạng phân bón Trong đó, rong sụn

Kappaphycus alvarezii được đặc biệt quan tâm vì thành phần chủ yếu

κ-carrageenan, nếu chúng ta thủy phân đưa về dạng oligo ( κ-oligo carrageenan)

sẽ tác động tích cực đến sự sinh trưởng của thực vật [1,2,3], ngoài ra rong sụn

Kappaphycus alvarezii còn có chứa các khoáng chất vi lượng: niken, cabon,

kẽm, đồng, sắt ; khoáng đa lượng như natri, canxi [4] đáp ứng tốt cho nhu cầu sinh trưởng, phát triển cho cây trồng

Rong sụn Kappaphycus alvarezii chứa hàm lượng carrageenan khá cao

(40% trọng lượng chất khô) Carrageenan ngày càng được ứng dụng phổ biển trong nhiều lĩnh vực khác nhau [4], [5], [6], [7] Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy việc thủy phân carrageenan đưa về dạng oligo carrageenan đang là xu hướng cần thiết Bởi lẽ, oligo carrageenan là một loại oligosaccharide có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng vi-rút, chất chống oxy hóa, chất điều hòa miễn dịch, chống viêm và chống khối u [8,9] và nhiều ứng dụng thực phẩm như làm tăng khả năng nhũ hóa thuốc, tăng khả năng tạo độ dẻo dai cho thực phẩm Đặc biệt oligo carrageenan còn thúc đẩy quá trình quang hợp, kích thích sự sinh trưởng ở thực vật [1,10] được nghiên cứu và làm phân bón lá có hiệu quả rõ rệt [11,12,13]

Oligo carrageenan được được thủy phân bằng nhiều phương pháp khác nhau ( vật lí [14,15], hóa học [16,17,18], sinh học [19,20,21]) Trong phương pháp hóa học, phương pháp thủy phân bằng xúc tác axit có một số lợi thế quan trọng như tốc độ phản ứng nhanh, giá rẻ và dễ dàng có sẵn; nhược điểm

là quá trình tách sản phẩm trong dịch thủy phân sẽ khó khăn

Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy việc sử dụng enzym để thu carrrageenan có nhiều ưu điểm carrrageenan thu được dễ dàng tinh chế Bởi

vì, trong quá trình thủy phân enzym làm suy yếu các mô của rong biển và bào mòn thành tế bào của thân rong, giúp cho quá trình chiết được triệt để và dễ dàng hơn Tuy nhiên, Tan và Lee, (2014) [22] cho thấy κ-carrageenan không

dễ dàng bị thủy phân bởi enzym do sự liên kết của κ-carrageenan và nước tạo

một liên kết khá chắc chắn chống lại sự thủy phân của enzym dẫn đến hiệu suất thủy phân không cao Vì thế sử dụng axit H3PO4 như là một chất xúc tác trong quá trình thủy phân carrageenan nhằm nâng cao hiệu suất thủy phân

rong sụn Kappaphycus alvarezii

Nhằm đưa ra quy trình thủy phân phù hợp để tạo ra hiệu suất thủy phân

cao sử dụng sản phẩm (oligo carrageenan) từ rong sụn Kappaphycus alvarezii

làm phân bón trong nông nghiệp Vì vậy thực hiện đề tài ― Xác định hiệu suất, trọng lượng phân tử và đặc trưng cấu trúc polysaccharide thủy phân từ rong

sụn Kappaphycus alvarezii bằng phương pháp kết hợp enzym với axit ‖ là cần

thiết, góp phần mở ra một hướng phát triển cho ngành nông nghiệp, đặc biệt ngành công nghiệp phân bón nước ta

Mục tiêu của luận văn

Xác định hiệu suất, trọng lượng phân tử và đặc trưng cấu trúc của oligo carrageenan thu được bằng phương pháp thủy phân enzym kết hợp axit (enzym Viscozyme L và axit H3PO4 0,15M) ở các điều kiện khác nhau (ảnh hưởng của enzym, thời gian xử lí enzym, thời gian thủy phân), từ đó đưa ra quy trình thủy phân phù hợp cho mục đích làm chất kích thích sinh trưởng trong nông nghiệp

Để đạt được mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm:

- Khảo sát hiệu suất thủy phân ở các điều kiện thủy phân khác nhau

- Đưa ra các điều kiện thủy phân đạt hiệu suất thủy phân thích hợp

- Phân tích trọng lượng phân tử trung bình và đặc trưng cấu trúc của carrageenan trong dịch oligo carrageenan thu được sau quá trình thủy phân

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

TỔNG QUAN VỀ RONG SỤN 1.1

Rong sụn thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta), phân lớp: Rhodophyceae, bộ: Gigartinales, họ: Solieriaceae, giống: Kappaphycus,

loài: alvarezii, trong đó loài Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty là loài có sản

lượng lớn nhất [23]

Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty được trồng phổ biến với mục đích

làm thức ăn hoặc như một nguồn cung cấp carrageenan cho ngành công nghiệp Loài này đã được nuôi thành công ở Philippines kể từ những năm

1970 và đã được giới thiệu ở hơn 20 quốc gia cho mục đích nuôi trồng thủy

sản Gần đây, K alvarezii đã thu hút sự chú ý đáng kể không chỉ như một

nguồn cung cấp carrageenans còn là nguồn protein có giá trị thực tiễn trong y học

Vào năm 1993, Viện nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang

đã di nhập rong sụn giống từ Nhật Bản để nghiên cứu nhân giống và tiến hành nuôi trồng thử nghiệm rong sụn tại các vùng ven biển của Việt Nam (Khánh Hòa, Ninh Thuận…)

Rong sụn tươi thường có màu xanh đỏ nâu hoặc màu xanh do trong rong có hai loại sắc tố là phycobline (bao gồm phycocyanine có màu xanh tím, phycocythine có màu đỏ) và chlorophyll Rong sụn thuộc loài đơn trụ bao gồm 2 phần:

Phần lõi: gồm một tế bào trung trụ chạy dọc thân từ gốc đến ngọn Xung quanh có từ 3 ÷ 4 hàng tế bào vây trụ có kích thước lớn, hình tròn hay hình đa giác, trong suốt, vách mỏng chứa các chất dinh dưỡng

Phần da: gồm nhiều tế bào nhỏ sắp xếp khít nhau, hình tròn hay hình bầu dục, không trong suốt, chứa đầy sắc tố Ngoài cùng là lớp vỏ keo chứa cellulose, chiếm khoảng 4% trọng lượng rong khô, đóng vai trò bảo vệ các lớp bên trong [24]

Thành phần chính của rong sụn là carrageenan Hàm lượng carrageenan

có thể chiếm đến 40% trọng lượng khô của rong sụn Thành phần hóa học cơ bản của rong sụn nguyên liệu trình bày ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của rong sụn [25]

Tên thành phần hóa học % (khối lượng)

gelatin và làm thuốc tại nhà để chữa ho và cảm lạnh

Carrageenan được sử dụng trong nhiều ứng dụng thương mại như chất tạo gel, làm đặc và ổn định, đặc biệt là trong thực phẩm sản phẩm và nước sốt Ngoài những chức năng này, carrageenan được sử dụng trong y học thực nghiệm, dược phẩm công thức, mỹ phẩm và các ứng dụng công nghiệp

Từ thế kỷ 19, rong biển đỏ Chondrus crispus cũng được sử dụng trong

công nghiệp bia Năm 1930 ở Mỹ bắt đầu sản xuất carrageenan thương mại chuyển từ bột rong biển khô sang carrageenan tinh chế [26] Sau chiến tranh thế giới thứ hai, việc đáp ứng lượng carrageenan ngày càng tăng cao Do đó,

vào đầu những năm 1950 Quá trình phân đoạn chiết xuất carrageenan thô ra đời [27]

Carrageenan là thành phần chính của thành tế bào ở tảo đỏ hay

Rhodophyta, là một polysaccharide có chứa các đơn vị galactose lặp lại và

3,6-anhydrogalactose ở cả hai loại sulfat và không sulfat hóa [28] Trong số

đó, κ-carrageenan chiết xuất từ rong sụn Kappaphycus alvarezii thường được

sử dụng cho các ứng dụng rộng rãi trong khoa học thực phẩm, công nghệ dược phẩm và nông nghiệp [29]

Trong cấu tạo của carrageenan gồm có D-Galactose (17 ÷ 31%) còn Galactose chiếm lượng rất nhỏ Do đó, carrageenan tạo thành chủ yếu bởi các mạch poly D-Galactose bị sulfat hoá có phân tử lượng 500 ÷ 700kDalton [30]

L-Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của carrageenan

Carrageenan là một polysaccharide dị thể của galactose –galactan Ngoài mạch polysaccharide chính còn có thể có các nhóm sulfat được gắn vào carrageenan ở những vị trí và số lượng khác nhau Vì vậy, carrageenan không chỉ là một polysaccharide đơn lẻ, có cấu trúc nhất định mà là các galactan sulfat Mỗi galactan sulfat là một dạng riêng của carrageenan và có ký hiệu riêng Ví dụ: λ – , κ –, ι –, ν – carrageenan [31]

Cấu trúc carrageenan 1.2.2.

Bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân phát hiện carrageenan có nhiều dạng cấu trúc hoá học khác nhau Dựa vào cấu trúc hoá học, người ta có thể phân carrageenan thành các loại như sau: mu, kappa, nu, iota, lamda, theta

và xi Các loại này chỉ khác nhau ở mức độ sulfat hoá, vị trí sulfat hoá, mức

độ dehydrat hoá của chuỗi polysacharid Khối lượng phân tử của đại phân tử

carrageenan khoảng từ 105 đến 106 phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu và quá trình chiết [32], [33], [34], [35]

Về cơ bản carrageenan chia thành 3 loại chính: κ-car, ι -car, λ -car Trong đó, κ-car chiếm thị phần lớn nhất (80%) Mu và Nu là chất ban đầu tổng hợp nên kappa và iota, việc chuyển đổi này là do enzym dekinkase có trong rong biển hay trong quá trình sản xuất khi dùng xúc tác để loại nhóm 6 sulfat [30]

* κ-carrageenan: là một loại polymer mạch ngắn, có cấu tạo xen kẽ giữa D- galactose-4-sulfat (GalS) và 3,6 anhydro D-galactose (GalA) (Hình 1.2) Cấu trúc phân tử của κ-car là vòng xoắn kép bậc III

Hình 1.2 Cấu trúc của κ-carrageenan

*ι -carrageenan : là một loại car có số lƣợng gốc sulfat nằm trung gian giữa số lƣợng gốc sulfat của κ-car và λ -car (Hình 1.3) Khi tạo gel, khối gel của ι -car có tính đàn hồi tốt hơn khối gel của các loại carrageenan khác

Hình 1.3 Cấu trúc của ι –carrageenan

*λ -carrageenan: Trong mạch phân tử gồm các đơn vị monomer gồm: D- galactose-2-sulfat (1,3) và D-Galactose-2-6-disulfat nối xen kẽ với nhau (Hình 1.4)

Hình 1.4 Cấu trúc của λ -carrageenan

Các loại carrageenan đều có tính đa phân tán, nhưng chúng chỉ khác nhau về thành phần sulfat ester và gốc quay quang λ -Car có khối lượng phân

tử cao và mạch dài hơn κ-Car Thành phần của phân đoạn này cũng phụ thuộc vào nhiệt độ chiết và loại rong nguyên liệu [30], [35], [36]

Sự khác nhau của các loại carrageenan trên ở vị trí và số lượng nhóm ester sulfat đính vào chuỗi polysacharide, do đó mỗi loại có tính chất vật lý và hoá học đặc trưng khác nhau

Tính chất lí hóa carrageenan 1.2.3.

Khả năng phản ứng hóa học của carrageenan phụ thuộc chủ yếu vào các nhóm este sulfat Carrageenan là anion mạnh có thể so sánh với chất vô

cơ Liên kết cation cùng với cấu trúc của đường các đơn vị trong chuỗi polyme xác định thuộc tính vật lý của carrageenan Ví dụ: kappa- và iota-carrageenan tạo thành gel khi có của các ion kali hoặc canxi trong khi lamda-carrageenan thì không [37] Chức năng của carrageenan trong các ứng dụng khác nhau phụ thuộc phần lớn vào tính chất lưu biến

Carrageenan dạng polyme mạch thẳng, tan trong nước, thường tạo thành các dung dịch nước có độ nhớt cao Độ nhớt phụ thuộc vào nồng độ, nhiệt độ, sự hiện diện của các chất hòa tan khác và loại của carrageenan và trọng lượng phân tử [38] Độ nhớt tăng khi tăng nồng độ carrageenan và giảm

theo nhiệt độ Nếu như nhiệt độ cao và độ pH thấp thì tốc độ thủy phân của car càng nhanh [39]

Trong môi trường kiềm, carrageenan từ nhóm cấu trúc không có cầu nối 3,6 – anhydro – D – galactose thành nhóm cấu trúc có cầu nối 3,6 – anhydro – D – galactose [40] Ví dụ: µ-, ν- carrageenan được xem là tiền thân của κ- và ι- carrageenan Sự hình thành liên kết cầu nối 3,6 – anhydro – D – galactose trong tự nhiên được xúc tác bởi các enzym sulphohydrolase [39]

Hình 1.5 Quá trình chuyển nhóm cấu trúc của các loại carrageenan [40]

Oligo carrageenan và ứng dụng 1.2.4.

1.2.4.1 Oligo carrageenan

Tiến hành thủy phân carrageenan của các cấu trúc kappa, lamda và iota thì mạch carrageenan bị cắt ngắn thu được oligo carrageenan Những oligo carrageenan này bao gồm khoảng 20 đơn vị galactose sulphat liên kết luân phiên bởi liên kết glycoside β-1,4- và α-1,3- với nhóm sulphat ở vị trí 2, 4 và

6 của vòng galactose có hoặc không có đơn vị anhydrogalactose [11]

Carrageenan rất dễ bị axit và chất oxy hóa bẻ gãy các liên kết Khi thủy phân bằng axít yếu, các liên kết glycoside α-l,3- bị phá vỡ, tạo thành các mảnh carrabiose Mảnh carrabiose chính là galactose nên gọi là galactobiose (Hình 1.6)

Hình 1.6 Thuỷ phân axit: liên kết glycoside α- l, 3- bị phá vỡ tạo thành

galactobiose Trong trường hợp thuỷ phân bằng axít đậm đặc, lực ion lớn không những liên kết glycoside α- l,3- bị phá vỡ mà cả liên kết glycoside β-1,4- cũng

bị phá vỡ

Hình 1.7 Thủy phân carrageenan bằng axit đậm đặc [16]

Khi thuỷ phân bằng enzym, liên kết glycoside β-1,4- bị phá vỡ, sản phẩm được tạo thành là neocarrabiose (Hình 1.8) Khi thủy phân bằng enzym,

do có tính lựa chọn cao nên cần phải lựa chọn các enzym cho phù hợp

Hình 1.8 Neocarrabiose - sản phẩm thuỷ phân carrageenan bằng enzym,

trong đó các liên kết glycoside β-1,4- bị phá vỡ

Ứng dụng của oligo carrageenan 1.2.4.2.

 Ứng dụng trong thực phẩm và y học Ngày nay, carrageenan được ứng dụng ngày càng phổ biến trong nhiều lĩnh vực như y dược cụ thể là chất kháng ung thư, sản phẩm nhiên liệu sinh học, phụ gia trong thực phẩm, trong ngành công nghiệp dệt ; Tuy nhiên oligo carrageenan sản phẩm sau thủy phân carrageenan là vẫn còn giới hạn và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu Cụ thể, luận văn thạc

sĩ, Bùi Huy Chích [6] sử dụng enzym Alpha-amylase Novo (hay còn gọi là

Termamyl-Te) cho quá trình thủy phân carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty với các điều kiện thủy phân [Te]=0,2 %;

[carrageenan]=0,75 %; pH=6,5; t0=80 0C; [Ca2+]=40 ppm; thời gian= 9 giờ Sản phẩm sau thủy phân là oligo carrageenan có khối lượng phân tử trung bình là 51.885 Da và được ứng dụng để sản xuất nước uống trà hòa tan

 Oligo carrageenan dùng làm chất phụ gia chế biến và bảo quản thực phẩm có hiệu quả để thay thế hàn the được Vũ Ngọc Ban và cộng sự [41] đã công bố, điều kiện cho quá trình thủy phân carrageenan ở pH ban đầu

= 1,0 – 1,5 với axit HC1 1N, nhiệt độ 60 °C với thời gian thủy phân là 120 phút Với việc sử dụng phương pháp đo độ nhớt, khối lượng phân tử trung bình của carrageenan được xác định là 27,7 kDa Kết quả nghiên cứu chỉ ra

rằng khi sử dụng oligo carrageenan với hàm lượng 0,3 % cho kết quả tương đương với hàn the hàm lượng 0,5 %

Trong luận án tiến sĩ vào năm 2017, Bùi Huy Chích [42] đã tiến hành khảo sát và nghiên cứu ứng dụng oligo carrageenan trong sản xuất surimi từ

cá đổng sử dụng enzym polysaccharase để thủy phân carrageenan thành oligo carrageenan: nồng độ carrageenan 1%, nồng độ enzym Termamyl 120 L 0,5

%, nhiệt độ 85 0C, pH = 6,5 và thủy phân trong 16 giờ Sản phẩm oligo carrageenan thu được có từ 2 đến 10 monose và có khối lượng phân tử trung bình nhỏ hơn carrageenan khoảng 132 lần Kết quả nghiên cứu cho thấy khi

bổ sung oligo carrageenan 0,2 % vào surimi cá đổng có thể làm tăng chất lượng, tăng tính ổn định, hạn chế biến đổi chất lượng của surimi trong quá trình bảo quản đông

 Trong y học, oligo carrageenan có khả năng chống oxy hóa [43], chống viêm và điều hòa miễn dịch [28,44,45,46], chống đông máu [43], kháng khuẩn và đặc tính kháng virus [28,43,47,48,49,50] và chữa bệnh [51], chống ung thư [43,52,53,54,55], với độc tính tế bào thấp [54] và cải thiện năng lực miễn dịch bị tổn hại bởi các loại thuốc gây ra

Cụ thể, nghiên cứu của Haijn và cộng sự (2003)[56] oligo carrageenan

có trọng lượng phân tử 1.726 Da, khi dùng đường uống với liều 100 mg/kg ở chuột thì sự hình thành khối u bị ức chế rõ rệt Tuy nhiên, hoạt tính chống khối u của carrageenan có sulfonated cao ít hơn nhiều so với chế phẩm không sulfonated hoặc sulfonated nhẹ Hoạt tính của các superoxide dismutase và catalase được tăng cường đáng kể, điều này cho thấy carrageenan oligosaccharide có hiệu quả trong việc thúc đẩy khả năng chống oxy hóa và loại bỏ các gốc tự do

 Ứng dụng trong nghành công nghiệp phân bón Trong nông nghiệp thường sử dụng rong biển (chứa nhiều chất dinh dưỡng cho cây trồng) dưới dạng bột nghiền làm phân bón nhưng hiệu quả không cao Trong rong biển các thành phần dinh dưỡng chính như N, P và K trong không nhiều, đặc biệt là các vi lượng không đủ nên khi sản xuất phân

bón cho cây trồng người ta thường sử dụng thêm một số vi lượng và sử dụng đồng thời với các chất dinh dưỡng chiết xuất bằng phương pháp thủy phân các chất giàu protein và khoáng chất, vitamin khác như cá biển, cám, đỗ tương

Các oligo carrageenan thúc đẩy sự phát triển của thực vật bằng cách tăng cường quang hợp, đồng hóa nitơ, hình thành phôi, quá trình chuyển hóa , phân chia tế bào, điều chỉnh tổng hợp phytohormone [1,57,58,59] và bằng cách tăng cường bảo vệ chống lại vi rút, nấm và nhiễm trùng do vi khuẩn [47,60,61,62] Ngoài ra, các oligosaccharide của carrageenan kích thích cho

sự tích lũy dinh dưỡng và tái tạo lại sức sản xuất, dẫn đến sự thụ phấn cho hoa

và tạo quả tốt hơn Do đó, oligo carrageenan có thể sử dụng như một chất tăng trưởng tự nhiên

Alberto González và cộng sự [11] đã nghiên cứu oligo kappa carrageenan có trọng lượng phân tử khoảng 10 kDa thu được bằng cách thủy phân carageenan bằng axit có khả năng kích thích sự phát triển của cây bạch đàn, làm tăng cường chiều cao, đường kính thân cây cũng như hàm lượng α-cellulose lên 58 %, 44 % và 16 % tương ứng, với liều lượng phun một tuần một lần với tổng số là 4 lần phun Một nghiên cứu khác của Lucille V Abad

và cộng sự (2016) [12] cho thấy khi chiếu xạ κ-carrageenan ở mức 20 kGy và

30 kGy với tốc độ liều lượng 6 kGy/h sử dụng Co-60 tại Viện nghiên cứu hạt nhân Philippine, oligo κ- carageenan được tạo ra có trọng lượng phân tử 1 kDa cho kết quả thử nghiệm trên cây cải thìa khá tốt Với chu kỳ phun 2 lần một tuần, sau 45 ngày phun trên lá thì chiều dài của chồi non đạt 308,98 mm

ở 1 kDa, cao hơn so với mẫu đối chứng phun bằng nước là 252,23 mm; khi sử dụng oligo κ-carrageenan với trọng lượng phân tử trung bình tăng lên 2 kDa

và 3 kDa thì chiều dài của chồi non lại giảm đi xuống còn 289,08 mm và 278,08 mm tương ứng

Một nghiên cứu phân bón cho cây sả từ oligo carrageenan, Minu Singh

và cộng sự (2017) [63] đã sử dụng oligo carrageenan thu được từ phương pháp chiếu xạ để phun Với nồng độ oligo carrageenan 80 mg/L, chu kỳ phun

2 tuần một lần, sau 90 ngày và 120 ngày phun thì lượng tinh dầu xả tăng lên

18,9 và 25,0 %, hàm lượng citral 7,33 và 8,19 % và hàm lượng geraniol lên 9,2 và 8,9 % tương ứng

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về phương pháp 1.2.5.

thủy phân carrageenan thành oligo carrageenan

Tình hình nghiên cứu oligo carrageenan ở Việt Nam 1.2.5.1.

Một số công trình nghiên cứu tại Việt Nam về oligo carrageenan như Nguyễn Quốc Hiến và cộng sự nghiên cứu sử dụng chùm electron năng lượng thấp để cắt carrageenan thành oligo carrageenan Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi đầu tư thiết bị bức xạ khá tốn kém và người tham gia sản xuất phải có trình độ kỹ thuật cao [64]

Bùi Huy Chích (2009) đã nghiên cứu và nhận thấy enzym Termamyl

120L là loại enzym thích hợp cho thủy phân carrageenan từ rong sụn K alvarezii Ngoài ra, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy enzym amylase chỉ cắt

mạch liên kết glycoside mà không ảnh hưởng đến sự phá vỡ cấu trúc phân tử carrageenan [6],

Trần Đình Toại và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thủy phân

carrageenan chiết từ rong Hồng Vân Eucheuma gelatinae để tạo oligo

carrageenan bằng phương pháp sử dụng axit HCl Kết quả phân tích cấu trúc của sản phẩm oligo carrrageenan thu được bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1

H-NMR, 13C-NMR) và phổ khối kết hợp sắc ký lỏng (LC- MS) cho thấy thủy phân carrageenan không làm thay đổi cấu trúc của carrageenan mà chỉ phá vỡ các liên kết glycoside dẫn tới làm cắt ngắn mạch polymer [7]

Sử dụng axit HCl để thủy phân carrageenan là một phương pháp thường dùng trong nghiên cứu thủy phân carrageenan, phương pháp này có ưu điểm

là đơn giản Tuy nhiên, sử dụng phương pháp này để sản xuất oligo carrageenan có nhược điểm là gây nhiễm môi trường và độc hại cho người trực tiếp sản xuất

Trần Đình Toại và cộng sự (2009) đã tiến hành thủy phân carrageenan

bằng enzym Phitopain do trung tâm Kỹ nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học - Nga cung cấp Kết quả nghiên cứu cho thấy, thủy phân carrageenan bằng enzym Phitopain làm thay đổi không đáng kể cấu trúc của carrageenan, chỉ có tác dụng phá vỡ các liên kết glycoside, cắt ngắn mạch tạo thành oligo carrageenan [65] Tuy nhiên, enzym Phitopain không phải là enzym thương mại nên chưa có công bố về thành phần của enzym và hiện không có bán ở thị trường Việt Nam

Trong luận văn thạc sĩ Nguyễn Hoàng (2019) đã sử dụng axit H2SO4,

ascorbic thủy phân rong sụn Kappaphycus alvarezii thu hồi oligo

carrageenan[66] Kết quả cho thấy axit H2SO4 làm thay đổi cấu trúc carrageenan, axit ascorbic không làm thay đổi cấu trúc Tuy nhiên cả 2 axit đều làm cho quá trình tinh chế carrageenan gặp khó khăn

Tình hình nghiên cứu oligo carrageenan ở nước ngoài 1.2.5.2.

 Phương pháp hóa học

Sang-Bum Lee và cộng sự (2015) [17] nghiên cứu quá trình thủy phân

rong sụn Kappaphycus alvarezii sử dụng H2SO4 Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân, kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng ở nhiệt độ thủy phân 160 0C, nồng

độ axit 1,09 % và thời gian thủy phân 20 phút thì hàm lượng glucose thu được

là 2,15 g/L Cùng điều kiện thủy phân, nồng độ axit giảm còn 1,02 % thì hàm lượng galactose thu được 14,47 g/L

Khi khảo sát các loại axit có hằng số phân ly pKa khác nhau (CH3COOH, HCOOH, H3PO4, CF3COOH, HNO3, H2SO4, và HCl) với điều kiện thủy phân bao gồm 2 % (w/v) κ-carrageenan, nồng độ axit 0,2 M, nhiệt

Một nghiên cứu của Abd-Rahim và cộng sự (2014) [18] thủy phân rong

sụn K Alvarezii từ vùng biển Malaysia, với qui hoạch thực nghiệm tối ưu hóa

sử dụng 8,0 g/100 mL rong khô K alvarezii trong dung dịch thủy phân 0,2 M

H2SO4 và HCl tại 110 0C trong 90 phút, kết quả tạo ra hàm lượng đường khử cao nhất tương ứng với axit H2SO4 và HCl là 34,275 ± 0,976 g/L và 35,872 ± 3,610 g/L, tương ứng với hiệu suất thủy phân 42,8 % và 44,8 %

 Phương pháp vật lí

Trong nghiên cứu của Mohammad Taghi Taghizadeh và Reza Abdollahi [14] sử dụng phương pháp siêu âm, phương pháp xúc tác quang và phương pháp xúc tác quang siêu âm kết hợp để nghiên cứu khả năng cắt mạch của κ-carrageenan Kết quả cho thấy sau 60 phút, trọng lượng phân tử trung bình của carrageenan sau cắt mạch bằng phương pháp siêu âm giảm từ 126,92

x 103 kDa xuống còn 107,31 x 103 kDa, trong khi đó trọng lượng phân tử trung bình của hai phương pháp xúc tác siêu âm và xúc tác quang siêu âm sử dụng TiO2 làm chất xúc tác, giảm còn 93,89 x103 kDa và 88,24 x 103 kDa tương ứng Một điều đáng chú ý là sau khi cắt mạch κ-carrageenan bằng phương pháp xúc tác quang siêu âm, cấu trúc hóa học của carrageenan vẫn không thay đổi

L Relleve và cộng sự (2005) [15] sử dụng phương pháp chiếu xạ để biến tính κ-carrageenan, quá trình được thực hiện ở nhiệt độ thường bằng tia gamma từ nguồn Co-60 trên dung dịch κ-carrageenan 4 % Kết quả nghiên cứu cho thấy khi tăng liều bức xạ từ 10 kGy lên 30 kGy, trọng lượng phân tử trung bình giảm từ 10,5x104 Da xuống còn 6,2x104 Da; trọng lượng phân tử đạt giá trị thấp nhất là 1,3x104 Da khi liều chiếu xạ tăng lên 200 kGy So với phương pháp xúc tác quang siêu âm, cấu trúc hóa học của carrageenan có sự thay đổi, một số nhóm sulfat đã bị mất sau khi cắt mạch bằng phương pháp chiếu xạ

 Phương pháp sinh học

Phương pháp thủy phân bằng eznzyme có đặc điểm thuận lợi là có thể thủy phân trực tiếp từ rong biển Trong nghiên cứu của Fangyuan Duan và

cộng sự (2016) [19], rong E Cottonii được thủy phân bằng enzym : đầu tiên thủy phân bằng enzym cellulase, sau đó tiếp tục thủy phân bằng enzym tái tổ hợp κ-carrageenan, được điều chế từ Escherichia coli BL21-HTa-cgkZ Kết quả cho thấy bằng cách sử dụng phương pháp GPC (sắc ký thẩm thấu gel) để xác định trọng lượng phân tử của dịch sau thủy phân, sau 4 giờ thủy phân số lượng carrageenan có trọng lượng phân tử thay đổi theo chiều hwớng trọng lượng phân tử cao giảm và trọng lượng phân tử thấp tăng lên, điều này chứng

tỏ quá trình thủy phân bằng enzym đã cắt mạch polysaccarid thành các monosaccarid Kết quả phân tích hóa học cho thấy sản phẩm cuối cùng bao gồm 79,79 % oligosaccharide và 18,89 % tro, với một lượng protein không đáng kể Tác giả cũng ước tính khoảng 64,8 % oligosaccharide κ-carrageenan

có trong dịch thủy phân rong E Cottonii

Sheng-Jun Wu (2012) [20] sử dụng enzym α-amylase để thủy phân carrageenan Trong nghiên cứu này, Sheng-Jun Wu sử dụng phương pháp đo

κ-độ nhớt bằng nhớt kế mao quản để đánh giá hiệu suất thủy phân; kết quả nghiên cứu cho thấy khi thời gian thủy phân trong 1 giờ với 40 mg enzym α-amylase, nhiệt độ 50 0C và pH = 7.5 thì độ nhớt giảm mạnh, độ nhớt tiếp tục giảm trong 4 giờ thủy phân và hầu như giảm không đáng kể sau đó Liều lượng sử dụng enzym α-amylase cũng ảnh hưởng đến độ nhớt của dịch thủy phân, khi tăng liều lượng lên hơn 40 mg thì độ nhớt thay đổi không đáng kể Kết quả rút ra ở điều kiện tối ưu t = 4 giờ; pH = 7.5; T= 50 0C; và enzym α-amylase 40 mg trong dịch chiết có 5 g κ- carrageenan, hàm lượng và hiệu suất oligosaccharide từ carrageenan thu được sau thủy phân lần lượt tương ứng là 96,5 % và 92,6 % (w/w)

Một nghiên cứu khác của Bernadette M Henares và cộng sự (2010) [21], Bernadette M Henares sử dụng Pseudoalteromonas carrageenovora để thủy phân carrageenan Pseudoalteromonas carrageenovora được nuôi cấy trong chất rắn hoặc môi trường lỏng, chứa 2 % iota- hoặc kappa-carrageenan, hoặc các polysaccharides khác, và phát triển ở 27 °C trong hai ngày Sau 5 ngày thủy phân đối với 0,5 % iota-carageenan và 2 ngày đối với 0,5 % kappa- carrageenan ở 40 0C, kết quả nghiên cứu cho thấy khi Pseudoalteromonas

carrageenovora được nuôi cấy trong môi trường sử dụng kappa-carrageenan

sẽ cho hiệu suất thủy phân chất nền iota- và kappa-carrageenan (50 % và 99%) cao hơn so với khi được nuôi cấy trong môi trường iota-carrageenan (hiệu suất thủy phân 10 % cho mỗi loại iota- hoặc kappa-carrageenan) Kết quả phân tích GPC cũng cho thấy sản phẩm sau thủy phân của kappa-carrageenan là các oligosaccarid có trọng lượng phân tử thấp

 Phương pháp kết hợp enzym kết hợp axit

Phương pháp thủy phân axit và enzym kết hợp để thủy phân rong K Alvarezii từ vùng biển Malaysia, Faiqah Abd-Rahim và cộng sự [18] đã nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như nhiệt độ thủy phân, thời gian, hàm lượng rong, nồng độ axit và thời gian thủy phân enzym lên hàm lượng đường khử được tạo thành Điều kiện thủy phân axit: hàm lượng rong

80 g/L, 0,2 M H2SO4, 110 0C trong 90 phút; sau đó tiếp tục được thủy phân bằng enzym sử dụng enzym Celluclast với hoạt độ 150 FPU, pH = 5.5, 50 0C trong 48 giờ; kết quả cho thấy hiệu suất thủy phân bằng phương pháp axit và enzym kết hợp đạt 62,35 %, lượng đường khử tăng lên là 15,6 g/L Kết quả nghiên cứu này cao hơn so với các nghiên cứu của Ge và cộng sự [67] và Wan và cộng sự [68] khi điều kiện thủy phân tương đồng nhau trên hai loại

rong tương ứng là L Japonica và G Salicornia

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA 1.3

Các phản ứng xảy ra:

R-CHNH2-COOH + H2SO4 COt 2 + SO2 + H2O +(NH4)2SO4

0

, xúc tác

2NaOH + (NH4)2SO4 Na2SO4 + NH3 + 2H2O

Phương pháp phân tích hàm lượng tro [69]

Phương pháp phân tích hàm lượng carbohydrat tổng sau 1.3.5.

thủy phân [71]

Xác định carbohydrate tổng số bằng phương pháp phenol-sulfuric axit

Phân tích trọng lượng phân tử của oligo carrageenan bằng 1.3.6.

phương pháp sắc kí thẩm thấu (GPC)

GPC (Gel Permeation Chromatography) là một kỹ thuật sắc ký dùng để phân tách các phân tử kích thước lớn dựa trên sự rửa giải của chúng trên cột Sắc ký thẩm thấu gel là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay

GPC có thể xác định một số thông số về cấu trúc quan trọng bao gồm như trọng lượng trung bình (Mw), trọng lượng phân tử trung bình số (Mn), và đặc trưng cơ bản nhất của một polymer là sự phân bố trọng lượng phân tử của nó GPC được sử dụng để nghiên cứu các chất phân tử lớn như polymer tổng hợp hay các polymer tự nhiên như polysaccharide, carrageenan GPC còn có thể tách một hợp chất cao phân tử phức tạp thành các bộ phận cấu thành của nó - polymer, oligomer, monomer và các chất phụ gia Ngoài ra, GPC được kết hợp với tán xạ ánh sáng, máy đo độ nhớt và máy dò nồng độ , nó có thể đo trọng lượng phân tử tuyệt đối, kích thước phân tử và độ nhớt nội tại và tạo ra thông tin về cấu trúc phân tử, cấu tạo, tập hợp và phân nhánh

bị giữ lại, được rửa giải trong thể tích loại trừ Vo (thể tích trống) Sự chia tách theo kích thước phân tử xảy ra giữa thể tích trống và tổng thể tích thấm, chia tách hiệu quả thường được thực hiện ở hai phần ba đầu tiên của khoảng này

Xây dựng một đồ thị biểu thị sự phụ thuộc giữa thể tích lưu của các chất chuẩn dùng cho hiệu chuẩn và hàm logarit của khối lượng phân tử của chúng Đường chuẩn thường xấp xỉ với một đường thẳng nằm giữa giới hạn loại trừ và giới hạn thấm tổng thể Khối lượng phân tử của thành phần quan tâm có thể được ước lượng từ đường chuẩn

Phân tích đặc trưng cấu trúc oligo carrageenan bằng phổ 1.3.7.

hồng ngoại ( IR)

Phương pháp quang phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy – IR) là một trong những kỹ thuật hữu ích và phổ biến để nghiên cứu xác định cấu trúc polysaccharide như carageenan có trong thành tế bào thực vật dựa trên phân tích các đỉnh hấp thụ ở các số sóng nhất định Phương pháp phổ hồng ngoại cung cấp thông tin cấu trúc quan trọng để xác định vị trí nhóm chức trong phân tử polysaccharide như pectin, hemicellulose, cellulose, tinh bột và các dẫn xuất polysaccharide từ rong biển [72] Phổ IR là một kỹ thuật dựa vào

sự dao động và quay của các nguyên tử trong phân tử Theo nguyên lí, phổ IR nhận được bằng cách cho tia bức xạ IR đi qua mẫu và xác định phần tia tới bị hấp thụ với năng lượng nhất định Năng lượng tại pick bất kì trong phổ hấp thụ xuất hiện tương ứng với tần số dao động của một phần của phân tử mẫu [73] Một trong các lợi thế của phổ IR là hầu như bất kỳ mẫu nào và trạng thái nào cũng có thể nghiên cứu được [74] Kỹ thuật này cũng thể hiện hai ưu điểm chính: lượng mẫu sử dụng để đo phổ nhỏ (miligam) và kết quả cho độ chính xác đáng tin cậy Tuy nhiên, quang phổ hồng ngoại thông thường đòi hỏi các thủ tục tốn nhiều công sức để thu được phổ với tỷ lệ tín hiệu / nhiễu tốt [72] Hạn chế này đã được khắc phục với sự phát triển của kỹ thuật phổ kế

IR biến đổi Fourier (được gắn với máy tính) nên chất lượng phổ cải thiện đáng kể và giảm bớt thời gian đo mẫu, được gọi là quang phổ FT - IR (Fourier Transform IR) Phân tích phổ hồng ngoại cho thông tin về các dao động của các liên kết điển hình trong cấu trúc của carrageenan: các dải sóng hấp thụ ở 1220 - 1260 cm−1 của nhóm S=O ester sulfat, 928 - 933 cm−1của nhóm C-O 3,6-Anhydrogalactose, 840 – 850 của cm−1 của nhóm C-O-S của Galactose-4-sulfat, 800-805 cm−1 của nhóm C-O-S của 3,6-Anhydrogalactose-2-sulfat

2 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu là carrageenan được chiết tách rong

sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) được nuôi trồng và khai thác tại huyện

Ninh Hải tỉnh Ninh Thuận vào tháng 6 năm 2019

Hình 2.1 Rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty

Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

- Thiết bị phân tích phổ hồng ngoại: NICOLET IMPACT-410FT-IR

SPECPTROMETER

- Cân phân tích CP224S Satorius

- Hệ thống sắc ký lọc gel GPC-2414 Waters-Mỹ

- Máy sấy chân không: FRANCE-ETUVE

- Máy đo quang: SHIMAZDU UV-VIS 1601PC SPECTROMETER

- Máy đo phổ IR: TENSOR 27 - BRUKER - GERMANY

- Máy xay đa năng QE-1000: xuất xứ Trung Quốc, điện áp 220V/ 50Hz,

công suất 2400W, tốc độ quay 28000 r.p.m

 Hóa chất

H3PO4(TQ), enzym Viscozyme® L do hãng NovoNordisk Đan Mạch sản xuất, H2SO4(TQ), cồn 960 và một số hóa chất khác Các hóa chất đều đảm bảo

độ tinh sạch sử dụng trong phân tích

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3

Phương pháp phân tích thành phần hóa học rong sụn 2.3.1.

Các thành phần hóa học của rong sụn được phân tích 03 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần phân tích

Phân tích protein thô bằng phương pháp Kieldahl [69]

2.3.1.1.

Protein thô được xác định bằng phương pháp Kjeldahl, đưa vào bình nón chịu nhiệt 1 g mẫu rong, thêm vào đó 30 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc, tiếp theo 10 g K2SO4 và 1 g CuSO4 Ban đầu hỗn hợp được đun nhẹ cho đến khi hết sủi bọt thì được tăng mạnh lên Khi dung dịch trở nên không màu hoặc trong suốt, được đun thêm 1 h nữa, để nguội, pha loãng với nước cất và chuyển vào bình Kjeldahl 800 mL Đưa vào bình 3 hoặc 4 hạt kẽm kim loại

và 100 ml dung dịch NaOH 40 % và bình được nối với đầu phun của thiết bị chưng cất Tiếp theo đưa 25 ml dung dịch H2SO4 0,1 N vào trong bình hứng

và chưng cất Khi hai phần ba lượng chất lỏng đã được chưng cất, kiểm tra xem phản ứng đã xảy ra hòa toàn chưa Bình thu được lấy ra chuẩn với dung dịch NaOH nồng độ 0,1 N Từ lượng H2SO4 bị mất đi xác định hàm lượng nitơ Sau đó chuyển đổi về hàm lượng protein:

Chiết rút dung dịch lipid Tách lớp dưới (chứa hàm lượng lipid hòa tan trong dung môi) cho chảy vào phễu chiết thể tích 50 ml Loại bỏ lớp dịch phía trên (chứa phần hỗn hợp gồm các tạp chất được loại như nước, muối, protein….)

Xác định thể tích chiết ở trên (V) X = ¼ V (mL) Cho thêm 5 mL MeOH 50 % vào mỗi mẫu trong phễu chiết 100 mL Đảo trộn ngược phễu chiết nhiều lần Cho phân chia tách thành 2 lớp và lắng qua đêm

ở 5 o

C

Định lượng lipid Lớp dưới được rút chảy xuống bình cầu 100 mL Cô quay chân không làm bay hơi dung môi trong bình cầu ở 37oC đến khi còn lại thể tích khoảng 1

mL Hòa tan mẫu lại ngay lập tức bằng một lượng thể tích nhỏ chloroform (chỉ cho phép tiếp xúc rất nhỏ lượng mẫu đã làm khô với không khí) Chuyển

lượng mẫu qua bình định mức 5 mL, tráng rửa bình cầu nhiều lần và định mức bằng chloroform vừa đủ 5 mL Sau khi xử lý xong, dung dịch này được mang đi xác định hàm lượng lipid tổng Dung dịch này có thể lưu giữ trong tủ đông –20 o

C

Xác định hàm lượng lipid tổng Lấy chính xác 2 mL dung dịch mẫu đã xử lý cho vào một ống thuỷ tinh có nắp 4 mL đã được sấy chân không và cân với lượng không đổi, làm khô bằng khí nitơ Cho vào tủ sấy chân không đến khối lượng không đổi, áp suất khoảng 65-70 psi trong một giờ

Lipid tổng số (%) tính theo công thức:

% Xt (g/g) = [(m1 - m0).Vdm.100] / m.Vm

% Xk (g/g) = [(m1 - m0).Vdm.100] / m.T.Vm

Xt: Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng tươi của mẫu Xk: Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng khô của mẫu m1: Trọng lượng cân ống vial và mẫu sau sấy (g)

m0: Trọng lượng cân ống vial khối lượng không đổi (g)

m: Trọng lượng cân mẫu (g)

Vdm: Thể tích định mức sau xử lý (mL)

Vm: Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (mL)

T: thành phần khô của mẫu, T = (100 - W)/100 W: Độ ẩm của mẫu (%)

Phân tích hàm lượng tro [69]

2.3.1.3.

Chén nung được rửa sạch và nung ở nhiệt độ 550 ÷ 600 oC đến khối lượng không đổi, sau đó cân mẫu rong 1,0 g cho vào cốc nung, đem đun trên bếp điện đến khi hóa than đen Sau khi hóa than ta chuyển vào lò nung ở nhiệt

độ 550 ÷ 600 o

C để hóa tro hoàn toàn (chuyển màu trắng), lặp lại ít nhất 2 lần

và cân đến khối lượng không đổi

Cân chính xác 1,0 g rong biển khô (đã cắt nhỏ) cho vào cốc sấy đã xác định khối lƣợng không đổi Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 80 o

C trong

30 phút Sau đó nâng nhiệt độ lên 130 o

C trong 1 giờ Sau đó lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, cân khối lƣợng rồi tiếp tục cho vào tủ sấy trong thời gian 1 giờ, lấy ra để nguội ở bình hút ẩm và cân nhƣ trên cho tới khi khối lƣợng không đổi Kết quả giữa 2 lần cân không lệch nhau quá 0,5 mg cho mỗi mẫu chất thử

Phương pháp thủy phân tạo oligo carrageenan 2.3.2.

Thủy phân carrageenan bằng phương pháp enzym Viscozyme L 2% theo hướng dẫn nhà sản xuất kết hợp axit H3PO4 0,15M được khảo sát ở các điều kiện thủy phân như thời gian ủ enzym, thời gian thủy phân, khảo sát sự ảnh hưởng của enzym giữa các mẫu

Dịch oligo-carrageenan sau thủy phân được xác định hàm lượng carbohydrat tổng và trọng lượng phân tử trung bình

Phương pháp phân tích hàm lượng carbohydrat tổng[71] 2.3.3.

Lấy 200 µL dung dịch cần xác định có hàm lượng carbohydrate trong khoảng 20-100 µg/mL, thêm vào 200 µL thuốc thử phenol 5 % lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt, thêm tiếp 1 mL axít sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút, lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 490 nm, sử dụng glucose làm chất chuẩn

Phương pháp phân tích khối lượng phân tử bằng phương 2.3.4.

pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC)

Khối lượng phân tử trung bình của oligo carrageenan xác định bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography - GPC) Phép đo GPC được thực hiện với cột Ohpak SB-804 HQ tại Viện Công Nghệ Hóa Học Nhiệt độ của cột được giữ ở 750C dung dịch oligo carrageenan có nồng độ 1mg/ml Thể tích mẫu bơm là 0,5ml với tốc độ 1,2ml/phút Dung dịch NaCl (1mg/ml) được sử dụng làm chất rửa giải

Đặc trưng cấu trúc carrageenan được đánh giá bằng phổ IR 2.3.5.

Phương pháp hồng ngoại là một phương pháp đơn giản, thuận tiện được sử dụng để xác định một số nhóm chức trong phân tử carrageenan Phép

đo này chỉ đòi hỏi một vài milligam mẫu khô được sấy, nghiền và trộn với bột KBr theo tỷ lệ 1: 2 Phổ hồng ngoại FT-IR của oligo Carrageenan được ghi trên máy TENSOR 27 - BRUKER – GERMAN đo tại Viện Công Nghệ Hóa Học Dựa vào phổ IR trong vùng từ 700 đến 1400 cm-1 ta có thể xác định được các nhóm chức của oligo carrageenan [58]

THỰC NGHIỆM 2.4.

Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.4.1.

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Thu và xử lý nguyên liệu 2.4.2.

Hình 2.3 Qui trình xử lý rong biển trước khi xử lí enzym

Giải thích quy trình:

Rong sụn khô Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty được thu mua tại các

xã ở huyện Ninh Hải tỉnh Ninh Thuận

Cho rong vào nước ngọt ngâm 20-30 phút, vừa ngâm vừa khuấy trộn nhằm rửa mặn và giảm bớt lượng tạp chất bám trên rong

Sau đó rong được sấy khô khoảng 600C cho đến khi lượng ẩm còn 5-10

%, rong được xay nhuyễn thành bột

Thủy phân rong sụn bằng enzym kết hợp axit ở các điều kiện 2.4.3.

khác nhau

So sánh hiệu suất thủy phân giữa mẫu xử lí enzym và không xử 2.4.3.1.

lí enzym

Hình 2.4 Qui trình thủy phân mẫu xử lí enzym và mẫu không xử lí enzym

Giải thích quy trình: Bột rong:nước= 1:50 (10g rong:500 mL nước) được xử lí bằng enzym Viscozym L 2% ủ 1 ngày Sau đó được thủy phân trực tiếp bằng axit H3PO4 0,15M, t0=700C Thủy phân cùng điều kiện cho mẫu không xử lí enzym Từ đó xác định hiệu suất thủy phân giữa mẫu xử lí enzym

và không xử lí enzym