NGHIÊN cứu SÀNG lọc ảo các CHẤT ức CHẾ CHỌN lọc MONOAMIN OXIDASE b

vi Hoa Kỳ MAO Enzym monoamin oxidase MAO-A Enzym monoamin oxidase A MAO-B Enzym monoamin oxidase B QSAR Quantitative Structure Activity Relationship Mối quan hệ định lượng cấu trúc – tác

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN HOÀNG TIẾN

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC ẢO CÁC CHẤT ỨC CHẾ

CHỌN LỌC MONOAMIN OXIDASE B

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2020

ii

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN HOÀNG TIẾN

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC ẢO CÁC CHẤT ỨC CHẾ

CHỌN LỌC MONOAMIN OXIDASE B

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Giảng viên hướng dẫn: PGS TS LÊ MINH TRÍ

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020

iii

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

LỜI CẢM ƠN x

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 SƠ LƯỢC VỀ BỆNH PARKINSON 2

1.1.1 Tổng quan về bệnh Parkinson 2

1.1.2 Các dấu hiệu và triệu chứng 2

1.1.3 Thuốc điều trị 4

1.1.4 Hội chứng pho mát 5

1.2 ENZYM MONOAMIN OXIDASE B 5

1.2.1 Tổng quan về enzym monoamin oxidase (MAO) 5

1.2.2 Khoang gắn kết của MAO-B 7

1.2.3 Các chất ức chế MAO-B 8

1.2.4 Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học trên MAO-B 9

1.3 TỔNG QUAN VỀ CÁC CÔNG CỤ SÀNG LỌC ẢO 10

1.3.1 Mô hình Pharmacophore 10

1.3.2 Mô hình 2D-QSAR 11

1.3.3 Đánh giá ADMET 11

1.3.4 Mô hình mô tả phân tử docking 12

1.4 THƯ VIỆN CÁC CHẤT SÀNG LỌC ẢO 12

1.4.1 ZINC 12

1.4.2 DrugBank 13

1.4.3 Thư viện các chất có nguồn gốc từ dược liệu Traditional Chinese Medicine (TCM) và Universal Natural Product Database (UNPD) 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

iv

2.1 XÂY DỰNG MÔ HÌNH 3D-PHARMACOPHORE 14

2.1.1 Xử lý cơ sở dữ liệu 14

2.1.2 Pharmacophore dựa trên cấu trúc MAO-B 17

2.1.3 Pharmacophore dựa trên ligand 17

2.1.4 Đánh giá mô hình 3D-pharmacophore 19

2.1.5 Ứng dụng mô hình 3D-pharmacophore trong sàng lọc 20

2.2 MÔ HÌNH 2D-QSAR 21

2.2.1 Chuẩn bị cơ sở dữ liệu 22

2.2.2 Lựa chọn thông số mô tả 22

2.2.3 Loại các chất gây nhiễu bằng Z-score 22

2.2.4 Xây dựng mô hình 23

2.2.5 Phân chia tập cơ sở dữ liệu 23

2.2.6 Đánh giá mô hình 23

2.2.7 Ứng dụng mô hình 2D-QSAR trong sàng lọc 25

2.3 SÀNG LỌC ADMET 25

2.4 MÔ HÌNH MÔ TẢ PHÂN TỬ DOCKING 26

2.4.1 Xây dựng mô hình mô tả phân tử docking MAO-B 27

2.4.2 Xây dựng mô hình mô tả phân tử docking MAO-A 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31

3.1 MÔ HÌNH 3D-PHARMACOPHORE 31

3.1.1 Pharmacophore dựa trên cấu trúc MAO-B 31

3.1.2 Pharmacophore dựa theo ligand 31

3.1.3 Kết quả đánh giá mô hình 3D-pharmacophore 32

3.1.4 Kết quả sàng lọc trên các tập dữ liệu 34

3.2 MÔ HÌNH 2D-QSAR TRÊN CHẤT ỨC CHẾ MAO-B 34

3.2.1 Lựa chọn thông số mô tả 34

3.2.2 Loại các chất gây nhiễu bằng Z-score 35

3.2.3 Xây dựng mô hình 2D-QSAR 37

v

3.2.4 Đánh giá mô hình 2D-QSAR 38

3.2.5 Ứng dụng mô hình 2D-QSAR trong sàng lọc 39

3.3 SÀNG LỌC ADMET 40

3.4 MÔ HÌNH MÔ TẢ PHÂN TỬ DOCKING 41

3.4.1 Xây dựng mô hình mô tả phân tử docking MAO-B 41

3.4.2 Mô hình mô tả phân tử docking MAO-A 44

3.5 BÀN LUẬN 48

3.5.1 Tập dữ liệu UNPD 48

3.5.2 Tập dữ liệu ZINC 51

3.5.3 So sánh với các nghiên cứu khác 53

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC PL-1

vi

Hoa Kỳ) MAO Enzym monoamin oxidase

MAO-A Enzym monoamin oxidase A

MAO-B Enzym monoamin oxidase B

QSAR Quantitative Structure Activity Relationship (Mối quan hệ định lượng

cấu trúc – tác dụng) 2D-QSAR QSAR trên không gian 2 chiều

3D-QSAR QSAR trên không gian 3 chiều

QSPR Quantitative Structure – Property Relationship (Mối quan hệ định lượng

giữa cấu trúc - tính chất) ADMET Hấp thu – phân bố - chuyển hóa – thải trừ - độc tính

TCM Traditional Chinese Medicine (Thư viện các chất phân lập từ các bài

thuốc cổ truyền Trung Hoa) UNPD Universal Natural Product Database (Thư viện các chất có nguồn gốc tự nhiên) MOE Molecular Operating Environment

FAD Flavin Adenin Denucleotid

IC50 Nồng độ tối thiểu ức chế 50% (50% inhibitory concentration)

PLS Partial Least Squares (Bình phương tối thiểu từng phần)

RMSD Root mean square deviation (Sai số trung bình bình phương gốc)

RMSE Root mean square error (Sai số bình phương trung bình)

LOO Bỏ - một – ra (Leave One Out)

TP Số lượng chất có hoạt tính được dự đoán đúng (True - Positive)

TN Số lượng chất không có hoạt tính được dự đoán đúng (True - Negative)

FP Số lượng chất có hoạt tính được dự đoán sai (False - Positive)

FN Số lượng chất không hoạt tính được dự đoán sai (False - Negative)

PDB Protein Data Bank (Ngân hàng protein)

WDI World Drug Index (Chỉ số thuốc thế giới)

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cơ chế các nhóm thuốc điều trị Parkinson 4

Hình 1.2 Cấu trúc MAO-A được vẽ bằng phần mềm Molecular Operating Environment 2015.10 từ protein mã 2Z5Y trên Protein Data Bank 6

Hình 1.3 Cấu trúc MAO-B được vẽ bằng phần mềm Molecular Operating Environment 2015.10 từ protein mã 2V5Z trên Protein Data Bank 6

Hình 1.4 Khoang gắn kết MAO-B được tạo bởi Hana Elshaflu và các cộng sự 7

Hình 1.5 Cấu trúc rasagilin, selegilin và safinamid 8

Hình 2.6 Các bước tiến hành nghiên cứu 14

Hình 2.7 Sơ đồ các bước xây dựng mô hình 2D-QSAR 21

Hình 2.8 Các bước tiến hành xây dựng mô hình mô tả docking MAO-B 27

Hình 3.9 Các mô hình pharmacophore S01, S02, S03 được xây dựng dựa theo cấu trúc protein và sự gióng hàng trên phối tử Safinamid 31

Hình 3.10 Các mô hình pharmacophore L01, L02, L07, L13 được xây dựng theo 4 chất của tập xây dựng 32

Hình 3.11 Kết quả sàng lọc bằng mô hình 3D-pharmacophore L13 34

Hình 3.12 Biểu đồ thể hiện mối tương quan giữa pIC50 thực nghiệm và pIC50 dự đoán của tập nhiễu 36

Hình 3.13 Biểu đồ thể hiện mối tương quan giữa pIC50 thực nghiệm và pIC50 dự đoán trên toàn tập 37

Hình 3.14 Kết quả sàng lọc qua mô hình 2D-QSAR 39

Hình 3.15 Tỷ lệ các chất đạt và không đạt trong sàng lọc ADMET 40

Hình 3.16 Khoang gắn kết của MAO-B được chụp bởi MOE 2015.10 42

Hình 3.17 Biểu đồ phân bố điểm số docking của 4.754 chất dock thành công trên MAO-B 43 Hình 3.18 Khoang gắn kết của MAO-A được chụp bởi MOE 2015.10 45

Hình 3.19 Sự khác biệt giữa khoang gắn kết của MAO-A và MAO-B 45

Hình 3.20 Kết quả tương tác của 1.905 chất tiềm năng với acid amin trên khoang gắn kết của MAO-B 46

Hình 3.21 Biểu đồ phần trăm các chất docking chọn lọc trên MAO-B 47

Hình 3.22 Tóm tắt kết quả sàng lọc trong nghiên cứu 48

viii

Hình 3.23 UNPD89644 (Crotafuran E) (màu xanh lá cây) trong khoang gắn kết của MAO-B và tương tác với acid amin (điểm số docking -24,48KJ/mol) 50 Hình 3.24 UNPD203145 (màu xanh lá cây) trong khoang gắn kết của MAO-B và tương tác với acid amin (điểm số docking -22,73 KJ/mol) 50 Hình 3.25 UNPD100906 (màu xanh lá cây) trong khoang gắn kết của MAO-B và tương tác với acid amin (điểm số docking -27,23 KJ/mol) 51Hình 3.26 UNPD13390 (màu xanh lá cây) trong khoang gắn kết của MAO-B và tương tác với acid amin (điểm số docking -20,63 KJ/mol) 51 Hình 3.27 Tương tác giữa ZINC78829248 với khoang gắn kết của MAO-B (điểm số docking -36,99 KJ/mol) 52 Hình 3.28 Tương tác giữa ZINC47435563 với khoang gắn kết của MAO-B (điểm số docking -35,40 KJ/mol) 52 Hình 3.29 Tương tác giữa ZINC59148702 với khoang gắn kết của MAO-B (điểm số docking -35,27 KJ/mol) 53 Hình 3.30 Tương tác giữa ZINC58283019 với khoang gắn kết của MAO-B (điểm số docking -35,07 KJ/mol) 53

ix

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Khung cấu trúc của 397 chất dùng đánh giá mô hình 3D-pharmacophore 15

Bảng 2.2 Tập xây dựng của mô hình 3D-pharmacophore 18

Bảng 2.3 Giá trị ngưỡng của các rủi ro được đề nghị bởi ADMET Predictor 9.5 26

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá mô hình 3D-pharmacophore 33

Bảng 3.5 Mức độ tương quan của các thông số mô tả với nhau và với pIC50 35

Bảng 3.6 Kết quả loại nhiễu Z-score 36

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá mô hình 2D-QSAR 38

Bảng 3.8 Miền ứng dụng của mô hình 2D-QSAR 39

Bảng 3.9 Kết quả sàng lọc ADMET 40

Bảng 3.10 Kết quả redocking MAO-B (mã PDB 2V5Z) 41

Bảng 3.11 Kết quả docking MAO-B (mã PDB 2V5Z) 43

Bảng 3.12 Kết quả redocking MAO-A (mã PDB 2Z5Y) 44

Bảng 3.13 Kết quả docking trên MAO-A (mã PDB 2Z5Y) 46

Bảng 3.14 Các chất sàng lọc được ở tập UNPD 49

Bảng 3.15 So sánh với nghiên cửu của Kiran Boppana và các cộng sự (2009) 54

x

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến Khoa Dược - Đại học Y Dược thành phố Hồ

Chí Minh, cũng như các thầy cô đã tạo ra một môi trường học tập bổ ích, dạy em

những kiến thức quý báu trong suốt 5 năm học tập Đồng thời Khoa Dược cũng tạo

điều kiện tốt nhất về máy móc và thiết bị để em có thể hoàn thành tốt khóa luận của

mình

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bộ môn Hóa Dược và đặc biệt cảm ơn đến thầy

PGS TS Lê Minh Trí và PGS.TS Thái Khắc Minh đã luôn theo sát, kiểm tra tiến

độ, tận tình chỉ bảo và quan tâm động viên em trong suốt thời gian thực hiện khóa

luận Thầy luôn sẵn sàng cung cấp kiến thức mới, giải đáp những thắc mắc và cho

em lời khuyên khi gặp các vấn đề trong khóa luận Em cũng xin cảm ơn thầy ThS Mai Thành Tấn đã luôn góp ý để cho khóa luận của em được hoàn thiện hơn

Em cũng xin dành lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Hội Đồng Hóa dược và đặc biệt

cảm ơn cô giảng viên phản biện TS Nguyễn Thụy Việt Phương đã dành thời gian

đọc bài và đưa ra những góp ý chi tiết cho khóa luận của em

Em xin cảm ơn anh DS Bùi Quốc Dũng, anh DS Trần Thái Sơn đã luôn có mặt ở

lab Hóa Dược để giúp em giải quyết những khó khăn Cũng như các anh chị DS

Nguyễn Minh Châu, DS Đinh Lê Quốc Hoàng, DS Nguyễn Minh Xuân đã giải đáp

thắc mặc khi em cần Vả cảm ơn các em monitor tại phòng lab Hóa Dược đã hỗ trợ

trong thời gian khóa luận gấp rút

Mình xin cảm ơn các bạn Ánh Tuyết, Giang Sơn, Hoàng Minh, Xuân Tiên, Ngọc

Trâm, Thanh Hằng và Thu Hạnh cùng làm khóa luận tốt nghiệp trên lab Hóa Dược

đã hỗ trợ, giúp đỡ, động viên nhau để cùng hoàn thành khóa luận đúng thời hạn

Cuối cùng con xin cảm ơn sâu sắc đến Ba, Mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng, dành những

điều tốt đẹp nhất cho con để con có thể học tập và hoàn thành được khóa luận này

Xin cảm ơn tất cả mọi người!

Hồ Chí Minh, ngày 07 tháng 08 năm 2020

Nguyễn Hoàng Tiến

« Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đặt vấn đề »

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Parkinson là bệnh thoái hóa thần kinh đặc trưng bởi các triệu chứng vận động và

không vận động [1] Bệnh Parkinson ảnh hưởng từ 1 đến 2‰ dân số và tỷ lệ này đang

càng ngày càng gia tăng theo độ tuổi [2] Tính đến năm 2020 chỉ có ba thuốc được

Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận để điều trị bệnh

Parkinson là rasagilin (năm 2006), selegilin (năm 2006) và safinamid (năm 2017) Ba

thuốc này là các chất ức chế chọn lọc enzym monoamin oxidase B (MAO-B) làm

ngăn chặn quá trình chuyển hóa dopamin ở thần kinh trung ương Kể từ lúc rasagilin

và selegilin được chấp thuận đến 11 năm sau mới có thêm safinamid được chấp thuận

cho thấy việc phát triển thuốc mới trị bệnh Parkinson diễn ra rất chậm Nguyên nhân

của việc này một phần do việc tìm kiếm các thuốc mới thất bại trong thử nghiệm lâm

sàng do tác dụng phụ nghiêm trọng của các chất ức chế MAO-B, gây “hội chứng pho

mát” làm tăng huyết áp mạnh khi sử dụng kèm các thực phẩm giàu tyramin [3] Các

nhà nguyên cứu chỉ ra rằng “hội chứng pho mát” liên quan đến việc ức chế cả

MAO-A và MMAO-AO-B vì vậy hướng nghiên cứu các thuốc trị Parkinson hiện nay là ức chế

chọn lọc MAO-B [4] Để giúp tiết kiệm thời gian và chi phí, các công cụ sàng lọc ảo

như pharmacophore, QSAR, docking,… được áp dụng trong nghiên cứu giúp tìm ra

các hoạt chất tiềm năng từ các ngân hàng dữ liệu

Với định hướng trên đề tài “Nghiên cứu sàng lọc ảo các chất ức chế chọn lọc

monoamin oxidase B” được tiến hành với các nội dung sau:

1 Thu thập cơ sở dữ liệu các chất ức chế MAO-B

2 Xây dựng mô hình 3D-pharmacophore trên các chất ức chế MAO-B

3 Xây dựng mô hình 2D-QSAR trên các chất ức chế MAO-B

4 Tiến hành đánh giá hấp thu - phân bố - chuyển hóa - thải trừ - độc tính (AMDET)

các chất sàng lọc được

5 Xây dựng mô hình mô tả phân tử docking trên khoang gắn kết của MAO-B

và MAO-A

6 Ứng dụng các mô hình trong sàng lọc các chất ức chế MAO-B trên các cơ sở dữ

liệu thuốc Drugbank, thư viện các chất phân lập từ các bài thuốc cổ truyền Trung Hoa

(TCM), thư viện các chất có nguồn gốc tự nhiên (UNPD) và cơ sở dữ liệu miễn phí

các chất đã thương mại hóa (ZINC)

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƯỢC VỀ BỆNH PARKINSON

1.1.1 Tổng quan về bệnh Parkinson

Bệnh Parkinson (hay còn gọi là PD) là một rối loạn của hệ thần kinh trung ương gây ảnh hưởng đến tình trạng cử động, thăng bằng và kiểm soát cơ của bệnh nhân Bệnh Parkinson thuộc nhóm các bệnh rối loạn vận động, ba đặc điểm đặc trưng của bệnh

là cứng cơ, run và vận động chậm, trường hợp bệnh nặng người bệnh có thể mất đi một số chức năng vận động vật lý [5] Các triệu chứng chính xuất hiện tương ứng với

sự giảm kích thích ở vùng vỏ não thuộc phạm vi điều khiển của hạch nền Điều này liên quan đến sự giảm hình thành và sản xuất dopamin trong tế bào thần kinh dopaminergic của não giữa [6] Các triệu chứng phụ có thể xuất hiện rối loạn chức năng nhận thức cao cấp và các vấn đề về ngôn ngữ Đây là bệnh mãn tính tự phát, nhưng trong một số trường hợp bệnh do độc tính của một số loại thuốc, chấn thương đầu, hay các rối loạn y tế khác [5]

Dựa theo nguyên nhân gây bệnh có thể chia bệnh Parkinson thành bốn nhóm: nhóm bệnh tự phát (không biết rõ nguyên nhân), nhóm sơ cấp (biết nguyên nhân), nhóm do

di truyền và nhóm bệnh Parkinson kết hợp chung với thoái hóa nhiều hệ thống khác Trong đó phần lớn là nhóm bệnh tự phát [7]

1.1.2 Các dấu hiệu và triệu chứng

Các dấu hiệu và triệu chứng có thể chia thành hai loại: triệu chứng vận động và triệu chứng không vận động

1.1.2.1 Triệu chứng vận động

Là những triệu chứng ảnh hưởng đến chức năng vận động của cơ thể Đây là những triệu chứng rõ ràng nhất của bệnh Parkinson Các triệu chứng vận động chính của bệnh là run, chậm vận động, cứng khớp và cân bằng kém (mất ổn định tư thế) Ở giai đoạn đầu, những triệu chứng này thường nhẹ Các triệu chứng thường bắt đầu ở một bên của cơ thể và có thể tiến triển thành hai bên sau một vài năm Khi diễn tiến nặng dần, một vài người có thể gặp khó khăn trong việc đi lại, nói chuyện và các công việc thường ngày khác Các triệu chứng này thường tiến triển chậm Tuy nhiên tốc độ diễn tiến sẽ khác nhau ở mỗi người [6]

Run thấy rõ ở đầu chi, môi, lưỡi Run thường khu trú ở một bên cơ thể trong nhiều năm đầu, run có thể tạm mất khi vận động, nhưng sau đó lại tái diễn, khi ngủ hết run, xúc động tăng run, tuy nhiên, có trường hợp hoàn toàn không run [8]

« Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu »

3

Cứng đơ: là một trong các triệu chứng quan trọng nhất, chân tay cứng ở tất cả các

nhóm cơ, đi lại khó, sờ nắn các cơ thấy chắc, cứng [8]

Giảm vận động: mất các động tác tự nhiên của nét mặt, của chân tay, nhất là khi cử

động Mất vẻ biểu lộ tình cảm, nét mặt như người mang mặt nạ, ít chớp mắt Đa số

mọi bệnh nhân bệnh Parkinson đều có chậm vận động và có thể làm cho người bệnh

cảm thấy yếu sức, mệt mỏi Ở cánh tay, chậm vận động có thể gây khó khăn trong

những hoạt động như cài nút áo, buộc dây giày, đánh máy tính… Chậm vận động có

thể khiến cho người bệnh khó nhấc chân lên khi đi, bước đi chậm ngắn hơn và cảm

giác không vững Người bệnh cũng có thể gặp những khó khăn khi thay đổi tư thế từ

đang ngồi sang đứng dậy [8]

Ngoài ra, ở giai đoạn trễ của bệnh còn gặp hiện tượng mất thăng bằng Khi các phản

xạ tự động bị mất, người bệnh có thể gặp khó khăn nhiều hơn trong việc đi lại, thậm

chí có thể cần có người hỗ trợ hoặc ngồi xe lăn Nếu như mất thăng bằng tiến triển

sớm ở giai đoạn đầu của bệnh, thì sẽ ít khi nghĩ đến bệnh Parkinson hơn, mà có thể

nghĩ đến hội chứng Parkinson khác như teo cơ hệ thống hoặc liệt trên nhân tiến triển [8]

1.1.2.2 Triệu chứng không vận động

Các triệu chứng không vận động có thể ảnh hưởng đến cảm xúc, xúc giác và khả năng

suy nghĩ của người bệnh Có thể kể đến là: những vấn đề về nhận thức và sa sút trí

tuệ, hoang tưởng và ảo giác, trầm cảm và lo âu, rối loạn giấc ngủ [8]

1.1.2.3 Các giai đoạn bệnh Parkinson

Các giai đoạn tiến triển của bệnh Parkinson bao gồm:

Giai đoạn 1: có các dấu hiệu ở 1 bên cơ thể, bệnh nhân vẫn tự chủ trong các sinh hoạt

Giai đoạn 2: có các dấu hiệu ở hai bên nhưng không bị mất thăng bằng

Giai đoạn 3: có triệu chứng cả 2 bên cơ thể có mất thăng bằng nhưng bệnh nhân vẫn

tự chủ được trong hoạt động tuy có bị hạn chế

Giai đoạn 4: bị suy giảm chức năng nặng nhưng vẫn có thể đi đứng được cần sự hỗ

trợ một phần

Giai đoạn 5: bệnh nhân phải ngồi xe lăn hoặc nằm tại giường, không còn tự chủ được

4

1.1.3 Thuốc điều trị

Mục đích điều trị nhằm giảm sự tiến triển của bệnh và tăng chất lượng sống cho bệnh

nhân [9] Các thuốc điều trị PD gồm các nhóm sau:

Gia tăng hoạt tính dopaminergic:

- Phục hồi dopamin thần kinh: levodopa

- Chủ vận dopamin: bromocriptin, pramipexol, ropinirol, apomorphin

- Kéo dài tác động của dopamin: ức chế enzym MAO-B có selegilin, rasagilin

và safinamid

- Giải phóng dopamin từ nơi dự trữ và ức chế sự tái hấp thu: amantadin

Giảm hoạt tính cholinergic: benzatropin, trihexylphenidyl

Ngoài ra còn có nhóm ức chế chuyển hóa levodopa trước khi vào hệ thần kinh:

entacapon, tolcapon và carbidopa

Thuốc được sử dụng ưu tiên ở hàng thứ nhất là levodopa phối hợp với carbidopa Ở

hàng thứ hai có thuốc ức chế MAO-B, các thuốc này có tác dụng yếu hơn levodopa,

nhưng có thể hỗ trợ làm giảm hiện tượng giảm hiệu quả cuối liều khi sử dụng thuốc

levodopa Và cho thấy hiệụ lực tương đương với chất ức chế enzym

catechol-O-methyltransferase (COMT) Ngoài ra thuốc ức chế MAO-B còn được sử dụng như

liệu pháp đơn trị trong giai đoạn sớm của bệnh Parkinson [10, 11]

Hình 1.1 Cơ chế các nhóm thuốc điều trị Parkinson [42]

« Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu »

5

1.1.4 Hội chứng pho mát

Trong thời gian sử dụng thuốc ức chế MAO, nếu bệnh nhân sử dụng thực phẩm giàu tyramin sẽ gây hiện tượng tăng huyết áp nghiêm trọng có thể dẫn đến tử vong Các nguyên nhân gây hiện tượng pho mát được giải thích như sau: việc tăng hấp thu tyramin qua hệ tiêu hóa kết hợp với giảm chuyển hóa ở gan dẫn đến lượng tyramin trong máu tăng cao, dẫn đến lượng tyramin ở các tế bào thần kinh giao cảm cũng tăng cao, nó chiếm vị trí của nornadrenalin và adrenalin trên chất nền là enzym MAO từ

đó lượng chất dẫn dẫn truyền thần kinh giao cảm tăng lên nhanh chóng dẫn đến việc tăng huyết áp cấp [12]

Nghiên cứu chỉ ra rằng, hội chứng pho mát có liên quan đến sự ức chế MAO-A hơn

là MAO-B [13] và đặc biệt ức chế không thuận nghịch MAO-A gây ra hội chứng nghiêm trọng nhất Đó là lý do vì sao nhiều thuốc chống trầm cảm có tác dụng mạnh nhưng lại bị hạn chế sử dụng trong lâm sàng [14] Việc ức chế chọn lọc một enzym MAO sẽ giảm được tác dụng phụ không mong muốn này [7]

1.2 ENZYM MONOAMIN OXIDASE B

1.2.1 Tổng quan về enzym monoamin oxidase (MAO)

MAO là họ của enzym xúc tác cho quá trình oxy hóa của monoamin [15,16], chúng

là một flavoprotein vì có chứa co-factor Flavin Adenin Denucleotid (FAD) trong cấu trúc Enzym MAO nằm ở màng ngoài ty thể của các loại tế bào và phân bố khắp cơ thể, có vai trò quan trọng trong sự phân hủy của monoamin trong thức ăn cũng như các hoạt động dẫn truyền thần kinh [17]

Ở người có hai loại enzym MAO là MAO-A và MAO-B cả hai đều được tìm thấy ở trong tế bào thần kinh Trong đó MAO-A còn phân bố nhiều ở nhau thai, ruột và gan, còn MAO-B phân bố chủ yếu ở não, gan và tiểu cầu [18] Hai enzym này giống nhau đến 70% trình tự acid amin [19] và mỗi enzym chuyển hóa cho các cơ chất khác nhau MAO-A có cơ chất là tyramin, noradrenalin và serotonin liên quan đến bệnh trầm cảm còn cơ chất của MAO-B là phenylethylamin, telmethylhistamin và dopamin, liên quan đến bệnh Parkinson và Alzheimer [18]

MAO-A và MAO-B đều là các enzym gắn lên màng ngoài ty thể với cấu trúc gồm hai phần, một phần bên ngoài màng và một phần gắn lên màng.Trong khi MAO-A là một monomer (Hình 1.2) thì MAO-B là dimer với hai chuỗi acid amin giống nhau (Hình 1.3) [20, 21]

6

Hình 1.2 Cấu trúc MAO-A được chụp bằng phần mềm Molecular Operating Environment

2015.10 từ protein mã 2Z5Y trên Protein Data Bank

Hình 1.3 Cấu trúc MAO-B được chụp bằng phần mềm Molecular Operating Environment

2015.10 từ protein mã 2V5Z trên Protein Data Bank

« Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu »

7

1.2.2 Khoang gắn kết của MAO-B

Cấu trúc khoang gắn kết MAO-B là một khoang lưỡng cực gồm hai khoang với tính chất trái ngược nhau Một khoang chất nền nằm trước co-factor FAD, nó tạo được nhiều liên kết phân cực (liên kết hydro, liên kết cộng hóa trị, tương tác điện tích) từ các acid amin xung quanh và các phân tử nước trong khoang với chất ức chế Khoang còn lại bao gồm nhiều tương tác kỵ nước giữa ligand và các acid amin xung quanh Nhìn chung khoang gắn kết MAO-B dài, hẹp và lưỡng cực Điều này trái ngược với MAO-A, ngắn, rộng và không phân chia hai khoang rõ rệt như MAO-B Đây chính

là đặc điểm mà các nhà nghiên cứu khai thác để tìm ra các chất gắn chọn lọc trên MAO-B [20, 22]

Hình 1.4 Khoang gắn kết MAO-B được tạo bởi Hana Elshaflu và

các cộng sự năm 2018 [43]

Các acid amin trong khoang gắn kết MAO-B (Hình 1.4) gồm: Ile 199, Cys 172, Ile

198, Tyr 435, Tyr 60, Phe 343, Tyr 398, Tyr 326, Leu 171, Leu 167, Ile 316, Phe 168

và Gln 206 Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu cấu trúc phức hợp MAO-B và safinamid của Claudia Binda và các cộng sự năm 2007 [20] và nghiên cứu của Luigi

De Colibus và các cộng sự năm 2005 [23]

8

1.2.3 Các chất ức chế MAO-B

Từ những năm 1950, các chất ức chế MAO đã được thử nghiệm lâm sàng trị các bệnh

về thần kinh như trầm cảm, Parkinson nhưng đều thất bại vì hiện tượng gọi là “hội chứng pho mát” Chúng kích thích cả thần kinh giao cảm thông qua tác động gián tiếp vào các amin dẫn truyền thần kinh, trong đó quan trọng là tyramin (là cơ chất của MAO-A) Tyramin có nhiều trong pho mát và rượu đỏ, khi sử dụng thuốc cùng những thực phẩm này sẽ gây hiện tượng tăng huyết áp nghiêm trọng, đây được xem

là tác dụng phụ nguy hiểm nhất của các chất ức chế MAO, là rào cản các chất này trong sử dụng lâm sàng Theo các nghiên cứu, hội chứng pho mát liên quan đến sự

ức chế MAO-A hơn là MAO-B [13] đặc biệt là ức chế không thuận nghịch MAO-A gây ra mức độ tăng huyết áp nghiêm trọng nhất, đây cũng là lý do nhiều thuốc chống trầm cảm mặc dù tác dụng mạnh nhưng vẫn không vượt qua được thử nghiệm lâm sàng [14]

Hướng nghiên cứu thuốc ức chế MAO hiện nay là chọn lọc MAO-A hoặc MAO-B

để tránh hội chứng pho mát [7] Đây là cơ sở để các thuốc ức chế chọn MAO-B ra đời điều trị bệnh Parkinson như rasagilin và selegilin được FDA chấp thuận năm 2006 (với tên biệt dược là Azilet và Emsam) và mới nhất là safinamid được FDA chấp thuận năm 2017 (tên biệt dược là Xadago)

Hình 1.5 Cấu trúc rasagilin, selegilin và safinamid Những năm gần đây, các bài báo về các chất ức chế MAO-B liên tục được đăng tải, trong đó có nhiều chất có tác dụng ức chế chọn lọc trên MAO-B, các chất này từ các khung cấu trúc có thể kể đến như sau [24]:

« Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu »

1.2.4 Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học trên MAO-B

1.2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính với chất nền là p-tyramin

Enzym MAO-B người tái tổ hợp được lấy từ Sigma-Aldrich (0,0075 mg protein/ml)

Sử dụng 0,1 mL đệm phosphat nồng độ 0,05 mol/l, ở pH 7,4 Ủ hỗn hợp trong 15 phút ở nhiệt độ 37 oC Sau đó cho 200 µM thuốc thử Amplex Red (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazin), 1 U/ml horseradish peroxidase và 1 mM p-tyramin Phản ứng tạo thành H2O2, kết hợp với thuốc thử trong điều kiện phản ứng như trên sẽ tạo thành chất resorufin có khả năng phát huỳnh quang Đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích là 545 nm và bước sóng phát xạ là 590 nm [59]

1.2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính với chất nền là kynuramin

Enzym MAO-B người tái tổ hợp được lấy từ Sigma-Aldrich Pha loãng môi trường thực hiện phản ứng bằng đệm kali phosphat nồng độ 100 mmol/l ở pH 7,4 Phản ứng được thực hiện ở thể tích 500 µl kynuramin nồng độ 30 µM và chất đồng tan DMSO được sử dụng với nồng độ 4% (thể tích/thể tích) Thêm enzym vào, ủ trong 20 phút với nhiệt độ 37 oC Phản ứng kết thúc khi thêm vào 400 µl NaOH 2N Sau khi thêm

1000 µl nước đem ly tâm với tốc độ 16000 vòng trong 10 phút 4- hydroxyquinolin được tạo ra sẽ nổi lên trên bề mặt sẽ được đo huỳnh quang với bước sóng kích thích

là 310 nm, bước sóng phát xạ là 400 nm [25]

10

1.3 TỔNG QUAN VỀ CÁC CÔNG CỤ SÀNG LỌC ẢO

Sàng lọc ảo cơ sở dữ liệu đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực khám phá thuốc bởi

vì đây là phương pháp ít tốn chi phí và và đáng tin cậy trong xác định các thuốc tiềm năng Trong ngành công nghiệp dược phẩm, nơi đang chịu áp lực ngày càng tăng về việc đưa thuốc mới ra thị trường, sàng lọc ảo được xem như là một công cụ hỗ trợ đắc lực và nâng cao tỷ lệ thành công [26]

1.3.1 Mô hình Pharmacophore

Paul Ehrlich đưa ra định nghĩa đầu tiên về pharmacophore vào năm 1890 là một khung phân tử mang các đặc trưng thiết yếu chịu trách nhiệm cho hoạt tính sinh học Sau đó Peter Günd định nghĩa pharmacophore là tập hợp các đặc trưng cấu trúc phân

tử liên quan với gắn kết thụ thể và chịu trách nhiệm cho hoạt tính sinh học của phân

tử [26] Theo IUPAC định nghĩa năm 1997, một pharmacophore là tập hợp các đặc tính mang điện cũng như không mang điện cần thiết để để đảm bảo tối ưu các tương tác với mục tiêu tác động để cho tác dụng sinh lý [27]

Như vậy pharmacophore không phải là một phân tử, một nhóm chức hoặc một cấu trúc hóa học mà nó là một khá niệm trừu tượng Những nguyên tử, nhóm chức của mỗi phân tử có thể biểu thị thành các đặc tính cụ thể để tạo ra các điểm pharmacophore như điểm kỵ nước, điểm vòng thơm, điểm cho liên kết hydro, điểm nhận liên kết hydro, điểm điện tích Hiện nay có hai cách cơ bản để xây dựng mô hình pharmacophore, một là dựa trên cấu trúc mục tiêu tác động, hai là dựa trên cấu trúc ligand Việc xây dựng mô hình pharmacophore có hiệu quả hay không tuỳ thuộc vào mức độ đa dạng và chính xác của dữ liệu đầu vào

Pharmacophore là công cụ sàng lọc ảo hiệu quả và nhanh chóng, nó có thể sàng trên tập dữ liệu rất lớn gồm cả chục triệu chất và tiết kiệm thời gian tìm kiếm tổng thể các chất mới Đồng thời nếu chưa có cấu trúc mục tiêu tác động thì pharmacophore dựa trên ligand phát huy được tác dụng tìm kiếm các chất mới dựa trên các ligand ban đầu [28]

Tuy nhiên, mô hình pharmacophore cũng có hạn chế nhất định:

- Thứ nhất, chưa có sự thống nhất trong định nghĩa và vị trí chính xác của các thuộc tính giữa các nền tảng mô hình hóa và sàng lọc ảo như Catalyst, LigandScout, Molecular Operating Environment (MOE) và Schrodinger dẫn đến mức độ trùng lặp không cao trong các danh sách sàng lọc thu được [28]

- Thứ hai, để sử dụng mô hình pharmacophore thì các chất cần phải được chuẩn bị cấu dạng đầy đủ, nếu cơ sở dữ liệu dùng cho sàng lọc thiếu hụt cấu dạng thì khả năng

có thể có các chất tiềm năng không được phát hiện [27]

« Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu »

11

1.3.2 Mô hình 2D-QSAR

Việc những tính chất khác nhau có tác dụng sinh học khác nhau đã được biết từ rất lâu, bên cạnh đó khả năng xác định được cấu trúc đã cho phép người ta thành lập những mối quan hệ cấu trúc – tác dụng (SAR - Structure Activity Relationship), đây

là những quan sát đơn giản mà một thay đổi xác định trong cấu trúc phân tử ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của chất đó Và khi cấu trúc phân tử được thông số hóa thành các thông số mô tả định lượng thì ta có thể xây dựng mối tương quan định lượng giữa cấu trúc và tác dụng sinh học (QSAR - Quantitative Structure Activity Relationship) [29]

QSAR có khả năng dự đoán hoạt tính sinh học hoặc phân loại hoạt tính (mạnh hay yếu) dựa và các thông số mô tả phân tử Các thông số này được tính toán nhờ vào sự

hỗ trợ của các phần mềm như MOE và xây dựng mô hình QSAR bằng thuật toán bình phương tối thiểu từng phần (PLS), đây là thuật toán tìm sự liên quan giữa các biến độc lập xi (thông số mô tả)và biến phụ thuộc yj (giá trị hoạt tính sinh học) dưới công thức: yj = a + Ʃβjxi + ɛj với a là hệ số hồi quy của hệ số chặn, ɛj là một biến số theo luật phân phối chuẩn với trung bình bằng 0 và phương sai σ2 và βj là độ dốc ứng với biến độc lập xi [30]

- BQSAR (Binary – QSAR): đây là QSAR phân loại cho kết quả có hay không

So với pharmacophore thì mô hình QSAR chỉ áp dụng được tên tập chất nhỏ, không thể áp dụng trên tập chất quá lớn vì việc tính toán thông số mô tả cho nguyên tập chất lớn gặp nhiều khó khăn Vì vậy QSAR nên được sử dụng sau mô hình pharmacophore khi số lượng chất đã giảm bớt

1.3.3 Đánh giá ADMET

Hơn hai thập kỷ gần đây, việc đánh giá ADMET(hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính) các chất bằng công cụ máy tính là bước kết hợp quan trọng trong quá trình tìm kiếm thuốc mới, nó hạn chế việc tốn thời gian và tiền bạc cho việc đi thử nghiệm tiền lâm sàng không đạt vì tính chất dược động học kém và độc tính cao [31] Quá trình đánh giá ADMET các chất bao gồm 2 bước: thứ nhất, cần phải xây dựng

mô hình tương quan định lượng giữa cấu trúc và tính chất (QSPR - Quantitative

12

Structure – Property Relationship), mô hình này dùng để tìm ra ngưỡng ADMET mong muốn Thứ hai, dự đoán giá trị ADMET cho các chất bằng mô hình QPSR đã xây dựng [31]

Hiện nay đánh giá ADMET có thể thực hiện trên các trang web như SwissADME (http://www.swissadme.ch/index.php),vNN

(https://vnnadmet.bhsai.org/vnnadmet/login.xhtml) và bằng nhiều phần mềm trả phí (ADMET Predictor, ADMEWORKS, Schrodinger QikProp, ARChem SPARC) và miễn phí (Chem Prop, EPI SuiteTM , Lazar, ToxTree) [31]

Tóm lại, đánh giá ADMET là bước quan trọng và ngày càng được sử dụng thường xuyên trong sàng lọc ảo đặc biệt là các chất trước khi thử nghiệm tiền lâm sàng Nghiên cứu này sẽ sử dụng phần mềm ADMET Predictor 9.5 [75] do công ty Simulation-Plus (Mỹ) xây dựng để đánh giá ADMET

1.3.4 Mô hình mô tả phân tử docking

Trong trường hợp có sẵn cấu trúc ba chiều (3D) của thụ thể đích hoặc vị trí gắn kết của nó, docking là một kỹ thuật hiệu quả cao để sàng lọc ảo [32] Docking đánh giá khả năng gắn kết của ligand và mục tiêu tác động (thường là các protein) cũng như tìm ra cấu dạng gắn kết tối ưu nhất của ligand với mức năng lượng gắn kết tự do thấp nhất Có ba phương pháp docking là docking cứng (protein và ligand đều không được xét đến tính linh động), docking bán linh động (ligand linh động và protein cứng nhắc), docking linh động (cả protein và ligand đều linh động), trong đó phương pháp docking bán linh động là phổ biển hơn cả [33]

Docking có nhiều ứng dụng trong thiết kế thuốc hợp lý, nó là công cụ sàng lọc ảo trên các tập dữ liệu, nó giúp đánh giá sự gắn kết của ligand và mục tiêu tác động và

từ đó có thể tối ưu hóa chất khởi nguồn, đưa ra các giả thuyết về gắn kết để dự đoán cho các nghiên cứu về đột biến, hỗ trợ nghiên cứu cấu trúc tinh thể nhiễu xạ tia X của protein [34]

Trong nghiên cứu này, mô hình mô tả phân tử docking được tiến hành sau cùng nhằm tìm ra các chất gắn kết chọn lọc trên mục tiêu tác động là MAO-B

1.4 THƯ VIỆN CÁC CHẤT SÀNG LỌC ẢO

1.4.1 ZINC

ZINC là một cơ sở dữ liệu trong nghiên cứu tìm kiếm thuốc mới cho các mục tiêu sinh học Từ lúc mới được giới thiệu năm 2005 đến nay kích cỡ tập ZINC đã tăng lên rất nhiều lần Hiện nay ZINC15 là phiên bản mới nhất, nó chứa hơn 750 triệu chất và đặc biệt chứa hơn 230 triệu cấu dạng sẵn sàng cho việc docking [35] Đây là một ưu điểm rất lớn của ZINC làm giảm thiểu được thời gian chủng bị cấu dạng cho nhà

« Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu »

13

nghiên cứu Ngoài ra, ZINC cũng phát triển một công cụ hỗ trợ việc sàng lọc online

đó là ZINCPharmer (http://zincpharmer.csb.pitt.edu/) [36], do đó có thể sàng lọc nhanh chóng bằng mô hình pharmacophore mình đã chuẩn bị Ngoài những ưu điểm, ZINC cũng có hạn chế nhất định, đó là chưa thể tiếp cận tập ZINC15 mà chỉ có thể

tiếp cận tập con mới nhất hiện nay là ZINC Purchasable: Last update 12/2014, dựa

trên phiên bản ZINC12 với khoảng 22 triệu chất và hơn 200 triệu cấu dạng

1.4.2 DrugBank

DrugBank là một cơ sở dữ liệu miễn phí sử dụng trên web (www.drugbank.ca) [37],

nó bao gồm các thông tin chi tiết của các chất, mục tiêu tác động, cơ chế tác động và thông tin tương tác của chất Bao gồm cả các thuốc đã được FDA chấp thuận và các thuốc đang trong các giai đoạn thử nghiệm [38]

Phiên bản đầu tiên DrugBank 1.0 được giới thiệu vào năm 2006, lúc này nó chỉ có thông tin lý hóa đơn thuần của các thuốc được FDA chấp thuận và mục tiêu tác động của nó Đến năm 2008, DrugBank 2.0 có thêm thông tin về dược lý và thông tin các chất sinh học Tiếp đến DrugBank 3.0 (2010) thêm tương tác thuốc và tương tác thuốc với thức ăn và các thông tin dược động học DrugBank 4.0 (2014) thêm các dữ liệu chính xác về chuyển hóa, QSAR và ADMET của các chất Hiện tại phiên bản DrugBank 5.0 là phiên bản mới nhất chứa dữ liệu đầy đủ của 8.820 chất lớn hơn bất

kỳ phiên bàn nào trước đây [38]

1.4.3 Thư viện các chất có nguồn gốc từ dược liệu Traditional Chinese

Medicine (TCM) và Universal Natural Product Database (UNPD)

Tính đến năm 2020 có hơn 120 cơ sở dữ liệu khác nhau của các chất có nguồn gốc từ thiên nhiên [39] Những tập dữ liệu này được công bố và sử dụng từ năm 2000 cho đến nay, trong đó có những tập đã sát nhập với những tập lớn hơn ZINC Natural Products Nghiên cứu này sẽ sử dụng hai tập chất TCM và UNPD để tìm kiếm các chất ức chế chọn lọc MAO-B tiềm năng có nguồn gốc từ thiên nhiên [39]

TCM là tập cơ sở dữ liệu hơn 50 nghìn chất với nguồn gốc từ thảo dược, động vật và khoáng vật được phát triển bởi các nhóm nghiên cứu ở các trường đại học y Trung Quốc, trường đại học châu Á (Đài Loan) và viện nghiên cứu công nghệ Massachusetts (Mỹ) Đây là cơ sở dữ liệu miễn phí được tải từ web http://tcm.cmu.edu.tw/ [40] Trong khi đó, UNPD lớn hơn TCM 4 lần (khoảng 230 nghìn chất) được tải từ trang web http://pkuxxj.pku.edu.cn/UNPD [39]

14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mục đích của nghiên cứu này là tìm ra các chất ức chế chọn lọc MAO-B tiềm năng

từ các ngân hàng dữ liệu ZINC, DrugBank, TCM, và UNPD Với cơ sở dữ liệu rất lớn khoảng 22 triệu chất nên cần phải có sự kết hợp giữa các mô hình để sàng lọc

được các chất tốt nhất, từ đó tiếp tục cho các thử nghiệm in vitro và in vivo Sàng lọc

3D-pharmacophore sẽ được thực hiện đầu tiên, tiếp đến là sử dụng mô hình QSAR, đánh giá ADMET và cuối cùng là mô hình mô tả phân tử docking (Hình 2.6)

2D-Hình 2.6 Các bước tiến hành nghiên cứu

2.1 XÂY DỰNG MÔ HÌNH 3D-PHARMACOPHORE

Đề tài này sẽ xây dựng mô hình 3D-pharmacophore dựa trên cấu trúc protein và dựa trên ligand Sử dụng phần mềm LigandScout 4.3 [41]

2.1.1 Xử lý cơ sở dữ liệu

Cơ sở dữ liệu các chất ức chế MAO-B gồm 397 chất với nhiều khung cấu trúc khác nhau thu thập từ 24 bài báo khoa học được trình bày trong Bảng 2.1 Các chất này có hoạt tính sinh học dao động từ 0,045 đến 1730 µM được thử hoạt tính trên cùng enzym MAO-B tái tổ hợp ở người (Recombinant human MAO-B) bằng hai phương pháp là sử dụng chất nền p-tyramin và kynuramin (được trình bày ở Mục 1.2.4) Giá trị IC50 được quy đổi về cùng phương pháp sử dụng chất nền kynuramin với chất đối chiếu là rasagilin và iproniazid

TẬP DỮ LIỆU ZINC, DrugBank, TCM và UNPD

« Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu »

15

Theo Lesetja J Legoabe và cộng sự (2012) [44] các chất có IC50 = 0,048 µM cho hoạt tính ức chế mạnh và theo Belinda Strydom và cộng sự (2010) [45] các chất có

IC50 từ 0,23 đến 1,3 µM cho hoạt tính ức chế trung bình Vì vậy đề tài sẽ chọn giá

IC50 của rasagilin là 0,03 µM [46] nhân cho 50 lần là 1,5 µM làm ngưỡng để chia hoạt tính Những chất có IC50 nhỏ hơn 1,5 µM là những chất có hoạt tính tốt được xếp vào tập hoạt tính, còn lại những chất có IC50 lớn hơn hoặc bằng 1,5 µM là những chất có hoạt tính kém được xếp vào tập không hoạt tính

Các chất được vẽ bằng phần mềm Chemdraw 18.1 [47], lưu dạng file *.mol Sau đó đưa vào phần mềm MOE 2015.10 để tối thiểu hóa năng lượng với các thông số được cài đặt như sau:

« Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu »

17

2.1.2 Pharmacophore dựa trên cấu trúc MAO-B

Trên ngân hàng dữ liệu protein Protein Data Bank (PDB) [69] có hơn 20 cấu trúc phức phợp enzym MAO-B với chất ức chế Các cấu trúc này được chụp bằng phương pháp tia X và đều có độ phân giải tốt từ 1,6 đến 3Å Đề tài sẽ chọn phức hợp mã 2V5Z vì đây là phức hợp với chất ức chế safinamid, đây là chất ức chế chọn lọc và thuận nghịch trên MAO-B đã được FDA chấp nhận trong điều trị bệnh Parkinson (2017) Safinamid có hoạt tính sinh học mạnh (IC50 = 0,024 µM) và chọn MAO-B lên đến 2.084 lần so với MAO-A [70]

Trên phần mềm LigandScout 4.3 tải protein lên tại cửa sổ ‘Structure-based’ nhấn chọn ligand đồng kết tinh là safinamid rồi sau đó chọn ‘Create Pharmacophore’ Phần mềm sẽ tạo ra mô hình pharmacophore tự động Tiến hành chọn, thay đổi các điểm pharmacophore theo các điểm tương tác acid amin quan trọng rồi chuyển lần lượt các

mô hình này qua tab ‘Screening’ để tiến hành đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tỷ suất hoạt tính, độ đúng và điểm số GH

2.1.3 Pharmacophore dựa trên ligand

Từ tập hoạt tính chọn ra 4 chất có hoạt tính sinh học tốt đồng thời có chỉ số chọn lọc MAO-B cao từ 4 khung cấu trúc khác nhau bao gồm khung indol, khung aryloxy, khung coumarin và khung chalcon để làm tập xây dựng Các chất được biểu diễn ở Bảng 2.2

18

Bảng 2.2 Tập xây dựng của mô hình 3D-pharmacophore

Hệ số chọn lọc MAO-B

so với MAO-A

Trích dẫn

Tại cửa sổ ‘Ligand-based’ chọn Ligand-Set/Add Molecules/To Training-Set, nhập tập

xây dựng vào phần mềm Chọn ‘Generate Conformations for Ligand-Set’ để chạy cấu dạng các chất

Tạo mô hình 3D-pharmacophore bằng cách ấn vào ‘Create Ligand-Based Pharmacophore’, chọn các thông số cài đặt như sau:

- Pharmacophore type: Shared feature pharmacophore

- Max number of result pharmacophores: 200

« Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu »

19

Phần mềm sẽ tạo ra 200 mô hình pharmacophore, nghiên cứu sẽ loại các mô hình trùng và chọn các mô hình còn lại chuyển qua tab ‘Screening’ để đánh giá độ nhạy,

độ đặc hiệu, tỷ suất hoạt tính, độ đúng và điểm số GH

2.1.4 Đánh giá mô hình 3D-pharmacophore

Sử dụng tập hoạt tính và tập không hoạt tính đã chuẩn bị ở bước xử lý cơ sở dữ liệu

để đánh giá mô hình pharmacophore Các thông số đánh giá bao gồm [71]:

- Độ nhạy (Se): tỷ lệ các chất dương tính thật (TP) trong tập hoạt tính, biểu thị bằng công thức (1):

𝑆𝑒 = 𝑇𝑃𝑇𝑃+𝐹𝑁 (1)

TP (True-Positive): số chất có hoạt tính, thỏa mô hình

FN (False-Negative): số chất có hoạt tính, không thỏa mô hình

TP+FN: tổng số chất có hoạt tính

- Độ đặc hiệu (Sp): tỷ lệ các chất âm tính thật (TN) trong tập không hoạt tính, biểu thị bằng công thức (2):

𝑆𝑝 = 𝑇𝑁𝐹𝑃+𝑇𝑁 (2)

TN (True-Negative): số chất không hoạt tính, không thỏa mô hình

FP (False-Positive): số chất không hoạt tính, thỏa mô hình

FP+TN: tổng số chất trong tập không hoạt tính

- Tỷ xuất hoạt tính (Ya): tỷ lệ các chất dương tính thật (TP) trên tổng số các chất thỏa

mô hình (TP+FP) khi sàng lọc qua mô hình, biểu thị bằng công thức (3):

𝑌𝑎 = 𝑇𝑃𝑇𝑃+𝐹𝑃 (3)

- Độ đúng (Acc): khả năng mô hình dự đoán đúng chất có hoạt tính và không hoạt tính, biểu thị bằng công thức (4):

𝐴𝑐𝑐 =𝑇𝑃+𝑇𝑁

𝑁 (4) N: tổng số chất của tập hoạt tính và không hoạt tính

- Điểm số GH (5): đánh giá năng lực phân biệt của mô hình, điểm GH kết hợp độ nhạy, độ đặc hiệu và tỷ suất hoạt tính Điểm GH cao có nghĩa tỷ lệ dương tính thật

và tỷ lệ âm tính thật đồng thời cao Giá trị GH dao động từ 0 đến 1 Giá trị GH trên 0,7 cho thấy mô hình có khả năng dự đoán tốt

20

𝐺𝐻 = (3

4 × 𝑌𝑎 +1

4× 𝑆𝑒) × 𝑆𝑝 (5) Trong ba thông số độ nhạy, độ đặc hiệu và tỷ suất hoạt tính thì giá trị tỷ suất hoạt tính

là quan trọng nhất, giá trị này càng cao cho thấy mô hình có khả năng sàng lọc tốt, hạn chế tối đa số chất âm tính giả lọt qua mô hình Đề tài sẽ kết hợp thông số Ya và

GH làm hai thông số trọng yếu để đánh giá mô hình

Mô hình 3D-pharmacophore tốt nhất sẽ được lưu dưới dạng file *.pml và được dùng

để sàng lọc trên các tập ZINC, DrugBank, TCM và UNPD

2.1.5 Ứng dụng mô hình 3D-pharmacophore trong sàng lọc

Tập ZINC gần 22 triệu chất nên không thể tạo cấu dạng năng lượng thấp để sàng lọc pharmacophore trên phần mềm LigandScout, vì vậy công cụ sàng lọc trực tuyến ZINCPharmer được sử dụng Tại trang web http://zincpharmer.csb.pitt.edu/ mô hình pharmacophore sẽ được tải lên Thiết lập trong ‘Filters’ như sau:

- Max hits per Mol: 1

- Subset selection: ZINC Purchasable: Last updated 12/20/14

Chọn ‘Submit Query’ để sàng lọc, khi hoàn tất tải kết quả về dưới dạng file *.sdf Kết quả sàng lọc sẽ được mở trên MOE 2015.10 và chọn các chất thỏa định luật 5 Lipinski tại mục ‘Select Entries/Druglike’ Cuối cùng lưu kết quả để tiến hành bước tiếp theo Các tập DrugBank, TCM và UNPD với số lượng chất ít hơn nhiều so với ZINC nên được chuẩn bị cấu dạng năng lượng thấp bằng phần mềm LigandScout 4.3, tiến hành như mục 2.1.1 Sau khi đã tải lên mô hình pharmacophore và cấu dạng tập chất, chọn

‘Perform Screening’ để tiến hành sàng lọc Kết quả sàng lọc sẽ được xuất file *.sdf

« Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu »

21

2.2 MÔ HÌNH 2D-QSAR

Mô hình 2D-QSAR được xây dựng theo sơ đồ tóm tắt ở Hình 2.7

Hình 2.7 Sơ đồ các bước xây dựng mô hình 2D-QSAR

Chuẩn bị cơ

sở dữ liệu

Loại nhiễu

Lựa chọn thông số mô

tả

Đánh giá mô hình

Xây dựng

mô hình 2D-QSAR

22

2.2.1 Chuẩn bị cơ sở dữ liệu

Từ cơ sở dữ liệu 397 chất dùng để đánh giá mô hình 3D-pharmacophore, đề tài chọn

ra 107 chất từ các khung cấu trúc khác nhau (Phụ lục 1), có giá trị IC50 xác định và được thử hoạt tính bằng cùng phương pháp sử dụng chất nền kynuramin Các chất có

IC50 dạo động lớn từ 1,4 nM đến 131 µM nên được quy đổi về pIC50 = -log(IC50) để phù hợp cho việc xây dựng phương trình 2D-QSAR Cấu trúc hóa học được vẽ bằng phần mềm Chemdraw 18.1 và chuyển vào phần mềm MOE 2015.10 để tối thiếu hóa năng lượng và tính toán thông số mô tả 2D

Tối thiểu hóa năng lượng bằng cách chọn Compute/Molecule/Energy Minimize với

thiết lập thông số như sau:

- Force field: MMFF94

- Gradient: 0,0001 Kcal/mol

Sau đó tiến hành tính toán thông số mô tả 2D theo đường dẫn Compute/ Descriptors/

Calculate, tại mục Class chọn tab 2D rồi chọn tất cả các thông số mô tả 2D

2.2.2 Lựa chọn thông số mô tả

Phần mềm MOE 2015.10 tạo 206 thông số mô tả, trong đó có nhiều thông số không

ý nghĩa và các thông số có tương quan cao với nhau khiến mô hình tốt giả tạo, vì vậy cần loại bỏ thông số mô tả đó qua các bước sau:

- Loại các thông số có ≥ 20% giá trị 0 bằng phần mềm Excel 365

- Các nhóm thông số có độ tương quan cao với nhau ≥ 0,9 được loại đi và chỉ giữ lại

1 thông số ngẫu nhiên bằng phần mềm RapidMiner Studio 9.7 [72]

- Chia tỷ lệ thông số mô tả: đây là bước quan trọng trước khi xây dựng phương trình 2D-QSAR Việc chia thông số mô tả để tránh sự ảnh hưởng của các thông số có giá trị lớn đối với các thông số có giá trị nhỏ và giảm bớt khó khăn cho việc tính toán Trong nghiên cứu này, các thông số mô tả được chia bằng công cụ ‘Normalize’ trong

phần mềm Rapidminer 9.7 với thuật toán range transformation, cài đặt min = 0 và

max = 1

- Cuối cùng tìm kiếm các thông số mô tả tốt nhất có tương quan cao với giá trị pIC50

bằng phương pháp tìm kiếm BestFirst với thuật toán CfsSubsetEval trong phần mềm

Weka 3.8.4 [73]

2.2.3 Loại các chất gây nhiễu bằng Z-score

Đây là phương pháp loại nhiễu dựa trên độ lệch của giá trị hoạt tính dự đoán so với giá trị hoạt tính trung bình của toàn tập dữ liệu xây dựng phương trình 2D-QSAR Z-

« Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu »

23

score lớn cho thấy khả năng cao chất đó nằm ngoài đường thẳng tuyến tính QSAR Đề tài tiến hành loại các chất có Z-score ≥ 2 khi tiến hành xây dựng mô hình [74]

2D-Z − Score = pIC50− pIC̅̅̅̅̅̅̅50

Độ lệch chuẩn

2.2.4 Xây dựng mô hình

Công cụ QSAR-Model trong phần mềm MOE 2015.10 để xây dựng mô hình với

phương pháp PLS (thuật toán bình phương tối thiểu từng phần) Chọn các thông số

mô tả tốt nhất sau khi qua Weka 3.8.4 Nhấn ‘Fit’ để thực hiện phân tích hồi quy, giá

trị R2 và RMSE sẽ xuất hiện ở mục trạng thái ‘status’ Phương trình hồi quy sẽ được ghi nhận bằng lệnh ‘Report’ trong cửa sổ ‘QSAR-model’ Phương trình hồi quy có

dạng y = a0 + aixi thể hiện mối liên quan định lượng giữa cấu trúc (thông số mô tả)

và tác dụng sinh học, bấm ‘Save’ để lưu phương trình dưới dạng *.fit, phương trình

này sẽ được ứng dụng để dự đoán hoạt tính sinh học của các chất cần nghiên cứu

2.2.5 Phân chia tập cơ sở dữ liệu

Tập dữ liệu 107 chất được chia ngẫu nhiên theo tỷ lệ 80% chất làm tập xây dựng và 20% chất làm tập kiểm trả (dùng để đánh giá mô hình) bằng cách sử dụng hàm RAND

trên MOE 2015.10 theo đường dẫn Compute/ Calculator/ RAND Tiến hành phân

chia 5 lần, mỗi lần được tiến hành độc lập để đảm bảo kết quả đánh giá được khách quan

2.2.6 Đánh giá mô hình

Mô hình 2D-QSAR được cho là có khả năng dự đoàn tốt khi giá trị dự đoán và giá trị thực nghiệm gần nhau Điểu đó thể hiện qua bình phương hệ số tương quan R2 và căn của tổng bình phương phần dư RMSE của tập xây dựng mô hình Các đánh giá mô hình 2D-QSAR như sau:

- Đánh giá nội LOO trên tập xây dựng đạt Q2>0,5 và RMSE<0,5

- Đánh giá ngoại LOO trên tập kiểm tra đạt R2pred>0,5

- Đánh giá Roy trên cả tập xây dựng và tập kiểm tra đạt 𝑟̅̅̅ > 0,5 và ∆𝑟𝑚2 𝑚2 < 0,2

2.2.6.1 Đánh giá nội

Đánh giá nội là sử dụng mô hình trên tập xây dựng để đánh giá trên chính tập đó Nghiên cứu áp dụng phương pháp đánh giá chéo LOO để đánh giá nội, nó được tiến hành đồng thời khi xây dựng mô hình 2D-QSAR Tại cửa sổ QSAR-Model trong

24

MOE 2015.10 chọn ‘Validate’ giá trị Q2 (XR2) và RMSE (XRMSE) của đánh giá

nội sẽ được tự động tính toán và hiển thị, công thức tính Q2 và RMSE như sau:

𝑄2 = 1 −∑ (𝑦𝑛 𝑒𝑖 − 𝑦𝑣𝑖)2

𝑖

∑ (𝑦𝑛 𝑒𝑖 − 𝑦̅ )𝑒 2 𝑖

𝑅𝑀𝑆𝐸 = √1

𝑛× ∑(𝑦𝑒𝑖 − 𝑦𝑣𝑖)2𝑛

𝑖Trong đó:

- 𝑦𝑒 là giá trị hoạt tính pIC50 thực nghiệm trên tập xây dựng

- 𝑦𝑣 là giá trị pIC50 dự đoán được tính từ đánh giá chéo LOO trên tập xây dựng (tương ứng với cột $XPRED trong MOE)

- 𝑦̅ là giá trị trung bình của pIC𝑒 50 thực nghiệm trên tập xây dựng

2.2.6.2 Đánh giá ngoại

Đánh giá ngoại là sử dụng mô hình trên tập xây dựng để đánh giá khả năng dự đoán trên tập kiểm tra Trong đánh giá ngoại, kết quả được thể hiện qua giá trị 𝑅𝑝𝑟𝑒𝑑2 được tính theo công thức:

𝑅𝑝𝑟𝑒𝑑2 = 1 −∑ (𝑦𝑛𝑖 𝑝(𝑡𝑒𝑠𝑡)𝑖− 𝑦𝑒(𝑡𝑒𝑠𝑡)𝑖)2

∑ (𝑦𝑛𝑖 𝑒(𝑡𝑒𝑠𝑡)𝑖− 𝑦̅ )𝑒 2Trong đó:

- 𝑦𝑒(𝑡𝑒𝑠𝑡) là giá trị pIC50 thực nghiệm trên tập kiểm tra

- 𝑦𝑝(𝑡𝑒𝑠𝑡) là giá trị pIC50 dự đoán trên tập kiểm tra (tương ứng với cột $PRED trong MOE)

- 𝑦̅ là giá trị trung bình của pIC𝑒 50 thực nghiệm trên tập xây dựng

2.2.6.3 Đánh giá Roy

Giá trị Q2 và R2pred thay đổi lớn giữa các lần xây dựng (khi lựa chọn tập train/test khác nhau) và giá trị 𝑦̅ được sử dụng để tính dẫn đến đánh giá sai nếu tập dữ liệu có 𝑒khoảng giá trị lớn Do đó, Roy và cộng sự đề xuất sử dụng các giá trị dự đoán mới là

𝑟𝑚2, 𝑟𝑚′2, 𝑟̅̅̅ và ∆𝑟𝑚2 𝑚2 được tính toán dựa trên mối tương quan giữa các giá trị hệ số tương quan 𝑟2 và 𝑟02

« Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu »

0 là bình phương hệ số tương quan khi hệ số chặn bằng 0:

2.2.7 Ứng dụng mô hình 2D-QSAR trong sàng lọc

Các chất từ các tập ZINC, DrugBank, TCM và UNPD sau khi qua mô hình pharmacophore được tính toán thông số mô tả bằng MOE 2015.10 theo đường dẫn

3D-Compute/Descriptors/Calculate , tại tab 2D chọn các thông số mô tả đã lựa chọn ở

mục 2.2.2

Chọn các chất trong miền ứng dụng của mô hình 2D-QSAR, các chất này sẽ được tính toán giá trị hoạt tính dự đoán (pIC50) Đề tài sử dụng giá trị pIC50 = 5,82 (đây là ngưỡng phân chia tập hoạt tính và không hoạt tính của mô hình 3D-QSAR) làm ngưỡng sàng lọc Các chất có giá trị pIC50 dự đoán ≥ 5,82 sẽ được chọn để đi sàng lọc ADMET

2.3 SÀNG LỌC ADMET

Quá trình nghiên cứu và phát triển dược phẩm có rủi ro cao về tài chính và tốn rất nhiều thời gian do việc thử nghiệm sinh khả dụng không đạt về các yếu tố hấp thu phân bố chuyển hóa thải trừ và độc tính của dược chất (gọi chung là ADMET) Vì vậy việc đánh giá ADMET này cần phải được thực hiện ở giai đoạn đầu để hạn chế rủi ro thất bại Bởi vì, phần lớn các thử nghiệm không thành công vì vấn đề ADMET hơn là vì hiệu quả trị liệu không đạt

Việc sử dụng công cụ máy tính để đánh giá ADMET thay vì sử dụng các thử nghiệm trên thú sẽ giảm thiểu chi phí, công sức và thời gian Và hiện nay có nhiều công cụ đánh giá ADMET nhưng trong đề tài này sử dụng phần mềm ADMET Predictor 9.5 (đây là phiên bản mới nhất) của công ty Simulation Plus (Mỹ) để tiến hành đánh giá Phần mềm ra đời từ năm 1999 được các công ty dược lớn trên thế giới và có sự cộng tác của FDA để xây dựng mô hình dự đoán ADMET hiệu quả [75]

26

Dữ liệu đầu vào của phần mềm là file *.sdf các chất sau khi sàng lọc bằng mô hình

2D-QSAR Tính toán các thông số ADMET theo đường dẫn Data/Calculate ADMET

properties Các thông số thiết lập như sau:

- Properties to calculate: chọn tất cả các mô mình ADMET

- Bỏ chọn 3D, chỉ sử dụng cấu trúc 2D

- pH: 7,4

Chọn ‘Calculate’ để tiến hành tính Trong bảng kết quả chọn thanh ‘Risk’, lưu kết quả dưới dạng file *.csv và chuyển qua Excel 365 để phân tích

Nghiên cứu sẽ chọn ra các cấu trúc có giá trị rủi ro nhỏ hơn ngưỡng tham chiếu được

để nghị bởi ADMET Predictor 9.5 trong Bảng 2.3

Bảng 2.3 Giá trị ngưỡng của các rủi ro được đề nghị bởi ADMET Predictor 9.5 [75]

Các ngưỡng rủi ro được thiết lập để dự đoán khả năng một chất có thành công trong các thử nghiệm sinh khả dụng đường uống hay không Bằng cách sử dụng 1 tập con gồm 2.316 chất từ World Drug Index (WDI), người ta đặt ra 1 ngưỡng mà tại ngưỡng

đó khoảng 85% chất trong tập đạt các thử nghiệm và dưới 10% các chất không đạt các thử nghiệm sinh khả dụng đường uống Đó là cách xây dựng ngưỡng rủi ro hấp thu, rủi ro chuyển hóa và rủi ro tổng Riêng đối với rủi ro độc tính, người ta thiết lập một mức chặt chẽ hơn đó là tại ngưỡng rủi ro có ít hơn 6% các chất trong tập không đạt các thử nghiệm độc tính [75]

2.4 MÔ HÌNH MÔ TẢ PHÂN TỬ DOCKING

Để chọn ra các chất có tác động ức chế chọn lọc MAO-B, đề tài tiến hành xây dựng

mô hình docking theo các bước sau:

- Bước 1: xây dựng mô hình mô tả phân tử docking của MAO-B, tiến hành sàng lọc

- Bước 2: xây dựng mô hình mô tả phân tử docking của MAO-A, tiến hành docking các chất thỏa mô hình docking MAO-B

- Bước 3: đánh giá, chọn các chất gắn chọn lọc trên MAO-B

Phần mềm LeadIT 2.1.8 [76] được sử dụng để docking, cùng sự hỗ trợ của các phần mềm MOE 2015.10 và SyByl-X 2.0 [52]

Rủi ro tổng

ADMET

Rủi ro hấp thu ADMET

Rủi ro huyển hóa ADMET

Rủi ro độc tính ADMET

« Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu »

27

2.4.1 Xây dựng mô hình mô tả phân tử docking MAO-B

Các bước xây dựng mô hình docking MAO-B được tiến hành theo Hình 2.8

Hình 2.8 Các bước tiến hành xây dựng mô hình mô tả docking MAO-B

2.4.1.1 Chuẩn bị protein

Khoang gắn kết được chuẩn bị từ phức hợp MAO-B và safinamid được tải từ PDB với mã 2V5Z Trong MOE, sử dụng công cụ ‘Sequence Editor’ để loại bỏ chuỗi acid amin B và ligand đồng kết tinh, giữ lại co-factor FAD và các phân tử nước Việc giữ lại các phân tử nước là quan trọng bởi vì trong khoang gắn kết của MAO-B có các phân tử nước tạo được các liên kết với ligand, các phân tử nước không quan trọng sẽ được loại bỏ trên phần mềm LeadIT

Tiến hành sửa chữa cấu trúc, proton hóa cấu trúc, tính điện tích riêng phần, tối ưu hóa hình học và tối thiểu hóa năng lượng bằng công cụ ‘Quickprep’ với thiếp lập như sau:

- Cố định (Tether – Receptor): Strength: 5.000

- Refine: 0,0001 Kcal/mol/Å

- Các thông số khác để như mặc định

Lưu file dưới dạng *.pdb và đưa vào phần mềm LeadIT để xác định khoang gắn kết

2.4.1.2 Xác định khoang gắn kết

Trên phần mềm LeadIT, đưa protein vừa chuẩn bị vào theo đường dẫn Molecules/

Prepare Receptor Bước ‘Choose Receptor Components’ chọn thêm co-factor là

FAD Đến bước “Define Bindind Site’, chọn ‘Reference Ligand’ sau đó tải ligand đồng kết tinh được tách ra từ phức hợp lên, phần mềm sẽ tự động chọn các acid amin quan trọng và khoang gắn kết và bán kính khoang đề nghị là 6.5Å

Bấm ‘next’ đến khi phần mềm tạo xong khoang gắn kết, lưu dưới dạng *.fxx để tiến hành redocking và docking

- Đánh giá RMSD

và điểm số docking

Chọn các chất có điểm số docking tốt nhất và phân tích tương tác acid amin

Docking tập chất sau khi qua các công cụ sàng lọc bằng LeadIT 2.1.8

28

2.4.1.3 Chuẩn bị ligand

Ligand đồng kết tinh trong phức hợp là safinamid được tối thiếu hóa năng lượng 3 bước bằng SyByl-X 2.0

- Bước 1: tối thiểu hóa năng lượng lần 1, chọn Compute/Minimize/Molecules, thiết

lập thông số như sau:

+ Method: Conj Grad

+ Termination: Energy Change = 0,0001 Kcal/mol

+ Max Iterations: 10.000

+ Modify/Charge: Gasteiger-Huckel

- Bước 2: chạy động học phân tử chọn Compute/Dynamics/Setup Smilated

Annealing, chọn Run = 5 và nhấn OK

- Bước 3: tối thiếu hóa năng lượng lần 2 giống như bước 1, lưu lại file *.mol2 Các chất trong tập ZINC sau khi sàng lọc qua mô hình 3D-Pharmacophore, 2D-QSAR và ADMET được chọn top để docking, cấu dạng các chất này được tải từ trang web http://zinc15.docking.org thông qua ZINCID Các cấu dạng này đã được chuẩn

bị sẵn cho việc docking nên không cần qua ba bước tối thiểu hóa năng lượng như trên

Các chất trong tập DrugBank, TCM và UNPD sau khi sàng qua mô hình pharmacophore, 2D-QSAR và ADMET được tối thiểu hóa năng lượng 3 bước trong SyByl

3D-2.4.1.4 Redocking và đánh giá kết quả

Để đánh giá sự phù hợp của mô hình docking, nghiên cứu tiến hành redocking ligand đồng kết tinh safinamid vào khoang gắn kết đã được chuẩn bị bằng phần mềm LeadIT với các thiết lập như sau:

- Chọn LeadIT/Open Project: tải lên khoang gắn kết vừa tạo được

- Chọn Docking/Define FlexX Docking

- Tại mục ‘General Docking Information/Docking library’ tải lên phối tử

- ‘Docking Details’ chọn:

+ Số bước lặp tối đa ‘Maximum Number of Solutions per Iteration’: 1.000

+ Số lần phân mảnh ‘Maximum Number of Solutions per Fragmentation’: 200

- Số lượng cấu dạng liên kết giữ lại ‘Number of Poses to Keep’: Top 10

« Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu »

29

- Chọn ‘Apply & Dock!’

10 cấu dạng có điểm số docking tốt nhất sẽ được giữ lại, đánh giá điểm số docking, tương tác acid amin và giá trị RMSD (Căn bậc hai của bình phương độ lệch trung bình của cấu dạng ligand sau docking so với cấu dạng có sẵn trong cấu trúc tinh thể) Giá trị RMSD ≤ 2Å thì mô hình docking mới đáng tin cậy [53]

Đồng thời nghiên cứu cũng tiến hành docking cấu trúc 2D đã tối thiểu hóa năng lượng của rasagilin vào khoang gắn kết MAO-B Điểm số docking của hai quá trình này sẽ được đánh giá và sử dụng để làm ngưỡng cho việc sàng lọc

2.4.1.5 Docking

Trên phần mềm LeadIT, tải file *.fxx của khoang gắn kết lên Tiếp đến tải thư viện các chất cần docking lên (các chất sau khi qua mô hình ADMET) Thiết lập các thông

số như sau:

- Số bước lặp tối đa ‘Maximum Number of Solutions per Iteration’: 1.000

- Số lần phân mảnh ‘Maximum Number of Solutions per Fragmentation’: 200

- Số lượng cấu dạng liên kết giữ lại ‘Number of Poses to Keep’: Top 1

Chọn ‘Apply and Dock!’ để bắt đầu docking

Sau khi docking xong, chọn Dock/Export Poses để lưu kết quả docking dưới dạng

file *.sdf có chứa điểm số docking Phân tích kết quả docking trên phần mềm MOE

2.4.2 Xây dựng mô hình mô tả phân tử docking MAO-A

Trên PDB có 4 cấu trúc tinh thể của MAO-A người với chất ức chế là harmin và clorgylin có mã 2Z5X, 2Z5Y, 2BXS VÀ 2BXR Trong đó phức hợp mã 2Z5Y có độ phân giải thấp nhất là 2,17Å nên đề tài sẽ chọn phức hợp này để đi redocking và đánh giá kết quả Các bước xây dựng mô hình mô tả phân tử docking MAO-A làm tương

tự như MAO-B

2.4.2.1 Chuẩn bị protein, ligand, redocking và đánh giá kết quả

Protein mã 2Z5Y được tải về từ PDB, dưới dạng file *.pdb được đưa vào phần mềm MOE để loại bỏ chuỗi acid amin B, loại bỏ ligand đồng kết tinh và xử lý qua công cụ

‘Quickprep’ tương tự như khi xử lý MAO-B Khoang gắn kết MAO-A được lưu file

*.fxx

Ligand đồng kết tinh tách ra từ phức hợp là harmin được tối thiểu hóa năng lượng ba bước trên SyByl-X 2.0 như mục 2.4.1.3 File *.mol2 được xuất ra để chuẩn bị cho việc redocking

30

Trong phần mềm LeadIT, tải khoang gắn kết và ligand đồng kết tinh đã chuẩn bị lên Cài đặt như sau:

- ‘Docking Details’:

+ Số bước lặp tối đa ‘Maximum Number of Solutions per Iteration’: 1.000

+ Số lần phân mảnh ‘Maximum Number of Solutions per Fragmentation’: 200

- Số lượng cấu dạng liên kết giữ lại ‘Number of Poses to Keep’: Top 10

- Chọn ‘Apply & Dock!’

10 pose có điểm số docking tốt nhất sẽ được giữ lại, đánh giá RMSD để xem tính tin cậy của mô hình docking

2.4.2.2 Docking

Các chất từ các tập ZINC, DrugBank, TCM và UNPD sau khi qua được mô hình docking MAO-B sẽ được sàng lọc tiếp tục trên mô hình docking MAO-A Các chất dock không thành công và dock thành công với điểm số docking kém sẽ là những chất gắn chọn lọc trên MAO-B tiềm năng