Luận văn thạc sĩ thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa enzyme columbamine o methyltransferase

Chi Bình vôi Stephanta có khoảng trên 45 loài, còn ở Việt Nam có từ 14 đến 16 loài, trong đó một số loài như Bình vôi hoa đầu Stephania cepharantha Hayata, Bình vôi tím Stephania rotun

34 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

Tangmany SYSOMEPHONE

THIẾT KẾ CẤU TRÚC VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN MÃ HÓA ENZYME COLUMBAMINE O- METHYLTRANSFERASE

Ở CÂY BÌNH VÔI (Stephania spp.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN, NĂM 2020

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS Phạm Thị Thanh Nhàn

THÁI NGUYÊN, NĂM 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn: “Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen

mã hóa enzyme columbamine O-methyltransferase ở cây Bình vôi (Stephania

spp.)” là công trình nghiên cứu của riêng tôi Mọi kết quả thu được là trung thực, không sao chép từ kết quả nghiên cứu khác Tất cả những tham khảo và

kế thừa đều được trích dẫn đầy đủ

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020

Tác giả luận văn

Tangmany SYSOMEPHONE

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn chính phủ hai nước Lào và Việt Nam đã dành

cho tôi học bổng học tập, để tôi có thể bước chân vào học tập và nghiên cứu tại

Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Thanh Nhàn,

người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi trong

quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hỗ

trợ của Đề tài cấp Bộ mã số B2019-TNA-09

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, bộ phận Sau đại học

của Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã trang bị cho tôi

những kiến thức, kinh nghiệm quý giá về các môn học liên quan đến chuyên

ngành của tôi và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học

Tôi xin cảm ơn ThS Trần Thị Hồng, cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ

gen và Công nghệ tế bào của Khoa Sinh học, Trường Đại học sư phạm – Đại

học Thái Nguyên, đã giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện thí

nghiệm

Tôi xin cảm ơn những ý kiến nhận xét của các thầy cô trong Hội đồng

đánh giá luận văn ngày 16 tháng 11 năm 2020

Tôi xin cảm ơn toàn thể đồng nghiệp, gia đình, bạn bè đã động viên, giúp

tôi vượt qua những khó khăn trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và sinh

sống tại Thái Nguyên, Việt Nam

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020

Tác giả luận văn

Tangmany SYSOMEPHONE

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cây Bình vôi 3

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học cơ bản của cây Bình vôi 3 1.1.2 Giá trị của cây Bình vôi ……… 7

1.1.3 Hiện trạng khai thác và bảo tồn nguồn gen cây bình vôi ………… 12

1.2 Gen CoOMT ở cây Bình vôi và bộ Mao lương……… 13

1.3 Vector biểu hiện gen và ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện hàm lượng dược chất có hoạt tính ở cây thuốc ……… ……… 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.2 Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu 23

2.2.1 Hóa chất nghiên cứu 23

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 24

2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu …… 24

2.3.1 Nhóm phương pháp tạo dòng gen 24

2.3.1.1 Thiết kế mồi colony- PCR 24

2.3.1.2 Tạo vector pUC19_1113bp tái tổ hợp 25

2.3.1.3 Tạo dòng vi khuẩn tái tổ hợp mang vector pUC19_1113bp 25

2.3.1.4 Tách chiết và tinh sạch plasmid 26

2.3.2 Nhóm phương pháp thiết kế vector biểu hiện mang gen đích 27

2.3.2.1 Xử lý enzyme cắt giới hạn 27

2.3.2.2 Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR 28

2.3.2.3 Gắn gen CoOMT 1113 bp vào vector pBI121 28

2.3.2.4 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt 29

2.3.2.5 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 29

2.3.2.6 Tách chiết plasmid từ tế bào E.coli 30

2.3.2.7 Phương pháp kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn 31

2.3.2.8 Phương pháp biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens bằng xung điện 31

2.3.2.9 Chọn dòng A tumefaciens tái tổ hợp 32

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Nghiên cứu lý thuyết về đặc điểm trình tự gen và protein CoOMT 33

3.2 Kết quả tạo dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang gen nhân tạo CoOMT 35

3.3 Kết quả thiết kế vector pBI121-1113 và tạo chủng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp mang gen CoOMT 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG BỐ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

khuẩn

PCR Polymerase Chain Reaction Phán ứng chuỗi Polymerase

SDS Sodium doecyl sulfate

S-adenosyl-L-methionine:scoulerine methyltransferase

9-O-SOC Soil organic carbon môi trường giàu dinh dưỡng

(dùng để tạo dòng vi khuẩn)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Hình ảnh về cây Bình vôi……… 6 Hình 1.2 Công thức cấu tạo của palmatin và L-tetrahydropalmatin (rotundin) 11 Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp tetrahydropalmatine và palmatine 14

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121……… 16

Hình 1.5 Sự tương tác của Agrobacterium và cơ chế chuyển T-DNA… 18 Hình 1.6 Cấu trúc Ri-plasmid của A rhizogenes……… 19

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector pUC19……… 22 Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc vector pBI121……… ……… 23 Hình 3.1 So sánh trình tự amino acid suy diễn của các enzyme OMT trong

con đường tổng hợp palmatine 34 Hình 3.2 Mô hình cấu trúc không gian 3D của protein CoOMT ……… 34 Hình 3.3 Cấu trúc thứ cấp của protein CoOMT 35 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm colony- PCR 36 Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm cắt xử lý vector PUC-1113 và vector

pBI121 với enzyme XbaI và SacI 37

Hình 3.6 Kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp pBI121-1113 trong E Coli 37 Hình 3.7 Kết quả chọn dòng plasmid tái tổ hợp pBI121-1113 trong

A.tumefaciens 38

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học của alkaloid phân lập từ một số loài thuộc

chi Bình vôi Stephania……… 10

Bảng 2.1 Cặp mồi đặc trưng của phản ứng colony- PCR 24

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng nối ghép gen 25

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng colony-PCR……… 26

Bảng 2.4 Thành phần dung dịch tách plasmid ……… 27

Bảng 2.5 Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn 28

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng nối ghép gen 28

Bảng 2.7 Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn……… 31

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng PCR……… 32

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Bình vôi có tên khoa học là Stephanta spp., họ Tiết dê (Menispermaceae),

là một loài cây thân thảo dạng dây leo, phần rễ phát triển thành củ to, bám vào núi đá, có củ nặng tới hơn 40kg Vỏ thân củ màu đen, xù xì giống như hòn đá

Củ còn được gọi là “củ một”, “củ mối trôn”, “ngải tượng”, “tử nhiên”… Cây Bình vôi thường ưa mọc ở những vùng có núi đá tại tỉnh Hà Giang, Tuyên Quang, Hòa Bình, Hà Tây (cũ) … Trong củ Bình vôi chứa một lượng chất

alkaloid: L-tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin

Những hợp chất này được sử dụng phổ biến để điều chế các loại thuốc quý có tác dụng an thần, dưỡng huyết, thanh nhiệt, giải độc, giảm đau, sốt nóng, đau

dạ dày, trị ho có đờm, hen suyễn, khó thở… Hiện nay, cây Bình vôi đang bị khai thác nhiều, số lượng cây Bình vôi tự nhiên ngày càng giảm mạnh Bình vôi đã được ghi trong Sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (V) và Danh mục Thực vật rừng quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ

Chi Bình vôi (Stephanta) có khoảng trên 45 loài, còn ở Việt Nam có từ

14 đến 16 loài, trong đó một số loài như Bình vôi hoa đầu (Stephania

cepharantha Hayata), Bình vôi tím (Stephania rotunada Lour), Thiên kim đằng

(Stephania japonica Miers) đang được khai thác, và nhìn chung hàm lượng

rotundin của các loài Bình vôi là thấp và rất thấp, tùy thuộc từng loài và điều kiện sinh thái Do vậy, định hướng nghiên cứu nhằm tăng hàm lượng rotundin

ở cây Bình vôi được quan tâm, trong đó xác định việc tăng cường biểu hiện enzyme chìa khóa tham gia trong quá trình chuyển hóa tổng hợp rutundin là rất

quan trọng Columbamine O-methyltransferase (CoOMT) mới được phát hiện

là một enzyme chìa khóa trong chuỗi chuyển hóa tổng hợp rotundin ở cây thuộc

bộ Mao lương, trong đó có cây Bình vôi [77] Biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme CoOMT sẽ làm tăng các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp và hàm lượng

rotundin trong cây Bình vôi được nâng cao Xuất phát từ những lí do trên chúng

tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen

mã hóa enzyme columbamine O- methyltransferase ở cây Bình vôi

(stephania spp.)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế được cấu trúc vector biểu hiện mang gen mã hóa enzyme columbamine O- methyltransferase ở cây Bình vôi

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu lý thuyết về đặc điểm trình tự gen và protein CoOMT

- Tạo dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp mang gen nhân tạo CoOMT

- Thiết kế vector chuyển gen pBI121-1113 và tạo chủng Agrobacterium

tumefaciens tái tổ hợp mang gen CoOMT

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Bình vôi

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học của cây Bình vôi

Về nguồn gốc, phân loại: Chi Bình vôi hay chi Thiên kim đằng (danh

pháp khoa học: Stephania, đồng nghĩa: Perichasma) là một chi thực vật có hoa trong họ Biển bức cát (Menispermaceae hay còn gọi là họ Tiết dê), có nguồn

gốc ở miền đông và nam châu Á cũng như Australasia Tên gọi dân dã trong tiếng Việt là Bình vôi [91]

Về mặt phân loại, cây Bình vôi thuộc:

Trên thế giới chi Bình vôi (genus: Stephania) có khoảng 50 loài, phân bố

ở vùng nhiệt đới, chủ yếu như là các nước châu Á như: Trung Quốc 43 loài, Thái Lan 18 loài, Indonesia 17 loài, Việt Nam 14-16 loài, Malaysia 17 loài, Ấn

Độ 11 loài, Philippine 8 loài, Papua New Guinea 8 loài, Myanma 5 loài, Nhật Bản 2 loài, Sri Lanka 2 loài, Lào 2 loài, Đông Timor 1 loài, Nepal 1 loài Ngoài

ra còn có ở châu Úc: Australia 7 loài và châu Phi 12 loài [11]

Ở Việt Nam, các loài trong chi Bình vôi phân bố rất rộng, trên nhiều địa phương từ Bắc vào Nam Song các khu vực có số loài phong phú, đa dạng và tập trung hơn cả ở các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Lào Cai, Yên Bái, Bắc Cạn, Tuyên Quang, Phú Thọ, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Lai Châu, Sơn La, Hòa Binh, Hà Tây, Hà Nam, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh Một số ít

loài (S venosa, S cambodica, Gagnep, S pierrei) chỉ gặp ở các tỉnh phía Nam

như: Đắc Lắc, Lâm Đồng, Bình Định, Phú Yến, Ninh Thuận, Khám Hòa, Bà Rịa-Vũng Tàu và An Giang [8]

Đặc điểm sinh học

Các loài trong chi Bình vôi (Stephania) đều là dây leo, sống lâu năm hoặc

hằng năm Ở giai đoạn non thân thường nhẵn, màu xanh nhạt, xanh bóng hoặc xanh đậm Trên thân già thường có những rãnh dọc, những mụn cóc sần sùi, màu nâu xám, nâu đen hoặc màu nâu đất Rễ dạng sợi hoặc phình to tạo thành

rễ củ Củ rất đa dạng về hình thái, kích thước và màu sắc Củ thường có dạng hình cầu, hình trứng, hình trụ hoặc hình dạng bất định Có loài rễ củ thường chỉ nặng 0,5 – 2kg (hoặc 3 kg), nhưng cũng có loài cho củ có thể nặng tới 50-70

kg Tuy thuộc vào từng loài, tuổi cây và điều kiện môi trường sống mà hình thái, màu sắc vỏ củ cũng có nhiều thay đổi (nhẵn hoặc xù xì, màu nâu sáng, nâu đậm, xám tro, đen…) Thịt củ nạc hoặc có lẫn những vằn xơ, màu trắng ngà,

vàng tươi, vàng nhạt hoặc đỏ nâu, đỏ tươi [16]

Lá Bình vôi mọc cách Cuống lá thường mảnh, dài 2 đến 5 hoặc 15 đến 20

cm và hai đầu phồng lên [8], có khi gấp khúc ở gốc [11] Cuống lá đính vào lá thường ở những vị trí cách xa mép dưới của gốc là ở những khoảng cách nhất định, tùy thuộc vào từng loài (có thể từ 1/5 đến 1/3 chiều dài phiến lá) Phiến

lá mỏng hoặc dài, nhẵn mỏng hoặc rải rác có lông, hình khiên, hình tam giác rộng, hình trứng-tam giác, tam giác tròn hoặc gần tròn; mép lá nguyên hoặc chia thùy; gân lá dạng chân vịt, gồm 8-9 hoặc 10-12 gân chính cùng xuất phát

từ đỉnh cuống lá Chóp lá nhọn, thuôn nhọn, tù hoặc gần tròn; gốc lá gần tròn, phằng hoặc gần hình tim Màu sắc của phiến lá tùy thuộc vào từng loài (màu

xanh nhạt, xanh vàng nhạt, xanh đậm, xanh nâu nhạt hoặc đốm tía) [24]

Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa đực, cái thường mọc từ kẽ lá Cụm hoa

có dạng tính tán đơn, tán kép, xim tán kép, hình đầu đến tán ngù [8], có cuống

đơn độc hoặc xếp theo kiểu chum ít nhất ở các nhánh tán cấp 1, các nhánh cuống cùng đôi khi không đều hoặc đôi khi các xim tụ họp thành đầu hình đĩa [13] Hoa đực thường có cấu tạo đối xứng tỏa tròn, đài 6-8 rời, xếp thành 2 vòng; 3-4 cánh hoa, dạng vỏ sò, màu vàng, đôi khi trắng xanh; nhị 2-6, thường

4, chỉ nhị dính nhau tạo thành ống hình trụ, đầu nhụy xòe thành đĩa tròn Hoa cái thường chỉ gồm 1 lá đài và 2 cánh hoa (rất ít khi có 3-4 lá đài và 3-4 cánh

hoa), bầu hình trứng có 4 đến 6 hoặc 7 núm nhụy hình dùi [24]

Quả hạch, dạng hình gần tròn, hình trứng, trứng bầu, 2 bên dẹt Ở quả trưởng thành cuống quả lệch về một phía gần với dấu vết còn lại của núm nhụy Bầu 2 noãn, nhưng chỉ có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi, nhẵn bóng Hạt hình móng ngựa, hình trứng đẹp hoặc hơi tròn, 2 mặt bên lõm, ở giữa có lỗ thủng hoặc không, dọc theo gờ lưng bụng thường có 4 hàng vằn hoặc gai (một số loài

có 5 hàng [24] Đặc điểm hình thái của hạt thường đặc trưng cho từng taxon; nên đây được coi là một trong những dấu hiệu đáng tin cậy để giám định tên khoa học đối với các loài chi Bình vôi [8] Cây mầm có lá mầm ít nhiều bằng

rễ mầm, bao quanh bởi nội nhũ [14]

Sinh thái, sinh trường và phát triển của các loài Bình vôi

Các loài thuộc cây Bình vôi thường sinh trưởng trong các rừng nguyên sinh hay rừng thứ sinh Chúng thường mọc trên đỉnh hay các sườn núi đá vôi, núi đất xen lẫn đá, các dài đất ven đường, ven song, đôi khi gặp ở ven bòe biển Sống thích hợp ở nhiệt độ trung bình năm 21- 23oC, lượng mưa 2000- 2500

mm, ưa đất nhiều mùn, thoát nước, độ pH= 6,5- 7 Một số loài có thể phân bố

ở độ cao tới 2000 – 2800 m so với mực nước biển Hầu hết các loài Bình vôi đều ưa đất có độ ẩm vừa phải và đặc biệt ở giai đoạn ra hoa tạo quả

Các loài Bình vôi hiện có ở Việt Nam có 2 thời vụ chồi chính trong năm

Vụ chồi đông xuân, bao gồm các chồi sớm xuất hiện (trên thân và trên đầu củ) ngay từ tháng 11- 12 Những chồi này ở trạng thái “chồi ngủ” cho đến mùa xuân (tháng 1- 2) thì bắt đầu thời kỳ sinh trưởng mạnh Chỉ trong vòng 1- 2 tháng, chồi đã dài tới hơn 1 m Chồi đông xuân là lứa chồi quan trọng nhất của cây Bình vôi, vì trên loài chồi này cây sẽ ra lá, ra hoa, quả và mọc ra lứa chồi xuân hè (chồi cấp II) Số lá chồi cấp II nhiều hơn cấp bội so với chồi đông xuân (tính trên cùng một đơn vị chiều dài của chồi) Lá trưởng thành ngay trong mùa

hè và sẽ rụng hết khi mùa khô hanh (tháng 10) Sự rụng lá hàng năm cũng là tập tính quang trọng của cây Bình vôi Sự tái sinh chồi mạnh mẽ của cây Bình vôi còn thể hiện ở khả năng mọc mầm trên các mảnh bổ ra từ củ đem vùi xuống đất Những mảnh ở đầu củ (khoảng 1/3 củ trở lên) mọc mầm tốt hơn những mảnh khác Có thể áp dụng khả năng này để nhân giống cây Bình vôi Trong

tự nhiên, hoa Bình vôi được thụ phấn chéo chủ yếu nhờ côn trùng

Hạt Bình vôi thường rất nhỏ, khối lượng trung bình của 1000 hạt thường chỉ khoảng 10- 29g Hạt phát tán nhờ nước Các cá thể Bình vôi trồng từ hạt thường sinh trưởng, phát triển khá nhanh Chỉ sau 5- 6 tháng tuổi, cây đã vươn dài tới 50-100) cm, phân cành khỏe Ở một số loài, cây có thể bắt đầu ra hoa và cho quả khi mới bước vào giai đoạn 6- 8 tháng tuổi Trong quá trình sinh trưởng, rễ chính thường lớn dần tạo thành củ (ở những loài có củ) hoặc phân nhánh nhiều tạo thành rễ dạng sợi (ở những loài chỉ có rễ dạng sợi) [8]

Hình 1.1 Hình ảnh về cây Bình vôi

(Nguồn:

http://www.thuocvuonnha.com/c/dung-cu-binh-voi-chua-mat-ngu/hoi-dap)

1.1.2 Giá trị của cây Bình vôi

Trong nhân dân củ Bình vôi được sử dụng là một vị thuốc dân gian Củ

Bình vôi thái nhỏ, phơi khô được dùng dưới dạng sắc hay ngâm rượu chữa hen,

ho lao, lỵ, sốt, đau bụng

Theo kinh nghiệm trong y học cổ truyền, Bình vôi được dùng dưới dạng thuốc sắc, thuốc bột hoặc rượu thuốc để chữa bệnh mất ngủ, sốt nóng, nhức đầu, đau dạ dày, ho nhiều đờm, hen suyễn khó thở… Liều dùng: 6 - 12 g/ngày [2], [3] Thuốc ngâm rượu gồm bột Bình vôi (1 phần) với rượu 40° (5 phần); mỗi ngày uống 5 - 15 ml rượu, có thể thêm đường cho dễ uống [6].Để tránh bị ngộ độc, nên sử dụng liều lượng 0,02 – 0,025g đối với trẻ 1 – 5 tuổi; 0,03 – 0,05g đối với trẻ 5 – 10 tuổi [6], [21] Trong y học hiện đại, Bình vôi chủ yếu được dùng làm nguyên liệu chiết xuất lấy L-tetrahydropalmatin hoặc cepharanthin tuỳ theo loài L-tetrahydropalmatin (Rotundin) được dùng là thuốc trấn kinh, an thần dùng trong các trường hợp: Mất ngủ, trạng thái căng thẳng thần kinh, một số trường hợp rối loạn tâm thần [6], [17], [94] Liều dùng

là 0,05g - 0,10g dưới dạng viên L-tetrahydropalmatin hydroclorid hoặc sulfat [6], [94]

Trong củ Bình vôi chứa một lượng chất alkaloid: L-tetrahydropalmatin

(rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin Những hợp chất này được sử dụng

phổ biến để điều chế các loại thuốc Các alkaloid này thuộc nhóm alkaloid dẫn xuất của nhân isoquinolin Trong đó quan trọng nhất là rotundin

Một số kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính sinh học của alkaloid và rotudin trong cây như sau:

Alkaloid là một hợp chất hữu cơ chứa nitơ, đa số có nhân vòng, có phản

ứng kiềm, thường gặp ở thực vật và đôi khi trong động vật, có dược lực tính mạnh và độc, cho kết tủa và phản ứng màu với một số thuốc thử gọi là thuốc thử của alkaloid Các alkaloid trong cây tồn tại dưới dạng muối với các hợp chất hữu cơ như acid succinic, acid oxalic, acid malic, acid meconic [55]

Alkaloid thường là các chất có trọng lượng phân tử cao, ở thể rắn ở nhiệt

độ thường Các alkaloid ở thể rắn thường là các alkaloid không bay hơi, các alkaloid bay hơi thường ở thể lỏng Ở thể rắn, chúng dễ kết tinh và có độ chảy xác định Một số alkaloid không đo được độ chảy do bị phá hủy ở nhiệt độ thấp hơn độ chảy Các alkaloid ở dạng lỏng thường không có oxy trong phân tử (nicotin, spartein) Các alkaloid ở dạng lỏng dưới dạng tự do nhưng khi tạo muối với acid thì nó có thể chuyển sang thể rắn (spartein ở thể lỏng nhưng spartein sulfat ở thể rắn) Tuy nhiên có một vài trường hợp ngoại lệ một số alkaloid có oxy trong phân tử nhưng vẫn ở thể lỏng như arecolin, pilocarpin [16], [4]

Alkaloid nói chung là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều chất rất độc Tác dụng của alkaloid thường khác nhau ở những loại cây khác nhau Trên thế giới hiện nay dùng nhiều thuốc tổng hợp nhưng vẫn không bỏ được các alkaloid lấy từ cây cỏ, vì có chất chưa tổng hợp được, và cũng có nhiều thuốc sản xuất tổng hợp không rẻ hơn chiết xuất hoặc tác dụng của chất tổng hợp chưa bằng tác dụng của các chất lấy từ cây Do đó, người ta vẫn dùng phương pháp chiết xuất từ cây, ví dụ như ajmalin, morphin, reserpin, quinin, eserin hoặc vừa sử dụng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên vừa tổng hợp vừa bán tổng hợp, ví dụ như: ajimalisin, theobromin, cafein, ephedrine, atropine, vincamin [16], [4], [8]

Trước đây, người ta cho rằng nhân cơ bản của các alkaloid là do các chất đường hay thuộc hợp chất của đường kết hợp với ammoniac để có nitơ mà sinh

ra Ngày nay bằng phương pháp dùng các nguyên tử đánh dấu (đồng vị phóng xạ) người ta chứng minh được alkaloid tạo ra từ các acid amin Qua định tính

và định lượng alkaloid trong các bộ phận khác nhau của cây và theo dõi sự thay đổi của chúng trong quá trình phát triển của cây, người ta thấy nơi tạo ra alkaloid không phải luôn luôn là nơi tích tụ alkaloid Nhiều alkaloid được tạo

ra ở rễ lại vận chuyển lên phần trên mặt đất của cây, sau khi thực hiện những biến đổi thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quả hoặc hạt

Năm 1941, Trần Xuân Thuyết cùng với Đỗ Tất Lợi và P Bonnet đã phát hiện ra hỗn hợp alkaloid của củ Bình vôi, đặt tên là rotundin - có tác dụng an thần gây ngủ, hạ huyết áp, điều hòa tim, giãn cơ trơn, do đó giảm các cơn đau

do co thắt cơ trơn [96]

Năm 1998, Nguyễn Tiến Vững và cs đã tiến hành thăm dò tác dụng của L-tetrahydropalmatin trên điện não thỏ Tất cả các thỏ được tiến hành đặt điện cực vào vùng cảm giác, vận động và thể lưới thân não Kết quả là sau khi cho thỏ uống L-tetrahydropalmatin với liều 100 mg/kg thể trọng trong 7 ngày liền, thành phần các sóng điện não trong vỏ não vùng cảm giác-vận động và trong thể lưới thân não có những biến động rõ Sự tăng thành phần sóng chậm denta

và giảm thành phần sóng nhanh beta chứng tỏ rằng L-tetrahydropalmatin có tác dụng tăng cường quá trình ức chế trong các tế bào thần kinh ở vỏ bán cầu đại não và thể lưới thân não [14]

Năm 1996, Dương Hữu Lợi thử nghiệm tiêm cho chuột nhắt trắng 0,1 ml dung dịch L- tetrahydropalmatin ở các nồng độ khác nhau 0,5%, 1%, 2% nhận thấy đều có tác dụng làm chuột nhắt trắng trấn tĩnh, tác dụng này được duy trì trong vòng 3-5 giờ [4]

Theo Zhu (1991), D-tetrahydropalmatin và L-tetrahydropalmatin được phân lập từ nhiều loài thuộc chi Stephania và cây Corydalis ambigua không chỉ

có tác dụng giảm đau mà còn có tác dụng an thần gây ngủ [90]

Năm 1986, Phạm Duy Mai và Phan Đức Nhuận nghiên cứu đã cho thấy gindarin hydroclorid (L- tetrahydropalmatin hydroclorid) và hỗn hợp alkaloid chiết từ củ Bình vôi đều tăng cường tác dụng gây ngủ của thiopental một cách

rõ rệt Gindarin hydroclorid với liều 30 mg/kg thể trọng chuột có khả năng kéo dài thời gian ngủ lên 1,5 lần Hỗn hợp alkaloid với liều 100 mg/kg thể trọng chuột cũng có tác dụng tương đương [18]

Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học của alkaloid phân lập từ một số loài thuộc

chi Bình vôi Stephania

Chống sốt rét Dehydroroemerine, tetrahydropalmatine,

xylopinine, cepharanthine, Nmethylliriodendronine, 2-O, N dimethylliriodendronine, liriodenine, dicentrinone, corydine, aloe-emodine

[30], [53]

Kháng sinh Glabradine, dịch chiết trong cồn từ củ từ

loài S glabra (Roxb.) Mies, dịch chiết trong methanol từ rễ của loài S japonica,

cepharanone D,Nformyl-asimilobine, Nformylannonain

[48], [71]

Diệt giun sán Dịch chiết trong cồn từ rễ của loài của cây

S glabra (Roxb.) Miers

chiết trong cồn từ củ của loài S venosa

(Blume) Spreng, aporphine, cepharanthine, cepharanoline, isotetrandrine

Nguyễn Tiến Vững đã thử tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của tetrahydropalmatin trên chuột nhắt trắng cho thấy L- tetrahydropalmatin đã kéo dài giấc ngủ của pentotal rất rõ rệt, liều 40 mg/kg thể trọng chuột (bơm trực tiếp vào dạ dày) đã làm tăng thời gian ngủ cùa chuột lên 8 lần [14]

L-Theo Mantsch John R, Li Shi-Jiang L-tetrahydropalmatin có tác dụng trong điều trị cai nghiện cocain và trong điều trị cai nghiện oxycodone [56] Rotundin có tên khoa học là L-tetrahydropalmatin, đây là một alkaloid, lần đầu tiên thu được vào năm 1902 nhờ phương pháp hydro hóa palmatin trong quá trình nghiên cứu cấu trúc của palmatin theo phản ứng [50]

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của palmatin và L-tetrahydropalmatin (rotundin)

Rotundin có công thức phân tử: C12H25NO4 Khối lượng phân tử là M=355,43 Danh pháp quốc tế của rotundin: 5,8,13,13a-tetrahydro-2,3,9,10-tetramethoxy-6H dibenzo [a, g] quinolizine

Đây là một hợp chất hữu cơ gồm 4 vòng kết dính, chứa nhân dị vòng isoquinolin, vì thế nó thuộc loại isoquinolin alkaloid và đó cũng là một trong các bộ khung alkaloid rất thường gặp trong một số họ thực vật

Rotundin là hợp chất ít độc và có nhiều hoạt tính vô cùng phong phú Kết quả nghiên cứu ở Liên Xô (cũ), Rumani, Trung quốc đã chỉ ra rằng L-tetrahydropalmatin rất ít độc Thí nghiệm cho thấy rằng một liều cao hơn 30 mg/kg cơ thể được tiêm vào mạch máu con thỏ chỉ làm thỏ mệt 1-2 ngày, đồng

tử bị liệt nhất thời rồi hết [16], [6]

Rotundin được áp dụng từ năm 1944 và suốt trong cuộc kháng chiến chống Pháp đã được dùng để điều trị có kết quả một số trường hợp đau tim, mất ngủ, hen, đau bụng, tác dụng rõ rệt nhất là gây ngủ và an thần Rotundin nguồn gốc tự nhiên có những ưu điểm nổi bật như độc tính thấp, sự dung nạp thuốc tốt, mang lại giấc ngủ sinh lý Sau khi ngủ không bị mệt mỏi và không

gây nhức đầu như các loại thuốc tổng hợp từ hoá chất [10]

Năm 2001, Nguyễn Minh Chính sử dụng thuốc tiêm rotundin sulfat có tác dụng ức chế thần kinh trung ương, tương tự như diazepam [19] Phạm Thị Kim, Bùi Minh Đức và các cán bộ khoa học khác ở Viện Dinh dưỡng và Học viện Quân y đã thử nghiệm rotundin liều cao trên chuột (150mg/kg thể trọng), tương đương với 7,5g dùng cho người lớn để uống (gấp 15 lần liều dùng theo Dược điển Trung Quốc-1988) mà chuột không chết và hiện tại không xác định được LD50 đường uống Điều đó chứng tỏ độ an toàn cao của chế phẩm Rotundin ít độc Khi tiêm vào mạch máu thỏ với liều 30 mg/kg, con vật đó tuy bị mệt nhất thời nhưng lại khỏi sau 1-2 ngày Ở Trung Quốc, ngoài dạng viên 30mg và 60mg, rotundin còn có ở dạng tiêm là rotundin sunfat, mỗi ống chứa 2ml (60mg), dùng làm thuốc giảm đau, an thần, gây ngủ trong điều trị loét dạ dày, hành tá tràng, đau dây thần kinh, mất ngủ do lo âu, căng thẳng thần kinh [10], [95] Chu Hongyuan, Jin Guozhang và cộng sự nghiên cứu cơ chế giảm đau của L-tetrahydropalmatin thấy thuốc có tác dụng ức chế receptor dopamin D2, ứng dụng này đã được sử dụng trong bài thuốc cai nghiện ở Trung Quốc [35] Một số sản phẩm của rotundin đã được thương mại hóa tại Việt Nam như: Rotundin của công ty Dược phẩm TW3 [92], Rotundin của Công ty cổ phần Dược phẩm TW2 [93]

1.1.3 Hiện trạng khai thác và bảo tồn nguồn gen cây bình vôi

Loài Bình vôi có khu phân bố chia cắt, sống ở vùng núi đá vôi, nơi cư trú

bị xâm hại do nạn chặt phá rừng Cây bị đào rễ để làm thuốc dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng cao Loài đã được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (2007) với cấp đánh

giá “sẽ nguy cấp” (Bậc V) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại [12] Trước tình hình trên cần áp dụng các biện pháp, kỹ thuật nuôi cấy tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu làm thuốc ngày một tăng

1.2 Gen CoOMT ở cây Bình vôi và bộ Mao lương

Hiện nay, hướng nghiên cứu genome và chức năng của các gen trên đối tượng cây Bình vôi còn rất mới mẻ Số trình tự gen đăng trên Ngân hàng gen Quốc tế chưa nhiều, chủ yếu là các nghiên cứu trình tự gen mã hóa protein ribosome S2, S3, S4, S7, S8, S11, S12, S14, S15, S16, S18, S19, 23S, 4.5S, 5S, L14, L16, L20, L22, L23, L33, L36, CP43, NADH dehydrogenase subunit 1, NADH dehydrogenase subunit 2, NADH dehydrogenase subunit 5, NADH dehydrogenase subunit 6, NADH dehydrogenase subunit 7, cytochrome b và c, RNA polymerase alpha, RNA polymerase beta, photosystem protein, envelope membrane protein, acetyl-CoA carboxylase beta, ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, ATP synthase, Psa A và B, ATPase, maturase K,

ribosomal RNA, tRNA ở cây Stephania Bên cạnh đó, hệ gen lục lạp của loài

Stephania japonica cũng được xác định trình tự, kích thước của trình tự được

xác định dài 157719 bp [76]

Thực vật bậc cao có rất nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau, gồm hơn

25000 terpenoid, khoảng 12000 alkaloid và 8000 phenolic [36].Trong đó nhiều chất có hoạt tính sinh học cao và được dùng làm thuốc, đặc biệt là các alkaloid

Methyltransferase là enzyme chìa khóa trực tiếp tham gia nhiều con đường sinh tổng hợp nhiều hợp chất quan trọng [66].Mỗi methyltransferase trong quá trình sinh tổng hợp palmatine (gồm có S-adenosyl-L-methionine: norcoclaurine 6-O-methyltransferase (6OMT) [68], [59], [69], [49], [57]; S-adenosyl-L-methionine: coclaurine N-methyltransferase (CNMT) [43], [83], [33], [34]; S-adenosyl-L-methionine: 3’ -hydroxy-N-methylcoclaurine 4’-O-methyltransferase

(4’OMT) [57], [43]; S-adenosyl-L-methionine: scoulerine 9-O-methyltransferase (SMT) [58], [78] và CoOMT) đòi hỏi tính đặc thù về cơ chất chặt chẽ cho dù các cơ chất có sự tương đồng về cấu trúc

Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp tetrahydropalmatine và palmatine [77]

Công trình nghiên cứu của Takashi Morishige và cs (2002) là công trình đầu tiên đã xác định được gen mã hóa columbamine O-methyltransferase tham

gia trực tiếp chuyển hóa cơ chất tetrahydrocolumbamine để sinh tổng hợp rotundin Các tác giả cũng xác định được trình tự cDNA mã hóa enzyme này dài 1053bp, mã hóa cho 351 amino acid (với mã số AB073908 trên Ngân hàng

gen Quốc tế) Các kết quả nghiên cứu xác định tất cả các gen

O-methyltransferase có liên quan đến sinh tổng hợp isoquinoline trong tế bào Copapis Japonica Tác giả giải trình tự 1014 cDNA được phân lập từ tế bào

nuôi cấy sản xuất alkaloid với hàm lượng cao của C Japonica Trong đó, tác

giả phát hiện ra tất cả ba O-methyltransferase và một O-methyltransferase giống như bản sao cDNA có mã số CJEST64 cDNA này khá giống với cDNA của gen mã hóa S-adenosyl-l-methionine: coclaurine 6-O-methyltransferase và S-adenosyl-l-methionine: isoflavone 7-O-methyltransferase Nhờ S-adenosyl-l-methionine: columbamine O-methyl-transferase xúc tác chuyển đổi columbamine thành palmatine, là một trong những thành phần chưa được phân

giải trong quá trình tổng hợp isoquinoline alkaloid ở C japonica, tác giả đã xác định được sự khác biệt của protein trong E.coli và đánh giá sự hoạt động của

columbamine O-methyltransferase Protein tái tổ hợp biểu hiện rõ ràng hoạt tính O-methyl hóa sử dụng columbamine, cũng như (S) -tetrahydrocolumbamine, (S) -, (R, S) -scoulerine và (R, S) -2,3,9,10-tetrahydroxyprotoberine làm chất nền Kết quả này chứng tỏ rõ ràng rằng EST rất hữu ích để phân lập gen quan tâm theo con đường sinh tổng hợp tương đối tốt Mối quan hệ giữa cấu trúc và sự nhận biết chất nền của O-methyltransferase liên quan đến sinh tổng hợp isoquinoline alkaloid và palmatine [77]

1.3 Vector biểu hiện gen và ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện

hàm lượng dược chất có hoạt tính ở cây thuốc

Ðặc điểm của kỹ thuật chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium là

bất kỳ DNA nào đã tạo dòng đều có thể được chuyển vào hệ gen của tế bào thực vật Hai lá mầm Trước đây, loại vector thường được đề cập đến là vector

liên hợp (co-intergrative vector), tuy nhiên gần đây vector nhị thể (binary vector) là phổ biến hơn Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA Hệ vector được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản Loại vector vận tải mang GOI

giữa đoạn ngoại biên của T – DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm nhiệm

chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật Plasmid hỗ trợ được cải biến từ các

Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng xâm nhập vào tế bào thực vật Để

tái bản trong A tumefaciens, vector nhị thể được thiết kế gồm các phần sau: (i)

Vị trí ghép nối đa điểm; (ii) Đoạn khởi đầu tái bản ở cả E coli và A

tumefaciens; (iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật; (iv)

Gen có khả năng vận chuyển (oriV, oriT, trfA); (v) Đoạn T – DNA ngoại biên

Ngoài ra, còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển

T – DNA [15], [60], [70]

Vector chuyển gen pBI121 có kích thước 14,75 kb, được cấu trúc bởi các

thành phần như 35S-promoter, chứa gen GUS với cặp enzyme giới hạn

XbaI/SacI, gen NPTII mã hóa protein kháng kháng sinh kanamycin (Hình 1.4)

Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121

Kỷ nguyên Genomics (Hệ gen học) đang được ứng dụng trên cây dược liệu

và ở nhiều cây trồng khác Gần đây dữ liệu hệ gen học được phát triển dựa trên những thông tin về trình tự các gen, dữ liệu EST (expressed sequence tag), thư viện cDNA, microarray Những nguồn thông tin này là cơ hội của việc ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật chuyển gen, là cơ sở của những hiểu biết về chức năng gen trên cơ sở tách dòng gen và phương pháp di truyền ngược Trên cơ sở đó, nghiên cứu xây dựng một hệ thống chuyển gen ổn định và có hiệu quả ở cây dược liệu nói chung, cây Bình vôi nói riêng là điều cần thiết đi tới thành công trong chiến lược cải thiện hàm lượng các dược chất quan trọng Hai nhóm phương pháp được ứng dụng trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vật là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp Trong đó, phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng

bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua A tumefaciens đã được ứng dụng

phổ biến [37]

Agrobacterium là các vi khuẩn đất thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, yếm

khí, gây ra bệnh sần ở thân và rễ khi xâm nhiễm qua vết thương Agrobacterium thuộc họ Rhizobiaceae, chi Agrobacterium có 4 loài chính, trong đó A

tumefaciens được sử dụng nhiều nhất cho việc chuyển gen A tumefaciens cũng

giống như các loại vi khuẩn khác là có mang các plasmid Các thực nghiệm

cho thấy, khi xử lý vết thương bằng vi khuẩn A tumefaciens không mang

plasmid sẽ không gây ra khối u ở thực vật Khối u này chỉ được hình thành khi

vi khuẩn có mang plasmid Như vậy chứng tỏ rằng plasmid của vi khuẩn đã chuyển vào tế bào thực vật các vật chất di truyền gây bệnh u ở cây Do vậy người ta gọi chúng là các Ti-plasmid (tumor inducing plasmid)

Tiplasmid là một plasmid lớn có kích thước khoảng 200 kb Trên Ti plasmid có đoạn T-DNA được giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border) T-DNA là đoạn sẽ tách khỏi plasmid, chuyển vào tế bào thực vật và gắn vào bộ gen của cây T-DNA chứa các gen tổng hợp auxin, cytokinin gây nên

-sự phân chia tế bào liên tục và hình thành khối u Ngoài ra nó còn chứa các gen

tổng hợp nên các axit amin biến dạng gọi là các opine là nguồn cacbon và nitơ

bổ sung cho vi khuẩn (các chất này không tồn tại ở cây bình thường) Ngoài T- DNA, trên Ti-plasmid còn có vùng gây độc, có chứa các gen vir chịu trách nhiệm trong hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp T-DNA vào hệ gen tế bào thực vật và tiêu hóa opine [9]

Hình 1.5 Sự tương tác của Agrobacterium và cơ chế chuyển T-DNA

Agrobacterium có 3 thành phần di truyền cần thiết cho quá trình

chuyển gen: (1) Vùng T-DNA: là đoạn DN chuyển từ vi khuẩn Agrobacterium

vào tế bào thực vật Đặc điểm của vùng này là xâm nhập ổn định vào bộ gen của cây chủ, không mã hóa cho các sản phẩm trợ giúp quá trình biến nạp, độ dài thay đổi khác nhau ở các Ti-plasmid tự nhiên và mang rất nhiều gen có thể biểu hiện trong quá trình chuyển hóa của tế bào thực vật [28]; (2) Vùng gây độc Vir

(Virulence Region): gồm 24 gen vir được sắp xếp trong 8 operon từ virA đến virH, mỗi operon chứa một số gen Vùng Vir có vai trò kích thích việc biến nạp của T-ADN Trong đó vir A, B, D, G có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong quá trình biến nạp ở tế bào thực vật; vir C, E, F, H có tác dụng làm tăng cường hiệu quả quá trình biến nạp gen [39]; (3) Nhiễm sắc thể (NST) của Agrobacterium:

Vùng Vir có vai trò chủ yếu trong quá trình biến nạp T-DNA, tuy nhiên NST

của vi khuẩn cũng rất cần thiết đối với quá trình này Chúng tác dụng lên bề mặt của tế bào vi khuẩn, giúp tạo ra exopolysaccarid, đồng thời gắn vi khuẩn vào tế

bào thực vật … Ngoài ra những gen khác như vir A đóng vai trò thứ yếu hơn trong

quá trình biến nạp [44]

Trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô, tế bào nuôi cấy cần thiết bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy Đây là một trong những trở ngại lớn do tồn dư các chất điều tiết sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe người sử dụng Tuy nhiên, việc này hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ [65]

Hình 1.6 Cấu trúc Ri-plasmid của A rhizogenes [84]

Vi khuẩn đất A.rhizogenes là vi khuẩn gram âm, gây bệnh rễ tơ ở thực vật hai lá mầm A.rhizogenes mang Ri-plasmid và đây là tác nhân gây bệnh rễ

tơ ở các mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm Tế bào thực vật bị thương tiết ra các polyphenol hấp dẫn các vi khuẩn, tại đây chuyển một đoạn T-DNA từ Ri-plasmit vào hệ gen của tế bào vật chủ Các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin ở

vi khuẩn A.rhizogenes có vai trò quan trọng quá trình hình thành rễ tơ ở thực vật

[26] Trong thực tế, gen tạo rễ tơ đã được các nhà nghiên cứu sử dụng để thiết

kế vector biểu hiện mang gen chuyển Cấu trúc vector biểu hiện mang gen

chuyển và gen tạo rễ tơ được chuyển vào thực vật thông qua A tumefaciens, giúp

cho việc phân tích cây chuyển gen được thuận lợi, nhanh chóng sau 2- 4 tuần chuyển gen

Đặc trưng nổi bật của hệ thống rễ tơ là chúng có khả năng phát triển nhanh, phân nhánh cao và ổn định trên môi trường nuôi cấy mà không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật Bên cạnh đó, khả năng tổng hợp ra các hợp chất tự nhiên của hệ thống rễ tơ cũng cao hơn rất nhiều so với thực vật nguyên vẹn, cũng như so với hệ thống dịch treo tế bào ở nhiều loài thực

vật Với sự chuyển gen của A.rhizogenes vào tế bào, rễ tơ có khả năng tổng

hợp ra nhiều loại hợp chất tự nhiên với hiệu suất cao mà các tế bào không phân hóa và các rễ bất định không chuyển gen không tổng hợp lại hoặc tổng hợp với hàm lượng không đáng kể Rễ tơ được xem như là nguồn nguyên liệu có giá trị trong sản xuất các hợp chất tự nhiên có lợi như dược phẩm, các chất phụ gia trong ngành mỹ phẩm và thực phẩm Hơn nữa, kỹ thuật này có ý nghĩa lớn trong việc sản xuất các sản phẩm hợp chất tự nhiên trên quy mô công nghiệp với hiệu suất cao, giảm chi phí trong quá trình sản xuất từ đó giảm giá thành

sản phẩm Bên cạnh việc chuyển T-DNA của A.rhizogenes vào tế bào, ta còn

có thể chuyển các gen ngoại lai thông qua việc tái tổ hợp đoạn gen đó vào trong

đoạn T-DNA của A.rhizogenes Các gen này có thể là gen biểu hiện ra các hợp

chất mục tiêu hay có thể là các gen mã hóa các enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên mong muốn [52], [65]

Các nghiên cứu về cải tiến việc sản xuất alkaloid C roseus đã tập trung

vào việc nuôi cấy tế bào và rễ tơ để làm sáng tỏ quy định về sự biểu hiện quá mức của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp TIA ở cây chuyển gen

Magnotta và cộng sự (2007) đã phân tích sự biểu hiện protein DAT trong rễ C

roseus và kết luận rằng nó thay đổi cấu trúc MIA Kết quả này cho thấy sự biểu

hiện quá mức của các gen trong con đường vindoline có thể dẫn đến những thay

đổi đáng kể hàm lượng alkaloid trong cây C Roseus [54] Dựa trên nghiên cứu

về sự biểu hiện mạnh của gen ORCA3 và G10H trong cây C Roseus Pan Q và

cộng sự (2012) kết luận rằng sự biểu hiện quá mức này làm tăng đáng kể sự tích lũy của strictosidine, vindoline, catharanthine và ajmalicine [64] Trong

năm 2010, Wang và cộng sự đã chuyển thành công gen G10H và ORCA3 vào cây dừa cạn thông qua A rhizogens MSU440 Do đó, hàm lượng catharanthine

trong cây chuyển gen tích lũy cao gấp 6,5 lần so với cây không chuyển gen

[82] Ngoài ra, hệ thống tái sinh và chuyển gen ở C roseus sử dụng

Agrobacterium tumefaciens được phát triển và hoàn thành thành công bởi

Wang và cộng sự (2012) [81]

Một số nghiên cứu khác như chuyển gen gus ở cây cà chua của Đỗ Xuân

Đồng và cs (2007), ở cây dưa hấu của Nguyễn Thị Thanh Nga và cs (2012), ở cây dầu mè của Võ Thị Thúy Huệ và cs (2011), ở cây thông nhựa của Vương Đình Tuấn và cs (2012), ở cây xoan ta của Bùi Văn Thắng và cs (2013) Ngoài

ra, nghiên cứu chuyển gen cũng được tiến hành trên cây lan hồ điệp

(Phalaenopsis amabilis) của Trần Lê Lưu Li và cs (2008) với thí nghiệm lây nhiễm bởi A.tumefaciens CV58 pGV2260 mang vector 35S -GUS-INT chứa gen uidA và nptII và thu được kết quả biểu hiện gus tối ưu ở nồng độ AS 50μM

sau 4 ngày đồng nuôi cấy [7], [20], [23], [25], [1], [22]