PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC MÃ HÓA CÁC PROTEIN GÂY ĐỘC CỦA E.COLI BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR

Báo cáo CNSHĐỀ TÀI: PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC MÃ HÓA CÁC PROTEIN GÂY ĐỘC CỦA E.COLI BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR Nhóm: Nguyễn Thị Ngọc Hương Nguyễn Minh Hoài Trần Thị Kim Hoàn Pha

Báo cáo CNSH

ĐỀ TÀI:

PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC

MÃ HÓA CÁC PROTEIN GÂY ĐỘC

CỦA E.COLI BẰNG KỸ THUẬT

MULTIPLEX – PCR

Nhóm: Nguyễn Thị Ngọc Hương

Nguyễn Minh Hoài Trần Thị Kim Hoàn Phan Thị Hồng Nhung

Nội dung báo cáo

Giới thiệu

Tổng quan

1 Vi khuẩn E.Coli:

 Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống

Escherichia.

 E coli là trực khuẩn Gram (-), di động, kích thước

khoảng 2 – 3 x 0,5 ìm, không hình thành bào tử và

có giáp mô

 E coli có mặt thường xuyên và chiếm ưu thế trong

ruột của người và động vật máu nóng, ở phần cuối

của ruột non và ở ruột già, được xem là vi khuẩn

chỉ danh ô nhiễm thực phẩm và nước được đánh giá dựa trên số lượng của chúng.

Tổng quan

2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa :

 E coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy ý

 T op = 35 – 370C, pHop = 6.4 – 7,5.

 Sau 24 giờ mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng hình

thành những khuẩn lạc dạng S màu xám trắng, tròn, ướt,

bề mặt bóng, kích thước khoảng 2 – 3 mm.

Mt EMB: E coli cho khuẩn lạc tím ánh kim.

Mt MacConkey: E coli cho khuẩn lạc đỏ hồng.

Mt thạch nghiêng TSI: E coli tạo acid / acid (vàng / vàng).

E.Coli trong môi trường EMB

E.Coli trên môi trường thạch MacConkey

Tổng quan

3 Yếu tố kháng nguyên :

Kháng nguyên thân O (somatic antigen):

Kháng nguyên lông H (flagellar antigen):

Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen):

Kháng nguyên tiêm mao F (fimbrial

antigen):

Tổng quan

4 Phân loại E.Coli :

 STEC (Shiga toxin-producing E coli) hoặc VTEC (Verotoxigenic E coli) và EHEC

(Enterohaemorrhagic E coli)

 EPEC (Enteropathogenic E coli)

 ETEC (Enterotoxigenic E coli)

 EAggEC hay EAEC (Enteroaggregative E coli)

 EIEC (Enteroinvasive E coli)

Tổng quan

5 Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của

E coli:

Yếu tố gây bệnh :

 Cư trú trên màng nhầy

 Kháng được sư phòng vệ của vật chủ

 Nhân lên

 Gây tổn hại cho vật chủ

Cơ chế gây bệnh :

 Sản xuất độc tố (ETEC, EAEC, STEC)

 Tấn công / xâm lấn (EIEC)

 Bám dính, truyền tín hiệu qua màng (EPEC và EHEC)

PCR: Polymerase Chain Reaction

: http://www.roche.com/pages/facets/1/pcr1.jpg

 Đây là kỹ thuật in vitro cho phép nhân

nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong thời gian ngắn

Tổng quan

 Kỹ thuật PCR

 Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt

 Các mồi này gồm có mồi “xuôi” (forward primer: mồi tác động lên sợi 3’→ 5’) và mồi “ngược” (reverse primer: mồi tác động lên sợi 5’→ 3’)

Tổng quan

Kỹ thuật PCR

 Các giai đoạn của phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

 Bước 1 (giai đoạn biến tính - denaturation): hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơnPhân

tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử

 Bước 2 (giai đoạn ủ bắt cặp – anealing): Nhiệt độ được

hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 – 600C tuỳ thuộc Tm của các mồi

sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

Tổng quan

Kỹ thuật PCR

 Các giai đoạn của phản ứng PCR

 Bước 3 (giai đoạn kéo dài – elongation hay extension): nhiệt độ ở giai đoạn này được tăng lên 720C giúp DNA polymerase hoạt động tổng hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate Đoạn DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA

Công thức:

Tổng DNA khuyếch đại = m * 2 n

Với n là số chu kỳ, m là số bản sao của chuỗi mã hóa

Tổng quan

Kỹ thuật PCR

 Các giai đoạn của phản ứng PCR

Trong thực tế, không vượt quá 40 chu kỳ trong một phản ứng, vì:

Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ

lệ với lượng mẫu ban đầu

Giai đoạn sau, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:

+ Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng

+ Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng

+ Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà lại bắt cặp với nhau

 Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban

đầu

Tổng quan

Kỹ thuật PCR

 Các thành phần của một phản ứng PCR

DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại

Mồi (primer): Mồi là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung với trình tự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA

Taq polymerase: là một DNA polymerase chịu

nhiệt, được chiết tách từ vi khuẩn Thermus

aquaticus ở suối nước nóng, không bị phá hủy ở

nhiệt độ cao Taq DNA polymerase tổng hợp DNA theo hướng 5’ → 3’ và hoạt động tốt nhất ở 70 -

720C

 Nồng độ Mg2+ (thường được sử dụng ở dạng MgCl2) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng PCR Ngoài ra còn có thể ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của mồi, nhiệt độ để biến tính

DNA thành dây đơn, hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả

Tổng quan

Kỹ thuật PCR

 Phân tích kết quả PCR

Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA được

khuếch đại) sẽ được phát hiện bằng phương pháp

điện di

Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng Các DNA trong gel agarose được hiện hình

dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide

Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose,

người ta sử dụng một “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker – MWM) là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết

(DNA ladder)

Tổng quan

Kỹ thuật PCR

 Multiplex – PCR

Là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong

đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dùng đồng thời nhiều cặp mồi trong một phản ứng Multiplex - PCR đầu tiên được mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kể từ đó multiplex

- PCR được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiểm tra DNA (Protocol online)

Phương pháp

Phân lập vi khuẩn E coli trong và thịt bò, heo

bằng phương pháp định lượng Từ đó đánh giá mức độ vệ sinh thực phẩm bằng cách so sánh với

TCVN về số lượng E coli trên thịt tươi (TCVN

7046 - 2002)

các gen độc lưc của vi khuẩn E coli phân lập

được bằng qui trình định lượng

Phân lập định tính vi khuẩn E coli trong thịt bò

và thịt heo Phát hiện các gen độc lực của E

coli đã phân lập định tính bằng kỹ thuật

multiplex - PCR.

Phương pháp

Phương pháp nghiên cứu:

Phân lập vi khuẩn E coli

 Đối tượng lấy mẫu

 Thịt bò, heo được lấy từ các chợ lẻ (dùng cho qui trình định lượng)

 Bề mặt quày thịt bò, thịt heo được lấy trong lò mổ

(dùng cho qui trình phân lập định tính)

 Cách lấy và bảo quản mẫu

 Mẫu thịt: Chọn ngẫu nhiên miếng thịt để lấy mẫu Khối lượng mẫu là 50 g thịt

 Mẫu bề mặt quày thịt: Chọn ngẫu nhiên quày thịt ở giữa

ca giết mổ

Phương pháp

Phương pháp nghiên cứu:

Phân lập vi khuẩn E coli

1 Thịt heo 49 23

MULTIPLEX - PCR

Phương pháp

Phương pháp nghiên cứu:

Phân lập vi khuẩn E coli

 Ly trích DNA từ vi khuẩn E coli phân lập được bằng

phương pháp nhiệt như sau:

 Chọn khoảng 20 khuẩn lạc E coli trên môi trường thạch

cho vào eppendorf đựng sẵn 1 ml nước cất 2 lần vô trùng

 Đun sôi trong 10 phút

 Chuyển ngay vào tủ –700C, giữ trong 10 phút

 Rã đông hoàn toàn

 Ly tâm với tốc độ 10.000 rpm trong 3 phút

 Thu phần nổi làm DNA khuôn mẫu

Phương pháp

 Phương pháp nghiên cứu:

Phân lập vi khuẩn E coli

 Xác định gen độc lực eae, hly, stx1, stx2, stx2e, sta, stb, lt-I

của E.coli phân lập được từ thịt

Thực hiện bằng 2 phản ứng multiplex – PCR với máy luân nhiệt (thermal cycler): Đun sôi trong 10 phút

 Multiplex – PCR1: phát hiện các gen eaeA, hlyA, stx1, stx2

 Multiplex – PCR2: phát hiện các gen stx2e, sta, stb, lt-I

 Trong quá trình thực hiện phản ứng multiplex – PCR, mẫu đối chứng dương (EDL933 hoặc H44) được thực hiện đồng thời với những mẫu khảo sát

 EDL933 là đối chứng dương với các gen eaeA, hlyA, stx1, stx2

 H44 là đối chứng dương với các gen stx2e, stb, lt-I.Chuyển

ngay vào tủ –70 0 C, giữ trong 10 phút

Phương pháp

Bảng số mẫu xét nghiệm các gen độc lực của E.coli

Mẫu E.coli phân lập được Số mẫu thực hiện PCR Phương

Phương pháp

Phương pháp nghiên cứu:

 Điện di trên gel agarose

 Gel điện di được ngâm trong 30 phút với dung dịch

ethidium bromide 1 mg/ml TBE rửa sạch chụp hình gel

 Các băng DNA được xác định bằng cách so với các băng của đối chứng dương và thang ladder 100 bp (AB gene, UK)

Phương pháp

Kết quả

 Tổng số vk E coli trung bình trên thịt bò là

14,8*104 ± 4,2*104 MPN/g biến thiên từ 1,1*104 đến 35*104 MPN/g.

Tổng số E coli trung bình trên thịt heo là 0,4*104 ±

1,1*104 MPN/g, biến thiên từ 0,4*102 đến 4,5*104 MPN/g

 Tiêu chuẩn TCVN 7046 – 2002 : 1 gam thịt tươi có

≤ 100 vk

☺ không có mẫu thịt bò nào đạt TCVN

☺ 6/23 mẫu thị heo đạt TCVN>

Kết quả

Kết quả

Trên thị bò :

Kết quả

Trên thịt heo :

Thảo luận

 Qui trình định lượng E coli có giai đoạn nuôi cấy ở

44,50C không thích hợp cho nhóm E coli gây bệnh

phát triển nên không phát hiện các gen độc lực ở 31 mẫu thịt bò, heo.

 Môi trường tăng sinh chọn lọc CT-SMAC tạo điều kiện cho nhóm STEC/EHEC trong thịt phát triển tốt, trợ giúp cho việc chọn khuẩn lạc để phát hiện các gen

độc lực Tỉ lệ phát hiện các gen độc lực của E coli từ

thịt bò và thịt heo lần lượt là 61,8% và 24,5%

 Chưa phát hiện được gen lt-I của E coli trong 34

thịt bò, 49 thịt heo.

Đề nghị

 Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán

bệnh và kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm.

 Vệ sinh và quản lý tốt tại các cơ sở chăn nuôi nhằm ngăn ngừa bệnh tiêu chảy, phù thủng trên heo con.

 Tuân thủ nghiêm ngặt các qui định về vệ sinh trong quá trình giết mổ gia súc.

 Sucrose 40%

 TE 1X vừa đủ 100%

Các môi trường thuốc thử

Các môi trường thuốc thử

 pH = 7,2± 0,2 (25oC)

Các môi trường thuốc thử

Các môi trường thuốc thử

 Ph = 6,9 ± 0,2

Các môi trường thuốc thử