Tuyển chọn vi sinh vật phân giải lân có hoạt tính cao để sản xuất chế phẩm phân lân vi sinh (1)

Xuất phát từ thực tế nước ta có trữ lượng quặng dồi dào, viộc nghiên cứu và sử dụng vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất phot pho khó tan để sản xuất phân bón vi sinh làm tăng

Bộ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRlỂiN NÒNG THÔN VIỆN CÔNG

NGHỆ SAU THU HOẠCH

><

3ÁO CÁO Dầ TÀI KHCN 02 - 0Ố-04

Đềjnuc: Tuyển chọn Vi sinh vật phân giải ỉân có hoạt tính

cao để sản xuất chế phẩm phân lân vi sinh

Huyền CN.Nguyễn

KS.Phạm Văn Điền KS.Trầrt Văn Tiiàn PTS.Nguyẻỉt Kim Vĩu

Hà nội 1998 BÁO CÁO ĐỂ TÀI x ~ •

TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT CÓ HOẠT TÍNH PHÂN GIẢI LÂN CAO ĐỂ SẢN XUẤT

PHÂN LÂN VI SINH.

I ĐẠT VÃN ĐỂ

Trong nông nghiệp, bên cạnh việc khai thác nguồn lợi từ đất, người ta còn chú trọng đến việc cải tạo lại đất, ỉàm tăng đô màu cho đất Cùng với sự phát triển của các ngành khoa học, để phấn đấu cho một nền nông nghiộp bền vững nhằm tạo ra những mùa màng bội rhu, cung cấp

đủ lương thực cho con người đồng thời bảo vệ môi trường sinh thái Có ngàv càng nhiều các phương pháp tổng thể, ứng dụng tiến bộ kỹ thuật của nhiều chuyên ngẳnh đã được áp dụng và phần nào đáp ứng được những yêu cầu trên

Phot pho là một trong những nguyên tố đóng vai trò quan trọng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng Nhưng trong đất phot pho thường tổn tại ở các dạng muối phot phát khó tan mà cây trổng không thể hấp thụ được

Xuất phát từ thực tế nước ta có trữ lượng quặng dồi dào, viộc nghiên cứu và sử dụng vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất phot pho khó tan để sản xuất phân bón vi sinh làm tăng cường đô mầu mỡ cho đất và nàng cao năng suất, chất lượng cây trồng tỏ rõ nhữne ưu điểm của mình : chi phí đầu tư thấp và tận dụng được nguồn lân sẵn có trong đất Hơn thế nữa, phân vi sinh còn có thể thay thế một phần phân bón vô cơ, điều này có ý nghiă rất ỉớn trong sản xuất nông nghiệp

Đề tài : ‘‘Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng vi sinh vật có khả

năng chuyển hoá phot phái để sản xuất phán lán vi sinh” là nhằm góp phần thực hiện những yêu cầu trên.

II VẬT LIỆU VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu.

1 Vạt liệu nghiên cứu.

Các mảu đất rẻ ngò, đậu tương, đậu đỗ và đất trồng màu được thu thập từ các tỉnh : Hà tĩnh, Ninh bình, Hà nội, Hà tây

- Bột apatit

2* Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1 Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật phân giải lân

Từ các mẫu đất, rễ ngô, đậu tương, thu thập ở các tỉnh : Hà tĩnh, Hà tây, Hà nội tiến hành cân 10 g đất, rẻ ngô cần phân lập pha loãng với nước vô trùng, ở độ pha loãng thích hợp

từ 10'3-10'6 Dùng Pipét vô trùng lấy dịch mẫu nhỏ 0,05ml cho vào đĩa thạch chứa mỏi trường Pikovskava có chứa

1, 5% Ca3(P04)2 gạt đều trôn mặt thạch, để trong ủ ấm ở nhiệt độ 30°c trong 48 giờ

Xác định khả năng phân giải Ca3(P04)2 của các chủng vi sinh vật dựa trên sự hình thành vòng phân giải bao quanh khuẩn lạc

Đổng thời quan sát các đặc điếm hình thái khuân lạc như máu sắc, hình dạng và dùng phương pháp nhuộm kép, nhuộm bào tử quan sát tế bào Căn cứ vào các đặc điểm đó để ký hiệu các chủng

2.2 Nghiên cứu một số điều kiên ánh hưởng tới sự sinh trương và phát triển của vi sinh vật phân giải lân

Đê cỏ thô sử dụng được vi sinh vật phàn giải lân trèn dồng ruộng,

chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ánh hưởng của độ mặn (ỉĩaCỈ) và đổ chua (pH), độ thông khí đối với các chủng vi sinh vật

- Nuôi cấy vi sinh vật trong các ống nghiộm có các nồng đô muối khác

nhau : 0%, 0,5%: 1%; 1,5%: 2%; 2,5% tiến hành nuôi cấy lắc trên máy lắc

(200vòng/phút) sau 48 giờ lấy ra xác định mật đô tế bào trong môt lít dịch nuôi cấy

- Nuôi cấy vi sinh vật trong các bình tam giác có điều chỉnh các độ pH khác nhau : 4; 4,5; 5; 6; 6,5; 7 ; 7,5; 8; 8,5 tiến hành nuôi cấy ỉắc trên máy lắc (200vòng/phút) sau 48 giờ lấy ra xác định mật độ tế bào trong một lít dịch nuôi cấy

- Nuôi cấy vi sinh vật trong các bình tam giác sau đó dùng đẽ nuôi cấy tĩnh (để vào tủ ấm) và nuôi cấy lắc trôn máy lắc (200vòng/phút) sau 48giờ nuôi cấy lấy ra xác định mật đô tế bào trong ỉml dịch nuôi cấy

2.3 Nghiên cứu khả năng phân giải phot phat can xi, bôt quặng apatit của vi sinh vật trên môi trường lỏng

2.3.1 Khẩ nâng phân giải phot phat can xi

Tiến hành nuôi cấy vi sinh vật trong ống nghiệm chứa 0,5% Ca3(P04)2 sau

3 ngày, 10 ngày, 15 ngày, nuỏi cấy ỉấv ra xác định hàm lượng phot pho hoà tan bằng phương pháp xanh Molipden (theo tiêu chuẩn ngành) trên máỵ so màu ở bước sóng 620nm Lượng P2O5 tan được tính theo % so với tổng lượng P2O5 có trong Ca3(PƠ4)2

2.3.2 Khả năng phủn giải apatit của vi sinh vật trên môi trường lỏng

Tiến hành nuôi cấy vi sinh vật trong các ống nghiệm có chứa 1*0 apatit sau

3 ngày, 10 ngày, 15 ngày nuôi cấy trên máy lắc (200vòng/phút)

x

~

xác định hàm lượng phot pho hoà tan bằng phương pháp“-xanh Molipden (theo tiêu chuẩn ngành) trên máy so màu ở bước sóng 620nm Lượng P2O5 tan được tính theo % so với tổng lượng P2O5 có trong apatit.

2.4 Nghiên cứu ảnh hương của vi sinh vật đến sự sinh trưởng và phát triển của cây ngô Bioseed 9670

Ngỏ Bioseed 9670 được trồng trong chậu đất đã được thanh trùng và không thanh trùng, bón Ca3(PC>4)2 Mỗi hạt ngô nhiễm 107 tế bào Trong quá trình thí nghiêm ngô được tưới nước vồ trùng cho những chậu đất thanh trùng và nước bình thường cho những chậu đất không thanh trùng Chăm sóc và theo dõi sự sinh trương và phát triển của cảy theo các chỉ tiêu chiều cao cây, trong lượng tươi, khô thân lá

2.5 Xây dựng quy trình sản xuất phân vi sinh vật phân giải lân

2.5.1 Chát mang :

Chất mang được dùng là than bùn có đủ dinh dưỡng cho vi sinh phát triển và tồn tại, không gây độc đối với vi sinh và cây trồng cũng như môi trường sinh thái Chất mang được xử lý đảm bảo các chỉ tiêu kỹ thuật như đô ắm, pH, pOo bao gói trong túi PE thanh trùng bằng phương pháp Tyndal

2.5.2 Sinh khối vi sinh vật

Ống thạch nghiêng —> bình tam giác (dịch giống cấp một) lắc trong 48giờ bình

iên men 5Iít ( nuôi cấy sục khí)—» Thu sinh khối

* Không khí được dưa vào 0,5lít khí/ỉ lít môi trường!ỉ phút.

2.5.3 Phản lân vi sinh trên nền chất mang thanh trùng

Chất mang -» Phối trôn + điểu chỉnh pH —>Đóng gói —> Thanh trùng

Vi sinh vật PGL —> Nhân giống -» Dịch vi sinh _4

Chế phẩm «— Sinh trưởng <— Tiêm dịch

(ủ> -2.5.4 Trên nến chất mang không thanh trùng

Chất mang —» Phối trôn + điếu chỉnh pH

-Vi sinh vật PGL —> Nhản giông —► Dịch vi sinh -*u

Chế phẩm «- Bao gói <—Định hình 4 _

Các chủng vi sinh vật có hoạt ỉực phân giải lân cao được nhản giống trên mỏi trường cho sinh khối đạt 1 tỷ tế bào/mi Điều kiện pH đô ẩm, nhiệt độ thích hợp sau 48 giờ nuôi cấy đem tiêm dịch vào chất mang đã vô trùng hoặc không vỏ trùng sau đó trộn đểu để ở tủ ấm nhiệt đô 30°c trong 7 ngàv sau đó được bảo quản

ở điều kiện nhiột độ, ánh sáng của phòng thí nghiệm

Tiến hành kiểm tra đinh kỳ mật độ tế bào sau 7 ngày, 15 ngày, 1 tháng, 3 tháng, 6 tháng

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn, đánh giá đặc điểm của các chủng đã tuyển chọn.

Bảng L Nguồn gấc các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn dược

Bản2 2 Khả nấng tạo vòng phân giải của các chủng vi khuẩn

Kích thước

vòng phản

(D-d,mm)

Thời gian

hình thành

vòng phân

giải

8-10 ngày 8-10 ngày 8-10 ngày 7-9 ngày 10-12 ngày

Theo bảng 2 kha năng tạo vòng phân giải và thời gian hình thành vòng phàn giải của các chủng vi khuẩn ỉà khỏng giống nhau.Thời gian hình thành vòng phân giải

TT

Ký hiệu các chủng đã tuyển chọn được

Địa điểm ỉ ấy mẫu Nguồn phân lập

Chúng tôi đã phân lập được 5 chủng vi khuẩn và ký hiộu chủng như trên bảng 1

của các chủng thường sau 2 ngày chỉ riêng chủng R thời gian hình thành vòng phản giẩi sau 4 đến 5 ngày Đường kính vòng phân giải của chủng Nọ và chủng NG là lớn nhất từ 6-9mm Tháp nhất là chủng Ttb và chủng HT chỉ đạt 4-5ram

Bảng 3 Một số đặc điểm hình thái nuôi cấy của các chủng vi khuẩn.

Ký hiệu

chủng

Nhuôm gram Đặc điểm tế bào Đặc điếm khuẩn ỉạc

đứng riêng rẽ, di động, kích thước tế bào 0.5 X 3,5 |am;

Không có bào tử

Khuẩn ỉạc tròn, nhẵn mầu trắng ngà sau 3 ngày chuyển sang màu vàng.Đường kính khuẩn lac: l,5-3mm

xếp thành chuỗi, kích thước tế bào 0,5 - x3|iin

không có bào tử

Khuẩn lạc trắng ngà, ở giữa

có điểm đồng tâm có ánh huỳnh quang đuờng kính khuẩn lạc : l,5-2mm

kích thước tế bào : 0.7-3um

Khuẩn lạc tròn, nhẵn đường kính khuẩn lạc 34mm

HT + Hình que hai đầu thuôn,

xếp thành chuỗi, kích thước

rế bào : 0,5 X 5miĩi; có bào tử

Khuẩn lạc tròn hơi rthàv Ị màu tráng sữa Đường kính khuẩn ỉạc 4-4.5mm

kích thước tế bào

0,5-3ỊJJTI

Khuẩn lạc tròn trongsau 4 ngày nuỡi cây chuyển sang máu vàng đường kinh khuẩn lac : 2-3mm

Bảng 3 chỉ ra một số đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn qua quan sát khuẩn lạc và qua quan sát tế bào

3.2 Điểu kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn phản giải lân.

Nhìn chung các chủng vi khuẩn đều có khá năng phát triển trên mồi trường

có nồng độ muối từ 0 đến nhỏ hơn 1,5%

Bảrĩọ 4 Ảnh hưởng của nồng độ NaCỈ đến sự sinh ỉrưởng và phát triển của vi

khuẩn.

muối (%)

Tên các chủng vi sinh vật

-Ghi chú :++ : Phát triển tốt

+ ; Phát ỉriển bình thường

+- : Phát triển yếu

; Không phút triển

Bảiĩịỉ 5 Ánh hưởng của độ pH đến sự sinh trưởng và phát ĩriển của vi khuẩn.

pH ban

đầu

Tên các chủng vi sinh vât

-Trong quá trình sinh trưởng đa số các chủng vi sinh vật có khả năng phân huỷ phot phát đều sản sinh ra axít làm hạ thấp pH mồi trường Nhờ đó các loại phot phát khó tan sẽ được chuyên thành dạng dẻ tan cho cây trổng dễ hấp thụ

Kết quả thực nghiêm cho thấy ánh hưởng của pH đối với các chủng vi khuẩn

là khồng giống nhau Chúng vẫn có thể phát triển được trong vùng pH từ 5 đến 8, nhưng pH tối thích đối với chúng giao động từ pH 6?5 đến pH 7 Nói chung các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được đều có khả năng phát triển tốt trên đồng mộng từ đất hơi axít đến hơi kiềm (pH 5-8) và độ mặn dưới 1,5%

Báng 6 Anh hưởng của độ thông khí đến sự sinh trưởng VCI pnát triển của

vi khuẩn

X

-3.3 Nghiên cứu khả nâng phân giải phot phaĩ can xi, apaĩií của vi khuẩn ĩrên mòi trường lỏng

3.3.1 Khả năng phân giải phot phat can xi của vi khuẩn trên môi trường lỏng Kết quả thực nghiệm cho thấy lượng phot phát hoà tan tảng dần theo thời gian nuôi cấy Khả năng phân giải lân của chủng No và chủng NG là cao hơn so với các chủng khác, ở các chủng khác hiệu quả thấp hơn nhưng cũng đạt >21%

Bảng 7 Khả năng phân giải Ca 3 (P0 4 )2 của các chủng vi khuẩn

3.3.2 Khả năng phân giải apatit

Bâng 8 Khả năng phân giải quặng apatit của cấc chủng vi khuẩn.

Tẽn các chủng vi sinh vạt

Nuồi cấy lắc

(200vòng/

phút)

2A2.10 9 5,25.10* oò ửs 3.21.10® 1.10*

Nuôi cấy tĩnh 4.107 6,34.106 2,1.107 4.19.106 U.107

Kết quả ở bảng 6 chỉ cho thấy tất cả các chủng vi sinh vật trên đều thuôc ỉoại hiếu khí Trong điều kiện nuôi cấy lắc chúng phát triến tốt hơn rỏ rột so với nuôi cấy tĩnh

X

-Nọ 1,64 10,81 11,30

Khả năng phân giải bột quặng apatit của các chủng vi khuân được trình bày ở bảng 8 Sau 15 ngày nuôi cấy hiệu quả phân giải bột quặng thấp hơn so với hiộu quả phân giải Ca3(P04)2 Chủng N2 cho hiệu quả phân giải lân lởn nhất đạt 11,3% sau 15 ngày nuôi cấy Các chủng khác thấp hơn cũng đạt trôn 6%

Do các vi sinh vật sản sinh ra các loại axit và enzym không giống nhau nên khả nãng phân giải các ỉoại phot phát không hoàn toàn giống nhau (Kneey và Legget 1988, Asea và cộng sự 1988)

3 A Ảnh hương của vi khuẩn đến sự sinh ĩrướng VCI phát triển của cày ngô Bioseed 9670.

Bản ọ Ọ Ánh hưàng rùa vi khuẩn đến sinh trưởng và phát triển của cây ngô

trên đất ĩhanh trùng.

thức

bón

Chiều cao củy (cm) Số lá trung

bình

Trong lương tươi thàn lả sau 30

Trọng lượng khô thàn lá sau

30 ngày

ngày

30 ngà y

1. Đối

chứng

30,24±0,50 30,39±1.41 4 6 2.0±0,12 0,28+0,05

X

-Kết quả ở bảng 9 cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn đều có ảnh hưởng tốt đến sự phát triển của ngô lai Bioseed 9670 Tuy nhièn trong 15 ngay đầu chưa biểu hiện rõ Khi nhiêm- vi sinh vật chiều cao cây lăng hơn, trọng lượng tươi, khô thân lá cũng cao hơn so với đối chứng Từ kết quẩ thí nghiệm trôn cho thấy chủng N2 có tác dụng tốt đồi với cây ngò

Nhằm khẩng định ưu thế của chủng No chúng tôi dã so sánh với

các chủng Bacilỉus polymyxa (Nga) và chủng Baciỉỉus spp (Viện Khoa

học kỹ thuật nông nghiệp Việt nam)

c -v

Báns ỈO Ảnh hương của vi khuẩn đến sinh trướng vcì phút írỉển của cây ngô

trẽn đất ĩhanh ỉrùng.

ngô trên đất thanh, ĩrùng.

TT

C ÔNG

THỨC

BÓN

C HIỀU CAO CÂY ( CM ) S

Ố LÁ TRUNG BÌNH

T RỌNG LƯỢNG TƯƠI THÂN LÁ SAU 30 NGÀY

TN ( G / CẦY ;

T RỌNG LƯỢNG KHÔ THÂN LÁ SAU 30

NGÀY TN ( G / CỦY )

15 NGÀY 30 NGÀY 15

NAÀV

30

NGÀ Y

I " Đ

C KHỎNG

44.33±0,68 50,26±1.35 5 7 4,16±0,18 0,60±0.05

X

-TT

C ÔNG

THỨC

BÓN

C HIÉU CAO CÂY ( CM ) S

Ố LÁ TRUNG BỪIH

T RỌNG LƯỢNG TƯƠI THÂN LÁ SAU 30 NGÀY

TN ( G / CÂY )

T RỌNG LƯỢNG ÍCHÔ THÂN LÁ SAU 30 NGÀY

TN ( G / CÂY )

15 NGÀY 30 NGÀY 15

NGÀY

30

NGÀ Y

1. Đ

C

KHÔNG

PHÂN

41.5 ±0,57 48,5 ±0.85 5 7 3,6±0.09 0,51±0,01

Ọ Đ/ C CÓ

PHÂN

42J J ± L ,74 50,6+1,87 5 1 4,17±0,25 0,72±0,03

3 B ACILLU

S

POLIMVX

44,5 ±2,46 55,8±4,57 6 8 5,16±0,18 0,87 ±0,02

4 B ACILLU

S

SPP

45±4,15 56,8±5, I 6 6 8 6,05±0,41 0,97±0,08

5 N 2 43,8±5,25 54^±5,78 6 8 4,9±0,74 0,78±0,05

Bấng ỉỉ Ảnh hưởng của vi khuẩn đến sinh trưởng và phát triển của cây

0 Đ/

C CÓ PHÂN

44,67±2,16 52.50+3,13 5 8 Ố ,25±0,21 0,78±0,07

3 B ACILLU

S POLYMYX

48,67±3,42 58.78±4,11 6 9 8,50±0,23 1,1410,02

4 B ACILỈUS

SPP

50,02±3,18 59,65±4,85 6 9 9,75±0,48 1,34±0.02

5 N 2 48,45±4.12 58,34±4,15 6 9 8,39±0,57 Ị 1.06+0.05

I

Qua hai thí nghiệm trên đất thanh trùng và không thanh trùng các vi khuẩn phân giái lân khi rứiiẻm vào cây đều thê hiện tác dụng tốt Cây phát triển tốt, lá xanh khoẻ Khi nhiễm chủng Nọ chiều cao, trọng lượng tươi, khô thân lá ngò cũng cho kết

quả không rhua kém với nhiễm chủng Baciỉỉus polymvxa.

Dựa vào kết quả đối với cảy trồng chúng tôi chọn ra 3 chủng ví khuẩn có ảnh hưởng tót đối với cây trổng làm những thí nghiệm tiếp theo

3.5 Xây dựng quy trình sản xuất phân vi sinh vật phản giải lân.

Bản

2 12 Động thái tế bào ở các thời điểm từ 0 giờ đến 72 giờ.

Thời gian lên

men (giờ)

Số lượng tế bào/mi

72

1 .

Kết quả thực nghiêm cho thấy tất cả 3 chủng Vì sinh vật đều có số lượng tế bào tăng dán và đạt mức cao nhất ở 64 giờ nuôi cấy sục khí

X

-Chủng NG cho mật độ tế bào cao nhất đạt 8,1.109Tb/ml sau 64 giờ nuố sục khí Chủng R thấp nhất nhưng mật độ tế bào cũng đạt 2,5.109TB/mi sau 64 giờ

2,0.109

2,1.10* 1,0.109 2,3.109 1,2.109

Bảnọ 14 Kết quả kiểm tra mật độ vi sinh vật trên nền íhan bùn không ĩhcinh

trùng.

N 2 1,0.10“ 2,7.10 8 4,0.10 8 2,3.10 8 3,4.10 7

Kết quả kiểm tra chất lượng chế phẩm phân vi sinh trong thời gian bảo quản cho thấy chủng Nọ và NG có khả nảng tồn tại trên nển chất mang than bùn thanh trùng Mật độ sau 90 ngày bảo quản vẫn đạt 109TB/g

Mật độ vi sinh vật tăng nhanh ở thời gian đầu và giảm manh ở thời gian sau Khả năng phát triển của 3 chủng vi sinh vật trên nền chất mang than bùn không thanh trùng rất kém Mật độ TB sau 90 ngày thấp chỉ đạt l07TB/g không đạt tiêu chuẩn chất lượng phân vi sinh

4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.

-Từ 5 chủng vi khuân có khả năng phân giải lân phân ỉập được từ đất và rể ngô, đậu tương, chúng tôi tuyển chọn được 3 chủng vi khuẩn (ký hiộu No, NG, R) có khá năng

X