Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền các giống/dòng chè (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) ở Việt Nam bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử microsatellite (SSR) Luận văn Thạc sỹ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ---Trần Đức Trung Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền các giống/dòng chè Camellia sinensis L.. Tôi xin chân thành cảm ơn c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-Trần Đức Trung

Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền các giống/dòng chè

(Camellia sinensis (L.) O Kuntze) ở Việt Nam

bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử microsatellite (SSR)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn khoa học: TS Lã Tuấn Nghĩa

Hà Nội- 2009

… bố mẹ… 

… vợ… 

… gia đình… 

… và bé Trần Đức Hoàng Minh…. 

  Lời cảm ơn 

Trước  hết,  tôi  xin  gửi  lời  cảm  ơn  chân  thành  và  sâu  sắc  tới         

TS.  Lã  Tuấn  Nghĩa,  người  đã  tận  tình  hướng  dẫn,  giúp  đỡ  và  hỗ  trợ  tôi 

trong suốt quá trình công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu 

và hoàn thành luận văn này. 

Tôi  xin  bày  tỏ  lòng biết  ơn  tới  các  thầy cô  và  cán  bộ  công  tác  tại  Viện 

Công  nghệ  Sinh  học  thực  phẩm,  Viện  đào  tạo  sau  đại  học‐  Trường  Đại  học 

Bách khoa Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt 

quá trình học tập tại trường. 

Nhân  dịp  này,  tôi  cũng  xin  gửi  lời  cảm  ơn  chân  thành  tới  các  cán  bộ 

công  tác  tại  Viện  Khoa  học  kỹ  thuật  Nông‐Lâm  nghiệp  miền  núi  phía  Bắc 

(NOMAFSI) đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thu thập số liệu và vật 

liệu nghiên cứu tại Viện. 

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, anh chị em trong Nhóm nghiên 

cứu Đa dạng di truyền và Công nghệ sinh học Nông nghiệp, Viện Di truyền 

Nông nghiệp, đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình công tác và nghiên 

cứu khoa học vừa qua. 

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã nhiệt tình 

động  viên,  giúp  đỡ  tôi  trong  quá  trình  học  tập,  nghiên  cứu  khoa  học  cũng 

như trong cuộc sống. 

Luận văn này được thực hiện với nguồn kinh phí từ Chương trình Công 

nghệ sinh học Nông nghiệp. 

Xin chân thành cảm ơn! 

Hà Nội, tháng 10 năm 2009   

        Trần Đức Trung

Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn  này. Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các  nghiên cứu khác; các số liệu, sơ đồ kết quả của luận văn này chưa từng được  công bố. 

Mọi dữ liệu, hình ảnh, biểu đồ và trích dẫn tham khảo trong luận văn   đều được thu thập và sử dụng từ nguồn dữ liệu mở hoặc với sự đồng ý của  tác giả. Các phần mềm phân tích TotalLab v2009, QuantityOne, NYSYS pc  2.11X,  TreeCon,  POPGENE32,  Dendroscopes,  PHYLIP  v3.69  đều  có  bản  quyền hoặc sử dụng với sự đồng ý của (nhóm) tác giả xây dựng phần mềm. 

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên! 

Trần Đức Trung

Mục lục

Trang

1.1 Khái quát chung về cây chè Camellia sinensis (L.) O Kuntze 4

1.1.1 Lược sử ngành sản xuất- chế biến chè trên thế giới

1.1.3 Phân loại thực vật và đặc điểm hình thái của cây chè 8 1.1.4 Đặc điểm di truyền của cây chè

Camellia sinensis (L.) O Kuntze 14 1.1.5 Ngành sản xuất, chế biến chè trên thế giới và Việt Nam 17

1.1.6.1 Phương pháp truyền thống 19 1.1.6.2 Áp dụng công nghệ sinh học

1.2 Chỉ thị trong đánh giá đa dạng di truyền 22

1.2.3.1 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA- chỉ thị RFLP

(Restriction Fragment Length Polymorphism) 29

1.2.3.3 Chỉ thị DNA dựa trên đa hình các vị trí nhận biết

giới hạn 31 1.2.3.4 Chỉ thị DNA dựa trên các trình tự lặp 33 1.2.3.5 Chỉ thị DNA dựa trên trình tự DNA 41 1.2.3.6 Một số loại chỉ thị DNA khác 42 1.3 Thành tựu trong nghiên cứu đa dạng di truyền chè

1.3.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền chè bằng chỉ thị hình thái 43 1.3.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền chè bằng chỉ thị hóa sinh 44 1.3.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền chè bằng chỉ thị DNA 45

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 50 2.1 Vật liệu nghiên cứu 50 2.2 Phương pháp nghiên cứu 55

2.1.3 Trích ly DNA tổng số từ mẫu lá chè 57 2.1.4 Nhận dạng di truyền các giống chè bằng chỉ thị SSR 58 2.1.5 Phân tích kết quả 60

2.1.5.3 Phân loại thứ chè theo tỷ lệ nguồn gen 63

3.1 Phân tích đa dạng di truyền chè dựa trên đặc điểm hình thái 64

3.1.2 Phân tích đa dạng di truyền dựa trên đặc điểm hình thái

3.2 Phân tích đa dạng di truyền chè bằng chỉ thị SSR 73 3.2.1 Trích ly DNA tổng số 73 3.2.2 Nhận dạng di truyền chè bằng chỉ thị SSR 75 3.2.3 Phân tích tính đa dạng di truyền của các locus SSR 81 3.2.4 Phân tích đa dạng di truyền giữa 9 quần thể chè

3.2.5 Phân tích đa dạng di truyền 96 giống/dòng chè

3.2.5.1 Phân nhóm di truyền dựa trên

3.2.5.2 Phân nhóm di truyền dựa trên

3.3 Kết hợp chỉ thị hình thái và chỉ thị SSR

trong phân tích đa dạng di truyền các giống/dòng chè 106

Bảng chữ viết tắt

AFLP Amplification Fragment Length Polymorphism

CAPs Cleaved Amplification Polymorphism Sequence

cs Cộng sự

CTAB Cetyl trimethylammonium bromide

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTPs Deoxy nucleotide triphosphates

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EST Expressed sequence tag

EthBr Ethidium bromide

IPGRI International Plant Genetic Resource Institute ISSR Inter-simple sequence repeat

MAS Molecular Assisted Selection

PCA Principles Component Analysis

PCR Polymerase Chain Reaction

PIC Polymorphism Information Content

RAPD Random Aplification Polymorhism DNA

RFLP Restriction Fragment length Polymorphism

SSR Simple sequence repeat

STS Sequence- tagged site

TAE Tris-Acetic acid- EDTA

TEMED N,N,N’,N’- Tetraethyl methylendiamine

Danh mục bảng

Trang

Bảng 1.1: So sánh đánh giá đặc điểm của một số loại chỉ thị được ứng

dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật 28

Bảng 1.2: So sánh ưu/nhược điểm của các phương pháp phân lập

Bảng 2.1: Danh sách 96 giống/dòng chè thu thập từ NOMAFSI 50

Bảng 2.2: 9 quần thể chè nghiên cứu 52 Bảng 2.3: Danh sách các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu 53 Bảng 2.4: 12 đặc điểm hình thái được sử dụng để đánh giá

Bảng 2.5: Thành phần phản ứng SSR-PCR 59

Bảng 2.6: Thành phần gel polyacrylamide 12% 60

Bảng 3.1: Giá trị đặc trưng của 90 thành phần trong phân tích PCA

(khoảng cách di truyền Euclidean của 90 giống/dòng chè) 71

Bảng 3.2: Tần số alen của 21 locus SSR 82

Bảng 3.3: Thống kê các chỉ số đa dạng di truyền của 21 locus SSR 83

Bảng 3.4: Kết quả đánh giá đa dạng di truyền giữa 9 quần thể chè 85

Bảng 3.5: Khoảng cách di truyền giữa 9 quần thể chè nghiên cứu 87 Bảng 3.6: Giá trị đặc trưng của 96 thành phần trong phân tích PCA

(khoảng cách di truyền Nei72 của 96 giống/dòng chè) 102

Danh mục hình ảnh minh họa

Trang

Hình 1.1: Các nước trồng chè dựa vào sản lượng được thống kê

Hình 1.2: Phân bố tự nhiên các thứ chè theo Stuart (A) và Barua (B) 10

Hình 1.3: Cây chè Trung Quốc (C.sinensis var sinnensis) 12 Hình 1.4: Cây chè Assam (C sinensis var assamica) 13 Hình 1.5: Cây chè Cambod (C sinensis var assamica sub sp

lasiocalyx) 13

Hình 1.6: Tiêu bản nhiễm sắc thể ở kỳ giữa của cây chè

(C sinensis var sinensis) 15

Hình 1.7: Kích thước biến thiên của lá chè 16

Hình 1.8: Biểu đồ sản lượng chè khô của một số nước năm 2005, 2006

Hình 1.9: Biểu đồ khối lượng sản xuất và xuất khẩu chè khô của một số

Hình 1.11: Nguyên lý kỹ thuật kỹ thuật AFLP 32

Hình 1.12: Phân loại trình tự lặp SSR 35

Hình 1.13: Đa hình DNA SSR giữa hai cá thể có motif (AT)n 37

Hình 1.14: Quy trình phát triển chỉ thị SSR từ thư viện hệ gen 39

Hình 2.1: Phân loại chè Cambod dựa trên tỷ lệ nguồn gen 63

Hình 3.4: Cây chè dạng thân gỗ 66 Hình 3.5: Cây chè dạng thân bụi 67 Hình 3.6: Sơ đồ cây phân nhóm 90 giống/dòng chè dựa trên

đặc điểm hình thái bằng phương pháp UPGMA 69

Hình 3.7: Phân tích PCA 90 giống/dòng chè thuộc 9 quần thể chè dựa

trên ma trận khoảng cách di truyền Euclidean

Hình 3.8: Kết quả trích ly DNA tổng số chè (dựa trên quy trình

Porebski) 74

Hình 3.9: Ảnh điện di xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu

Hình 3.10: Ảnh điện di xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu

cho mồi MSCjaH46 (SSR-17) và MSCjaF37 (SSR-20) 76

Hình 3.11: Kết quả nhận dạng di truyền 96 giống/dòng chè

Hình 3.12: Kết quả nhận dạng di truyền 96 giống/dòng chè

bằng chỉ thị SSR CamsinM8 và CamsinM13 78

Hình 3.13: Kết quả phản ứng PCR của 96 giống/dòng chè

Hình 3.14: Sơ đồ phân nhóm di truyền 9 quần thể chè

Hình 3.15: Phân tích PCA biểu diễn quan hệ nhóm của 9 quần thể chè

trong không gian ba chiều 88

Hình 3.16: Sơ đồ cây phân loại 96 giống/dòng chè

Hình 3.17: Phân tích PCA 96 giống/dòng chè thuộc 9 quần thể chè

dựa trên mức độ tương đồng di truyền Jaccard 97

Hình 3.18: Sơ đồ cây phân nhóm 96 giống/dòng chè

bằng phương pháp Weighted- Neighbor Joining 99

Hình 3.19: Phân tích PCA 96 giống/dòng chè thuộc 9 quần thể chè

dựa trên khoảng cách di truyền Nei72 103

Hình 3.20: Cây phân nhóm 96 giống/dòng chè

dựa trên khoảng cách di truyền Nei72

(xây dựng bằng phần mềm PHYLIP 3.69 và Dendroscopes) 105

Trần Đức Trung – Cao học CNSH khóa 2007-2009, ĐH Bách khoa Hà Nội

MỞ ĐẦU

Chè (trà) không chỉ là thức uống giải khát hàng ngày mà còn là một nét văn hóa đặc trưng, một thứ nghệ thuật (Trà đạo) của người dân châu Á Cùng với cà phê và ca cao, chè là một trong ba loại đồ uống có nguồn gốc tự nhiên không chứa cồn được cả thế giới ưa chuộng Hơn hai phần ba dân số thế giới uống chè hàng ngày không chỉ bởi hương vị đặc sắc mà còn vì những lợi ích cho sức khỏe mà chè mang lại Từ những kinh nghiệm dân gian cho đến các nghiên cứu khoa học gần đây đã khẳng định giá trị của cây chè đối với sức khỏe

Cây chè (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) thuộc họ chè Theaceae là

loại cây trồng lưu niên có thời gian thu lợi kinh tế kéo dài đến hơn 60 năm Sản xuất và chế biến chè đã trở thành một trong những ngành kinh tế nông nghiệp quan trọng ở nhiều quốc gia với sản phẩm tạo ra có giá trị xuất khẩu cao Năm 2003, diện tích trồng chè trên toàn thế giới đã lên tới 2,7 triệu ha với tổng sản lượng chè khô khoảng 3 triệu tấn [47] Trước nhu cầu tăng nhanh

cả về năng suất và chất lượng, công tác chọn tạo giống chè đã được đẩy mạnh, nhiều giống chè mới đã được tạo ra, đặc biệt ở các nước Ấn Độ, Srilanka, Trung Quốc… Tuy nhiên, do đặc điểm nông- sinh học khác biệt của cây chè nên công tác chọn tạo bằng phương pháp lai tạo hữu tính giữa các cặp bố mẹ được chọn lựa dựa trên kiểu hình gặp rất nhiều khó khăn Để có được những dòng triển vọng thì các nhà chọn giống sẽ phải tiêu tốn rất nhiều thời gian, công sức và cần có những điều kiện cơ sở vật chất khác Trong khoảng 20 năm trở lại đây, với việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống đã khắc phục được những trở ngại trong phương pháp chọn tạo truyền thống Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử- MAS (Molecular-Assisted Selection) đang được áp dụng rộng rãi không chỉ trong chọn tạo giống cây trồng mà còn

Trần Đức Trung – Cao học CNSH khóa 2007-2009, ĐH Bách khoa Hà Nội

cả trong chăn nuôi Nhờ các chỉ thị phân tử mà các nhà khoa học xác định được sự khác biệt về mặt di truyền của quần thể giống khởi đầu, từ đó xác định các cặp lai có khoảng cách di truyền phù hợp có thể cho ưu thế lai cao nhất Việc tiếp cận ở mức độ phân tử cho phép đánh giá các giống bố mẹ một cách chính xác, không bị tác động bởi các điều kiện ngoại cảnh, rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả công tác lai tạo

Ở Việt Nam, cây chè và các sản phẩm từ chè đã được người dân trồng và chế biến từ lâu Nước ta có nhiều vùng trồng và chế biến chè nổi tiếng như Mộc Châu, Thái Nguyên hay B’lao- Lâm Đồng, cùng với nhiều giống chè quý như chè Shan ở Hà Giang, Suối Giàng; chè Tân Cương ở Thái Nguyên… Bên cạnh đó, nhằm đáp ứng nhu cầu phát triển của ngành sản xuất chế biến chè, nhiều giống/dòng chè đã được nhập từ các nước trên thế giới như Ấn Độ, Srilanka, Trung Quốc, Nhật Bản… Đây là nguồn vật liệu rất có giá trị đối với chương trình chọn tạo giống chè

Hiện nay cây chè được xác định là một trong những cây trồng chủ lực trong quy hoạch phát triển kinh tế các tỉnh trung du và miền núi phía Bắc nước ta Tuy nhiên, để thâm canh cây chè đạt hiệu quả cao, tránh lãng phí trong đầu tư ban đầu thì việc phải có những giống chè cho năng suất cao, chất lượng tốt, phù hợp với điều kiện khí hậu- thổ nhưỡng là một yêu cầu cần được quan tâm Trong bối cảnh đó, công tác đánh giá đa dạng di truyền cây chè ở nước ta- có vai trò rất quan trọng trong khai thác hiệu quả nguồn gen, vẫn còn nhiều hạn chế Cho đến nay việc nghiên cứu đánh giá sự đa dạng nguồn gen cây chè trên quy mô lớn để có thể cung cấp cơ sở di truyền ban đầu và hỗ trợ cho công tác chọn tạo giống chè còn rất khiêm tốn Vì vậy, chúng tôi tiến

hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền các

giống/dòng chè (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) ở Việt Nam bằng chỉ

thị hình thái và chỉ thị phân tử microsatellite (SSR)” với mong muốn có

Trần Đức Trung – Cao học CNSH khóa 2007-2009, ĐH Bách khoa Hà Nội

được cái nhìn tổng quan về sự đa dạng di truyền của các giống/dòng chè ở Việt Nam

Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi đã tiến hành những nội dung nghiên cứu sau:

1 Dựa trên một số chỉ tiêu chính, đánh giá đặc điểm hình thái của các giống/dòng chè thuộc các quần thể chè được bảo tồn ở vườn quỹ gen chè- Viện Khoa học Kỹ thuật Nông-Lâm nghiệp miền núi phía Bắc (NOMAFSI)

2 Nhận dạng di truyền các giống/dòng chè bằng chỉ thị phân tử SSR

3 Phân tính đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống/dòng chè dựa trên kết quả đánh giá hình thái

4 Phân tích đánh giá sự đa dạng di truyền của các quần thể chè; của các giống /dòng chè bằng chỉ thị phân tử SSR

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở dữ liệu hữu ích trong phân loại các giống/dòng chè, hỗ trợ đắc lực cho công tác chọn tạo giống chè mới năng suất cao, chất lượng tốt, góp phần thúc đẩy phát triển ngành sản xuất-chế biến chè nước ta

Trần Đức Trung – Cao học CNSH khóa 2007-2009, ĐH Bách khoa Hà Nội

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY CHÈ Camellia sinensis (L.) O

Kuntze

1.1.1 Lược sử ngành sản xuất- chế biến chè trên thế giới

và Việt Nam

Chè từ lâu đã quen thuộc với đời sống của người dân các nước châu Á

Các tài liệu của Trung Quốc đều cho rằng cây chè được phát hiện một cách

tình cờ bởi Thần Nông (một vị vua trong truyền thuyết) vào khoảng năm 2737

trước Công nguyên Tuy nhiên, cũng có những giả thuyết cho rằng ngay khi

người Trung Quốc biết đến các giá trị y học của cây chè thì nhu cầu về các

sản phẩm từ chè đã nảy sinh và cùng với đó là sự ra đời ngành trồng và chế

biến chè ở tỉnh Tứ Xuyên- Trung Quốc từ cách nay khoảng 3000 năm Về

sau, kiến thức về canh tác cây chè đã được phổ biến rộng rãi cùng với những

cuộc hành hương và di cư của các tín đồ đạo Phật, từ rất lâu trước khi sự phát

tán cây chè được ghi nhận

Tại Ấn Độ năm 1823, thiếu tá Robert Bruce tìm thấy cây chè dại đầu tiên

ở tỉnh Assam, nhưng cho đến năm 1834, các hạt giống chè vẫn được nhập từ

Trung Quốc (bởi Gordon) để phục vụ nhu cầu thành lập các vườn trồng chè

thương mại Về sau, các cây chè bản xứ đã được đưa vào trồng nhiều hơn nhờ

C.A Bruce, người quản lý trang trại chè thuộc chính phủ Anh tại thuộc địa

Ấn Độ Lợi ích thương mại từ cây chè ngày càng gia tăng và cho đến

12-02-1839, công ty chè đầu tiên- Công ty chè Assam- đã được thành lập ở Jorhat,

Assam dưới sự điều hành của Nghị viện Anh Đây chính là mốc đánh dấu sự

ra đời ngành công nghiệp chè ở Ấn Độ cũng như trên thế giới [47] Hiện nay

trên toàn thế giới đã có hơn 30 quốc gia trồng và sản xuất chè, trong đó tập