Tóm tắt luận án: Nghiên cứu phân lập, tinh chế, thiết lập chất chuẩn để định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cleisanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).

Nghiên cứu phân lập, tinh chế, thiết lập chất chuẩn để định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cleisanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).Nghiên cứu phân lập, tinh chế, thiết lập chất chuẩn để định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cleisanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).Nghiên cứu phân lập, tinh chế, thiết lập chất chuẩn để định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cleisanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).Nghiên cứu phân lập, tinh chế, thiết lập chất chuẩn để định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cleisanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).Nghiên cứu phân lập, tinh chế, thiết lập chất chuẩn để định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cleisanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN LÂM HỒNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TINH CHẾ, THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ĐỂ ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ LIGNAN TRONG QUẢ

CỦA CHI CLEISANTHUS, HỌ THẦU DẦU

(EUPHORBIACEAE)

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, NĂM 2019

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG

VIỆN HÓA SINH BIỂN - VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC &

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học:

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện Quốc gia Việt Nam

Thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội

MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của luận án

Trong khuôn khổ của dự án “Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tínhsinh học từ thảm thực vật Việt Nam”, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn LâmKhoa học và Công nghệ Việt Nam phối hợp với Viện Hóa học các hợp chất

tự nhiên– Cộng hòa Pháp đã thu hái, định danh khoa học và thử sàng lọc hoạttính sinh học của dịch chiết ethyl acetat của 2,500 loài thực vật của nước ta,

trong đó nổi bật là dịch chiết từ quả cây Cách hoa Đông Dương (C.

indochinensis Merr ex Croiz), Chà chôi (C tonkinensis Jabl.) và Cách hoa

eberhardt (C eberhardtii Gagn) có phần trăm ức chế mạnh dòng tế bào ung

thư biểu mô KB từ 88,40 đến 95,17% Từ quả của 3 loài trên đã phân lập vàxác định cấu trúc được nhiều hợp chất tinh khiết như: cleistantoxin,cleisindoside D…Một điều rất thú vị là, các hợp chất cleistantoxin,cleisindoside D có cấu trúc hoá học gần giống etoposid và teniposid là 2 dẫnchất glycosid của podophyllotoxin đang được sử dụng làm thuốc điều trị ungthư phổi, tinh hoàn, buồng trứng…

Nghiên cứu liên quan cấu trúc cleistantoxin, cleisindoside D với tácdụng dược lí, cơ chế gây độc tế bào cho thấy các chất này có khả năng ứcchế enzym topoisomerase IIB và enzym caspase và được dự đoán có hoạt

tính kháng tế bào ung thư phù hợp với kết quả thử trên in vitro và in vivo,

cleistantoxin có hoạt tính kháng ung thư mạnh nhất

Từ các kết quả đó, Đề tài độc lập cấp Nhà nước, mã số ĐTĐLCN.14/16

của Bộ Khoa học và Công nghệ đã tiến hành thử hoạt tính kháng ung thư củacao khô chiết xuất từ quả cây Chà chôi trên chuột Nude cấy tế bào ung thưphổi người với liều 100mg/kg cân nặng, cho thấy 100% chuột còn sống và kéodài được thời gian sống sau 6 tuần điều trị so với nhóm chứng không đượcdùng cao Vì vậy, cao khô đang được tiếp tục nghiên cứu, phát triển thànhnguyên liệu thuốc Để xây dựng tiêu chuẩn cho cao khô này, rất cần có chấtchuẩn cleistantoxin và cleisindoside D Tuy nhiên, 2 chất này đang đượcnghiên cứu, phát triển thuốc mới nên trên thế giới chưa có chất chuẩn đốichiếu Vì vậy, cleistantoxin và cleisindoside D phải được thiết lập thànhchất chuẩn gốc Đây là lĩnh vực nghiên cứu mới, hầu như ở Việt Nam cònchưa có công trình nào công bố về thiết lập chuẩn gốc, chủ yếu là thiết lậpchuẩn thứ cấp

Xuất phát từ nhu cầu thực tế, luận án “Nghiên cứu phân lập, tinh chế,

thiết lập chất chuẩn để định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cleistanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)” là công trình đầu

tiên thiết lập hai chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D

từ quả cây Chà chôi (có hàm lượng 2 chất này cao nhất) với các mục tiêusau:

-Mục tiêu 1: Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc của cleistantoxin

và cleisindoside D từ quả cây Chà chôi làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn

và xác định cấu trúc các chất tinh khiết mới phân lập được

-Mục tiêu 2: Thiết lập được hai chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và

cleisindoside D

-Mục tiêu 3: Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính và định

lượng một số lignan trong quả cây chi Cách hoa (Cleistanthus).

2.Những đóng góp mới của luận án

-Về mặt hoá học

Lần đầu tiên đã phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc 8 chất mới từ quả

cây Chà chôi là: 7′,8′-dehydrocleistantoxin (CT1), cleistonkiside A (CT2), cleistonkinin A (CT3), cleistonkinin B (CT4), cleistonkiside B (CT5), cleistonkinen (CT6), cleistonkinin E (CT7), cleistonkinin C (CT8).

-Về mặt thiết lập chất chuẩn

Lần đầu tiên công bố:

Tiêu chuẩn chất lượng của nguyên liệu thiết lập chuẩn gốc định lượngcleistantoxin và cleisindoside D theo hướng dẫn của tổ chức y tế thế giới(WHO) và thiết lập chất chuẩn theo hướng dẫn của ISO GUIDE 35

Đóng được 96 ống chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin có giá trị trênCOA là 99,3%, độ không đảm bảo đo là 0,1%, nghiên cứu độ ổn định được

18 tháng và 76 ống chất chuẩn gốc định lượng cleisindoside D có giá trị trênCOA là 94,2%, độ không đảm bảo đo là 0,4%, nghiên cứu độ ổn định được

12 tháng Tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc

định tính 7’,8’-dehydrocleistantoxin (CT1) và cleisindoside A Trong đó, có

chất 7′,8′- dehydrocleistantoxin là chất mới phân lập được từ quả Chà chôi vàphần xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất 7′,8′-dehydrocleistantoxin là công

bố hoàntoàn mới của luận án

Đóng ống chuẩn phân giải gồm 4 chất chuẩn: cleisindoside A, cleisindoside D,cleistntoxin và 7’,8’-dehydrocleistantoxin để đánh giá độ phù hợp hệ thống sắc

kí

-Về mặt kiểm nghiệm dược liệu và thuốc dược liệu

Lần đầu tiên ứng dụng 2 chất chuẩn gốc định lượng và 2 chất chuẩn gốcđịnh tính để xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thờicleisindoside D và cleistantoxin và định tính được 4 lignan: cleisindoside A,cleisindoside D, cleistntoxin và 7’,8’-dehydrocleistantoxin trong quả của chiCách hoa và chưa có công trình nào công bố về kết quả này

3.Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 148 trang, 76 hình và 45 bảng Bố cục gồm các phần: Đặtvấn đề (2 trang); Tổng quan (29 trang); đối tượng nội dung và phương phápnghiên cứu (14 trang); Kết quả nghiên cứu (80 trang); Bàn luận (22 trang); Kếtluận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình đã công bố liên quanđiến luận án (1 trang); Luận án có 96 tài liệu tham khảo và 240 trang phụ lục

NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Đã tổng quan được các nội dung chính liên quan đến luận án gồm có:

-Tổng quan về chi Cách hoa (Cleistanthus), tình hình nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính kháng ung thư của chi Cleistanthus trên thế giới

và tại Việt Nam

-Tổng quan về nhóm chất lignan: khái niệm, phân loại, một sốaryltetralin lignan đang được phát triển thành thuốc điều trị ung thư, một sốhoạt chất chính nhóm aryltetralin lignan được phân lập được từ quả cây

thuộc chi Cleistanthus và một số phương pháp phân tích hoạt chất nhóm

aryltetralin lignan trong thực vật

-Tổng quan về chất chuẩn: khái niệm và phân loại chất chuẩn gồm:chất chuẩn gốc (PCRS) và chất chuẩn thứ cấp (SCRS), tổng quan một sốhướng dẫn về thiết lập chất chuẩn Theo ISO 17034 và ISO GUIDE 35 quytrình thiết lập chất chuẩn gồm các bước: xác định nhu cầu thiết lập chấtchuẩn, thu thập nguồn nguyên liệu, chuẩn bị nguyên liệu thiết lập chuẩn,đóng ống chuẩn, đánh giá độ đồng nhất, xác định các đặc tính, xác định giátrị ấn định trên COA, dán nhãn, bảo quản và nghiên cứu độ ổn định

-Tổng quan về xác định các đặc tính của chất chuẩn gốc: Theo hướng dẫncủa IP, USP, WHO các chỉ tiêu xác định đặc tính (characterization) của chấtchuẩn gốc gồm bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc: cảm quan, nhiệt độ nóngchảy, góc quay cực riêng, bộ phổ IR, NMR, MS, UV…và xác định độ tinhkhiết chất chuẩn gốc bằng phương pháp cân bằng khối lượng: xác định tạpchất liên quan và tạp chất phân huỷ bằng các kỹ thuật: HPLC/DAD, xác địnhtạp chất vô cơ bằng phương pháp cắn sau nung (residue on ignition-ROI) haytro sulfat, xác định hàm lượng tạp chất bay hơi bằng mất khối lượng do làmkhô hoặc phân tích nhiệt lượng TGA; xác định độ tinh khiết trực tiếp bằng kỹthuật: DSC…

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

 Đối tượng để phân lập, tinh chế cleistantoxin và cleisindoside D làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn

Hình 2.1 Sơ đồ qui trình chiết xuất cao cồn khô từ quả cây Chà chôi

168 g cao cồn khô được chiết xuất theo sơ đồ (Hình 2.1) từ quả Chà

chôi hay Cọc rào (Cleistanthus tonkinensis, Jabl;) được thu hái ngày

06/06/2016, tại Đại từ-La Bằng-Thái Nguyên, kí hiệu VN 0308 (LB-TN) đểphân lập, tinh chế các chất tinh khiết làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn

Đối tượng để phân tích định tính, định lượng một số lignan trong quả cây chi Cách hoa (Cleistanthus)

Quả Chà chôi hay Cọc rào (Cleistanthus tonkinensis, Jabl.) thu hái ngày

16/06/2018, tại Đại từ-La Bằng-Thái Nguyên, kí hiệu ĐL 2338 (LB-TN)

Quả Cách hoa eberhardt (Cleistanthus eberhardtii, Gagn), thu hái ngày

08/06/2018 tại Phú lộc-Thừa Thiên Huế, kí hiệu ĐL 2151 (PL-TTH)Xác định đúng tên loài và lưu giữ mẫu tại Viện Tài nguyên và sinh thái- Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

2.2.HOÁ CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ

- Chất tinh khiết cleistantoxin và cleisindoside D được phân lập từ quảCách hoa Đông dương Hai chất này đã được đo phổ xác định cấu trúccleistantoxin và cleisindoside D (Phòng tổng hợp hữu cơ-Viện Hoá sinhbiển- Viện HL KH&CN VN)

2.2.1.Hoá chất

-Hoá chất, dung môi để chiết xuất, phân lập, tinh chế đạt tiêu chuẩn tinhkhiết phân tích Hoá chất, dung môi chạy HPLC và đo phổ NMR (Merck)2.2.2.Thiết bị nghiên cứu

-Thiết bị nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và phân tích của ViệnHoá học và Viện Hoá sinh biển-Viện HL KH & CN VN, Bộ môn Hoá Phântích - Độc chất, ĐH Dược HN, Viện KNT TƯ, Viện KNT TPHCM

2.3.NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm:

-Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc chất cleistantoxin, cleisindoside

D từ quả Chà chôi làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn

-Xây dựng bộ dữ liệu phổ nhận dạng các các chất cleistantoxin, cleisindoside

D nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ UV, IR, MS, NMR

-Xây dựng phương pháp xác định tạp chất hữu cơ, vô cơ và tạp chất bayhơi của các chất cleistantoxin, cleisindoside D

-Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin, cleisindoside D

-Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin, cleisindoside D

-Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cách hoa

-Áp dụng phương pháp đã xây dựng bước đầu định tính, định lượng một số lignan trong quả của chi Cách hoa

2.3.1. Phương pháp phân lập, tinhchế và khẳng địnhcấutrúc của chất tinh khiết

-Phân lập các chất bằng sắc ký cột cổ điển nhồi silica gel, sephadex LH-20,

SK lớp mỏng bán điều chế silica gel 60 GF254 và silica gel 60 RP-18 GF254

(Merck).

-Tinh chế các chất tinh khiết bằng: kết tinh và cột cổ điển nhồi hạtSilica gel pha đảo YMC-GEL ODS-A có cỡ hạt 75 μmm (YMC).

-Xác định độ tinh khiết của các nguyên liệu thiết lập chất chuẩn bằngHPLC/DAD sử dụng phương pháp chuẩn hoá diện tích

-Khẳng định cấu trúc một số chất tinh khiết nhóm lignan làm NLTLCC:bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT)

và 2 chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ khối lượng phân giải cao(HR-MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ lưỡng sắc tròn (CD), góc quay cực riêng([α]α]] 20)

2.3.2.Thiết lập chất chuẩn gốc

Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng

-Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng các chất tinh khiết làm nguyên liệuthiết lập chất chuẩn: Phổ 1H NMR, 13C NMR, HR-MS, IR, UV-VIS, nhiệt

độ nóng chảy, góc quay cực riêng ([α]α]]D20)…

-Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí vàhàm lượng tạp chất liên quan bằng HPLC/DAD, phương pháp xác địnhhàm lượng tạp chất vô cơ bằng phép thử tro sulfat và tạp chất bay hơi bằngTGA

-Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn gốc định lượng

Bảng 2.1 Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn gốc định lượng

1 Tính chất Dạng thù hình, màu sắc, mùi vị, độ tan DĐVN V

2. Nhiệt độ nóngchảy Nhiệt độ nóng chảy phải phù hợp với điểm chảytrong TL công bố DSC

3. Góc quay cựcriêng Giá trị GQC phải phù hợp với GQC trong TLcông bố phụ lục 6.4DĐVN V

Phổ IR Phải có dao động đặc trưng theo cấu trúc hoá học

của chất tinh khiết trong TL đã công bố

IR

Phổ UV-VIS Dữ liệu phổ UV-VIS phải có các phổ của chất tinh khiết trong TL đã công bốmax trùng với UV-VIS

5. Độ tinh khiếtsắc kí Không được nhỏ hơn 95% HPLC/DADtính bằng

chuẩn hoá diện tích

6 Tạp chất liênquan Không được lớn hơn 5%

7. Tạp chất bayhơi Không được thấp hơn giới hạn cho phép (tuỳthuộc vào từng nguyên liệu thiết lập chuẩn) TGA

8 Tạp chất vô cơ Không được lớn hơn 0,1% Tro sulfat

D

9. Độ tinh khiếtDSC Không được thấp hơn giới hạn cho phép (tuỳthuộc vào từng nguyên liệu thiết lập chuẩn) DSC

-Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng

• Đóng ống chất chuẩn, dán nhãn và bảo quản ống chuẩn, nghiên cứu

độ ổn định của chất chuẩn theo hướng dẫn ISO GUIDE 35

• Đánh giá độ đồng nhất trong quá trình đóng ống

• Xác định giá trị ấn định trên COA từ 3 PTN: Xác định độ tinh khiếtsắc kí bằng HPLC/DAD và hàm lượng tạp chất bay hơi bằng TGAtại 3 PTN đạt tiêu chuẩn GLP hoặc ISO 17025 Mỗi PTN nhận 6ống chất chuẩn lấy ngẫu nhiên cùng tiêu chuẩn cơ sở để tiến hànhphân tích Tập hợp các kết quả của ba PTN tham gia (n = 18), đánhgiá kết quả bằng test ANOVA một yếu tố, so sánh 2 giá trị Ftn vàFlt Khi Ftn > Flt kết quả trung bình của 3 phòng thí nghiệm khácnhau có ý nghĩa, giá trị độ tinh khiết sắc kí và hàm lượng tạp chấtbay hơi được lấy từ kết quả trung bình của 3 PTN

• Xác định giá trị ấn định công bố trên phiếu kiểm nghiệm COA bằng

phương pháp cân bằng khối lượng (mass-balance):

Độ tinh khiết = Độ tinh khiết sắc kí × (100- % tạp bay hơi - % tạp vô cơ)/100

• Xác định độ không đảm bảo đo:

Độ không đảm bảo đo của hàm lượng tạp chất liên quan bằngHPLC/DAD và tạp chất bay hơi bằng TGA Mỗi chất chuẩn đượcgửi đến 3 PKN, mỗi phòng 6 ống, tiến hành phân tích 6 mẫu chotừng chỉ tiêu độ tinh khiết sắc kí và hàm lượng tạp chất bay hơi

Độ không đảm đo chuẩn của mỗi PKN : u = t

+ u2 + us1 s2 s3

Độ không đảm bảo đo lan truyền của kết quả tro sulfat theo công thức:

UKhối lượng Tro sulfat = Uchế phẩm = √u2 + u2

sulfat Tro sulfat mTro

sulfat

mchế phẩmTiến hành phép thử tro sulfat 2 lần lấy giá trị trung bình, nên:

Uc kết hợp của tro sulfat =

√u2 + uthử 1 thử 2

s

Độ không đảm bảo đo mở rộng được tính cho tổng cả kết quả của 3 phép thử tạp chất liên quan, tạp chất bay hơi và tro sulfat theo công thức:

𝐔𝐦𝐫 = √𝐮2

𝟐 + 𝐮𝟐 + 𝐮𝐜𝟏 𝐜𝟐 𝐜â𝐧

Giá trị công bố trên chứng chỉ phân tích: X  2 Umr

Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn định tính

Bảng 2.2 Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn định tính

1 Tính chất Dạng thù hình, màu sắc, mùi vị, độ tan DĐVN V

2. Nhiệt độ nóngchảy Nhiệt độ nóng chảy phải phù hợp với điểm chảytrong TL công bố DSC

3. Góc quay cựcriêng Giá trị GQC phải phù hợp với GQC trong TLcông bố phụ lục 6.4DĐVN V

Phổ IR Phải có dao động đặc trưng theo cấu trúc hoá học của chất tinh khiết trong TL đã công bố IR

Phổ UV-VIS Dữ liệu phổ UV-VIS phải có các 

6 Tạp chất liên quan Không được lớn hơn 10%

2.3.3.Xây dựng phương pháp định tính và định lượng đồng thời một

số lignan trong quả của chi Cách hoa.

Xác định độ ẩm của bột quả của chi Cleistanthus

Xác định độ ẩm của dược liệu bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô (Phụ lục 9.6, DĐVN V)

Xây dựng phương pháp định tính đồng thời một số lignan trong quả của chi Cách hoa bằng HPLC/DAD

-Khảo sát chương trình sắc kí: pha tĩnh, pha động, chương trình

gradient, bước sóng phát hiện

Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời cleistantoxin và cleisindoside D trong quả Chà chôi bằng HPLC/DAD

-Xây dựng qui trình chiết xuất đồng thời cleistantoxin và cleisindoside

D trong quả cây Chà chôi: khảo sát dung môi, kĩ thuật chiết, thời gian chiết…

-Tính hàm lượng hoạt chất

HL% =S x M x (100 − X) x 100 x 1000ST x Cc x DT x 100%

Thẩm định phương pháp phân tích bằng HPLC/DAD.

Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH: độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng và giới hạn định lượng (LOQ)

Áp dụng Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời một số lignan trong quả cây chi Cách hoa bằng HPLC/DAD

Quả cây Chà chôi và cây Cách hoa eberhardt

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

CLEISTANTOXIN VÀ CLEISINDOSIDE D

Qua khảo sát hàm lượng một số hoạt chất trong cao khô có hoạt tính

kháng ung thư trên chuột Nude và trong quả của chi Cách hoa (Cleistanthus),

tìm thấy 2 hoạt chất chính là cleistantoxin, cleisindoside D (glycosid củacleistantoxin) có hoạt tính sinh học, hàm lượng cao nhất và là những chất đặctrưng của chi này Vì vậy, lựa chọn hai chất tinh khiết này để thiết lập chấtchuẩn định lượng Bên cạnh đó, tìm thấy trong quả Chà chôi có hàm lượngcleistantoxin, cleisindoside D cao nhất, nên sử dụng nguồn thực vật này đểphân lập, tinh chế cleistantoxin, cleisindoside D làm nguyên liệu thiết lập chấtchuẩn

3.1.1.Phân lập thô cleistantoxin và cleisindoside D trên cột silica gel

Để phân lập được 2 chất cleistantoxin và cleisindoside D làmnguyên liệu thiết lập chất chuẩn sử dụng cột thuỷ tinh trung tính (80x10cm) nhồi silica gel 60 (40-63 m) Dùng hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2sau đó thêm MeOH với tỉ lệ tăng dần từ 2, 5, 10 100% Kiểm tra các bìnhgiống nhau bằng SKLM, gom các bình giống nhau vào thành một phânđoạn, thu được 23 phân đoạn (Phụ lục 1.2) Các phân đoạn được chấm lênbản mỏng cùng với chất tinh khiết cleistantoxin và cleisindoside D để tìmcác phân đoạn có chứa cleistantoxin và cleisindoside D (Hình 3.1 và 3.2)

Trên SKĐ nhận thấy phân đoạn PĐ 7, 8, 9, 10 xuất hiện 1 vết cómàu khi soi đèn UV 254 nm và hiện màu thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc,tương ứng với vết của chất cleistantoxin tinh khiết (Hình 3.1), gom cácPĐ7, 8, 9, 10 có chứa chất cleistantoxin, đem cô chân không được 10,6916

g cắn A

(a) : Phát hiện tại 254 nm (c): Hiện màu TT valinin/H2SO4 đặc

Hình 3.1 SKĐ phát hiện cleistantoxin trong các phân đoạn từ PĐ1-14

Trên SKĐ nhận thấy PĐ 16, 17, 18 xuất hiện 1 vết có màu khi soiđèn UV 254 nm và hiện màu thuốc thử vanilin/H2SO4 đặc tương ứng với vếtcủa chất cleisindoside D tinh khiết (Hình 3.2) Vì vậy, các PĐ16, 17, 18,được gom lại đem cô quay chân không thu được 52,9519 g cắn D.

(a): Phát hiện tại 254 nm (c): Hiện màu TT valinin/H2SO4 đặc

Hình 3.2 SKĐ phát hiện cleisindoside D trong các phân đoạn từ PĐ12-23

3.1.2.Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc cleistantoxin

10,6916 g cắn A thu được có chứa cleistantoxin được tiếp tục phân lập, tinh chế theo sơ đồ sau:

Hình 3.1 Sơ đồ phân lập, tinh chế cleistantoxin thành NL thiết lập chuẩn

Chất tinh chế được tiến hành đo phổ HR-MS, CD, 1D và 2D-NMR trùng khớp

với dữ liệu phổ của chất cleistantoxin phân lập từ loài C indochinensis, cho phép xác định chất tinh chế được chính là hợp chất (7R,8R,7′R,8′R)-7-hydroxy-6-

methoxy- 3′,4′:4,5-bis(methylenedioxy)-2,7′-cyclolignan-9′,9-olide có tên làcleistantoxin

3.1.3.Phân lập, tinh chế và khẳng định cấu trúc cleisindoside D

52,9519 g cắn D thu được có chứa cleisindoside D được tiếp tụcphân lập, tinh chế theo sơ đồ sau:

Hình 3.2.Sơ đồ phân lập, tinh chế cleisindoside D thành NLTLCC

Đo phổ HRESI-MS, CD, 1D và 2D-NMR chất tinh chế được trùng khớpvới dữ liệu phổ của chất là 6-methoxy-7-(β-D-glucopyranosyloxy)-3',4':4,5-bis(methylenedioxy)-2,7'-cyclolignan-9',9-olide chính là cleisindoside D.Trong quá trình phân lập cleistantoxin và cleisindoside D làm chất chuẩn gốc

định lượng, đã phân lập thêm được 0,5235 g CT1 (chất mới), 0,5481 g

cleisindoside A, lượng chỉ đủ làm chất chuẩn định tính Vì vậy, cần khẳng định

cấu trúc của cleisindoside A và xác định cấu trúc chất CT1 làm chuẩn định tính.

3.1.4.Khẳng định cấu trúc của cleisindoside A làm chất chuẩn định tính

Khi tinh chế cleisindoside D trên cột C18, tách riêng được vài lọ kết tinhdưới dạng chất rắn màu trắng, tiến hành đo phổ HR-MS, 1D, 2D-NMR và sovới tài liệu tham khảo, chất phân lập được xác định là hợp chất cleisindoside

A, do lượng chất phân lập được ít nên sử dụng làm chất chuẩn định tính.3.1.5.Phân lập và xác định cấu trúc các chất mới từ quả Chà chôi

Trong quá trình phân lập, tinh chế cleistantoxin, cleisindoside D, luận án đãphân lập, tinh chế được 8 chất Tiến hành đo phổ NMR, HR-MS, IR, UV-VIS,

CD, nhiệt nóng chảy (Mp), góc quay cực riêng ([α]α]] 𝟐

20)… đã xác định cấu trúc 8 chất lần đầu tiên phân lập từ tự nhiên và đặt tên là:

7’,8’-dehydrocleistantoxin (CT1), cleistonkiside A (CT2), cleistonkinin A (CT3), cleistonkinin B (CT4), cleistonkiside B (CT5), cleistonkinen (CT6),

cleistonkinin E (CT7), cleistonkinin C (CT8) Đây là đóng góp lớn của luận án

trong nghiên cứu các

D

hợp chất từ tự nhiên, là công trình lần đầu tiên đã công bố phân lập được 8hợp chất mới nhóm aryltetralin lignan được phân lập từ quả Chà chôi.

Trong đó, phân lập được khoảng 0,5 g CT1 làm nguyên liệu thiết lập chuẩn định tính Vì vậy phần xác định cấu trúc của CT1 là dữ liệu để xây

3.2.1. Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng cleistantoxin và cleisindoside D

Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng cleistantoxin và cleisindoside D

Kết quả khẳng định cấu trúc các chất cleistantoxin và cleisindoside D bằng1D và 2D-NMR, HR-MS, IR, UV-VIS, CD…cho thấy bộ phổ của 2 chất phânlập được trùng với bộ dữ liệu đã công bố của 2 chất cleistantoxin vàcleisindoside

D Từ đó, xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn gốc định lượngcleistantoxin và cleisindoside D gồm: tính chất, nhiệt độ nóng chảy, góc quaycực riêng, bộ phổ 1H, 13C-NMR, HR-MS, IR và UV-VIS dựa trên các tài liệu

đã công bố và các kết quả thực nghiệm của luận án (phụ lục 1.3 và 1.4)

Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc

kí của cleistantoxin và cleisindoside D bằng HPLC/DAD.

- Xây dựng phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí và tạp chất liên quan

của cleistantoxin và cleisindoside D

Cột: Inertsil® ODS-3 (250 x 4,6 mm; 5 m)