XÂY DỰNG các mô HÌNH SÀNG lọc ảo CHẤT CHỦ vận THỤ THỂ APELIN

Đề tài “Xây dựng các mô hình sàng lọc ảo chất chủ vận thụ thể apelin” được thực hiện với mục tiêu tổng quát là tìm kiếm các cấu trúc phân tử nhỏ mới và có tác dụng chủ vận mạnh trên thụ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGÔ THỊ HẰNG

XÂY DỰNG CÁC MÔ HÌNH SÀNG LỌC ẢO

CHẤT CHỦ VẬN THỤ THỂ APELIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Giảng viên hướng dẫn: ThS Mai Thành Tấn

PGS TS Huỳnh Thị Ngọc Phương

TP Hồ Chí Minh – 2020

TP Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 08 năm 2020

GIẤY XÁC NHẬN ĐÃ BỔ SUNG, SỬA CHỮA KHÓA LUẬN

THEO Ý KIẾN ĐÓNG GÓP CỦA HỘI ĐỒNG

Tên đề tài: Xây dựng các mô hình sàng lọc ảo chất chủ vận thụ thể apelin

Họ và tên sinh viên: Ngô Thị Hằng

Lớp : Dược chính quy 2015 Mã số sinh viên : 511156062

Giảng viên hướng dẫn: ThS Mai Thành Tấn

PGS TS Huỳnh Thị Ngọc Phương Khóa luận đã được bổ sung, sửa chữa các nội dung sau:

1 Bản đồ tự tổ chức của tập huấn luyện

2 Lỗi chính tả

Giảng viên hướng dẫn Giảng viên phản biện Chủ tịch hội đồng

XÂY DỰNG MÔ HÌNH SÀNG LỌC ẢO CHẤT CHỦ VẬN THỤ THỂ APELIN Sinh viên thực hiện: Ngô Thị Hằng Giảng viên hướng dẫn: ThS Mai Thành Tấn; PGS TS Huỳnh Thị Ngọc Phương Đặt vấn đề

Apelin là một phối tử peptid nội sinh của thụ thể apelin, thuộc họ thụ thể bắt cặp protein (GPCR) Các tác dụng có lợi của apelin đối với các bệnh lý tim mạch và bệnh chuyển hóa đã được chứng minh trên các mô hình động vật và các nghiên cứu lâm sàn Đề tài được thực hiện với mục tiêu là tìm kiếm các cấu trúc phân tử nhỏ mới và

G-có tác dụng chủ vận mạnh trên thụ thể này

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng của nghiên cứu là cơ sở dữ liệu của các phân tử nhỏ chủ vận thụ thể apelin

đã được công bố tại hai bằng sáng chế US9156796 và WO2017100558A1; cấu trúc tinh thể của thụ thể apelin được tải từ Ngân hàng dữ liệu protein (PDB ID: 5VBL); các thư viện ZINC12 và Maybridge Screening and Fragments Collection

Các phương pháp nghiên cứu được ứng dụng bao gồm 3D-pharmacophore, QSAR, docking phân tử và mô phỏng động lực học phân tử

2D-Kết quả và bàn luận

Đề tài thu thập được 689 chất thuộc hai bằng sáng chế để làm cơ sở dữ liệu xây dựng các mô hình Trong ba mô hình 3D-pharmacophore 5 điểm xây dựng được, mô hình

Ph003 là mô hình tốt nhất và đã thể hiện hiệu năng tốt trong quá trình sàng lọc ảo

Mô hình QSAR-2 theo phương pháp CPG-NN với kết quả đánh giá tương đối tốt,

ứng dụng trong dự đoán tác dụng sinh học của các chất Một mô hình docking phân

tử cũng đã được xây dựng để đánh giá khả năng gắn kết của chất trên thụ thể apelin

Ứng dụng sàng lọc ảo và đánh giá ADMET các chất sàng lọc được, kết quả chọn được 8 chất tiêu biểu có tiềm năng chủ vận thụ thể apelin Trong đó, hai chất tiềm năng từ quá trình sàng lọc ảo được mô phỏng động học 10 ns, để khảo sát khả năng gắn kết của các chất này

Kết luận và đề nghị

Các mô hình insilico đã được xây dựng và ứng dụng thành công để sàng lọc các chất

có tiềm năng chủ vận thụ thể apelin Các kết quả sàng lọc chất tiềm năng cần được

tiến hành các thử nghiệm invitro để tìm ra các chất có hoạt tính thực sự.

IN SILICO MODELS FOR VIRTUAL SCREENING OF

APELIN RECEPTOR AGONIST

Student: Ngo Thi Hang Supervisor: Mai Thanh Tan, MSc.; Huynh Thi Ngoc Phuong, Assoc Prof PhD Introduction

Apelin is a peptide known as the ligand of the G-protein-couple receptor apelin The beneficial effects of apelin on cardiovascular and metabolic diseases have been demonstrated in animal models and clinical studies The aim of this study was finding novel and strong small molecular agonist for apelin receptor

Materials and Methods

The objects of this study included the database of small molecular apelin receptor agonists had been published in two patents US9156796 and WO2017100558A1; the crystal structure of apelin receptor downloaded from the Protein Data Bank (PDB ID: 5VBL); the ZINC12 database and the Maybridge Screening and Fragments Collection The methods were used included 3D-pharmacophore, 2D-QSAR, molecular docking and molecular dynamics simulations

Results

689 apelin receptor agonist compounds were collected from two patents and used as

a database to build the models Among the obtained 5-points 3D-pharmacophore

models, the Ph003 model was the best model and had good performance during the virtual screening The QSAR-2 model built with CPG-NN method had good

assessment results and was applied to predict the agonist effects of new compounds

A molecular docking model has also been constructed to evaluate the binding on apelin receptors of the agonist compounds

Applying the virtual screening models and ADMET assessment, 8 potential agonists

of apelin receptor were selected Two potential compounds from virtual screening were molecular dynamics simulated in 10 ns to further investigate the binding capacity

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ v

LỜI CẢM ƠN vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ APELIN 3

1.2 ĐƯỜNG TRUYỀN TÍN HIỆU CỦA THỤ THỂ APELIN 5

1.3 VAI TRÒ SINH HỌC CỦA APELIN 6

1.4 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỦ VẬN THỤ THỂ APELIN .8

1.5 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHẤT CHỦ VẬN THỤ THỂ APELIN HIỆN NAY .9

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC ẢO 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 12

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28

3.1 MÔ HÌNH 3D-PHARMACOPHORE 28

3.2 MÔ HÌNH 2D-QSAR 30

3.3 MÔ HÌNH DOCKING PHÂN TỬ 36

3.4 ỨNG DỤNG SÀNG LỌC ẢO 40

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Từ viết đầy đủ bằng tiếng Anh Từ viết đầy đủ bằng tiếng Việt

ACE2 Angiotensin Converting Enzym

2

Enzym chuyển đổi angiotensin 2

ADMET Absorption, Distribution,

Metabolism, Excretion - Toxicity

Hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ - độc tính

APLNR APj endogenous LigaNd

EC50 Effective Concentration Nồng độ chủ vận 50%

eNOS Endothelial nitric oxide synthase Enzym tổng hợp nitric oxid nội

mô

FN False negative compounds Chất âm tính giả

FP False positive compounds Chất dương tính

GH Goodness of hit list Khả năng phân biệt mô hình GPCR G-protein coupled receptor Thụ thể bắt cặp G-protein

MDS Molecular Dynamics Simulation Mô phỏng động lực học phân tử PCA Principal Component Analysis Phân tích thành phần chính PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại gen hay

phản ứng chuỗi trùng hợp PDB Protein Data Bank Ngân hàng dữ liệu protein

PLS Partial Least Squares Phương pháp bình phương tối

thiểu từng phần

Từ viết tắt Từ viết đầy đủ bằng tiếng Anh Từ viết đầy đủ bằng tiếng Việt

QSAR Quantitative Structure-Activity

TN True negative compounds Chất âm tính thật

TP True positive compounds Chất dương tính thật

Ya Yield of actives Tỷ suất hoạt tính

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Giá trị ngưỡng của các rủi ro được đề nghị bởi ADMET Predictor 9.5TM

26

Bảng 3.1 Ba mô hình 3D-pharmacophore của các chất chủ vận thụ thể 29

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá ba mô hình 3D-pharmacophore theo điểm số GH 30

Bảng 3.3 Ý nghĩa của các thông số mô tả 30

Bảng 3.4 Mức độ tương quan giữa các thông số với nhau và với pEC50 .31

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá mô hình QSAR-1 32

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá mô hình QSAR-2 theo phương pháp CPG-NN 35

Bảng 3.7 Miền ứng dụng của mô hình QSAR-2 36

Bảng 3.8 Các thư viện hợp chất dùng để sàng lọc ảo chất có tiềm năng chủ vận thụ thể apelin 40

Bảng 3.9 Kết quả sàng lọc ADMET 42

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Quá trình sinh tổng hợp tạo thành các dạng apelin [9] 3

Hình 1.2 Cấu trúc tổng thể và sự sắp xếp phối tử AMG3054 trong khoang gắn kết [10] .4

Hình 1.3 Đường truyền tín hiệu của hệ thống thụ thể apelin [9] 6

Hình 2.1 Cấu trúc của thụ thể apelin đồng kết tinh với AMG3054 12

Hình 2.2 Cấu trúc chung của các dẫn chất (A) 1H-benzimidazol-5-carboxamid; (B) 1H-pyrazol-3-carboxamid .13

Hình 2.3 Quy trình sàng lọc ảo 24

Hình 3.1 Ba mô hình 3D-pharmacophore cho chất chủ vận thụ thể apelin 28

Hình 3.2 Kết quả loại nhiễu bằng PCA 31

Hình 3.3 Mối tương quan pEC50 thực nghiệm và dự đoán của mô hình QSAR-1 xây dựng theo phương pháp PLS 33

Hình 3.4 Bản đồ tự tổ chức của tập huấn luyện và tập kiểm tra 34

Hình 3.5 Mối tương quan pEC50 thực nghiệm và dự đoán của mô hình QSAR-2 xây dựng theo phương pháp CPG-NN 35

Hình 3.6 Mô hình khoang gắn kết của thụ thể apelin 36

Hình 3.7 Phân bố điểm số docking của 689 chất chủ vận thụ thể apelin 37

Hình 3.8 Biểu đồ tỉ lệ số chất tạo tương tác với các acid amin trong thụ thể apelin .38

Hình 3.9 Biểu đồ tần suất tạo liên kết kỵ nước và liên kết hydro với các acid amin của thụ thể apelin 38

Hình 3.10 Biểu đồ tần suất tạo liên kết kỵ nước và liên kết hydro giữa 123 chất chủ vận mạnh với các acid amin tại khoang gắn kết của thụ thể apelin 39

Hình 3.11 Mô hình gắn kết 3D và tương tác 2D của WO2017100558A1-479 với thụ thể apelin 40

Hình 3.12 Kết quả sàng lọc ảo chất chủ vận thụ thể apelin 41

Hình 3.13 Biểu đồ phân bố điểm số docking trên tập ZINC12 43

Hình 3.14 Biểu đồ phân bố điểm số docking trên tập Maybridge 44

Hình 3.15 Mô hình gắn kết 3D và tương tác 2D của ZINC19634420 với thụ thể

(apo-thụ thể apelin) và ở dạng phức hợp với các ligand 54

Hình 3.26 Tần suất tương tác của các ligand với thụ thể apelin 56 Hình 3.27 Sự tương tác của các ligand với thụ thể apelin 57

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Cô PGS TS Huỳnh Thị Ngọc Phương Em cảm ơn Cô đã hướng dẫn và dành thời gian quý báu để xem xét, góp ý

và sửa chữa chi tiết cho em hoàn thiện khóa luận

Em cảm ơn Thầy ThS Mai Thành Tấn Thầy đã luôn quan tâm, đồng hành và hướng dẫn em tận tình từ ngày đầu tiếp cận lĩnh vực này và trong suốt quá trình thực hiện khóa luận Thầy đã định hướng cho em nhiều ý tưởng để phát triển đề tài và truyền đạt những kiến thức quý báu để em thực hiện tốt khóa luận Em cảm ơn thầy đã dành nhiều thời gian, tâm huyết để góp ý và chỉnh sửa từng chi tiết nhỏ cho khóa luận của

em được hoàn thiện

Em xin cảm ơn thầy PGS TS Thái Khắc Minh đã tạo điều kiện giúp em tiếp cận với lĩnh vực nghiên cứu khoa học Em cảm ơn thầy đã phản biện và góp ý giúp đề tài của

em hoàn thiện hơn

Con cũng xin gửi lời cảm ơn yêu thương đến bố mẹ, đấng sinh thành ra con Bố mẹ luôn quan tâm, chăm sóc con và là chỗ dựa tinh thần cho con hoàn thành tốt khóa luận

Em gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô và các Chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược

Em cảm ơn anh DS Bùi Quốc Dũng, anh ThS Trần Thái Sơn cùng các bạn trong phòng Hóa Dược 314 đã sẵn lòng giúp đỡ, giải đáp thắc mắc của mình trong thời gian qua

Cuối cùng, cảm ơn em Nguyễn Đắc Nhân, Diệu Linh và các bạn monitor đã hỗ trợ chị trong giai đoạn cuối của khoá luận

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 07 tháng 08 năm 2020

Ngô Thị Hằng

3 lần so với người không mắc bệnh [1]

Mặc dù đã có nhiều thuốc điều trị, tăng huyết áp và suy tim vẫn gây ra gánh nặng lớn

về sức khỏe và kinh tế Các thành công đáng kể của các thuốc hạ huyết áp đã được chứng minh Tuy nhiên, tình trạng kháng thuốc của thuốc điều trị tăng huyết áp vẫn

là một vấn đề lâm sàng quan trọng Vì vậy, các hướng trị liệu mới là cần thiết để giúp cho quá trình điều trị đạt hiệu quả cao hơn, cải thiện sự tổn thương cơ quan đích và giúp ngăn chặn sự phát triển các biến chứng của bệnh tim mạch như đột quỵ, thiếu máu tim cục bộ và suy tim [2]

Apelin là một phối tử peptid nội sinh của thụ thể apelin, thuộc họ thụ thể bắt cặp protein (GPCR) Các tác dụng có lợi của apelin đối với các bệnh lý tim mạch và bệnh chuyển hóa đã được chứng minh trên các mô hình động vật và các nghiên cứu lâm sàng [3] Vì thế, các chất chủ vận thụ thể apelin nổi lên trong những năm gần đây như

G-là những tác nhân tiềm năng để điều trị các bệnh nói trên

Tuy nhiên, vẫn còn nhiều thách thức để khai thác thụ thể apelin như một mục tiêu điều trị Đặc biệt, bản chất peptid của apelin dẫn đến sự hạn chế về tính ổn định và sinh khả dụng của chất này khi dùng bằng đường uống [4] Có nhiều nghiên cứu thiết

kế phân tử nhỏ chủ vận thụ thể apelin, nổi bật là các cấu trúc được mô tả trong bằng sáng chế US9156796 [5] và WO2017100558A1 [6]

Đề tài “Xây dựng các mô hình sàng lọc ảo chất chủ vận thụ thể apelin” được thực

hiện với mục tiêu tổng quát là tìm kiếm các cấu trúc phân tử nhỏ mới và có tác dụng chủ vận mạnh trên thụ thể này Các mục tiêu cụ thể của đề tài bao gồm:

1 Thu thập cơ sở dữ liệu cấu trúc và hoạt tính của các chất chủ vận thụ thể apelin từ hai bằng sáng chế nói trên

2 Xây dựng mô hình 3D-pharmacophore dựa trên các chất có hoạt tính chủ vận mạnh

để làm công cụ sàng lọc ảo

3 Xây dựng mô hình 2D-QSAR từ cơ sở dữ liệu để làm công cụ dự đoán hoạt tính in

silico cho các chất mới chủ vận thụ thể apelin

Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đặt vấn đề

4 Xây dựng mô hình mô tả phân tử docking để khảo sát sự gắn kết của các chất chủ vận trên thụ thể apelin

5 Ứng dụng 3 mô hình trên để sàng lọc ảo qua thư viện hóa học lớn (ZINC12 và Maybridge) để tìm kiếm các chất mới có tiềm năng chủ vận mạnh trên thụ thể apelin

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.1 Quá trình sinh tổng hợp tạo thành các dạng apelin [9]

Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu

1.1.1 CẤU TRÚC THỤ THỂ APELIN

Thụ thể apelin là một thụ thể bắt cặp G-protein loại A (G-protein coupled receptor A

- GPCRA) Thụ thể này bao gồm 380 acid amin với 7 miền xuyên màng, trọng lượng phân tử khoảng 42.660 Da Được phân lập bằng phương pháp PCR từ ADN bộ gen người, thụ thể apelin lần đầu tiên được xác định vào năm 1993 Thụ thể apelin được

mã hóa bởi gen APLNR trên nhiễm sắc thể số 11 Việc phát hiện thụ thể apelin dựa trên sự tương tự trình tự acid amin của nó với thụ thể angiotensin II loại 1 (AT1R) nhưng nó không được kích hoạt bởi angiotensin II [7, 10, 11]

Thông qua cấu trúc được chụp nhiễu xạ tinh thể tia X của thụ thể apelin đồng kết tinh với ligand AMG3054 (một peptid bắt chước apelin-17), hai vị trí gắn kết riêng biệt với thụ thể đã được xác định (Hình 1.2)

Hình 1.2 Cấu trúc tổng thể và sự sắp xếp phối tử AMG3054 trong khoang gắn kết [10]

Hình 1.2A cho thấy vị trí đầu tiên (vị trí 1) nằm sâu trong khoang gắn kết, được phân

4-Cl-Phe17 của ligand AMG3054 (tương ứng là acid amin Phe17 của apelin-17) Acid amin Trp24 và Tyr93 tạo thành một túi nhỏ cho Pro16 Acid amin Tyr271 và Phe291 bao quanh Nle15 (Norleucin) Acid carboxylic cuối cùng của apelin tương tác với các acid amin Arg168, Lys268 và Tyr264 thông qua liên kết hydro và tương tác tĩnh điện

Vị trí liên kết thứ hai rất nông, nằm giữa vùng đầu N tận và vòng ngoại bào 2 (extracellular loop - ECL2) Vị trí này được đặc trưng bởi sự hình thành liên kết hydro giữa nhóm C=O của Gln5 và Thr177 Một mạng lưới liên kết hydro giữa hArg8 (homoarginin) với Asp23, Lys178ECL2 và Asp92ECL1 cũng được quan sát thấy Trên apelin-13, Lys8 tương tác với Asp284

Hình 1.2B minh họa trình tự acid amin của apelin-17, AMG3054 và apelin-13 Các acid amin khác nhau giữa các peptid được tô màu đỏ Các đơn vị hArg, Cha, Oic, Nle

và 4-Cl-Phe là các acid amin không tự nhiên [4]

1.2 ĐƯỜNG TRUYỀN TÍN HIỆU CỦA THỤ THỂ APELIN

Tín hiệu xuôi dòng của thụ thể apelin tương đối phức tạp và các mối quan hệ của nó với sự kích hoạt của G-protein vẫn đang được làm rõ Hình 1.3 minh họa đường truyền tín hiệu của apelin Để truyền tín hiệu đối với hệ thống thụ thể này, cần có hai tiểu phần của tiểu đơn vị Gα là Gαi/o và Gαq/11 Tương tự như các hiệu ứng xuôi dòng trung gian của Gαi/o cổ điển, protein Gαi/o với thụ thể apelin gây ức chế adenylate cyclase (AC) và do đó giảm sản xuất AMP vòng (cAMP) nội bào và làm bất hoạt protein kinase A (PKA)

Sự kích hoạt thụ thể apelin còn dẫn đến việc phospholipase Cβ kích hoạt protein kinase C (PKC) và hệ thống Ras/Raf/MEK/ERK, cùng với Akt thông qua mTOR có liên quan đến sự kích hoạt P70S6K và hoạt hóa sự tổng hợp nitric oxid nội mô (eNOS)

và thúc đẩy sự giải phóng NO, gây giãn mạch máu, kiểm soát trương lực mạch máu

và tăng sinh tế bào Việc kích hoạt bộ trao đổi Na/H loại 1 thông qua PKC trong tế bào cơ tim làm tăng co bóp cơ tim [9]

Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu

Hình 1.3 Đường truyền tín hiệu của hệ thống thụ thể apelin [9]

1.3 VAI TRÒ SINH HỌC CỦA APELIN

Đối với hoạt động của tim mạch

Apelin giúp hạ huyết áp động mạch thông qua cơ chế phụ thuộc nitric oxyd Điều trị bằng apelin cũng làm giảm trương lực tĩnh mạch toàn thân và ức chế sự giải phóng arasin vasopressin để thúc đẩy sự lợi tiểu Mặt khác, tiêm apelin trong phúc mạc làm giảm tiền tải cho tâm thất trái và không gây phì đại tim Đây là một trong những chất

có tác dụng tăng co bóp tim (hiệu ứng inotropic dương) [11] Do đó, chất chủ vận apelin được đề nghị như tác nhân điều trị tăng huyết áp và suy tim [8]

Đối với suy tim

Vai trò của apelin và thụ thể của nó trong sự tiến triển của bệnh suy tim ngày càng được quan tâm Nồng độ apelin trong huyết tương thấp hơn đáng kể ở những bệnh nhân bị suy tim Điều này cho thấy rằng sự giảm nồng độ apelin huyết tương có thể được ứng dụng như một dấu ấn sinh học đáng tin cậy để phát hiện và chẩn đoán suy tim

Sự biểu hiện của cả apelin và thụ thể của nó giảm rõ rệt khi bệnh nhân bị suy tim Apelin có thể giúp giảm tiền tải và hậu tải tâm thất trái ở chuột, và có tác dụng tăng mạnh sức co bóp cơ tim Dựa trên các tác dụng bảo vệ tim mạch của apelin, các chiến

lược để tăng cường tín hiệu của peptid này có thể giúp làm chậm sự tiến triển của suy tim Sự tăng cấp tính nồng độ apelin đã được báo cáo là gây giãn mạch ngoại biên và mạch vành và làm tăng cung lượng tim ở bệnh nhân suy tim mạn tính [11]

Thụ thể apelin đóng một vai trò quan trọng trong hệ thống tim mạch, có thể ức chế quá trình apoptosis của các tế bào cơ trơn mạch máu (VSMC – Vascular Smooth Muscle Cells), giúp tăng sinh và có tác dụng kích thích mạnh đối với cơ tim [12]

Alen G212A mã hóa thụ thể aplein có tác dụng bảo vệ, giúp chống lại sự phát triển của bệnh tăng huyết áp Apelin được báo cáo là làm giảm huyết áp ở chuột bị tăng huyết áp do deoxycorticosteron acetat bằng cách ức chế hệ thống Renin-Angiotensin (RAS) Jia và cộng sự đã quan sát thấy rằng sự giãn mạch do apelin gây ra có liên quan trực tiếp đến việc kích hoạt enzym L-arginin/nitric oxid synthase (NOS) Apelin gây giãn mạch dẫn đến sự giảm huyết áp động mạch trung bình (MABP - Mean Arterial Blood Pressure), từ đó giảm tiền tải và hậu tải Việc điều trị liên tục bằng apelin-13 cho thấy sự tăng khả năng co bóp của cơ tim và hạ thấp huyết áp động mạch trung bình MABP ở bệnh nhân suy tim

Apelin có thể được sử dụng như một tác nhân trị liệu trong điều trị tăng huyết áp trong tương lai Tuy nhiên, cần chú ý đến sự phức tạp của việc điều hòa huyết áp bằng apelin Các nghiên cứu sâu hơn cần phải được thực hiện để xác định vai trò chính xác của tín hiệu apelin trong việc kiểm soát huyết áp [11]

Đối với bệnh tăng áp động mạch phổi

Các thử nghiệm trên bệnh nhân tăng huyết áp động mạch phổi (PAH - Pulmonary Arterial Hypertension) đã khẳng định tiềm năng trị liệu này Trong đó, sự truyền tín hiệu của apelin giúp cải thiện cung lượng tim và giảm sức cản mạch máu phổi [8]

Đối với xơ vữa động mạch

Xơ vữa động mạch là một bệnh viêm mãn tính phức tạp của thành mạch với các tổn thương do sự lắng đọng của lipid Sự hình thành các tế bào bọt bởi đại thực bào trong

Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu

vùng nội mạc mạch máu là một dấu hiệu chính của các tổn thương xơ vữa động mạch trong giai đoạn đầu Apelin-13 chiếm ưu thế trong hệ thống tuần hoàn, thúc đẩy đáng

kể dòng chảy cholesterol nội bào và làm giảm sự hình thành tế bào bọt đại thực bào bằng cách tăng mức độ protein ABCA1 (ATP Binding Cassette Subfamily A Member 1), một protein vận chuyển màng ngược của cholesterol, tăng tạo lipoprotein tỉ trọng cao (HDL – High Density Lipoprotein) [11]

1.4 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỦ VẬN THỤ THỂ APELIN 1.4.1 Phương pháp calci huỳnh quang

Nguyên tắc của thử nghiệm này là hoạt tính chủ vận thụ thể apelin dẫn đến sự kích hoạt enzym ERK (kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào) và gây ra sự phóng thích ion

Ca2+ nội bào Sự huy động calci được theo dõi bằng cách sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang

Các nguyên liệu của thử nghiệm gồm tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc (CHO - Chinese Hamster Ovary) biểu hiện gen Gαq16 mã hóa cho thụ thể Phương pháp calci huỳnh quang được thực hiện ở bước sóng kích thích 448 nm và bước sóng phát xạ 520 nm

Tế bào được đếm bằng hemocytometer 30.000 tế bào được chuyển đến từng giếng của của đĩa 96 giếng trong thiết bị Costar Optical Mỗi đĩa được ủ ở 37°C trong 24 giờ Các môi trường nuôi cấy được loại bỏ và sau đó các tế bào được nạp với đầu dò calci huỳnh quang (thuốc nhuộm AM Fluo-4; Invitrogen/Phân tử thăm dò, Eugene, OR) tại một nồng độ tải cuối cùng của 2 µM trong bộ đệm dựa trên HBSS chứa HEPES 20 mM, BSA 1% và probenecid 10 probM (Sigma) trong tổng khối lượng

225 µL Các tế bào được ủ ở 37°C trong 1 giờ và sau đó được kích thích bằng

apelin-13 tổng hợp ở các nồng độ khác nhau bằng cách sử dụng đầu đọc đĩa tự động Flexstation Thêm chất chủ vận ở mức 10 lần nồng độ vào từng giếng sau khi đọc các giá trị cơ bản trong khoảng 17 giây

Theo dõi trong mỗi giếng tại khoảng thời gian cứ 60 giây và kết quả được báo cáo cho mỗi giếng Dữ liệu được thu thập bằng Softmax phiên bản 4.8 (công nghệ phân tích MDS) và được phân tích bằng phần mềm Prism (GraphPad,La Jolla, CA) [5, 6, 13]

1.4.2 Phương pháp phóng xạ

Các tế bào phôi thận người (HEK293 - Human embryonic Kidney cells 293) được cấy gen mã hóa thụ thể apelin của người và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp Thụ thể apelin là một protein trên màng tế bào HEK293 Sau đó, các tế bào này

được phá vỡ và ly tâm để thu lấy protein màng Protein màng tiếp tục được ủ với chất phóng xạ và phối tử để thực hiện thử nghiệm gắn kết

Các phối tử không liên kết được loại bỏ bằng cách lọc và rửa lại bằng dung dịch đệm Kết quả được ghi nhận bằng sự phát xạ của tia gamma Liên kết không đặc hiệu, được xác định với sự có mặt của 10−5 nM Pyr-apelin-13, không vượt quá 5% tổng tín hiệu Các kết quả được vẽ trên đường cong phản ứng nồng độ bằng cách sử dụng phần mềm GraphPad Prism 7 để tính toán các giá trị EC50 Hằng số phân ly Ki được tính

từ giá trị EC50 bằng phương trình Cheng − Prusoff và kết quả được hiển thị dưới dạng trung bình của ba thí nghiệm độc lập [8]

1.5 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHẤT CHỦ VẬN THỤ THỂ APELIN HIỆN NAY

Các peptid apelin dễ dàng chuyển hóa in vivo với chu kỳ bán hủy (T1/2) khoảng 5 phút [4] Vì vậy, việc nghiên cứu các chất chủ vận thụ thể apelin giúp đảm bảo tác dụng sinh học, cũng như tìm hiểu rõ hơn về hệ thống apelinergic Một số nghiên cứu về chất chủ vận thụ thể aplein đã được công bố:

1.5.1 Peptid ELA chủ vận thụ thể apelin

Gần đây, ELABELA (còn gọi là Apela/Toddler/ELA) được báo cáo là phối tử nội sinh thứ hai của thụ thể apelin ELA ở người là một peptid 54 acid amin bao gồm peptid tín hiệu và một peptid trưởng thành 32 acid amin (ELA-32) Gen APELA được

mã hóa trên nhiễm sắc thể 4, trước đây được coi là một khu vực không mã hóa Sự phân tách bởi furin tạo ra các đồng dạng ngắn hơn cũng cho chức năng hoạt động là ELA-21 và ELA-11 ELA cho thấy tác dụng có lợi trong một số mô hình động vật của bệnh mạn tính như suy tim, tăng huyết áp động mạch phổi, béo phì với tình trạng

đề kháng insulin, hoặc các tình trạng cấp tính như thiếu máu cơ tim và rối loạn chức năng tim do nhiễm trùng huyết ở chuột

Trong nhiều trường hợp, tác dụng sinh lý của apelin và ELA là tương tự nhau, tuy nhiên, một số khác biệt đã được báo cáo gần đây ELA ngăn ngừa tiền sản giật, trong khi biểu hiện cao của apelin trong quá trình tạo phôi có thể có tác dụng xấu Trong

mô hình nhiễm trùng huyết, hai phối tử hoạt động khác nhau đối với chức năng thận Ngược lại với apelin, ELA không làm thay đổi nồng độ arginin vasopressin [4]

1.5.2 Dẫn chất vòng lớn của apelin-13

Các chất dẫn chất vòng lớn của apelin-13 cho thấy độ ổn định cao hơn đáng kể trong huyết tương chuột (thời gian bán hủy > 3 giờ so với 24 phút đối với Pyr-apelin-13), kèm theo ái lực được cải thiện (Ki = 0,15 nM và T1/2 = 6,8 giờ) Một số hợp chất cho thấy hiệu ứng inotropic dương tính cao hơn trong mô hình tim cô lập Langendorff ở chuột (đáp ứng tối đa ở 0,003 nM so với 0,03 nM của apelin-13) [8]

Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Tổng quan tài liệu

1.5.3 Phân tử nhỏ chủ vận thụ thể apelin

Hai khung cấu trúc 1H-benzimidazol-5-carboxamid và 1H-pyrazol-3-carboxamid lần

lượt trong hai bằng sáng chế US9156796 [5] và WO2017100558A [6] thể hiện khả năng chủ vận thụ thể apelin Đây là hai trong số ít các nhóm chất thuộc hệ thống non-peptid cho kết quả gắn kết tốt, khắc phục nhược điểm về thời gian bán hủy (T1/2) của các apelin nội sinh và có khả năng dùng được bằng đường uống

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC ẢO

1.6.1 Mô hình 3D-pharmacophore

Pharmacophore (nhóm quyết định tác dụng sinh học) bao gồm tất cả các yếu tố không gian (steric) và điện tử (electron) cần thiết để đảm bảo cho sự tương tác của phân tử hợp chất với cấu trúc mục tiêu sinh học chuyên biệt để gây nên hiệu ứng kích thích (hay ức chế) đáp ứng sinh học của mục tiêu tác động này Một pharmacophore không đại diện bởi một phân tử cụ thể hoặc nhóm chức cụ thể nào mà khái niệm này dùng

để mô tả các cấu trúc có khả năng liên kết của một nhóm hoạt chất lên điểm tác động Pharmacophore có thể được xem như là mẫu số chung lớn nhất của các cấu trúc có tác dụng sinh học (cấu trúc hiện diện ở tất cả các phân tử có hoạt tính) [14]

Pharmacophore được mô tả bằng các yếu tố có khả năng tạo liên kết hydro (cho và nhận), khả năng tương tác kỵ nước, tương tác vòng thơm, khả năng tích điện… và được xác định bằng các nguyên tử, các vòng, các điểm giả định (virtual points) Ứng dụng của mô hình 3D-pharmacophore để tìm những phân tử hợp chất có các đặc tính cần thiết từ cơ sở dữ liệu cấu trúc 3D một cách nhanh chóng và hiệu quả Mô hình 3D-pharmacophore có thể được xây dựng bằng các cách như:

i Dựa trên cấu trúc phối tử (ligand–based): mô hình được tạo ra từ một hợp chất hoặc

từ một dãy các hoạt chất có cùng vị trí gắn kết trên mục tiêu tác động

ii Dựa trên cấu trúc của mục tiêu tác động (structure-based): mô hình được xây dựng dựa trên cấu trúc của đích tác động trong không gian 3 chiều [15]

1.6.2 Mô hình mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc và tác dụng (QSAR)

Việc hệ thống hóa các thông tin cấu trúc của phân tử dựa trên các thông số mô tả phân tử và phân tích dữ liệu cho phép thành lập mô hình QSAR - mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính QSAR có khả năng dự đoán các hoạt tính sinh học (IC50, EC50, MIC hay hằng số gắn kết KD) hoặc phân loại (hoạt tính mạnh hay hoạt tính yếu) dựa trên các thông số mô tả phân tử của các hợp chất trước khi xác định bằng thực nghiệm

SONNIA được phát triển bởi Molecular Networks dựa trên mạng neuron tự tổ chức (SOM) và mạng neuron nhiều lớp ngược hướng (CPG-NN) Do khả năng xây dựng các mô hình phi tuyến tính phức tạp, SONNIA có nhiều ứng dụng trong thiết kế thuốc như ứng dụng trong nghiên cứu QSAR, mô hình hóa tính chất dược động ADMETox (hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ, độc tính), phân tích dữ liệu của sàng lọc đầu vào cao, phân tích tính đồng dạng và đa dạng của cơ sở dữ liệu hóa học tổ hợp, lựa chọn thông số mô tả phân tử, phân loại và dự đoán hoạt tính sinh học, [16]

1.6.3 Mô hình mô tả phân tử docking

Docking là một phương pháp có vai trò quan trọng trong việc thiết kế thuốc dựa vào máy tính Mục đích của docking nhằm đánh giá khả năng gắn kết cũng như dự đoán được cấu dạng của phối tử (ligand) khi gắn kết với cấu trúc mục tiêu (thường là các protein) Cùng với sự phát triển không ngừng của công nghệ thông tin trong lĩnh vực sinh học cũng như các tập cơ sở dữ liệu phân tử nhỏ và các cấu trúc mục tiêu như các ngân hàng dữ liệu protein, phương pháp docking ngày càng được sử dụng rộng rãi trong sàng lọc ảo

Docking có khá nhiều ứng dụng trong thiết kế thuốc hợp lý, như nghiên cứu liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính (SAR), tối ưu hóa chất khởi nguồn (lead), tìm các chất khởi nguồn tiềm năng thông qua sàng lọc ảo, đưa ra các giả thuyết về gắn kết nhằm đưa ra các dự đoán cho các nghiên cứu đột biến (mutagenesis studies), hỗ trợ việc phù hợp hóa các chất nền và chất ức chế vào bản đồ mật độ electron (electron density) trong cấu trúc nhiễu xạ tinh thể tia X hoặc nghiên cứu cơ chế hóa học [17]

Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu tìm ra các chất mới có cấu trúc phân tử nhỏ và có tiềm năng chủ vận thụ thể apelin bằng các mô hình sàng lọc ảo Đối tượng của nghiên cứu này bao gồm:

1 Cấu trúc của thụ thể apelin đồng kết tinh với AMG3054 được tải về Ngân hàng dữ liệu protein (PDB ID: 5VBL) [18] Cấu trúc của phức hợp được minh họa ở Hình 2.1, trong đó phối tử AMG3054 được biểu diễn ở dạng peptid màu vàng, thụ thể apelin với cấu trúc bậc 3 có màu xanh

Hình 2.1 Cấu trúc của thụ thể apelin đồng kết tinh với AMG3054

2 Cơ sở dữ liệu cấu trúc và tác dụng sinh học của các phân tử nhỏ chủ vận thụ thể apelin đã được công bố tại các bằng sáng chế US9156796 và WO2017100558A1 [5, 6]

3 Các thư viện lớn chứa các cấu trúc phân tử nhỏ được sử dụng để sàng lọc ảo Hai thư viện được sử dụng trong nghiên cứu này gồm cơ sở dữ liệu ZINC12 (với 22.723.923hợp chất) [19, 20] và cơ sở dữ liệu Maybridge Screening and Fragments Collection (với 59.520 hợp chất) [21]

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thu thập cơ sở dữ liệu chất chủ vận thụ thể apelin

Cơ sở dữ liệu gồm 689 chất chủ vận thụ thể apelin thuộc hai khung cấu trúc benzimidazol-5-carboxamid và 1H-pyrazol-3-carboxamid (Hình 2.2) có cùng

1H-phương pháp thử hoạt tính sinh học bằng thử nghiệm calci huỳnh quang, có giá trị

EC50từ 0,86 nM đến 44331 nM được thu thập từ hai bằng sáng chế US9156796 và WO2017100558A [5, 6]

2.2.2 Phương pháp xây dựng mô hình 3D-pharmacophore

Trong đề tài này, mô hình 3D-pharmacophore được xây dựng bằng phương pháp dựa trên cấu trúc ligand (ligand-based) Mô hình này sẽ được ứng dụng để sàng lọc các chất có những đặc điểm cấu trúc cần thiết để có tác dụng chủ vận thụ thể apelin

2.2.2.1 Chuẩn bị cơ sở dữ liệu

Từ cơ sở dữ liệu của 689 chất ban đầu, những chất có EC50 ≤ 100 nM được xác định

là những chất có hoạt tính chủ vận thụ thể apelin mạnh [23] Những chất này được

xếp vào tập xây dựng (training set) để xây dựng mô hình 3D-pharmacophore Các

mô hình sau khi được xây dựng xong cần phải được đánh giá Tập hợp dùng để đánh giá mô hình pharmacophore (tập đánh giá) bao gồm hai tập:

i Tập dữ liệu 1: Gồm 300 chất có EC50 tốt nhất từ cơ sở dữ liệu (trong đó, bao gồm

123 chất xây dựng mô hình pharmacophore), gọi là tập active

ii Tập dữ liệu 2: Gồm 514 chất có EC50 chưa xác định, có tính chất đối lập với 123 chất chủ vận mạnh trong tập xây dựng Việc sử dụng tập không hoạt tính (còn gọi là

tập decoy) để mô hình được đánh giá khách quan Tập decoy gồm những chất giống

Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

các chất có hoạt tính mạnh trong tập xây dựng về 5 thông số mô tả (khối lượng phân

tử, số liên kết quay được, tổng số nhóm cho hydro, tổng số nhóm nhận hydro và hệ

số phân bố octanol/ nước), nhưng các chất trong tập decoy không có tính chất hóa học tương tự với bất kì chất nào trong tập xây dựng nó Tập decoy trong nghiên cứu này được xác định bằng phần mềm DecoyFinder [24]

2.2.2.2 Tạo cấu dạng của các chất trong cơ sở dữ liệu

Bước đầu tiên của việc xây dựng mô hình 3D-pharmacophore là tạo cấu dạng có thể

có đối với từng cấu trúc hóa học của phân tử hợp chất Công cụ sử dụng để tạo cấu

dạng là Compute → Conformations → Import trong phần mềm MOE 2015.10 Công

cụ này dùng để tính toán các cấu dạng có năng lượng thấp của một tập hợp các phân

tử và lưu trữ chúng trong một cơ sở dữ liệu [22] Các thông số của quá trình tạo cấu dạng gồm:

- Giới hạn số cấu dạng cho mỗi chất (Conformations): 10.000

- Số bước tìm kiếm lặp lại (Stochatis Search Iteration Limit): 1.000

- Số bước tối thiểu hóa năng lượng (Energy Minimization Iteration Limit): 1.000

- Năng lượng giảm thiểu test gradient (Energy Minimization Gradient Test): 0,0001

2.2.2.3 Xây dựng mô hình 3D-pharmacophore

Quá trình xây dựng mô hình 3D-pharmacophore được thực hiện bằng công cụ

Pharmacophore Elucidator trong phần mềm MOE 2015.10 Mục đích của chương

trình này là tạo ra tất cả các truy vấn pharmacophore (pharmacophore query) có sự

chồng phủ tốt ở hầu hết các phân tử hợp chất có hoạt tính mạnh và tách biệt với các phân tử không có hoạt tính nếu phân tử hợp chất không có hoạt tính cũng có trong tập hợp dữ liệu [22]

Ứng dụng Pharmacophore Elucidator được thực hiện với cơ sở dữ liệu cấu dạng của

tập huấn luyện gồm 123 chất chủ vận mạnh thụ thể apelin Ứng dụng sẽ tạo ra các truy vấn có thể có dựa trên cấu dạng các chất trong tập dữ liệu

2.2.2.4 Đánh giá mô hình 3D-pharmacophore

Sau khi có được nhiều mô hình pharmacophore được xây dựng từ các chất có hoạt tính mạnh, tiến hành đánh giá mô hình bằng cách tìm các hợp chất thỏa và không

thỏa mô hình trong tập đánh giá (gồm tập hoạt tính và tập decoy ở mục 2.2.2.1) bằng

chương trình Pharmacophore Search trong phần mềm MOE 2015.10

Đánh giá mô hình theo thang điểm của phần mềm MOE

Quá trình đánh giá này diễn ra đồng thời khi xây dựng các mô hình Kết quả được trả

về khi mô hình được tạo ra:

- Điểm chính xác (Accuracy scoring): Điểm chính xác tổng thể = m/n với n là số phân

tử trong tập hợp đầu vào và m là tổng số các phân tử có hoạt tính thỏa mô hình và số các phân tử không có hoạt tính không thỏa mô hình

- Điểm chồng phủ (Overlap scoring): Mô hình tạo ra được sử dụng để tìm những hơp chất có hoạt tính Với giả thuyết là một mô hình pharmacophore có thể chấp nhận được phải gióng hàng tốt các phân tử có hoạt tính, việc tìm kiếm được thực hiện nhằm tạo ra như một sự gióng hàng như vậy và được đánh giá bằng độ chồng phủ nguyên

tử Điểm chồng phủ nằm trong khoảng [0, n] với n là số phân tử có hoạt tính Số điểm càng lớn cho thấy mức độ gióng hàng càng tốt

Đánh giá theo điểm số GH (Goodness of hit list)

Các chất có hoạt tính, thỏa mô hình 3D-pharmacophore được gọi là TP (chất dương tính thật) Các chất không có hoạt tính, không thỏa mô hình 3D-pharmacophore được

ký hiệu là TN (chất âm tính thật) Chất có hoạt tính, không thỏa mô hình pharmacophore được gọi là FN (chất âm tính giả) Chất không có hoạt tính, thỏa mô hình 3D-pharmacophore được gọi là FP (chất dương tính giả)

3D-Các tiêu chuẩn được sử dụng để đánh giá bao gồm độ nhạy (Se), độ đặc hiệu (Sp), độ đúng (Acc), tỷ suất hoạt tính (Ya) và điểm GH

Độ nhạy (Se): là tỉ lệ của các chất có hoạt tính, thỏa mô hình 3D-pharmacophore

trong tập active Giá trị này đánh giá mức độ chọn lọc của mô hình trên những chất

có hoạt tính sinh học tốt và được tính bằng công thức:

TP + FN

Độ đặc hiệu (Sp): là tỉ lệ các chất không có hoạt tính, không thỏa mô hình

3D-pharmacophore trong tập decoy Giá trị này đánh giá mức độ chọn lọc của mô hình trên những chất có hoạt tính sinh học yếu:

TN + FP

Tỷ suất hoạt tính (Ya): cho biết tỉ lệ chất có hoạt tính, thỏa mô hình

3D-pharmacophore trên tổng số chất thỏa mô hình 3D-3D-pharmacophore:

TP + FP

Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Độ đúng (Acc): là khả năng dự đoán các chất được phân loại đúng bởi mô hình (TP

+ TN) trên toàn tập (N):

Acc =TP + TN

N

Điểm số GH: đánh giá năng lực phân biệt của mô hình 3D-Pharmacophore Giá trị

GH cao đồng nghĩa với tỉ lệ số chất có hoạt tính, thỏa mô hình và số chất không có hoạt tính, không thỏa mô hình phải đồng thời đều cao Giá trị GH đi từ 0 (mô hình

vô hiệu) đến 1 (mô hình lý tưởng), giá trị GH trên 0,7 cho thấy rằng mô hình có khả năng dự đoán tốt [25]:

GH = (3

4× Ya +

1

4Se) × Sp

2.2.3 Phương pháp xây dựng mô hình 2D-QSAR

Nghiên cứu tiến hành xây dựng mô hình 2D-QSAR dùng để dự đoán hoạt tính sinh học của các chất có tiềm năng chủ vận thụ thể apelin

2.2.3.1 Chuẩn bị cơ sở dữ liệu và tính toán thông số mô tả phân tử

Cơ sở dữ liệu gồm 689 chất chủ vận thụ thể apelin được tối thiểu hóa năng lượng

bằng công cụ Energy Minimize của phần mềm MOE 2015.10 với thông số Gradient

= 0,0001 kcal/mol

Vì giá trị EC50 (nM) của các chất chủ vận có khoảng biến thiên rất lớn nên được quy đổi thành giá trị pEC50 = −log(EC50) bằng công cụ Compute → Calculator để phù

hợp cho việc xây dựng phương trình 2D-QSAR

Thông số mô tả phân tử 2D của các chất được tính toán bằng phần mềm MOE 2015.10

và phần mềm PaDEL Descriptor Trong đó, MOE 2015.10 có thể tính được 206 thông

số mô tả phân tử 2D và phần mềm PaDEL Descriptor có thể xác định được 1444 thông số mô tả phân tử 1D và 2D

2.2.3.2 Lựa chọn thông số mô tả

Để lựa chọn thông số mô tả dùng cho xây dựng mô hình 2D-QSAR, cần phải loại bỏ các thông số mô tả không có ý nghĩa, các thông số có tương quan cao với nhau, giữ lại các thông số có tương quan tốt với giá trị pEC50 Tiến hành lựa chọn thông số mô

- Chia tỉ lệ thông số mô tả để loại bỏ trọng số chỉ liên quan đến các đơn vị dùng để biểu thị một thông số mô tả riêng biệt Ví dụ, giá trị của một thông số mô tả có thể gấp hàng trăm, hàng nghìn lần giá trị của môt thông số mô tả khác, nếu không quy về một tỉ lệ nhất định ta đã vô tình chấp nhận thông số này quan trọng hơn thông số kia

gấp trăm, gấp nghìn lần Nghiên cứu này chia tỉ lệ bằng thuật toán Range

transformation trong công cụ Normalize của phần mềm RapidMiner Giá trị gốc của

các thông số được chia tỉ lệ một cách tự động sang giá trị từ 0 đến 1 Công thức chia

tỉ lệ một giá trị bất kì là tỉ số giữa độ lệch của giá trị đó so với giá trị nhỏ nhất và độ lệch của giá trị lớn nhất so với giá trị nhỏ nhất

- Cũng trên phần mềm RapidMiner, sử dụng công cụ Remove Correlated Attributes

để loại các thông số mô tả có tương quan chéo trên 90% với nhau để tránh việc chọn

2 hay nhiều thông số gần giống nhau vào mô hình 2D-QSAR

- Sau cùng, phương pháp tìm kiếm BestFirst với thuật toán đánh giá CfsSubsetEval

trong phần mềm Weka 3.8 được sử dụng để tìm ra các thông số mô tả có giá trị liên quan nhất với pEC50 thực nghiệm

2.2.3.3 Loại các chất gây nhiễu

Các chất gây nhiễu được loại bỏ vì chúng làm cho kết quả đánh giá các mô hình trở nên kém hơn Loại nhiễu bằng phân tích thành phần chính – PCA là phương pháp loại nhanh và chính xác các chất gây nhiễu do biễu diễn trực quan tập dữ liệu trong không gian ít chiều Trong không gian, dễ dàng thấy được mức độ tập trung của các chất và chất nào nằm rời rạc so với vùng tuyến tính của tập dữ liệu [26]

Trong MOE, chọn Compute → Descriptors → Principal Components, chọn các

thông số mô tả đã được chọn bởi Weka, có bao nhiêu thông số mô tả sẽ xuất hiện tương ứng bấy nhiêu PCA Sau đó xác định vùng không gian 3 chiều bởi 3 trục PCA,

chọn Compute → Analysis → 3D Plot, trục X – Y – Z tương ứng PCA1 – PCA2 – PCA3, Activity chọn pEC50, nhấn Plot, vùng không gian 3 chiều sẽ xuất hiện, các chất

nằm ngoài vùng không gian này sẽ bị loại

2.2.3.4 Xây dựng mô hình 2D-QSAR

Nghiên cứu này sử dụng hai phương pháp khác nhau để xây dựng mô hình 2D-QSAR, gồm phương pháp cổ điển (bình phương tối thiểu từng phần) và phương pháp máy học hiện đại (mạng neuron nhân tạo)

Phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS)

Phương trình 2D-QSAR được xây dựng bằng phương pháp tối thiểu từng phần trên

MOE 2015.10 Chọn Compute → Model → QSAR, các thông số được thiết lập như

sau:

Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

- Cột hoạt tính: pEC 50

- Phương pháp: PLS

- Chọn các thông số mô tả, nhấn Fit để thực hiện phân tích hồi quy và xây dựng

phương trình 2D-QSAR, giá trị R2 và RMSE sẽ được hiển thị

- Tiếp theo nhấn Validate và tích hết các ô trong hộp thoại xuất hiện → OK, giá trị

XR2 (Q2) sẽ được hiển thị

- Nhấn Report để xem các thông số phân tích hồi quy và phương trình 2D-QSAR

- Tiến hành Save để lưu phương trình 2D-QSAR vừa xây dựng trong bảng

QuaSAR-Model dưới dạng *.fit để ứng dựng dự đoán hoạt tính sinh học

Miền ứng dụng của mô hình 2D-QSAR chính là miền giá trị của các thông số mô tả được chọn để xây dựng mô hình trước khi chia tỉ lệ thông số mô tả

Phương pháp mạng neuron nhiều lớp ngược hướng (CPG-NN)

Nghiên cứu này sử dụng phần mềm SONNIA được phát triển bởi công ty Molecular Networks dựa trên mạng neuron tự tổ chức (SOM) và mạng neuron nhiều lớp ngược hướng (CPG-NN) Do khả năng xây dựng các mô hình phi tuyến tính phức tạp, SONNIA có nhiều ứng dụng trong thiết kế thuốc như ứng dụng trong nghiên cứu QSAR, dự đoán tính chất dược động, phân tích dữ liệu của sàng lọc đầu vào cao, phân tích tính đồng dạng và đa dạng của cơ sở dữ liệu hóa học tổ hợp, lựa chọn thông

số mô tả phân tử, phân loại và dự đoán hoạt tính sinh học, [16]

Mạng neuron nhiều lớp ngược hướng (Counter-propagation) với kiểu mạng hình xuyến (toroidal) được sử dụng để xây dựng mô hình Kích thước mạng phụ thuộc

vào số lượng các chất trong cơ sở dữ liệu đưa vào và thường bao gồm √2N,

√N, √N/2, √N/4 neuron với N là số chất trong tập huấn luyện Với kiểu mạng hình xuyến đã chọn, kích cỡ mạng được cho là tốt nhất khi bằng căn bậc hai của số lượng chất trong tập huấn luyện (√N) [27]

Các thông số khác được giữ nguyên mặc định của phần mềm SONNIA, vì ở phiên bản 4.2, SONNIA đã được lập trình tự động lựa chọn số vòng huấn luyện tốt nhất cho kích cỡ cơ sở dữ liệu đưa vào [28] Trọng số liên kết của các neuron lớp Kohonen

được gán trị số ngẫu nhiên (random), số chu kỳ huấn luyện được thiết lập ở giá trị mặc định: Epochs = 100; Interval = 1; Span(x) = Span(y) = N / 2; Step(x) = Step(y)

= Span/Epochs; Rate = 0,5; Rate Factor = 0,995

Sau khi khởi tạo và huấn luyện, mô hình dùng để dự đoán chính là mạng đã được

học Mạng được lưu lại bằng lệnh File → Write và lưu dưới dạng Network File

bằng lệnh Maps → Selected Maps Từ bản đồ này, ta có thể xem sự phân bố của các chất trong các neuron bằng lệnh Export Structure Bản đồ đươc lưu lại bằng lệnh File

→ Write và lưu dưới dạng Map File (*.kmap) Giá trị dự đoán hoạt tính sinh học của

các chất có thể được ghi ra bằng lệnh File → Write và lưu dưới dạng Prediction File

(*.prd) Tất cả các tập tin được lưu bởi SONNIA đều ở dạng ASCII và có thể dễ dàng đưa vào phần mềm Microsoft Excel 365 để đánh giá kết quả mô hình

2.2.3.5 Đánh giá mô hình 2D-QSAR

Mục tiêu của nghiên cứu QSAR là xây dựng được mô hình có khả năng dự đoán tốt, giá trị dự đoán và giá trị thực gần nhau Điều đó thể hiện qua bình phương hệ số tương quan R2và căn của tổng bình phương phần dư RMSE của tập xây dựng mô hình Chính vì vậy mô hình sau khi xây dựng được cần phải tiến hành các đánh giá cần thiết thì mới đảm bảo được khả năng dự đoán tốt

Phân chia tập dữ liệu

Cơ sở dữ liệu được chia thành 2 phần: (1) Tập huấn luyện (tập train) chứa 80% số chất dùng để xây dựng mô hình; (2) Tập kiểm tra (tập test) chứa 20% số chất dùng

để đánh giá mô hình đã xây dựng

Trong nghiên cứu này, cơ sở dữ liệu ban đầu được chia theo phương pháp phân phối

đa dạng (diverse) Phân phối đa dạng là sắp xếp các chất trong tập dữ liệu dựa trên

khoảng cách từ chất này đến chất khác Có nhiều cách tính khoảng cách giữa hai chất

phụ thuộc vào dữ liệu sử dụng là thông số mô tả (descriptors), dấu vân tay (fingerprint) hay dữ liệu cấu dạng (conformation data) Với thông số mô tả, khoảng

cách giữa hai chất là khoảng cách Euclide giữa hai điểm đại diện cho hai chất trong không gian n-chiều Trong nghiên cứu này, việc phân chia được thực hiện bằng lệnh

Diverse subset trong MOE dựa trên 1650 thông số mô tả phân tử được tính ban đầu

[29] Mục đích của phân chia dựa vào tính đa dạng là chọn ra một tập con khác biệt nhất trong tập hợp ban đầu Việc này thích hợp cho việc chọn tập xây dựng mô hình

có tính đại diện cho cả tập dữ liệu ban đầu

Đánh giá loại-ra-một (leave one out – LOO)

Nghiên cứu áp dụng phương pháp đánh giá chéo LOO để đánh giá ngoại và đánh giá nội Trong đánh giá nội, kết quả được thể hiện qua giá trị trung bình bình phương hệ

số tương quan của các mô hình thứ cấp Q2và RMSE được tính theo công thức sau:

Q2 = 1 − ∑(𝑌𝑝 − 𝑌𝑒)2

∑(𝑌𝑒 − 𝑌̅ )𝑒 2

Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

RMSE = √1

N× ∑(Yp− 𝑌𝑒)2Trong đánh giá ngoại, kết quả được thể hiện qua giá trị R2

pred được tính theo công thức sau:

R2pred= 1 − ∑(Yp(test)− Ye(test))2

∑(Ye(test)− Y̅e)2

Trong đó:

𝑌𝑝: Hoạt tính pEC50 dự đoán trên tập xây dựng

𝑌𝑒: Hoạt tính pEC50 thực nghiệm trên tập xây dựng

Y̅ : Giá trị hoạt tính pECe 50 thực nghiệm trung bình trên tập xây dựng

Yp(test) : Hoạt tính pEC50 dự đoán trên tập test

Ye(test) : Hoạt tính pEC50 thực nghiệm trên tập test

Mô hình được đánh giá là có khả năng dự đoán tốt khi Q2 > 0,5, R2pred > 0,5 và RMSE < 0,5 [30]

Đánh giá Roy

Giá trị R2và Q2thay đổi giữa các lần xây dựng (khi lựa chọn các tập xây dựng và tập kiểm tra khác nhau) và giá trị hoạt tính thực nghiệm trung bình được sử dụng để tính nên dẫn đến đánh giá sai nếu tập dữ liệu có khoảng giá trị lớn Vì lý do đó, Roy và cộng sự đề nghị sử dụng các giá trị dự đoán mới là 𝑟𝑚2, 𝑟𝑚′2, 𝑟̅̅̅, ∆𝑟𝑚2 𝑚2, được tính toán dựa trên mối tương quan giữa các giá trị thực nghiệm (r2) và dự đoán (𝑟02)của các đường thẳng hồi quy (𝑟𝑚2) được tính dựa trên đường thẳng hồi quy có trục X là giá trị dự đoán trục Y là giá trị thực nghiệm, ngược lại 𝑟𝑚′2 được tính dựa trên đường thẳng hồi quy có trục X là giá trị thực nghiệm, trục Y là giá trị dự đoán, theo công thức sau:

Trong đó:

r2: Hệ số tương quan của phuong trình hồi qui

𝑟02: Hệ số tương quan của phương trình hồi qui với hệ số chặn bằng 0

Đánh giá Roy được thực hiện trên cả tập xây dựng và tập kiểm tra Mô hình được đánh giá có khả năng dự đoán tốt khi rm2 > 0,5 và ∆rm2< 0,2 [30]

Phương pháp Y ngẫu nhiên (Y-scrambling)

Phương pháp này được sử dụng để chứng tỏ kết quả độ đúng của các mô hình dự đoán không phải là do ngẫu nhiên mà có được, đặc biệt là các mô hình sử dụng mạng neuron dễ xảy ra hiện tượng “over-fitting” [31]

Giá trị hoạt tính sinh học của các chất trong tập xây dựng sẽ được xáo trộn một cách ngẫu nhiên để xây dựng mô hình và cũng thực hiện các đánh giá như mục 0 và mục

0 Trong nghiên cứu này, quá trình này được thực hiện10 lần Nếu kết quả đánh giá giữa mô hình đã xây dựng với kết quả đánh giá mô hình Y ngẫu nhiên lớn hơn 0,2 thì chứng minh được kết quả mô hình đã xây dựng là do mối tương quan giữa các thông

số mô tả phân tử với giá trị sinh học chứ không phải đạt được ngẫu nhiên nhờ thuật toán đã sử dụng

2.2.4 Phương pháp xây dựng mô hình mô tả phân tử docking

Trong nghiên cứu này, phương pháp docking tự động được sử dụng bằng cách dùng công cụ FlexX được tích hợp trong phần mềm Lead IT 2.1.8

2.2.4.1 Chuẩn bị cấu trúc protein

Cấu trúc của AMG3054 (peptid bắt chước apelin-17) đồng kết tinh với thụ thể được tải về từ Protein Data Bank (PDB ID: 5VBL) [18] dưới dạng *.pdb Cấu trúc thụ thể

apelin được chuẩn bị bằng công cụ QuickPrep, với các thông số quan trọng bao gồm:

- Protonate: proton hóa và tích điện cho các acid amin của protein

- Tether và Fix: Các nguyên tử trong protein được xác định vùng không gian chuyển

động, nhằm đảm bảo các nguyên tử không lệch quá xa so với tọa độ ban đầu

- Refine: Tối thiểu hóa năng lượng Giá trị RMS Gradient là 0,0001 kcal/mol/Å Sau khi chuẩn bị với công cụ QuickPrep, protein được lưu dưới dạng file *.pdb

Cấu trúc thụ thể apelin sau khi được chuẩn bị bằng phần mềm MOE, được đưa vào phần mềm LeadIT 2.1.8 để tiến hành docking Khoang gắn kết của thụ thể apelin được xác định từ vị trí của phối tử AMG3054 (phối tử bắt chước apelin-17) sao cho bán kính khoang là 10 Å

Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.2.4.2 Chuẩn bị cấu trúc phối tử để docking

Các phối tử trước khi docking được tối thiểu hóa năng lượng bằng công cụ công cụ

Energy Minimize của phần mềm MOE 2015.10 với thông số Gradient = 0,0001 kcal/mol Lưu các phân tử sau khi được tối thiểu hóa năng lượng vào một cơ sở dữ

liệu dạng file *.sdf để có thể sử dụng cho docking

2.2.4.3 Docking bằng phần mềm FlexX/Lead IT 2.1.8

Các phối tử sau khi tối thiểu hóa năng lượng được chuyển vào phần mềm theo đường

dẫn Docking → Define FlexX Docking → Docking library → Load Quá trình

docking được thự hiện với các thông số được thiết lập như sau:

- Số lượng các cấu dạng liên kết (pose) giữ lại (Number of Poses to Keep) là 1

- Số bước lặp tối đa (Maximum Number of Solutions per Iteration) là 1000

- Số lần phân mảnh (Maximum Number of Solutions per Fragmentation) là 200 Chọn Apply and Dock để bắt đầu quá trình docking Kết quả docking được lưu dưới

dạng *.sdf và *.fxx

2.2.4.4 Đánh giá kết quả

Các liên kết tạo thành giữa phối tử và protein bao gồm liên kết ion, liên kết hydro, liên kết Van der Waals, liên kết π- π… được thể hiện qua điểm số docking (kJ/mol) Kết quả docking cho biết ái lực gắn kết của phối tử với protein và tương tác giữa acid amin xung quanh với phối tử

Việc phân tích liên kết tạo thành giữa acid amin quan trọng của protein và phối tử

được thực hiện bằng công cụ Protein Ligand Interaction Fingerprints (PLIF) và được quan sát trực quan bằng công cụ Ligand Interacteractions trong MOE

2.2.5 Sàng lọc ảo khám phá chất chủ vận mới thụ thể apelin

2.2.5.1 Thư viện ứng dụng sàng lọc ảo

Thư viện ZINC 12

ZINC là một trong những thư viện thu hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu Thứ nhất, thư viện cấu trúc hóa học ZINC có khả năng cung cấp cấu dạng, chuẩn bị trong các tập tin cấu trúc thích hợp với một số chương trình docking như là *.mol2, *.sdf [20] Thứ hai, thư viện ZINC có số lượng cấu trúc hóa học vô cùng đa dạng lên đến hơn 20 triệu chất, được trình bày ở các dạng liên quan đến sinh học, được chú trọng vào trạng thái đồng phân và proton hóa của cấu trúc, được sắp xếp thành các tập hợp con liên quan đến quá trình khám phá thuốc [19] giúp tăng cường khả năng tìm kiếm được các cấu trúc thỏa mãn yêu cầu Thứ ba, đây là một cơ sở dữ liệu miễn

phí, dễ dàng truy cập tại địa chỉ http://zinc.docking.org/, với các hợp chất có sẵn về mặt thương mại, cùng các thông tin đầy đủ của nhà cung cấp [19] Điều này sẽ giúp cho kết quả của các nghiên cứu sàng lọc và tìm kiếm các cấu trúc trên cơ sở dữ liệu này trở nên có ý nghĩa hơn, vì các nghiên cứu nối tiếp (follow-up) có thể mua được

các cấu trúc này dễ dàng để thử nghiệm hoạt tính in vitro Nghiên cứu này sử dụng

phiên bản ZINC12 với hơn 22 triệu chất và hơn 200 triệu cấu dạng để sàng lọc ảo

Thư viện Maybridge

Maybridge là một thư viện rất đa dạng với hơn 53.000 hợp chấp, được biết đến rộng rãi như một công cụ quan trọng trong những chương trình sàng lọc Hầu hết các hợp chất trong bộ sưu tập Maybridge thường tuân theo quy luật 5 Lipinski vì vậy có giá trị ADME tốt (hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ) điều này làm cho các hợp chất trở thành ứng cử viên lý tưởng cho sự phát triển và vượt qua được thử nghiệm sàng lọc ban đầu

Maybridge tự tổng hợp ra gần như tất cả các hợp chất trong thư viện của mình, điều này cho phép Maybridge tái cung cấp các chất dễ dàng hơn Những hợp chất sàng lọc này được tổng hợp chủ yếu với lượng tính bằng gam, đảm bảo khả năng cung cấp nguyên liệu cao Các hợp chất trong thư viện có sẵn ở nhiều dạng, bao gồm một số được thiết kế sẵn hoặc có thể được lựa chọn trước Các hợp chất có thể được cung cấp dưới dạng bột khô hoặc màng film hoặc lọ với lượng tính bằng milligram, gram hoặc micro/millimol được cân với độ chính xác cao, thuận tiện cho người dùng [21]

2.2.5.2 Quy trình sàng lọc ảo

Quy trình sàng lọc ảo các chất có tiềm năng chủ vận thụ thể apelin được tiến hành như Hình 2.3

Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Hình 2.3 Quy trình sàng lọc ảo

Sàng lọc qua mô hình 3D-pharmacophore

Đối với thư viện Maybridge, trước khi sàng lọc qua mô hình 3D-pharmacophore, các chất trong thư viện Maybridge phải được tạo cấu dạng như trình bày ở mục 2.2.2.2 Sau đó, tập dữ liệu này được sàng lọc qua mô hình 3D-pharmacophore bằng công cụ

Pharmacophore Editor → Search trong phần mềm MOE 2015.10 Những chất nào

thỏa mãn mô hình 3D-pharmacophore sẽ được báo cáo kết quả trong một bảng dữ liệu riêng

Đối với thư viện ZINC12, vì thư viện này chứa 22.723.923 chất nên cách tiếp cận bằng phần mềm như thư viện Maybridge sẽ gặp nhiều khó khăn do không đủ tài

Các thư viện hợp chất: ZINC12, Maybridge

Docking phân tử

Tạo cấu dạng

Mô phỏng động lực học phân tử

nguyên máy tính và thời gian Tuy nhiên, ZINC có sẵn chức năng hỗ trợ sàng lọc online trên trang web ZINCPharmer (http://zincpharmer.csb.pitt.edu/), tại đây các chất đã được chuẩn bị cấu dạng sẵn sàng cho việc sàng lọc qua mô hình 3D-Pharmacophore Mô hình 3DPharmacophore được lưu thành dạng file *.ph4 trong MOE, sau đó được tải lên trang web http://zincpharmer.csb.pitt.edu/pharmer.html ở

tab Pharmachphore, trong tab Filters chọn các tùy chọn sau:

- Max Hits per Mol: 1

- Subset selection: ZINC Purchasable

Sau đó chọn Submit Query để tiến hành sàng lọc, sau khi sàng lọc xong chọn Save

Results để lưu kết quả dưới dạng file *.sdf

Dự đoán đặc tính dược động học và độc tính (ADMET)

Để có thể đánh giá ADMET nhanh chóng, toàn diện và tiết kiệm, các mô hình sàng lọc ảo đã được xây dựng nhằm cung cấp công cụ sàng lọc sơ bộ các thông số ADMET

trước khi tiến đến thử nghiệm in vitro và xa hơn là thử nghiệm tiền lâm sàng

Đề tài sử dụng phần mềm ADMET PredictorTM9.5 [32] của công ty Simulation Plus,

Mỹ, một phần mềm được ra mắt vào năm 1999, với tên ban đầu là QMPRPlus® Phần mềm ADMET PredictorTMđưa ra thuật ngữ rủi ro (risk) để đưa ra ngưỡng cho các thông số ADMET được tính toán (đặc tính lý hóa, chuyển hóa và độc tính) Ngoài giá trị rủi ro ADMET tổng, nhà phát triển còn đưa ra các giá trị cho 3 mô hình nhỏ hơn là hấp thu, chuyển hóa, và độc tính Các giá trị rủi ro không có đơn vị, sẽ tăng từ

0 cho tới vô cùng Giá trị rủi ro càng cao, khả năng vượt qua được các đánh giá lâm sàng và tiền lâm sàng càng thấp Việc nghiên cứu thực hiện sàng lọc các chất dựa trên rủi ro ADMET nhằm đảm bảo các “hit” cuối cùng có khả năng cao vượt qua các thử nghiệm lâm sàng và tiền lâm sàng để được chấp thuận làm một thuốc dùng trong điều trị trong tương lai

Các thông số ADMET được tính bằng phần mềm ở pH sinh lý Nghiên cứu chọn ra các cấu trúc có giá trị rủi ro nhỏ hơn ngưỡng tham chiếu như trình bày trong Bảng 2.1

Khóa luận tốt nghiệp DSĐH Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Rủi ro chung Rủi ro hấp thu Rủi ro chuyển hóa Rủi ro độc tính

Sàng lọc qua mô hình mô tả phân tử docking

Các chất sau khi đạt các tiêu chí đánh giá ADMET, được tối thiểu hóa năng lượng bằng MOE 2015.10 và tiến hành docking vào khoang gắn kết bằng phần mềm LeadIT Để đạt thông lượng cao trong sàng lọc, nghiên cứu này lấy kết quả Top1 trong quá trình docking

Dự đoán hoạt tính chủ vận thụ thể apelin qua mô hình 2D-QSAR

Các chất docking thành công vào khoang gắn kết của thụ thể apelin được sàng lọc qua miền ứng dụng của mô hình 2D-QSAR rồi dự đoán hoạt tính sinh học EC50

Mô phỏng động lực học phân tử

Sau khi sàng lọc qua mô hình docking phân tử, phức hợp của các chất chủ vận tiềm năng nhất với thụ thể apelin được khảo sát sâu hơn bằng phương pháp mô phỏng động lực học phân tử (MDS) Công cụ được sử dụng để MDS là Desmond 4.7 được phát triển bởi D E Shaw Research [33] tích hợp trong Maestro của gói phần mềm Schrödinger 2018 [34] Quá trình MDS gồm các bước [35]:

Chuẩn bị phức hợp protein – ligand

Cấu dạng docking tốt nhất của các chất với thụ thể apelin được lưu dưới dạng *.pdb

Phức hợp được đưa vào phần mềm Maestro và chuẩn bị bằng công cụ Protein

Preparation Wizard bao gồm các bước như thêm hydro, tối thiểu hóa năng lượng và

tối ưu hóa các liên kết

Đánh giá kết quả

Độ ổn định của protein và ligand được xác định bằng các giá trị RMSD, RMSF Sự tương tác của ligand với thụ thể được đánh giá bằng tần suất tạo các tương tác như liên kết hydro, ion, kỵ nước, cầu nước