CHUYÊN đề PHÂN lập, CHIẾT XUẤT, KIỂM NGHIỆM và TIÊU CHUẨN hóa dược LIỆU đại BI

Kết quả phân tích các thành phần hóa học của dầu dễ bay hơi từ Blumea balsamifera bằng GC / MS DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ... Xu hướng sử dụng dược liệu và những hoạt chất tinh chế từ dược liệu n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HUTECH

KHOA DƯỢC

NHÓM -LỚP 17DDUB3 NGUYỄN VĂN TUẤN ANH TRẦN THỊ MỸ DUYÊN PHÙNG VÕ CÁT NGUYÊN NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM

NGÔ THỊ NHO

CHUYÊN ĐỀ PHÂN LẬP, CHIẾT XUẤT, KIỂM NGHIỆM VÀ TIÊU

CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU ĐẠI BI

TP Hồ Chí Minh - 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC HUTECH

KHOA DƯỢC

NHÓM -LỚP 17DDUB3 NGUYỄN VĂN TUẤN ANH TRẦN THỊ MỸ DUYÊN PHÙNG VÕ CÁT NGUYÊN NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM

NGÔ THỊ NHO

CHUYÊN ĐỀ PHÂN LẬP, CHIẾT XUẤT, KIỂM NGHIỆM VÀ TIÊU

CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU ĐẠI BI

GV hướng dẫn: ThS Trương Đỗ Quyên

TP Hồ Chí Minh - 2020

MỤC LỤC

1.1 TÊN GỌI CỦA DƯỢC LIỆU 2

1.2 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN BỐ 2

2.2.7 Ngăn ngừa béo phì 6

3.1 CHIẾT XUẤT 5

3.1.1 Phương pháp cất kéo hơi nước 6

3.1.2 Phương pháp cất kéo hơi nước mới 6

3.2 PHÂN LẬP 5

Type chapter title (level 3) 6

Type chapter title (level 3) 6

Type chapter title (level 3) 6

Type chapter title (level 3) 6

Type chapter title (level 3) 6

4.2.1 Định lượng borneol bằng phương pháp sắc ký khi (GC) 6

4.2.2 Xác định tổng hàm lượng Flavone bằng phép đo quang phổ UV-VIS 6

Hình 1.1 Ảnh dược liệu Đại bi (Blumea balsamifera (L.) DC)

Hình 2.1 Cấu trúc hóa học của borneol

Hình 2.2 Cấu trúc của camphor

Hình 2.3 Cấu trúc cineol

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình cất kéo đại bi bằng hơi nước

Hình 4.1 Sắc ký đồ tổng dòng ion GC-MS của dầu dễ bay hơi Blumea balsamifera

Hình 4.2 Kết quả phân tích các thành phần hóa học của dầu dễ bay hơi từ Blumea

balsamifera bằng GC / MS

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Trường Đại Học Công Nghệ ThànhPhố Hồ Chí Minh đã tạo cho chúng em một môi trường học tập lành mạnh và tiến bộ Đặcbiệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giảng viên bộ môn – Cô Trương Đỗ Quyên đã nhiệttình giúp đỡ, truyền đạt những kiến thức quý báu về cuộc sống cũng như kiến thức chuyênmôn và còn làm cho chúng em yêu thích bộ môn Dược liệu nhiều hơn

Với vốn kiến thức còn hạn chế và đây cũng là lần đầu tiên chúng em làm bài báo cáo vớihình thức tiểu luận nên sẽ không tránh khỏi sai sót Chúng em rất mong nhận được những ýkiến đóng góp, phê bình của thầy cô Đó sẽ là hành trang quý giá để chúng em có thể hoànthiện và cống hiến những kiến thức ít ỏi của mình vào sự nghiệp tiến bộ xã hội sau này Cuối cùng, chúng em xin cảm ơn gia đình, người thân và cảm ơn các bạn thành viên trongnhóm đã hết sức cố gắng hoàn thành tốt nhất bài báo cáo

Chúng em xin chân thành cảm ơn!

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Viê ̣t Nam, NXB Y học, tr.605-607.

2 BỘ Y TẾ (2017), Dược điển Việt Nam V, NXB Y HỌC, Hà Nội, tr 183, 267.

3 Bộ Y tế (2018), Dược điển Việt Nam V, NXB Y học, PL 2

4 Pang, Y.; Wang, D.; Fan, Z.; Chen, X.; Yu, F.; Hu, X.; Wang, K.; Yuan L (2014),

“Blumea balsamifera—A Phytochemical and Pharmacological Review”, Molecules,

19(7), pp 9453-9477.

5 Zhou X., Yang X.S., Zhao C (2001), “Chemical components of volatile oil from

folium et cacumen Blumea balsamifera originated from Guizhou”, J Instrem Anal,

20, pp 76–78.

6 China Pharmacopoeia Committee (2005), Chinese Medicine Science and Technology

Press, Chinese Pharmacopoeia, pp 740.

7 Isidorov VA, Krajewska U, Vinogorova VT, Vetchinnikova LV, Fuksman IL, Bal K

(2004), “Gas chromatographic analysis of essential oil from buds of different birch

species with preliminary partition of components”, Biochem Syst Ecol, 32, pp 1–13.

8 Zhi-long Jiang, Yan Zhou, Wei-chen Ge, and Ke Yuan (2004), “Phytochemical

compositions of volatile oil from Blumea balsamifera and their biological activities”,

Pharmacogn Mag, 10(39), pp.346–352.

9 Saikia P., Khan ML (2011), “Diversity of medicinal plants and their uses in home

gardens of upper Assam, Northeast India”, Asian J Pharm Biol Res, 1, pp 296-309.

10 Ganesh Chandra J (2015), “Ethnomedicinal Use and Phytochemical Analysis of

Selected Medicinal Plants of Mizoram, India”, Vol.1.Truy cập từ trang chemistry.imedpub.com/ethnomedicinal-use-and-phytochemicalanalysis-of-selected-medicinal-plants-ofmizoram-india.php?aid=7836 (ngày truy cập 10-18-2020)

https://green-11 Joshi K, Joshi R, Joshi AR (2011), “Indigenous knowledge and uses of medicinal

plants in Macchegaun”, Nepal Ind J TradKnowl, 10, pp 281-286.

12 Nessa, F.; Ismail, Z.; Karupiah, S.; Mohamed (2005), “N RP–HPLC method for the

quantitative analysis of naturally occurring flavonoids in leaves of Blumea

balsamifera DC”, Journal of Chromatographic Science, 43, pp 416–420.

13 Wang, Yuanhui; Shi, Linfan; Wang, Aimei; Tian, Hongyun; Wang, Hongxin; Zou,

Chunli(2014), “Preparation of High-Purity (–)-Borneol and Xanthoxylin from Leaves

of Blumea balsamifera (L.) DC”, Separation Science and Technology, 49, pp 1535-

1540

14 Xu, Jing; Jin, Da-qing; Liu, Cuizhou; Xie, Chunfeng; Guo, Yuanqiang;

Fang, Lingzhi (2012), “Isolation, Characterization, and NO Inhibitory

Activities of Sesquiterpenes from Blumea balsamifera”, Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 60, pp 8051- 8058

15 D.M.H Ali; K.C Wong; P.K Lim (2005), “Flavonoids from Blumea

Với những tiến bộ của nền khoa học hiện đại trên thế giới đã giúp cho ngành dược liệu họccủa Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung ngày càng phát triển và gặt hái được nhiềuthành công Xu hướng sử dụng dược liệu và những hoạt chất tinh chế từ dược liệu ngày càngphổ biến nhằm tìm tòi, phát hiện những tính năng mới có thể ứng dụng trong y học

Trong số rất nhiều dược liệu được nghiên cứu cho đến hiện nay, cây đại bi (Blumea

balsamifera) từ xưa đã được ông bà ta sử dụng để chữa trị một số bệnh thông thường như

cảm cúm, đau mắt, đau bụng, ho lâu ngày… Từ nhu cầu muốn hiểu rõ và sâu sắc hơn nguồngốc gây nên những tác dụng có lợi ở trên Dựa trên phương tiện của khoa học hiện đại đểphân lập, định tính những hoạt chất có tác lợi trong cây và từ đó chiết xuất, tinh chế ra cáchoạt chất đó góp phần làm phong phú thêm nguồn tài nguyên hoạt chất cho y học

1 PHẦN TỔNG QUAN:

1.1 TÊN GỌI CỦA DƯỢC LIỆU

Tên gọi: cây Đại bi

Tên gọi khác: Từ bi xanh, băng phiến, đại ngải, mai hoa não, gãi nạp hương,

mai phiến, mai hoa băng phiến, long não hương, …

Tên khoa học: Blumea balsamifera (L.) DC.

có quả tháng 7-8 [1]

Hình 1.1 Ảnh dược liệu Đại bi (Blumea balsamifera (L.) DC)

1.2.2 Phân bố

Cây phân bố rộng rãi khắp các vùng núi ở độ cao dưới 1000m, ở trung du

và cả ở đồng bằng, thường gặp ven đường, quanh làng, trên các savan, đồng

cỏ (Việt Nam, Trung Quốc và các nước vùng Nam Á, từ Ấn Độ kéo đếnMalaysia, Philippin, …)

Tại Việt Nam, cây phân bố ở nhiều vùng, là loại cây mọc dại ven đường Cónhiều ởmiền trung du, đồng bằng, hải đảo, ven rừng và vùng núi cao dưới1000m Các vùng đồi núi quang, có nhiều ánh sáng, bãi đất rộng là địa điểm

lý tưởng cho cây phát triển và phát tán nhanh chóng Nhiều nhất là vùngTây Nguyên, Tây Nam Bộ như Cà Mau, Kiêng Giang, Đồng Tháp

1.3 BỘ PHẬN DÙNG

Toàn cây

1.4 THU HÁI

Có thể thu hái lá quanh năm, chủ yếu vào mùa hạ Thu hái toàn cây vào mùa hạ

và thu, dùng tươi, hoặc phơi hay sấy khô Có thể dùng lá non và búp để chưngcất rồi cho thăng hoa thành Mai hoa băng phiến (Long não Ðại bi)

1.5 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Lá chứa từ 0,2-1,8% tinh dầu Trong đó thành phần chủ yếu là D-borneol, Lcamphor, cineol, limonen, acid palmitic, acid myristic, còn có sesquiterpenalcol Thành phần chính của mai hoa băng phiến là borneol; đó là một chất cótinh thể óng ánh và trắng như hoa mai, do đó mà có tên mai hoa băng phiến haybăng phiến đại bi

Ngoài ra, trong thành phần của đại bi còn có nhiều hoạt chất có lợi cho sứckhỏe khác như: Vitamin C, protit, lipit, sắt, corten, canxi, … [2]

2 HOẠT CHẤT

2.1 HOẠT CHẤT CHÍNH

Trong lá cây đại bi thường có chừng 0,2 đến 1,88% tinh dầu và chất băngphiến Thành phần chủ yếu của tinh dầu có D-Borneol, L camphor, Cineol,Limonen, … Tỉ lệ Borneol và L camphor thay đổi theo từng vùng: Hà Giang97% borneol, 1,2% Camphor, Hà Nội 50,57% và 18, 71%, Đắc Nông 5,7% và70,05%

Không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ và cồn cao độ

Rất dễ bị oxy hoá thường xảy ra cùng với trùng hiệp hoá

Hình 2.1 Cấu trúc hóa học của borneol

2.1.2 L-camphor

Bột kết tinh hoặc phiến trắng hoặc gần như trắng, khối kết tinh không màu.Thăng hoa ngay ở nhiệt độ thường

Khó tan trong nước, rất tan trong ethanol 96 % và ether dầu hỏa (khoảng sôi từ

50 °C đến 70 °C) Dễ tan trong dầu béo, rất khó tan trong glycerol

Hình 2.2 Cấu trúc của camphor

2.1.3 Cineol

Chất lỏng trong, không màu, có mùi đặc trưng

Thực tế không tan trong nước, trộn lẫn được với ethanol 96 %

và dihydroquercetin-4'-metyl ete…

2.1.5 Sesquiterpene lactones

Là nhóm các chất hoá học phổ biển ở các cây họ Cúc, có ba sesquiterpenelactones, Blumealactone A, Blumealactone B, và Blumealactone C Có tácdụng gây độc tế bài và ức chế khối u

2.2 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ

2.2.1 Hoạt động chống khối u

Các thành phần dihydroflavonol cho thấy sự hiệp đồng đáng kể nhất với phối

tử gây apoptosis liên quan đến khối u (TRAIL) Nó nâng cao mức độ hoạtđộng của promoter TRAIL-R2 và thúc đẩy sự biểu hiện của protein bề mặttheo cách độc lập với p53

Chiết xuất methanol làm giảm sự biểu hiện của cyclin-E và quá trìnhphosphoryl hóa protein của bệnh ung thư nguyên bào võng mạc (Rb) dẫn đếnbắt giữ chu kỳ tế bào Tương tự như vậy, nó làm giảm mức độ của phối tử liênquan đến tăng sinh

Chiết xuất metanol của B balsamifera đã được sử dụng để xác định độc tính tế

bào của nó trên bảng dòng tế bào ung thư ở người bằng xét nghiệm MTT

Luteolin-7-metyl ete cho thấy độc tính tế bào mạnh đối với các dòng tế bàoung thư phổi ở người, độc tính vừa phải đối với các dòng tế bào ung thưkhoang miệng

Ba chủng streptomycetes nội sinh của B balsamifera, bao gồm: YIM 56092,

YIM 56093 và YIM 56099 thể hiện hoạt tính chống ung thư

Chiết xuất blumealactone A, B và C từ lá khô của cây sambong và nhận thấychúng có thể ức chế sự phát triển của ung thư Yoshida ở nồng độ 5–10 μg /ml

Chiết xuất methanol của B balsamifera (thu thập ở tỉnh Lâm Đồng) có hoạt tính

ức chế men xanthine oxidase mạnh với giá trị IC 50 là 6,0 μg/ml

Dịch chiết methanol của B balsamifera thể hiện hoạt tính ức chế xanthine oxidase

cao hơn so với chất chiết xuất từ chloroform và pet-ether

2.2.4 Kháng khuẩn và kháng viêm

Tinh dầu có nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 150 µg/ml và 1,2 mg/ml đối

với Bacillus cereus, S aureus và Candida albicans.

Chiết xuất hexan ức chế Enterobacter cloacae và S aureus

2.2.5 Tăng thẩm thấu qua da

Các L -borneol, như các hợp chất có hiệu quả chính của B balsamifera, cho thấy

hiệu quả thẩm thấu qua da được tăng cường Tinh dầu long não và 1-menthol củacây đặc biệt thúc đẩy sự hấp thụ qua da của nicotinamide

2.2.6 Chữa lành các vết thương

Những con chuột được tiếp xúc với dầu B balsamifera nguyên chất ở liều 2000

mg/kg trong 24 giờ không có phản ứng dị ứng hoặc phản ứng độc cấp tính, nhưnghoạt động phục hồi vết thương tốt hơn so với những con được điều trị bằng công

thức dầu không phải B balsamifera

2.2.7 Ngăn ngừa béo phì

Chất chiết xuất từ B balsamifera ức chế sự tích tụ lipid và các hoạt động của

glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH), chủ yếu làm giảm biểu hiện củacác yếu tố phiên mã adipogenic quan trọng, chẳng hạn như thụ thể kích hoạtperoxisome proligenase γ, liên kết yếu tố CCAAT protein và leptin trong tế bào

mỡ 3T3-L1 Do đó, các chất chiết xuất của B balsamifera có thể có chức năng

chống đái tháo đường, kháng thời tiết và chống viêm Các chiết xuất metanol (100μg/mL) được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế sự hình thành mạch máu bằngphương pháp vòng động mạch chủ chuột

3 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP

Trong đại bi có tinh dầu có chứa các thành phần chính là các hợp chất kết tinh ở nhiệt độ thường nên người ta có thiết kế bộ phận ngưng tụ tinh dầu theo kiểu hình đèn xếp

Cách tiến hành:

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình cất kéo đại bi bằng hơi nước

3.1.2 Phương pháp cất kéo hơi nước mới

Trộn nước và nguyên liệu thô theo tỷ lệ trong lượng 6:1-12:1, tiến hành siêu

âm 10-60 phút, ngâm lạnh trong 0.5-6h

Gia nhiệt trong điều kiện chân không, đun sôi nhẹ hỗn hợp dung dịch từ 8h và ngưng tụ ở nhiệt độ 6-15 độ C

2-Thu lấy tinh thể và nước thơm được tạo thành trong quá trình ngưng tụ, táchnước thơm thu được bằng một lương dung môi hữu cơ có cùng thể tíchtrong 1-3h, tách nước và thu hồi pha hữu cơ để thu được chất dầu có màuvàng

Trộn tinh thể và chất dầu có màu vàng để thu được tinh dầu đại bi

3.2 PHÂN LẬP

3.2.1 Phân lập Borneol và xanthoxylin

Quá trình chưng cất và chiết xuất đồng thời đã được sử dụng để thu các chấtbay hơi của lá B Balsamifera ,các chất bay hơi này được tách bằng sắc ký cột silica gel và sau đó tinh chế bằng cách kết tinh lại để thu được độ tinh khiết cao (-) – borneol và xanthoxylin

Đây là một quy trình mới và đơn giản để chiết xuất , tách và tinh

chế (-) -borneol và xanthoxylin có độ tinh khiết cao (-) từ lá

của Blumea balsamifera (L.) DC

3.2.1.1 Chưng cất và chiết xuất đồng thời

Lá (16-100 g) được cân cẩn thận và đưa vào thiết bị

Likens-Nickerson để chưng cất và chiết xuất đồng thời (SDE) Với tỷ lệ

nguyên liệu / nước (1: 10-1: 60, g: mL), dung môi chiết (dietyl

ete khan) thể tích (40-100 mL) và thời gian chiết (1-10 giờ) Sau

khi chiết xuất, dietyl ete khan được cô đặc để thu được các chất

bay hơi trong thiết bị dưới áp suất giảm Sau đó các chất bay hơi

được hòa tan trong etyl axetat để phân tích GC

3.2.1.3 Kết tinh lại

Sau khi tách, bằng cách kết tinh lại ở (60−90◦C) để thu được xanthoxylin

và (-) – borneol (tan trong ete dầu hỏa) có độ tinh khiết cao

Đun sôi ete dầu hỏa để đạt được độ hòa tan cao nhất của xanthoxylin hoặc (-) - borneol, và lọc nóng để loại bỏ tạp chất không tan.Sau đó làm lạnh dịchchiết lại trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng, 4 giờ ở –4◦C và qua đêm ở –20◦C sau

đó thu tinh thể Các độ tinh khiết của tinh thể và cặn được phân tích bằng

GC Các cấu trúc của xanthoxylin tinh khiết và (-) - borneol được phân tích bằng NMR

3.2.2 Phân lập các Sesquiterpenes

Các phần trên mặt đất của Blumea balsamifera được làm khô bằng không

khí (6,0 kg) và được chiết xuất bằng MeOH (3 ×42 L) dưới sự hồi lưu Làm

bay hơi dung môi hữu cơ để thu được chiết xuất thô (800 g).Sau đó chiết

tiếp bằng EtOAc Phần hòa tan trong EtOAc (220,0 g) được sắc ký cột silica gel, sử dụng gradien axeton trong ete dầu hỏa (1−40%), để tạo ra bảy phần (F1-F7) dựa trên sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích

F5 được phân đoạn bằng sắc ký lỏng áp suất trung bình (MPLC) trên ODS rửa giải với gradient bước từ 60 đến 90% MeOH trong H2O để tạo ra bốn phân đoạn con (F5-1-F5-4) F5-3 được tinh chế bằng HPLC điều chế

(YMC-pack ODS-AM, 20 × 250 mm, 75% MeOH trong H2O) để thu được hợp chất 1 (tR = 39 phút, 29,9 mg) Việc tinh chế tiếp tục F5-2 với cùng một hệ thống HPLC sử dụng 72% MeOH trong H2O dẫn đến việc phân lập các hợp chất 3 (tR = 36 phút, 15,6 mg) và 11 (tR = 32 phút, 12,5 mg) Phân đoạn F4, sử dụng cùng một MPLC (60−90% MeOH trong H2O) cung cấp ba phân đoạn con (F4-1 − F4-3) và việc tinh chế thêm F4-2 bằng hệ thống HPLC như trên (77% MeOH trong H2O) thu được hợp chất 2 (tR =

32 phút, 11,9 mg)

Phân đoạn F3 bằng MPLC (60−90% MeOH trong H2O) để thu được ba phân đoạn (F3-1 − F3-3) và việc tinh chế F3-2 sau đây bằng cùng một hệ thống HPLC (79% MeOH trong H2O) đã thu được hợp chất 4 (tR = 34 phút, 14,7 mg), 6 (tR = 45 phút, 12,5 mg), và 8 (tR = 28 phút, 16,8 mg) Các hợp chất 5 (tR = 27 phút, 14,7 mg) và 7 (tR = 33 phút, 12,5 mg) được phân lập từ F2-3 (88% MeOH trong H2O)

Phân đoạn F6 tạo ra ba phân đoạn con (F6-1-F6-3), hợp chất 9 (tR = 32 phút, 8,9 mg) được phân lập từ F6-3 (70% MeOH trong H2O), và hợp chất

10 (tR = 37 phút, 12,7 mg) thu được từ F6-2 (67% MeOH trong H2O)