Đề tài tìm hiểu về VI KHUẨN ACETIC

Acetobacter xylinus, một kết hợp mới được đề nghị cho những chủng được xác định đặc điểm bởi ubiquinone-10 Q-10 ngược với ubiquinone-9 Q-9 của những chủng thuộc A.. Những loài được đề cậ

TP Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2004

I TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN ACETIC 1

I.1 Acetobacter 1

I.2 Gluconobacter 5

I.3 Gluconacetobacter 6

I.4 Asaia 8 I.5 Acidomonas 9

I.6 Kozakia 10 II DINH DƯỠNG CỦA VI KHUẨN ACETIC 11

II.1.Một số nghiên cứu khởi đầu 11

II.2.Nguyên liệu và phương pháp 12

II.3.Kết quả thí nghiệm 14

II.4.Thảo luận 19

II.5.Kết luận 20

III SINH LÝ VI KHUẨN ACETIC 21

IV MÔI TRƯỜNG IV.1 Môi trường MRS 23

IV.2 Môi trường Trypticase đậu nành và chất chiết nấm men 23 IV.3 Môi trường Gluconobacter oxydans 24

IV.4 Môi trường Acetobacter peroxydans 24

IV.5 Môi trường YPM 25

IV.6 Môi trường Methylobacterium với methanol 25

IV.7 Môi trường Acetobacter europaeus 26

IV.8 Môi trường RAE 26

IV.9 Môi trường AE 27

IV.10 Môi trường thay thế Acetobacter intermedius 28

IV.11 Môi trường Acetic acid bacterium 28

V ỨNG DỤNG 29

V.1.Sản xuất giấm 29

V.2.Sản xuất L – sorbose 29

V.3.Sản xuất thức uống Kombucha 30

I TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN ACETIC

Vi khuẩn acetic được biết đến như vi khuẩn sản xuấtgiấm từ hàng trăm năm trước Chúng thuộc họ

Acetobacteraceae Gillis & De Ley 1980, hình que, Gram (-), tế bào

có thể đứng một mình, thành đôi hay thành chuỗi ngắnhoặc dài, một số loài có thể chuyển động, một sốkhông Chúng sinh sản vô tính, trao đổi chất hiếu khí bắtbuộc, oxi hóa rượu hay đường không hoàn toàn dẫn đếnsự tích lũy các acid hữu cơ như các sản phẩm cuối, vàchịu được điều kiện acid tượng đối cao (pH < 4)

Cho tới gần đây (1992), Acetobacter và Gluconobacter vẫn

là hai giống chính của vi khuẩn acetic Đặc điểm chủ yếu

để phân biệt chúng là Acetobacter có thể oxi hóa hoàn

toàn acid acetic thành khí carbonic và nước bằng hệ enzym

của chu trình Krebs, còn Gluconobacter thì không oxi hóa acid

acetic vì không có đầy đủ hệ enzym này [13, 14] Sự thayđổi đáng kể trong việc phân loại vi khuẩn acetic là việc

giới thiệu giống Gluconacetobacter bởi Yamada et al (1997 và

1998) Hiện nay, 6 giống (genera) với 34 loài (species) vi

khuẩn acetic đã được nhận dạng, gồm Acetobacter Beijerinck

1898 (14 loài), Gluconobacter Asai 1935 (3 loài), Acidomonas Urakami et al 1989 (1 loài), Gluconacetobacter Yamada et al 1997 (11 loài), Asaia Yamada et al 2000 (4 loài), và Kozakia Lisdiyanti

et al 2002 (1 loài) [6, 9, 16]

1.1 Acetobacter

Acetobacter có kích thước khoảng 0.6-0.8 x 1.0-3.0m Các

loài Acetobacter có khả năng oxi hóa ethanol thành acid

acetic, điều này hoàn toàn dựa vào enzym nằm trên bềmặt màng tế bào chất gọi là dehydorgenase liên kết –màng (membrane – bound dehydorgenase); alcohol dehydorgenase(ADH) và acetaldehyde dehydorgenase (ALDH) [6]

Trong Danh sách Tên vi khuẩn được công nhận (theApproved Lists of Bacterial Names), 1980, 3 loài được liệt kê ở

cấp độ phân loại chi tiết của giống Acetobacter là

Acetobacter aceti (type species), A pasterianus và A peroxydans.

Trong 2 loài đầu, nhiều loài phụ (subspecies) được nhận dạng

gồm A.ceti subsp aceti, A aceti subsp liquefaciens, A.aceti subsp.

orleanensis, A aceti subsp xylinum, A pasteurianus subsp pasterianus, A pasteurianus subsp ascendens, A pasteurianus

subsp estunensis, A.pasteurianus subsp lovaniensis, A.pasteurianus subsp paradoxus Hệ thống phân loại trên có nguồn gốc

từ Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (8th edition,1974)

Năm 1983, Gosselé et al khảo sát những chủng được

cho là thuộc giống Acetobacter theo phân tích về đặc điểm

kiểu hình và sự vận chuyển điện tử protein gel (protein gelelectrophoresis) Họ kết luận rằng nên bỏ những loài phụ

được đề cập ở trên Giống Acetobacter được chia thành 4 nhóm với cấp độ chi tiết gồm: Acetobacter liquefaciens,

A.hansenii, A aceti (type species), A pasteurianus

Acetobacter xylinus, một kết hợp mới được đề nghị cho

những chủng được xác định đặc điểm bởi ubiquinone-10

(Q-10) ngược với ubiquinone-9 (Q-9) của những chủng thuộc A.

aceti và A pasteurianus Chủng của giống này cuối cùng

được xếp vào A pasteurianus.

Sokollek et al đã mô tả 2 loài mới là A pomorum và A.

oboediens năm 1998 Loài sau sau đó được chuyển qua giống Gluconacetobacter dựa trên nền tảng của chuỗi gene 16S

rRNA và quinone chính gồm có Q-10

Lisdiyanti et al (2000 và 2001) khảo sát những chủng

thuộc giống Acetobacter cũng như phân lập từ những

nguồn ở Indonesia về lượng DNA G+C và sự lai DNA-DNA

(hybridization) Họ đã nhận diện A pasteurianus và A.

peroxydans cùng với type species là A.aceti Họ đề nghị

những loài mới là A indonesiensis, A tropicalis, A.

cibinongensis, A orientalis, A orleanensis, A lovaniensis và A estunensis.

Năm 2002, Cleenwerck et al đã mô tả những loài mới

thêm vào dựa trên cơ sở lai DNA-DNA Những loài mới được

đề nghị là A cerevisiae và A malorum.

Những loài được đề cập ở trên của giống Acetobacter

được chia loài thành 2 sublineages là A và B Loại đầu bao

gồm A.aceti (type species) được xác định đặc điểm bởi sự

tạo thành 2-keto-D-gluconate từ glucose, và loại sau gồm A.

pasteurianus xác định đặc điểm bởi không tạo thành

2-keto-D-gluconate [16]

Theo Bảng Cập nhật Danh pháp vi khuẩn (BacterialNomenclature Up-to-date), dựa trên Danh sách Tên vi khuẩnđược công nhận (the Approved Lists of Bacterial Names,International Journal of Systematic Bacteriology) và được cậpnhật theo Tập san International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology, do Hãng DSMZ (Đức) cung cấp tháng

9/2004 thì giống Acetobacter gồm các loài như sau: [4]

Acetobacter aceti

Acetobacter aceti subsp liquefaciens → Acetobacter

liquefaciens → Gluconacetobacter liquefaciens Acetobacter aceti subsp orleanensis → A orleanensis

Acetobacter aceti subsp xylinus (corrig.) → Acetobacter xylinus subsp xylinus → Gluconacetobacter xylinus Acetobacter cerevisiae 52:1557*

Acetobacter cibinongensis 52:3

Acetobacter diazotrophicus → Gluconacetobacter

Acetobacter estunensis 51:263

Acetobacter europaeus → Gluconacetobacter

Acetobacter hansenii → Gluconacetobacter

Acetobacter indonesiensis 51:263

Acetobacter intermedius → Gluconacetobacter

Acetobacter liquefaciens → Gluconacetobacter

Acetobacter pasteurianus subsp estunensis → A

estunensis Acetobacter pasteurianus subsp lovaniensis → A

lovaniensis Acetobacter pasteurianus subsp paradoxus  A

pasteurianus Acetobacter peroxydans  A pasteurianus

Giải thích các ký hiệu:

Tên, không

có ghi chú

nào khác

Acetobacter aceti Có trong Danh

sách được côngnhận (ApprovedLists)

diazotrophicus → Gluconacetobacter

Tên cũ, và đượcphân loại lạithành

xylinus (corrig.) → Acetobacter xylinus

subsp xylinus →

Gluconacetobacter xylinus

 Acetobacter aceti (type species)

Acetobacter aceti (Beijerick, 1898) Beijerrick, 1900 Theo

Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (1957) thì loài nàycó đặc điểm như sau: [2]

Hình gậy, 0.4-0.8 x 1.0-2.0m, đứng một mình hay thànhchuỗi dài, thường thấy dạng hình chùy (club-shaped) lớn;nhuộm màu vàng với dung dịch iod; có thể chuyển động,các tế bào chuyển động có tiên mao kiểu cực mao (polarflagellum)

Khi nuôi trên môi trường gelatin bia chứa 10% sucrose thìtạo khuẩn lạc (colonies) lớn, bóng Khi ở trong môi trườnglỏng thì tạo thành màng mỏng và nhầy, cũng có thể tạothành vòng (ring) hay lớp đục (turbidity) mà không thànhmàng

Tạo acid từ glucose, ethanol, propanol và glycol Không tạoacid từ arabinose, galactose, sorbose, sucrose, maltose, lactose,raffinose, dextrin, tinh bột, glycogen, inulin, methanol, isopropanol,butanol, isobutanol, pentanol, glycerol, erythriol, mannitol, dulcitolhay acetaldehyde

Đặc điểm phân biệt: có năng lực oxi hóa rõ rệt, gâyoxi hóa nhanh chóng và hoàn toàn các cơ chất như glucosehay ethyl alcohol; có khả năng sử dụng muối nitơ vô cơ nhưlà nguồn nitơ duy nhất; phát triển và hoạt động oxi hóacùng với nấm men trong lên men

Nhiệt độ tối ưu là 30oC, có thể phát triển ở nhiệt độtừ 10 – 42oC

Môi trường sống: giấm, trái cây, rau và thức uống bịchua

1.2 Gluconobacter

Gluconobacter kích thước 0.6-0.8 x 1.5-2.0m, không oxi hóađược acid acetic thành CO2 và H2O theo chu trình Tricarboxylic

Acid như Acetobacter, do có 2 enzym thuộc chu trình này là

ketoglutarate dehydrogenase và succinate dehydrogenase khônghoạt động [14]

Theo Bacterial Nomenclature Up-to-date của DSMZ thì cácloài thuộc giống này gồm có: [4]

Gluconobacter asaii  G cerinus

Gluconobacter cerinus 34:503

Gluconobacter frateurii 39:182*

Gluconobacter oxydans subsp industrius

Gluconobacter oxydans subsp melanogenes

Gluconobacter oxydans subsp oxydans

Gluconobacter oxydans subsp sphaericus

Gluconobacter oxydans subsp suboxydans

 Gluconobacter oxydans

Gluconobacter oxydans trước đây được đặt tên là Acetobacter suboxydans, là một vi khuẩn khá hữu dụng trong

công nghiệp Việc phân loại lại A suboxydans thành G.

oxidans là kết quả của việc khám phá ra rằng giống Gluconobacter thiếu con đường hexose monophosphate

G.oxydans có tên từ oxys, theo tiếng Latin là “chua, gắt”,

và dans là “đưa, cho” Nó được tìm thấy trên hoa và quả,

có thể được dùng để lên men sorbose Chúng là catalsedương và là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc Khuẩn lạc hìnhtròn với đường kính khoảng 3mm, lồi lên, và thường có rìarõ nét Khuẩn lạc có thể màu trắng, vàng hay thậm chínâu về phía giữa của khuẩn lạc Chúng phát triển thíchhợp nhất ở nhiệt độ 25-30oC, tuy nhiên không phát triểnđược ở 37oC pH thích hợp từ 5.5-6.0 [5]

Sự oxi hóa không hoàn toàn nhiều carbohydrate và

alcohol của G oxydans rất thích hợp cho nhiều ứng dụng trong công nghệ sinh học Một tính chất quan trọng của G oxydans

là khả năng oxi hóa D-glucose thành acid D-gluconic và oxi

hóa hơn nữa thành acid 5-keto-D-gluconic (5-KGA), chất nàyđang được xem là thích hợp trong công nghiệp nhóa học nhưlà chất tiền đề cho sự sản xuất acid L(+) tartaric, vì 5-KGAcó thể dễ dàng chuyển thành acid L(+) tartatic Acid L(+)tartatic có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩmcũng như y học

Nhiều enzym liên quan đến các phản ứng oxi hóakhông hoàn toàn là các quinoprotein dehydrogenase, làenzym sử dụng cofactor pyrrolloquinolie quinone (PQQ) Trong

Gluconobacter người ta đã xác định được các quinoprotein

xúc tác cho sự oxi hóa alcohol, glucose, gluconate, glycerol,frutose và xylose [3]

1.3 Gluconacetobacter

Yamada và Kondo đã chia giống Acetobacter thành 2 giống

phụ (subgenera) dựa trên cơ sở về hệ thống ubiquinone

khác nhau Loại subgenus Acetobacter được xác định bởi Q-9 Ngược lại, subgenus Gluconacetobacter Yamada & Kondo 1984

được xác định bởi Q-10 Đối với giống phụ thứ hai, có 2

loài được chuyển sang là Acetobacter (Gluconacetobacter)

liquefaciens và Acetobacter (Gluconacetobacter) xylinus

Năm 1997, giống phụ (subgenus) Gluconacetobacter được

nâng lên thành giống (generic level) dựa trên cơ sở của sự

phân tích một phần chuỗi 16S rRNA Giống Gluconacetobacter

Yamada et al 1997 được đề nghị với những kết hợp mớigồm: Gluconacetobacter liquefaciens, Gluconacetobacter

diazotrophicus, Gluconacetobacter xylinus, Gluconacetobacter hansenii và Gluconacetobacter europaeus.

Những loài được điều chỉnh hoặc chuyển qua giống

Gluconobacter là: G oboediens, G intermedius, G sacchari, G entanii, G johannae, G azotocaptans.

Những loài được đề cập ở trên của giống

Gluconacetobacter được chia loài thành 2 sublineages, A và B.

Loại đầu gồm G liquefaciens (type species), và loại sau gồm

G xylinus và G hansenii [16]

Theo Bacterial Nomenclature Up-to-date của DSMZ thì

Gluconacetobacter gồm 11 loài như sau: [4]

Gluconacetobacter xylinus corrig (Brown 1886) Yamada et al.

1998, comb nov., trước đây được phân loại là Acetobacter

xylinus corrig (Brown 1886) Yamada 1984, hay Acetobacter xylinum

(sic) (Brown 1886) Bergey et al 1925 Chúng là loại vi khuẩn có

khả năng tạo polysaccharide ngoại bào (EPS –exopolysaccharides) EPS được ứng dụng nhiều trong côngnghiệp thực phẩm như các tác nhân làm dầy (thickening),tạo gel hay chất ổn định

1.4 Asaia

Theo Bacterial Nomenclature Up-to-date của DSMZ thì giống

Asaia gồm các loài: [4]

Asaia bogorensis 50:828*

Asaia krungthepensis 54:315*

Asaia siamensis 51:562*

Ngoài ra, theo Puspita Lisdiyanti thì giống này có thêm

loài Asaia indonesiensis phân lập được từ các nguồn ở

Indonesia [14]

 Asaia bogorensis

8 chủng của loài này được phân lập gần đây từ hoacủa cây phong lan (Bauhinia purpurea) và của cây plumbago(Plumbago auriculata), và từ gạo nếp lên men ở Indonesia,trong một nghiên cứu của Y Yamada và cọâng sự Chúng là

vi khuẩn Gram (-), hiếu khí, hình que và có tiên mao kiểu chumao (peritrichously flagellated) Chúng phát triển tốt trên môitrường phân lập là môi trường sorbitol ở pH 3.0 và 30oC.Chúng không oxi hóa ethanol thành acid acetic, hoặc cóchủng oxi hóa ethanol yếu, và 0.35% acid acetic sẽ ức chếhoàn toàn sự phát triển của chúng Tuy nhiên, chúng oxihóa acetate và lactate thành CO2 và H2O Những chủng phânlập được phát triển tốt trên môi trường thạch mannitol vàthạch glutamate, và đồng hóa ammonium sulfate cho sự pháttriển trên môi trường glucose không có vitamin Các chủngphân lập được sản xuất acid từ D-glucose, D-fructose, L-sorbose, ducitol và glycerol Hệ quinone là Q-10 Thành phầnDNA cơ bản có phạm vi từ 59.3 đến 61.0 mol% G+C Nghiêncứu về DNA cho thấy những chủng vi khuẩn phân lập đượcđã thiết lập một loài mới Phân tích hệ thống loài(phylogenetic analysis) dựa trên chuỗi gen 16S rRNA chỉ rarằng chúng thuộc về vi khuẩn acetic, nhưng khác với cácgiống Acetobacter, Gluconobacter, Acidomonas và Gluconacetobacter, và được đặt tên là Asaia bogorensis [15]

 Asaia siamensis

Trong một nghiên cứu của K Katsuravà cộng sự, 5chủng vi khuẩn được phân lập từ những hoa nhiệt đới lấytừ Thái Lan và Indonesia Phân tích hệ thống loài dựa trênchuỗi gen 16S rRNA chỉ ra rằng những chủng phân lập được

thuộc giống Asaia Chúng tạo thành một nhóm khác với

Asaia bogorensis dựa trên cơ sở giá trị DNA Lượng DNA G+C

của chúng từ 58.6-59.7 mol%, hơi thấp hơn A bogorensis.

Những chủng này có đặc điểm hình thái, sinh lý và hóa

sinh tương tự như các chủng của A bogorensis, nhưng chúng

không tạo thành acid từ dulcitol Chúng được đề nghị tên

là Asaia siamensis [7]

 Asaia krungthepensis

Trong nghiên cứu của P Yukphan và Y Yamada và cộngsự, 3 chủng vi khuẩn được phân lập từ hoa lấy từ Bangkok,

Thái Lan Phân tích hệ thống loài dựa trên chuỗi gen 16SrRNA chỉ ra rằng những chủng phân lập được thuộc giống

Asaia, nhưng tạo thành một nhóm khác với Asaia bogorensis

và Asaia siamensis Thành phần DNA cơ bản có phạm vi từ

60.2-60.5 mol% G+C Chúng có đặc điểm hình thái, sinh lý,

hóa sinh tương tự như các chủng của A bogorensis và A.

siamensis, nhưng không phát triển trên maltose Ubiquinone

chính là Q-10 Chúng được đặt tên Asaia krungthepensis [11]

Acetobacteraceae nhưng rõ ràng khác với các giống Acetobacter, Gluconobacter, Gluconacetobacter, Asaia và Kozakia.

14 chủng này được xác định là một loài độc lập,

Acidomonas methanolica, bởi sự tương đồng DNA-DNA, cho thấy

lượng DNA G+C có phạm vi từ 62-63 mol% và có Q-10 làquinone chính, chiếm >87% tổng ubiquinone Tế bào của

Acidomonas methanolica có một tiên mao kiểu cực mao (hay

thỉnh thoảng là chùm cực mao – polar tuft flagella), điều nàykhác với một nghiên cứu trước đây mô tả là tiên maokiểu chu mao (peritrichous flagella) Tất cả các chủng đều oxihóa acetate, nhưng oxi hóa lactate yếu và khác nhau ở cácchủng Dihydroacetone không được sản xuất từ glycerol.Pantothenic acid rất cần thiết cho sự phát triển Các chủngphát triển hầu hết cùng phạm vi ở pH 3.0 – 8.0 Do đó,

Acidomonas methanolica nên được xem là chịu acid

(acidotolerant) hơn là ưa acid (acidophilic) Với những dữ liệu

mới này, sự mô tả giống Acidomonas và loài Acidomonas

methanolica Urakami, Tamaoka, Suzuki và Komagata 1989 được

sửa lại [12]

1.6 Kozakia

Hiện có 1 loài là Kozakia baliensis 52:817* [4]

Trong nghiên cứu của P Lisdiyanti và cộng sự, 4 chủng vikhuẩn được phân lậm từ đường cọ nâu và ragi từ Bali vàYogyakarta, Indonesia Phân tích hệ thống loài dựa trên chuỗigen 16S rRNA chỉ ra rằng 4 chủng phân lập tạo thành một

nhóm khác với Acetobacter, Gluconobacter, Acidomonas,

Gluconacetobacter và Asaia Chúng có giá trị DNA-DNA tương

đồng với nhau cao (78-100%) và giá trị tương đồng thấp

(7-25%) với chủng của Acetobacter aceti, Gluconobacter oxydans,

Gluconacetobacter liquefaciens và Asaia bogorensis Thành phần

DNA cơ bản có phạm vi từ 56.8-57.2 mol% G+C Quinone chínhlà Q-10 Những chủng này oxi hóa acetate và lactate thành

CO2 và H2O, nhưng hoạt độ yếu giống như các chủng của

Asaia bogorensis Những chủng phân lập được khác với các

chủng của Asaia bogorensis về đặc điểm kiểu hình Chúng được đặt tên Kozakia baliensis gen nov, sp nov [10]

II DINH DƯỠNG CỦA VI KHUẨN ACETIC

(Nghiên cứu của M.R RAGHAVENDRA RAO và J.L STOKES, bộ môn Vi khuẩn học, trường Đại học Indiana, Bloomington, Mỹ) [8]

2.1 Một số nghiên cứu khởi đầu

Các nghiên cứu về yếu tố sinh trưởng và nguồn Nitơcần thiết cho vi khuẩn Acetic được bắt đầâu vào năm 1898khi Hoyer và Beijerinck quan sát thấy rằng chỉ có loài

Acetobacter aceti có thể phát triển trên môi trường có

nguồn Nitơ vô cơ dưới dạng muối NH4+ và nguồn carbon làethanol và acetate Gần nay, các nhà khoa học tìm thấy

nhiều loài khác của giống Acetobacter cũng có khả năng

này

Frateur(1950) chỉ ra rằng acetate không cần thiết nếu

nuôi giống Acetobacter trong môi trường đệm phosphate Hoyer và Beijerinck cũng nhận thấy loài A xylinum và

A.rancens có thể phát triển trong môi trường chứa muối

NH4+ nếu glucose được thêm vào môi trường ethanol Điều

tương tự cũng xảy ra với loài A pasteurianum và

A.kutzingianum Frateur cho rằng 2 loài trên không thể phát

triển trong môi trường chứa ethanol và nitơ ammonium nhưngKaushal và Walker (1951) đã nuôi được 2 loài này cùng với

A.acetigenum trong môi trường chứa glucose, ethanol và nitơ

ammonium Môi trường chỉ chứa glucose như nguồn dinh

dưỡng Carbon sẽ thích hợp cho A.peroxydans (Visser’Hooft, 1952)

và môi trường chỉ chứa muối ammonium như nguồn dinh

dưỡng Nitơ duy nhất sẽ thích hợp cho loài A.lovaniense

(Frateur,1951)

Có nhiều bằng chứng cho thấy nhiều loài khác ngoài

Acetobacter aceti có thể sử dụng nguồn Niơ vô cơ để sinh

trưởng mặc dù một số chủng chỉ có thể thực hiện điềunày khi sử dụng glucose làm nguồn cung cấp carbon vànăng lượng

Tuy nhiên ta cần xem xét những khía cạnh khác về mặtdinh dưỡng Những điều được đề cập ở trên là kết quảthu được với những môi trường không chứa những yếu tốsinh trưởng Phải mất một thời gian dài các nhà khoa học

mới biết rằng môi trường chứa nguồn nitơ phức tạp nhưdịch chiết nấm men, pepton cần thiết cho sự phát triển của

nhiều loài thuộc giống Acetobacter như: A.suboxydans,

A.melanogenum và A.rancens Cùng với sự hiểu biết ngày

càng sâu về nhu cầu các yếu tố sinh trưởng của vi sinhvật và khả năng tạo thành các hoạt chất ở dạng tinhkhiết, các nhà khoa học đã cố gắng xác định những chấtdinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy đặc biệt cầnthiết cho vi sinh vật

Năm 1943, Underkofler, Bantz và Peterson đã quan sát

thấy một chủng của loài A.suboxydans, chủng ATCC 621 cần

pantothenic, p-aminobenzoic, acid nicotinic để phát triển trongmôi trường chứa sản phẩm thủy phân từ casein (nguồnnitơ) và glycerol (nguồn carbon) Điều này đã giúp cho Stokesvà Larsen khẳng định việc chủng này cần 6 acid amin đểcó thể phát triển tốt Hai nhà khoa học này đã phát biểurằng nitơ dưới dạng muối ammonium không thích hợp cho sựphát triển của chủng này nhưng sự có mặt của các acidamin thiết yếu với nồng độ gần tối ưu, nguồn nitơ vô cơnày sẽ thúc đẩy sự phát triển của chủng này Tuy nhiên,Gray và Tatum (1944) thấy rằng nitơ ammonium cần thiết cho

sự phát triển của chủng A.melanogenum, M.A 6.1 nếu các

yếu tố sinh trưởng như thiamin, acid pantothenic, acid nicotinicvà acid p-aminobenzoic được cung cấp trong môi trường Bằngviệc chiếu xạ tia X, Gray và Tatum đã thu được những nhữngchủng vi sinh vật đột biến cần amino acid để phát triển Những kết quả trên đã cho thấy có nhiều loài khác

ngoài A.aceti và cả những loài được đề cập trước đó có

thể phát triển với nguồn nitơ ammonium nếu được cung cấpcác yếu tố sinh trưởng cần thiết và nguồn carbon vànăng lượng thích hợp

Những thông tin ít ỏi về nhu cầu yếu tố sinh trưởng và

nguồn nitơ của nhiều loài thuộc giống Acetobacter đã gợi ý

cho các nhà khoa học tiến hành các cuộc thí nghiệm đểtìm hiểu sâu về vấn đề này Kết quả đạt được đã minhchứng cho khả năng sử dụng nitơ ammonium của rất nhiềugiống vi khuẩn acetic Nó cũng cho thấy nhiều chủng đòihỏi những yếu tố sinh trưởng hoàn toàn mới và không

thể định danh Kết quả còn cho thấy sự ảnh hưởng rấtlớn của nguồn carbon và năng lượng đến nhu cầu nitơ vàyếu tố sinh trưởng của vi khuẩn acetic

2.2 Nguyên liệu và phương pháp:

25 chủng thuộc các loài A.xylinum, A.rancens,

A.gluconicum, A.suboxydans và A.melanogenum đại diện cho vi

khuẩn acetic được dùng để thí nghiệm 11 chủng bắt đầubởi prefix M.A được cung cấp bởi Dr C.B Van Niel 14 chủngcòn lại được phân lập từ trái cây, cider, bia và bã củadịch lên men được nấu từ bắp, malt và milo Các chủng

này được xác định là thuộc loài A.rancens, A.suboxydans và

A.melanogenum bằng các phương pháp và hệ thống phân

loại của Frateur Canh trường giữ giống là thạch nghiêngchứa 2% glycerol và 10% sản phẩm của quá trình tự phânnấm men (yeast autolysate) hoặc thạch nghiên chứa 2%glucose, 10% sản phẩm của quá trình tự phân nấm men và2% CaCO3

Sản phẩm của quá trình tự phân nấm men thu đượcbằng cách hoà tan 453.6 g nấm men bánh mì vào 0.5 lítnước Nhũ tương này được đun ở 50oC trong 24 giờ để sự tựphân của nấm men xảy ra Sau đó dung dịch được đun đếnsôi và được chỉnh pH đến 7.0 bằng dung dịch NaOH 2N, lọcqua giấy lọc cho đến khi thu được dung dịch trắng trong rồihấp tiệt trùng

Môi trường A dùng trong hầu hết các thí nghiệm cóthành phần như sau:

Ethanol, glucose hay những nguồn carbon khác 2.0 g

Hay

Sản phẩm thuỷ phân từ casein( không cóVitamin)

0.5g(thêm 10 mg L-cysteine và 20 mg DL- tryptophan)

Hỗn hợp Vitamin:

Nicotinic acid (NA) 40 g

Sau khi cho các chủng phát triển trên canh trường gồmglucose, CaCO3 và các sản phẩm của quá trình tự phânnấm men 24-36 giờ, người ta lấy ra một ít vi khuẩn thuộcmột chủng nhất định rồi hoà tan vào một lượng nước thíchhợp Lượng vi khuẩn này sẽ gây ra độ đục từ 15-20 có thểđọc được trên máy đo quang Klett Summerson với bộ lọc640m Một giọt của dung dịch có chứa chủng vi khuẩnnày sẽ được cho vào các erlen có chứa môi trường thí

nghiệm Các canh trường này sau đó được đem đi ủ ở 28oCtrong 5 ngày Sự phát triển của vi khuẩn trong từng erlenđược xác định bằng độ đục đo bằng máy đo quang Cácmôi trường không được chuyển vi khuẩn vào sẽ được dùnglàm môi trường chuẩn để điều chỉnh máy đo quang về 0.Để đơn giản hóa việc thể hiện các số liệu, sự pháttriển của các chủng được ký hiệu từ + đến ++++ chứkhông dùng tỷ lệ Klett của máy đo Quy định quy đổi nhưsau:

- : giá trị Klett <15+ : giá trị Klett 15-50++ : giá trị Klett 51-100+++ : giá trị Klett 101-200++++ : giá trị Klett trên 200

2.3 Kết quả thí nghiệm:

Không có chủng vi khuẩn acid acetic nào phát triểntrên môi trường khoáng chứa (NH4)2SO4, ethanol hay sảnphẩm thuỷ phân casein Những kết quả giống hệt nhau

được ghi nhận trừ một trường hợp duy nhất là A.xylinum.

Loài này có thể phát triển với nitơ ammonium hoặc sảnphẩm thủy phân casein khi thay ethanol bằng glucose, giốngnhư sự khẳng định trước đó của Hoyer

Tuy nhiên người ta đã thu được những kết quả kháchoàn toàn khi thêm vitamin vào môi trường Kết quả đượctrình bày trong bảng 1 Sự bổ sung vitamin đã giúp ít nhất 8

trong 11 chủng của loài A.suboxydans và 2 trong số 6 chủng của loài A.melanogenum phát triển trong môi trường có cả

(NH4)2SO4 và sản phẩm thuỷ phân casein Ba chủng khác:

A.suboxydans M.A 8.2, A.melanogenum M.A 6.4 và chủng số 2

cũng phát triển nhưng chỉ trên môi trường có chứa casein

bị thủy phân Không có chủng nào có thể phát triểnmà thiếu các vitamin

Một kết quả khác cũng được ghi nhận là: hỗn hợp 10vitamin không hỗ trợ gì cho sự phát triển của tất cả các

chủng thuộc loài A.gluconicum và A.rancens, các chủng

A.suboxydans 4 và 5, chủng A.melanogenum M.A 6.3 và 6.5.