Tóm tắt: Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid.

Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid.Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid.Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid.Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid.Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid.Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid.Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Công trình được hoàn thành tại:

Bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Đình Luyện

Vào hồi: giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện Quốc gia Việt NamThư viện trường Đại Học Dược Hà Nội

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN

ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

1 Nguyễn Minh Ngọc, Trần Thị Kim Ngân, Nuyễn Văn Phương,

Nguyễn Thị Hường, Nguyễn Văn Hải, Nguyễn Đình Luyện (2018),

‘Nghiên cứu tổng hợp berberin từ piperonal”, Tạp chí hóa học, Số

4ER 23 R55, tháng 7/2018, tr.240 - 243

2 Nguyễn Minh Ngọc, Phạm Trung Kiên, Nguyễn Thị Hường,

Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Văn Hải, Nguyễn Đình Luyện (2019)

“Nghiên cứu quy trình tổng hợp, tinh chế berberin clorid dược

dụng”, Tạp chí Hóa học, Tập 57, Số 6ER 1,2 R, Tháng 12/2019, tr 441

-446

3 Nguyễn Đình Luyện, Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Minh Ngọc, Lê

Thị Hương, Phạm Trung Kiên, Nguyễn Văn Hải, (2019), “Nghiêncứu cải tiến quy trình tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid làm

nguyên liệu quan trọng điều chế berberin”, Nghiên cứu Dược và

Thông tin thuốc, Số 1, năm 2019, tr 21 - 26.

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Berberin là một hóa dược phổ biến dùng để sản xuất thuốc chođiều trị các bệnh liên quan đến nhiễm khuẩn đường ruột và ức chếtình trạng kích thích co thắt nhu động ruột Berberin được sử dụngrộng rãi tại Việt Nam từ những năm 1960 làm thuốc chữa lỵ vànhiễm khuẩn đường ruột Ngoài ra, berberin còn có trong thành phầncủa một số loại thuốc khác như thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc,đau mắt đỏ do tác nhân kích thích bên ngoài và thuốc điều trị bệnhđau mắt hột Hiện nay, rất nhiều tác dụng khác của berberin đượcnghiên cứu và ứng dụng lâm sàng như giúp ngăn ngừa nhiễm nấm,bội nhiễm nấm và chống lại tác hại của vi khuẩn tả, hạ đường huyết,làm giảm mạnh lượng cholesterol, triglycerid và xơ vữa Berberinngăn chặn sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thư mà không ảnhhưởng đến sự phát triển của các tế bào bình thường Ngoài ra,berberin còn có tác dụng bảo vệ tim mạch, đồng thời có tác dụngchống trầm cảm

Nhu cầu về berberin ngày càng tăng Tại Việt Nam, nhu cầu sửdụng berberin cũng rất lớn Trên thế giới, ngành công nghiệp dượcđang phải đối mặt với việc khai thác tràn lan quá mức các loại dượcliệu mà chưa có chiến lược bảo tồn hợp lý, nguồn nguyên liệu chiếtxuất berberin đang đứng trước nguy cơ cạn kiệt Việc canh tác truyềnthống tại các vùng trồng dược liệu chứa berberin hiện nay cũngkhông đáp ứng được nhu cầu của thị trường thuốc hiện tại Trên thếgiới, các quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc đã tổng hợp, thươngmại hóa chế phẩm berberin tổng hợp từ rất lâu Các nghiên cứu mới

về berberin đã được các nhà khoa học trên thế giới phát triển trongnhiều thập kỉ nay Chúng tôi thấy rằng sản xuất berberin bằng con

đường tổng hợp hóa học nhằm đảm bảo sự ổn định, bền vững nguồnnguyên liệu là rất triển vọng và thiết thực Vì vậy, Nghiên cứu xâydựng quy trình sản xuất tổng hợp berberin clorid và vấn đề cấp thiết,

có ý nghĩa khoa học, góp phần phát triển ngành công nghiệp Hóadược Việt Nam

2 Mục tiêu của luận án

- Xây dựng được quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô500g/mẻ đạt tiêu chuẩn Dược dụng

- Đánh giá được độc tính cấp và độ ổn định của sản phẩmberberin clorid tổng hợp được

3 Nội dung của luận án

- Tổng hợp và tinh chế berberin clorid ở quy mô phòng thí nghiệm:Tổng hợp berberin clorid và các chất trung gian từ nguyên liệuvanilin, piperonal thông qua trung gian homopiperonal

- Tổng hợp berberin clorid theo phương pháp mới từ dimethoxybenzaldehyd qua chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim

2,3 Kiểm tra độ tinh khiết, xác định cấu trúc hóa học của berberin clorid tổng hợp được và các chất trung gian

- Tinh chế nguyên liệu berberin tổng hợp được đạt tiêu chuẩn dược dụng quy mô phòng thí nghiệm

- Cải tiến và nâng cấp quy mô tổng hợp berberin clorid ở quy mô 100g/mẻ và 500 g/mẻ

- Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu berberin tổng hợp được

- Kiểm nghiệm nguyên liệu berberin clorid tổng hợp được theo tiêu chuẩn cơ sở

- Nghiên cứu độ ổn định của nguyên liệu berberin clorid tổng hợp được ở điều kiện lão hóa cấp tốc và điều kiện dài hạn

- Thử độc tính cấp của sản phẩm berberin clorid tổng hợp.

4 Những đóng góp mới của luận án

- Lần đầu tiên ở Việt Nam, đưa ra được quy trình tổng hợp toàn phầnberberin clorid từ nguyên liệu vanilin qua trung gian piperonal, trunggian homopiperonylammin clorid và lần đầu tiên trên thế giới tổnghợp berberin clorid từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd qua chất trunggian 2,3-dimethoxybenzaldoxim

- Cải tiến được quy trình tổng hợp quy mô 100g/mẻ và quy mô 500g/mẻ với hiệu suất đạt 40,7% thông qua 4 giai đoạn tổng hợp đi từpiperonal và 1 giai đoạn tinh chế Quy trình thực hiện được trongđiều kiện tại Việt Nam, thân thiện với môi trường và có thể áp dụngtrong sản xuất ở quy mô lớn

- Nguyên liệu berberin clorid tổng hợp được đã ổn định trong thờigian theo dõi và thử độc tính an toàn trên chuột Sản phẩm nguyênliệu berberin tổng hợp có thể được ứng dụng trong điều trị và bình ổngiá thành sản phẩm

5 Cấu trúc của luận án

- Luân án gồm 154 trang, 63 bảng, 48 hình, 123 tài liệu tham khảo

Bố cục gồm: Đặt vấn đề (1 trang); tổng quan 20 (trang); đối tượng vàphương pháp nghiên cứu (7 trang); kết quả nghiên cứu (70 trang);bàn luận (40 trang); kết luận và đề xuất (3 trang); danh mục các côngtrình đã công bố liên quan đến luận án (1 trang); tài liệu tham khảo(12 trang); phụ lục (trang 45)

Chương 1 TỔNG QUAN

Phần tổng quan trình bày các nội dung: Khái quát chung về berberinclorid, đặc điểm cấu trúc hóa học, tính chất hóa lý, ứng dụng tronglâm sàng, tác dụng dược lý khác, ưu nhược điểm phương pháp sản

xuất berberin và phân tích và lựa chọn phương pháp tổng hợp

- Thiết bị tổng hợp và phân tích đáng tin cậy

2.2.1 Tổng hợp hóa học và tinh chế sản phẩm, khảo sát các thông

O O

Tổng hợp berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd và homopiperonal

thông qua hợp chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62) theo

N OH H+, Fe

H 3 C O

OMe OMe

Hình 2.2 Sơ đồ tổng hợp berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd qua chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62)

2.2.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết

Sản phẩm được kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc

ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Các sản phẩm tổng hợp được xác định cấu trúc thông quacác số liệu phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR) và phổ cộnghưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR)

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu độ ổn định của nguyên liệu tổng hợp được

Nghiên cứu đánh giá độ ổn định của nguyên liệu berberinclorid tổng hợp được theo thông tư 44/2014/TT-BYT và theo hướngdẫn của ICH-Q1A(R2) ở hai điều kiện:

+ Điều kiện lão hoá cấp tốc:

+ Điều kiện dài hạn

+ Hàm lượng của berberin clorid và hàm lượng tạp chất được đánh giá bằng phương pháp HPLC.

2.2.5 Phương pháp thử độc tính cấp của nguyên liệu tổng hợp được

Phương pháp thử độc tính cấp theo hướng dẫn của Bộ Y tế

a Tổng hợp piperonal từ vanilin qua hai giai đoạn với hiệu suất 57,4

%.

+ Giai đoạn 1: Hợp chất trung gian chưa được thương mại hóapiperonal được điều chế từ vanilin qua 2 bước phản ứng với hiệu suấtcao Đây là con đường tổng hợp hoàn toàn mới trong sự hiểu biếtcủa chúng tôi trong lĩnh vực tổng hợp berberin

+ Giai đoạn 2: Hợp chất trung gian piperonal (25) kết hợp vớinitrometan tham gia phản ứng nitroaldol (phản ứng Henry) gồm 2giai đoạn bao gồm tạo liên kết cacbon – cacbon để tạo thành hợpchất ß-hydroxyl, kế tiếp sau đó là tạo thành hợp chất 61 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren qua phản ứng tách nước

b Tổng hợp và lựa chọn được điều kiện phản ứng tối ưu để tổng hợp

homopiperonylamin (6a) từ piperonal với hiệu suất 87% qua hai giai

đoạn phản ứng.

Hợp chất homopiperonylamin hydroclorid (6a) được lựa chọn là hợpchất trung gian tiếp theo trong quy trình tổng hợp do tính ổn định củahợp chất này trong điều kiện khí hậu Việt Nam, khó bay hơi và đễ

thao tác Hợp chất 6a được tổng hợp từ tiền chất 61

3,4-methylendioxy-β-nitrostyren thông qua phản ứng hydro hóa hợp chất

chứa nhóm nitro

c Tổng hợp berberin clorid từ homopiperonylamin (6a) với một số

điều kiện phản ứng đã được tối ưu với hiệu suất 57% qua hai giai đoạn phản ứng.

+ Giai đoạn 1: hợp chất dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid 31 được tổng hợp bằngphương pháp ngưng tụ imin hợp chất trung gian 6a và aldehyd 2,3-dimethoxybenzaldehyd, tiếp ngay sau đó là phản ứng khử hóa nhómimin tạo thành hợp amin bậc hai dưới dạng muối clorid

2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-+ Giai đoạn 2: Berberin thu được từ phản ứng ngưng tụ đóng vònghợp chất 31 và oxi hóa tạo hệ liên hợp thơm của berberin và phảnứng axit base tạo muối

- Phương pháp mới tổng hợp berberin clorid từ dimethoxybenzaldehyd qua chất trung gian 2,3- dimethoxybenzaldoxim

2,3-+ Giai đoạn 1: Hợp chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62)

được tổng hợp từ aldehit thơm đơn giản 2,3-dimethoxybenzaldehydbằng phản ứng ngưng tụ oxim (hiệu suất 89,5%)

+ Giai đoạn 2: khử hóa oxim bằng các nguồn hydro trong môi trường

axit nhằm tạo hợp chất (2,3-dimethoxyphenyl)methanamin (63) (hiệu

suất 85,6%)

+ Giai đoạn 3: hợp chất

2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid 31 được tổng hợp bằng phương pháp ngưng tụ imin hợp chất trung gian 63 và aldehyd

homopiperonal, tiếp ngay sau đó là phản ứng khử hóa nhóm imin tạothành hợp amin bậc hai dưới dạng muối clorid (hiệu suất 79,5%)

+ Giai đoạn 4: tương tự với bước số 5 của phương pháp sử dụngvalinin, berberin thu được từ phản ứng ngưng tụ đóng vòng hợp chất

31 và oxi hóa tạo hệ liên hợp thơm của berberin và phản ứng acid

base tạo muối (hiệu suất 65,1%)

3.2 Xây dựng quy trình tinh chế berberin clorid quy mô phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn dược dụng

- Lựa chọn được điều kiện kết tinh và dung môi ethanol 96% để tinhchế berbebrin clorid tổng hợp được đạt tiêu chuẩn DĐVN V ở quy

mô phòng thí nghiệm Hàm lượng đạt 97,6%

3.3 Xây dựng quy trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid quy

mô 100 g/mẻ

- Nâng cấp quy trình tổng hợp berberin clorid ở quy mô 100 g/mẻ từpiperonal đạt tiêu chuẩn dược dụng Trong đó đã cải tiến được phản

ứng khử hóa dẫn chất nitrostyren 61 bằng tác nhân thay thế

Fe/NHR 4 RCl để phù hợp với điều kiện thực tế

- Hiệu suất quá trình tổng hợp berberin clorid từ piperonal theophương pháp cải tiến mới đạt độ lặp lại với hiệu suất 42%, đạt tiêuchuẩn dược dụng

3.4 Xây dựng quy trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid quy mô 500 g/mẻ

- Nâng cấp quy trình tổng hợp berberin clorid ở quy mô 500 g/mẻ từpiperonal đạt tiêu chuẩn cơ sở với hiệu suất 40,7% Nguyên liệu banđầu là piperonal, bao gồm 4 giai đoạn phản ứng và 1 giai đoạn tinh chế và đã có những biện pháp phù hợp để xử lý môi trường qua mỗigiai đoạn

Bảng 3.47 Kết quả kiểm nghiệm nguyên liệu berberin clorid

tổng hợp được ở quy mô 500g/mẻ

1 Tính chất Bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị

đắng Tan trong nước nóng, khó tan trong cloroform, không tan trong ether

CR 20 RHR 18 RNOR 4 RCl, tính theo chế phẩmkhan

Đạt (100,0%)

3.5 Khẳng định cấu trúc hóa học của các chất tổng hợp được

- Berberin và các chất trung gian tổng hợp được khẳng định cấu trúc đúng bằng các phương pháp phân tích phổ IR, NMR và MS

3.6 Kết quả nghiên cứu độ ổn định và thử độc tính cấp của nguyên liệu berberin tổng hợp

- Số liệu độ ổn định ở điều kiện lão hóa cấp tốc cho thấy sảnphẩm không có biến đổi đáng kể về các chỉ tiêu chất lượng đã theodõi

- Sau 12 tháng bảo quản ở nhiệt độ dài hạn, mẫu nguyên liệucủa cả 3 lô sản xuất không có sự biện đổi nhiều về các chỉ tiêu chấtlượng đã thử Khi sử dụng phần mềm Minitab 18 để dự đoán tuổi thọ

của sản phẩm cho thấy sản phẩm có tuổi thọ dự đoán là 24 tháng 3.7 Kết quả thử độc tính cấp của sản phẩm berberin clorid tổng hợp được

Thử nghiệm độc tính cấp trên chuột nhắt trắng theo đường uống của nguyên liệu berberin chlorid cho thấy:

Mức liều thấp nhất gây chết động vật nghiên cứu quan sát được (10% động vật nghiên cứu) là 1,56 g/ kg chuột nhắt trắng

Mức liều cao nhất gây chết động vật nghiên cứu quan sátđược (90% động vật nghiên cứu) là 11,25 g/ kg chuột nhắt trắng

Mức liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LDR 50 R) của

nguyên liệu berberin chlorid là 4,0 (2,3 – 5,6) g/kg.

Biểu hiện độc tính cấp quan sát được trên chuột nhắt trắngbao gồm: giảm hoạt động, hơi dựng lông, da và niêm mạc nhợt, chết.Tùy thuộc mức liều sử dụng, các tác dụng này có thể xuất hiện sớm,trong vòng 15 - 30 phút, và kéo dài tới 16 giờ sau khi chuột đượcuống mẫu thử Các động vật thường chết trong vòng 4-8 giờ sau khiuống mẫu thử Trên các chuột còn sống, các biểu hiện độc tính đều

có thể phục hồi được sau 24 giờ

Chương 4 BÀN LUẬN 4.2.1 Về phương pháp tổng hợp berberin mới

Bằng cách phân tích tổng hợp ngược phân tử berberin, Luận

án đề xuất quy trình tổng hợp mới thay thế việc sử dụng chất trung

gian piperonal bằng hợp chất dimethoxybenzaldoxim (63) từ

2,3-dimethoxybenzaldehyd Điểm mới của phương pháp tổng hợp này làthay đổi vị trí của nhóm amin so với quy trình phía trên từ cấu trúcphức tạp dựa trên phân tử piperonal sang một cấu trúc đơn giản hơncủa dimethoxybenzaldehyd Quy trình tổng hợp được trình bày tómlược lại bao gồm 4 bước:

Bước tổng hợp số 1: Hợp chất trung gian

2,3-dimethoxybenzaldoxim (62) được tổng hợp từ aldehyd thơm đơn

giản 2,3-dimethoxybenzaldehyd bằng phản ứng ngưng tụ oxim Đây

là phản ứng đi qua 2 giai đoạn: cộng hợp ái nhân vào nhóm carbonyl,tiếp theo đó có sự dehydrat hóa

Bước tổng hợp số 2: khử hóa oxim bằng các nguồn hydrotrong môi trường acid nhằm tạo hợp chất (2,3-

Bước tổng hợp số 4: tương tự với bước số 5 của phương

pháp sử dụng valinin, berberin thu được từ phản ứng ngưng tụ đóng

vòng hợp chất 31 và oxi hóa tạo hệ liên hợp thơm của berberin và

phản ứng acid bazơ tạo muối được lặp lại và không có thêm nghiêncứu sâu hơn

Mặc dù đã tổng hợp berberin clorid bằng phương pháp mới

từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd, những hiệu suất tổng của quá trìnhcòn khiêm tốn 36,23% qua 4 giai đoạn phản ứng với hiệu suất lầnlượt là 89,50%, 85,63%, 79,52%, 59,45% Đây là con đường tổnghợp mới chưa từng công bố không đi qua trung gian

homopiperonalamin (6) mà thông qua trung gian dimethoxybenzaldoxim (63) Các phương pháp tổng hợp berberin

2,3-clorid và các hợp chất trung gian đều dựa trên các hóa chất đã đượcthương mại hóa Thông thường, giá thành các chất nguyên liệu banđầu đều rất cao hoặc cần đòi hỏi nhiều bước tổng hợp, xử lý trướckhi đến được sản phẩm cuối cùng Điểm mới cần được nhấn mạnhtrong luận án này là việc sử dụng chất đầu quy trình rẻ tiền, dễ kiếm

Việc bắt đầu quy trình sản xuất berberin dựa trên chất hóahọc phổ biển nhu vanillin, piperonal có rất nhiều ý nghĩa trong côngnghiệp dược bởi lẽ điều đó sẽ đảm bảo tính an toàn trong dây truyềnsản xuất cũng như làm hạ giá thành sản phẩm berberin

Bên cạnh đó, việc sử dụng các phương pháp khác nhau chocùng một phản ứng của mỗi bước trong quy trình sản xuất berberinđược đánh giá có hiệu quả trong việc khảo sát các điều kiện phảnứng phù hợp trước và sau khi nâng quy mô mẻ Các dữ liệu mô tảmối liên hệ giữa điều kiện phản ứng, hệ xúc tác với giá trị hiệu suấtcủa phản ứng trong quy mô phòng thí nghiệm lần đầu tiên được thuthập với mục đích tổng hợp berberin Kết quả tổng hợp của bộ số liệu

sẽ giúp dự đoán quy trình sản xuất khi mở rộng quy mô mẻ có phùhợp với điều kiện trong nước