Tóm tắt: Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2oxoindolin.

Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2oxoindolin.Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2oxoindolin.Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2oxoindolin.Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2oxoindolin.Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2oxoindolin.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ MAI DUNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ

ACID HYDROXAMIC

MANG KHUNG 2-OXOINDOLIN

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC

HÀ NỘI, 2020

Công trình được hoàn thành tại:

Bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Hải Nam Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá cấp Trường họp tại: Vào hồi giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện Quốc gia Việt Nam

Thư viện Đại học Dược Hà Nội

I.MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của luận án

Trong những năm gần đây, các chất ức chế enzym HDAC đã trở thànhcác tác nhân chống ung thư đầy triển vọng Acid suberoylanilid hydroxamic(SAHA) là chất ức chế enzym HDAC đầu tiên đã được FDA cấp phéptrong điều trị u lympho tế bào T dưới da Sau đó, belinostat, panobinosatcũng đã được phép sử dụng trong điều trị một số bệnh ung thư Bên cạnh

đó, rất nhiều chất ức chế enzym HDAC, đặc biệt các dẫn chất kiểupropenamid, cũng được nghiên cứu và đang đưa vào thử nghiệm lâm sàngnhư NVP- LAQ824, MS-275, cyclodepsipeptid FK-228… Luận án đượcthực hiện theo hướng nghiên cứu nhằm tìm kiếm ra các chất ức chế HDAC

mới có hoạt tính kháng tế bào ung thư Đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2-oxoindolin” được

tiến hành với 2 mục tiêu chính

3.Những đóng góp mới của luận án

Về thiết kế tổng hợp các acid hydroxamic

Luận án đã thiết kế và tổng hợp được 62 acid hydroxamic mới, những cấutrúc này chưa được công bố trong các tài liệu trước đó

Về thử tác dụng sinh học

Thử tác dụng ức chế enzym: 21 chất dãy I-III được thử tác dụng ức chế

HDAC bằng phương pháp Wesstern blot ở nồng độ 3 µg/ml, có 18/21 chất

thể hiện tác dụng ức chế HDAC 41 chất dãy IV-X được định lượng nồng

độ ức chế HDAC2 bằng phương pháp định lượng huỳnh quang, có 6 chất

có IC50 nhỏ hơn SAHA, đa số các chất có IC50 < 6,5 µM Cả 62 chất đềuđược thử độc tính tế bào trên 3-4 dòng tế bào ung thư Kết quả, 20 chất bao

gồm Ia-g, IIa-e, Ve, Vf, VIIIe, IXc, IXg, Xa-c có độc tính mạnh hơn SAHA ở các dòng tế bào thử nghiệm Trong đó, chất Xc thể hiện tác dụng

mạnh nhất và được tiến hành thêm một số thử nghiệm gồm đánh giá tác

3

dụng ức chế HDAC1, 6, 8 và cùng với IXg, Xa, Xb được đánh giá độc tính trên tế bào phổi thường MRC-9 Kết quả, Xc có khả năng ức chế các

HDAC tương đương SAHA và có xu hướng chọn lọc HDAC1 và 6 hơnHDAC2 và 8 Các chất thử nghiệm đều thể hiện khả năng gây độc chọn lọc

tế bào ung thư hơn so với tế bào thường và mức độ chọn lọc cao hơnSAHA

4.Bố cục luận án

Luận án có 149 trang, 16 bảng, 66 hình, 15 sơ đồ Bố cục gồm các phần:Đặt vấn đề (1 trang), tổng quan (41 trang), nguyên liệu, thiết bị, nội dung vàphương pháp nghiên cứu (11 trang), kết quả nghiên cứu (57 trang), bàn luận(36 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang), danh mục các bài báo đã công bốliên quan đến luận án (1 trang) Luận án có 172 tài liệu tham khảo (14trang) và 281 phụ lục (148 trang)

II.NỘI DUNG LUẬN

ÁN Chương 1 TỔNG QUAN

Chương tổng quan đã trình bày về:

-Enzym HDAC: Khái niệm, phân loại và cấu trúc các HDAC nhóm I, II, IV

- Các chất ức chế HDAC đã được công bố theo các nhóm chất: acidhydroxamic, benzamid, peptid vòng, ceton, acid béo mạch ngắn và cácnhóm chất khác

-Phương pháp tổng hợp vòng triazol: cơ chế, xúc tác, phối tử

-Phương pháp tổng hợp acid hydroxamic từ ester

-Định hướng thiết kế cấu trúc các chất trong luận án

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị

-Các nguyên liệu, hóa chất, dung môi: Đức, Trung Quốc, Việt Nam

-Các dụng cụ thí nghiệm thông thường dùng trong tổng hợp hữu cơ

- Các máy đo nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân Máy đo độ hấp thụ huỳnh quang, tủ nuôi cấy, máyđiện di

-Các dòng tế bào ung thư người thử nghiệm

2.2 Nội dung nghiên cứu

-Tổng hợp 62 dẫn chất acid hydroxamic

- Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp dựa trên phân tích dữ liệu phổ

khối, phổ hồng ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H, 13C-NMR)

-Thử tác dụng ức chế HDAC của các chất tổng hợp được

-Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người in vitro của các chất tổng hợp được.

Chương 3 KẾT QUẢ

3.1 Tổng hợp và kết quả phân tích phổ

Các chất được tổng hợp theo các quy trình dưới đây:

* Nhóm các acid hydroxamic không chứa vòng triazol

Gồm 3 dãy chất Ia-g, IIa-g, IIIa-g được tổng hợp theo các sơ đồ dưới đây,

và được khẳng định có cấu trúc đúng như dự kiến dựa vào kết quả phântích các phổ

+ Dãy Ia-g

+ Dãy IIa-g

+ Dãy IIIa-g

+ Dãy IV - VIII

+ Dãy IXa-g + Dãy Xa-c

Năng lượng tương tác của các chất đều nhỏ hơn SAHA cho thấy tiềmnăng ức chế HDAC2 của các chất có thể so sánh với SAHA Ngoài ra, hìnhảnh tương tác của các chất ở mô hình trung tâm hoạt động của HDAC2(Hình 3.1) cũng cho thấy, các chất đều có phần cầu nối nằm trọn trong lòngkênh enzym, nhóm chức acid hydroxamic tiếp cận được tới ion kẽm ởkhoảng cách đủ gần để có thể tạo được phức chelat Ngoài ra, những chất

có vòng thơm trong phần cầu nối, đặc biệt là vòng benzen, tạo được cáctương tác van der Waals kiểu xếp chồng π-π với Phe155 và Phe210 Đâyđược dự đoán là yếu tố quan trọng tạo nên ái lực liên kết tốt

Hình 3.1: Hình ảnh docking của dãy chất IIIa-g

Phản ứng alkyl hoá: Cơ chế phản ứng là phản ứng thế nucleophil,

được minh hoạ trong Sơ đồ 4.1

Sơ đồ 4.1 Cơ chế phản ứng alkyl hoá

Theo các tài liệu tham khảo, phản ứng N-alkyl hoá khung indolin đều

được tiến hành trong môi trường base với tác nhân alkyl hoá là các dẫnxuất halogen Một số loại base thường được sử dụng trong quá trình gắnmạch alkyl vào nguyên tử N trên khung indolin có thể kể đến như: Na2CO3,K2CO3, Cs2CO3, LiH, NaH, CaH2, TEA, LiOH, NMP, NaOEt Các loạidung môi có thể sử dụng trong phản ứng này gồm: DMF, DMA, HMPT,MeCN, DMSO, NMP, EtOH, MeOH, Me2CO So sánh các xúc tác base vàdung môi về sự thuận lợi cho thao tác, sự sẵn có cũng như giá thành củanguyên liệu luận án đã lựa chọn sử dụng chất xúc tiến là K2CO3, dung môiDMF và xúc tác KI Sự có mặt của KI giúp tăng tốc độ phản ứng, do xảyphản ứng trao đổi nhóm khó bị thế -Br bằng nhóm dễ bị thế hơn -I theo

phản ứng Finkelstein Kết quả thu được các phản ứng N-alkyl hoá đều có

thể tiến hành thuận lợi trong điều kiện này với hiệu suất tương đối cao từkhoảng 75,0–96,0%

Phản ứng azid hoá : dùng trong các giai đoạn tổng hợp các chất trung

gian azid Đây là phản ứng theo cơ chế thế nucleophil (Sơ đồ 4.2):

Sơ đồ 4.2 Cơ chế phản ứng azid hoá

Trong trường hợp này, muối azid natri là một tác nhân nucleophil rấtmạnh nên quá trình phản ứng có thể diễn ra trực tiếp mà không cần giaiđoạn hoạt hoá Phản ứng azid hoá là phản ứng thế SN2 nên thường đượctiến hành trong dung môi phân cực không proton như acetonitril,dimethylsulfoxid, dimethylformamid Tuy nhiên, một số nghiên cứu gầnđây cho thấy phản ứng azid hóa cũng có khả năng phản ứng tốt trong môitrường nước có sử dụng sóng siêu âm hỗ trợ hay hỗn hợp dung môi nước-THF Trong giai đoạn khảo sát lựa chọn dung môi, luận án đã thử tiến hành

phản ứng tổng hợp chất 3.9 trong nước và hỗn hợp nước-THF Nhưng do nguyên liệu ban đầu methyl 3-bromopropanoat (chất 3.8) là chất lỏng

không màu, có tính phân cực kém, không đồng tan trong nước và có tỷtrọng nặng hơn nước nên thường tách lớp nằm phía dưới đáy bình cầu Dù

đã sử dụng khuấy từ cũng như đun hồi lưu để hỗ trợ quá trình khuấy trộntrong bình cầu nhưng phản ứng vẫn diễn ra rất khó khăn Do đó, phản ứngđược khảo sát tiếp theo với dung môi methanol, dung môi này ít phân cực

hơn nước, có khả năng hoà tan được cả ester 3.8 và NaN3 Kết quả khảo sát

cho thấy sau khoảng 6 h ở điều kiện nhiệt độ phòng phản ứng diễn ra hoàn

toàn Quá trình tổng hợp các dẫn xuất alkyl azid khác gồm 3.12, 3.15, 3.18, 3.21, 3.24 cũng được tiến hành tương tự với dung môi methanol và điều

kiện nhiệt độ phòng Nhìn chung, các phản ứng tổng hợp các dẫn chất aziddiễn ra tương đối thuận lợi, nhưng quá trình xử lý phản ứng phải trải quagiai đoạn tách chiết nên hiệu suất thu không cao chỉ khoảng từ 48,5% đến68,4%

Phản ứng đóng vòng Click: phản ứng dùng để tạo thành cấu trúc

1,2,3-triazol trong cấu tạo của các dãy chất từ IV đến X Để phản ứng diễn ra

theo hướng tạo một sản phẩm duy nhất mang khung 1,2,3-triazol xúc tácđược lựa chọn là muối đồng (I): CuI Muối CuI có ưu điểm là độ phân cựckhác biệt nhiều so với các sản phẩm tạo ra nên giai đoạn xử lý phản ứngloại xúc tác tồn dư diễn ra thuận lợi hơn so với các muối đồng khác thườngđược dùng làm xúc tác như CuOTf.C6H6 hay CuSO4.5H2O/Natri ascorbat.Dựa trên kết quả nghiên cứu của Yan Z.Y và cộng sự và một số nghiên cứukhác một số dung môi đã được lựa chọn để khảo sát phản ứng đóng vòngClick gồm: nước, aceton, t-BuOH, acetonitril, DMF Các alkyn và nitrilkhông tan hoặc ít tan trong nước, aceton và t-BuOH nên phản ứng hầu nhưkhông diễn ra trong các dung môi này Ngược lại, phản ứng diễn ra khá tốttrong dung môi DMF và acetonitril Khi sử dụng dung môi DMF, phản ứngđóng vòng có thể tiến hành ở điều kiện nhiệt độ phòng và thời gian phảnứng khá nhanh từ 3-5 h Do nhiêt độ sôi của DMF khá cao (153oC) nênkhông thể loại dung môi bằng phương pháp cất quay chân không Hướng

xử lý phản ứng trong trường hợp này sẽ là tạo kết tủa sản phẩm trong môitrường nước, kết tủa thu được sẽ bao gồm sản phẩm và lượng CuI dùnglàm xúc tác Quá trình xử lý buộc phải tiến hành tinh chế thêm một bướcnữa Vì vậy, thời gian xử lý phản ứng khá dài và lượng sản phẩm tinh khiếtthu được với hiệu suất khá thấp (dưới 40%) Trong khi đó, nếu sử dụngdung môi acetonitril thì sau khi kết thúc phản ứng có thể dễ dàng loại bỏdung môi bằng phương pháp cất quay và tinh chế sản phẩm chỉ cần qua một

bước, lượng sản phẩm tinh khiết thu được với hiệu suất tương đối cao

khoảng trên 60% Vì vậy, dung môi acetonitril là dung môi được lựa chọn

để tiến hành các phản ứng đóng vòng để tạo khung 1,2,3-triazol Nhìnchung, phản ứng Click là một phản ứng tương đối dễ thực hiện, tiến hànhtrong điều kiện đơn gian và có hiệu suất cao từ 58,2% đến 89,0%

Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic: phản ứng cuối cùng của mỗi

chuỗi phản ứng để tạo ra các acid hydroxamic theo thiết kế ban đầu Cơ chếphản ứng được minh hoạ trong Sơ đồ 4.3 như sau:

Sơ đồ 4.3 Sơ đồ cơ chế phản ứng tạo acid hydroxamic từ ester

Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic từ ester và hydroxylamin là một

phản ứng N-acyl hoá theo cơ chế thế nucleophil Phản ứng chỉ có thể diễn

ra trong môi trường kiềm mạnh pH > 10 Nguyên liệu hydroxylamin thamgia phản ứng thường được dùng dư khá nhiều so với ester để đảm bảo thuđược tối đa sản phẩm acid hydroxamic từ một lượng ester ban đầu Theocác tài liệu tham khảo, hydroxylamin có thể dùng dưới dạng muối NH2OH.HCl và khi tham gia phản ứng cần sự có mặt của các chất kiềm mạnh đểchuyển hoàn toàn thành dạng base Do đó, các phản ứng tạo acidhydroxamic trong luận án đều sử dụng NaOH thêm vào hỗn hợp phản ứngvới tỷ lệ gấp đôi số mol NH2OH.HCl Lượng NaOH dùng dư để chuyểnhoàn toàn hydroxylamin thành dạng base, đồng thời tạo được pH môitrường đủ cao để phản ứng có thể diễn ra Ngoài ra, do cấu trúc của cácacid hydroxamic được thiết kế khá cồng kềnh, không có nhiều nhóm chứcthân nước nên khả năng tan trong nước có thể dự đoán là rất thấp (thực tế

là các chất đều không tan trong nước) nên khi được tạo thành có thể kết tủangay trong bình phản ứng, cản trở sự tương tác của các ester vớihydroxylamin Do đó, một lượng dư NaOH là cần thiết để chuyển dạngacid sang dạng muối hydroxamat tan được trong hỗn hợp dung môi phảnứng Và sau khi kết thúc phản ứng cần acid hoá dung dịch về pH = 3 – 4 đểthu được sản phẩm acid hydroxamic dạng kết tủa Phản ứng tạo acidhydroxamic của các chất trong luận án có hiệu suất phản ứng dao động từ45,0 đến 82,5%

MS, 1H-NMR và 13C-NMR Các chất Ia, VIIa và IXa được chọn làm chất

đại diện để đo phổ 2D NMR HMBC và HSQC

là chứng minh cho sự hiện diện của nhóm chức acid hydroxamic ở tất cảcác chất mục tiêu tổng hợp được

-Các vòng benzen có dao động hóa trị C-H vòng thơm xuất hiện trongkhoảng 3089 – 3004 cm-1 và dao động hóa trị C=C vòng thơm xuất hiệntrong khoảng 1615 – 1456 cm-1

-Phần cầu nối alkyl của các chất tổng hợp được cũng cho thấy sự cómặt trên phổ đồ với dao động hóa trị bất đối xứng CH2 từ 2998 – 2903 cm-1

và dao động hóa trị đối xứng CH2 từ 2895 – 2834 cm-1 Vị trí xuất hiện củahai đỉnh hập thụ này tương đối cố định trong mỗi dãy dẫn chất

-Trong vùng khoảng 1660 –1820 cm-1 của hầu hết các chất đều có haiđỉnh hấp thụ với cường độ mạnh và độ rộng trung bình Đây là dải phổ đặctrưng cho dao động hóa trị của liên kết C=O Tương ứng với hai nhómchức carbonyl trong cấu trúc của các chất mục tiêu gồm nhóm C=O ở vị trí

số 2 trên khung indolin và nhóm C=O của chức acid hydroxamic Giá trịcủa 2 đỉnh hấp thụ dao động trong khoảng 1685-1638 và 1735-1703 cm-1.4.2.2.Phổ khối lượng

Phổ khối lượng đóng vai trò quan trọng trong khẳng định cấu trúc cácchất tổng hợp và thường được dùng để kiểm chứng xem sản phẩm phản ứngđược tạo thành có khối lượng phân tử đúng như công thức dự kiến haykhông

Sau khi phân tích ion phân tử thu được trên phổ khối lượng, kết quảcho thấy tất cả các chất đều có sự phù hợp giữa kết quả đo khối phổ vớicông thức phân tử dự kiến Một số chất trên phổ đồ xuất hiện pic M+23tương ứng với ion [M+Na]+ thay vì pic [M+H]+ trên phổ ESI(+) Đây là

hiện tượng thường gặp trong phương pháp đo ESI vì dòng khí mang hoặc

bên trong thiết bị có thể chứa ion H+, Na+, K+ Như vậy, phổ khối lượng là cơ

sở để khẳng định các chất tổng hợp được có công thức phân tử đúng như dựkiến

4.2.3.Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ cộng hưởng từ proton 1 H-NMR:

4.2.3.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của dãy chất Ia-g, IIa-g và IIIa-g

-Proton vị trí 4” (H-4”) có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 7,03 –8,01 ppm Tín hiệu cộng hưởng của proton H-4” có thể có dạng singlet,doublet hoặc doublet-doublet, do có tương tác ghép cặp với proton H-5”,

JH4”-H5”(ortho) = 7,0 – 8,5 Hz, tương tác với proton H-6”, JH4”-H6”(meta) = 2,0 –

2,5 Hz hoặc tương tác với F, JH4”-F(ortho) = 6,5 – 8,5 Hz.

-Proton vị trí 5” có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 7,07–7,15 ppm,tín hiệu cộng hưởng có dạng triplet do có tương tác ghép cặp với proton H-4” và H-6” ở các chất không có nhóm thế hoặc các chất mang nhóm thế 7”-

Cl Hằng số ghép cặp của proton H-5” với hai proton bên cạnh là JH5”-4”(ortho) =

JH5”-6”(ortho)= 7,5–8,5 Hz

-Proton vị trí 6” có độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 6,94 – 7,56 ppm.Tín hiệu cộng hưởng của proton H-6” có các dạng là doublet, triplet,doublet-doublet hoặc doublet-triplet Dạng tín hiệu cộng hưởng doublet vàdoublet-doublet của proton H-6” có thể xuất hiện ở phổ đồ của các chấtmang nhóm thế không phải F ở vị trí 5”, 7” do tương tác với các proton H-5”, 7” và 4” Dạng tín hiệu cộng hưởng triplet hoặc doublet-triplet xuất hiệntrên phổ đồ của các chất không mang nhóm thế hoặc mang nhóm thế F ở vịtrí 5” do tương tác với H-4”, 5”, 7” và nguyên tử F

-Proton vị trí 7” có độ dịch chuyển hóa học tương đối ổn định, ít bị ảnhhưởng bởi các nhóm thế hút hay đẩy electron, chỉ thay đổi trong mộtkhoảng hẹp 6,82 – 7,02 ppm Dạng tín hiệu cộng hưởng của proton H-7” đa

số trường hợp là doublet do có tương tác ghép cặp với H-6”, JH7”-6”(ortho) =

7,5 – 8,5 Hz Riêng với hai chất có nhóm thế 5”-F (Ib, IIIb), tín hiệu cộng

hưởng có dạng doublet-doublets do H-7” ngoài tương tác với H-6” còn có

tương tác ghép cặp với nguyên tử F, JH7”-F(meta) = 4,0 Hz.

-Hai proton của cầu nối methylen cũng có độ dịch chuyển hóa học tươngđối ổn định, nằm trong khoảng 4,82 – 4,95 ppm Ngoại trừ, các dẫn xuất cónhóm thế 7”-Cl, pic của proton methylen bị dịch chuyển về vùng trườngthấp nằm trong khoảng 5,21 – 5,30 ppm

- Khung benzen trong phần cầu nối có dạng thế di-para, có 4 proton tạothành hai cặp đối xứng là cặp 2’, 6’ và 3’, 5’ Vị trí cộng hưởng của các cặptương đối cố định với δH3’-H5’ = 7,19 – 7,35 ppm, δH2’-H6’ = 7,51 – 7,54 ppm.Tín hiệu cộng hưởng của cả hai cặp proton luôn là doublet có hằng số ghép

cặp JH2’-H3’(ortho) = JH5’-H6’(ortho) = 7,0 – 8,5 Hz

-Cầu nối –CH2=CH2- có hai proton có giá trị nằm trong khoảng δH-2 = 6,42