Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng đường hóa trong quá trình lên men rượu của hai chủng nấm sợi mucor spp và rhizopus oryzae dùng trong sản xuất rượu truyền thống ở tỉnh bình định

Bình Định - Năm 2017NGUYỄN PHƯƠNG THỤY NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG ĐƯỜNG HÓA TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU CỦA HAI CHỦNG NẤM SỢI Mucor spp.. Bình Định - Năm 2017NGHIÊN

Bình Định - Năm 2017

NGUYỄN PHƯƠNG THỤY

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG ĐƯỜNG HÓA TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU CỦA

HAI CHỦNG NẤM SỢI Mucor spp VÀ Rhizopus oryzae DÙNG TRONG

SẢN XUẤT RƯỢU TRUYỀN THỐNG Ở TỈNH BÌNH ĐỊNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN

Bình Định - Năm 2017

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG ĐƯỜNG HÓA TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU CỦA HAI

CHỦNG NẤM SỢI Mucor spp VÀ Rhizopus oryzae DÙNG TRONG

SẢN XUẤT RƯỢU TRUYỀN THỐNG Ở TỈNH BÌNH ĐỊNH

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số : 60 42 01 14

Người hướng dẫn : TS TRẦN VĂN LƯ

Tôi xin cam đoan công trình này là kết quả nghiên cứu của riêng tôi.Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được công bốtrong bất cứ một công trình nghiên cứu nào.

Bình Định, tháng 6 năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Phương Thụy

tình hướng dẫn, chỉ bảo và động viên giúp em hoàn thành tốt luận văn này.Trong quá trình thực hiện luận văn em đã nhận được rất nhiều sự quantâm, giúp đỡ của các Thầy, Cô khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Quy Nhơn.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới quý Thầy, Cô

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc và các anh chị ở Trung tâmỨng dụng Tiến bộ Khoa học và Công nghệ Bình Định đã tạo điều kiện cho emthực hiện đề tài này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các hộ gia đình ở làng Bàu Đá - XãNhơn Lộc - Thị xã An Nhơn - Tỉnh Bình Định và thôn Vĩnh Cửu - Xã VĩnhHiệp - Huyện Vĩnh Thạnh - Tỉnh Bình Định, đặc biệt là gia đình bác NguyễnThị Năm và gia đình bác Lê Mạnh Hưng đã nhiệt tình giúp đỡ em hoàn thành

đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và tập thể lớp Cao học Sinhhọc thực nghiệm K18 đã luôn động viên, khích lệ tinh thần trong suốt quá trìnhhọc tập và thực hiện đề tài

Mặc dù đã rất cố gắng trong thời gian thực hiện luận văn nhưng vì cònhạn chế về kiến thức, kinh nghiệm nghiên cứu cũng như thời gian nên khôngtránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự thông cảm và những ýkiến đóng góp quý báu từ quý Thầy, Cô để luận văn được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

4 CẤU TRÚC LUẬN VĂN 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ RƯỢU

4 1.1.1 Ngoài nước 4

1.1.2 Trong nước 5

1.2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU 8

1.2.1 Cơ chế của quá trình lên men rượu 8

1.2.2 Các quá trình chuyển hóa các chất trong lên men rượu 9

1.2.2.1 Các quá trình vi sinh vật học 9

1.2.2.2 Các quá trình sinh lý, sinh hóa 9

1.3.1.1 Các loại nấm sợi thường gặp trong men rượu 13

1.3.1.2 Vai trò của nấm sợi trong lên men rượu 15

1.3.2 Nhóm nấm men 16

1.3.2.1 Nấm men trong men rượu 16

1.3.2.2 Vai trò của nấm men trong quá trình lên men rượu 17

1.4 TỔNG QUAN VỀ NẤM SỢI 17

1.4.1 Giới thiệu chung về nấm sợi 17

1.4.2 Hình thái và đặc điểm dinh dưỡng chung của nấm sợi 18

1.4.2.1 Hình thái và kích thước của nấm sợi 18

1.4.2.2 Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm sợi 19

1.4.3 Cấu tạo của nấm sợi 20

1.4.3.1 Khuẩn ty (hypha) 20

1.4.3.2 Bào tử (spore) 20

1.4.4 Các dạng biến hóa của hệ sợi nấm 22

1.4.5 Sinh sản ở nấm sợi 23

1.4.5.1 Sinh sản vô tính 23

1.4.5.2 Sinh sản hữu tính 24

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ 25

• ' • PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 25

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 25

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 25

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 25

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.3.1 Phương pháp vi sinh 26

2.3.1.1 Phương pháp quan sát hình thái nấm sợi 26

2.3.1.2 Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của các chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae 26

2.3.2 Phương pháp hóa sinh 27

2.3.2.1 Phương pháp xác định khả năng phân giải tinh bột 27

2.3.2.2 Phương pháp thử hoạt tính enzyme amylase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch 27

2.3.2.3 Phương pháp khảo sát khả năng đường hóa trong quá trình lên men rượu của hai chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae 28

2.3.3 Phương pháp sản xuất bánh men rượu 30

hóa 31

2.3.3.3 Quy trình sản xuất men rượu thuần 32

2.3.4 Phương pháp đánh giá năng suất, chất lượng rượu lên men giữa men rượu thuần và men rượu thị trường tại làng nghề 32

2.3.5 Phương pháp cảm quan 34

2.3.5.1 TCVN 8007 : 2009 về chuẩn bị mẫu thử và kiểm tra cảm quan rượu 34

2.3.5.2 TCVN 3217 - 1979 về phân tích cảm quan và phương pháp cho điểm rượu 35

2.3.6 Phương pháp hóa lý 36

2.3.6.1 Phương pháp xác định hàm lượng ethanol 36

2.3.6.2 Phương pháp xác định hàm lượng methanol 37

2.3.6.3 Phương pháp xác định hàm lượng aldehyde 37

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 38

3.1 KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CHỦNG NẤM SỢI Mucor spp VÀ CHỦNG NẤM SỢI Rhizopus oryzae 38

3.2 KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA HAI CHỦNG NẤM SỢI Mucor spp VÀ Rhizopus oryzae 40 3.2.1 Hàm lượng NaN(O trong môi trường Czapek - Dox tối ưu cho sự sinh trưởng của chủng nấm sợi Mucor spp và chủng nấm sợi Rhizopus oryzae 40

3.2.2 Hàm lượng saccharose trong môi trường Czapek - Dox tối ưu cho sự sinh trưởng của chủng nấm sợi Mucor spp và chủng nấm sợi Rhizopus oryzae 43

3.3 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI TINH BỘT CỦA HAI

spp và Rhizopus oryzae 46

3.3.2 Xác định hoạt tính enzyme amylase chiết rút được từ hai chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae 49

3.4 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐƯỜNG HÓA TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU CỦA HAI CHỦNG NẤM SỢI Mucor spp VÀ Rhizopus oryzae 50

3.4.1 Sự thay đổi độ Brix của dịch rỉ sau khi ủ 51

3.4.2 Sự thay đổi độ pH của khối ủ 53

3.4.3 Khảo sát một số chỉ tiêu đánh giá khả năng đường hóa của nấm sợi 54

3.5 SẢN XUẤT BỘT MỐC, TỈ LỆ BỘT MỐC SỬ DỤNG TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH ĐƯỜNG HÓA VÀ SẢN XUẤT MEN RƯỢU THUẦN 56

3.5.1 Sản xuất bột nấm sợi (bột mốc) 56

3.5.2 Tỉ lệ bột mốc sử dụng tối ưu cho quá trình đường hóa 56

3.5.3 Sản xuất men rượu thuần 57

3.6 LƯỢNG RƯỢU THU HỒI VÀ ĐỘ CỒN CỦA RƯỢU THU ĐƯỢC58 3.7 ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN RƯỢU THU ĐƯỢC 59

3.8 PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA RƯỢU ĐƯỢC SẢN XUẤT BẰNG MEN THUẦN THÍ NGHIỆM VÀ RƯỢU ĐƯỢC SẢN XUẤT BẰNG MEN THỊ TRƯỜNG 62

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64

1 KẾT LUẬN 64

2 ĐỀ NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC

QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ (BẢN SAO)

P - value Probability value

Số hiệu Tên bảng Trang

2.1 Điểm chưa có trọng lượng của các chỉ tiêu về rượu 353.1 Một số đặc điểm của chủng nấm sợi Mucor spp và chủng nấm sợi Rhizopus oryzae 38

3.2

Đường kính khuẩn lạc các chủng nấm sợi khi nuôi cấy

trong môi trường Czapek - dox có thay đổi hàm lượng

NaNO3

41

3.3

Thời gian để khuẩn lạc của các chủng nấm sợi phủ kín bề

mặt đĩa petri khi nuôi cấy trong môi trường Czapek - Dox

có thay đổi hàm lượng NaNO3

41

3.4

Đường kính khuẩn lạc của các chủng nấm sợi khi nuôi cấy

trong môi trường Czapek - dox có thay đổi hàm lượng

saccharose

43

3.5

Thời gian để khuẩn lạc của các chủng nấm sợi phủ kín bề

mặt đĩa petri khi nuôi cấy trong môi trường Czapek - Dox

có thay đổi hàm lượng saccharose

443.6 Khả năng phân giải tinh bột của hai chủng nấm sợi 46

3.7 Đường kính vòng phân giải tinh bột phản ánh hoạt tính enzyme amylase 493.8 Sự thay đổi độ Brix của dịch rỉ sau khi ủ 51

3.10 Khả năng đường hóa của nấm sợi trên gạo 543.11 Khả năng đường hóa của bột mốc qua các tỉ lệ sử dụng bộtmốc khác nhau 56

3.12 Lượng rượu thu hồi sau mỗi mẻ rượu và độ cồn của rượu thu được 58

loại men trên thị trường

59

3.14

Kết quả đánh giá cảm quan rượu được sản xuất bằng men

rượu thí nghiệm so với rượu được sản xuất bằng các loại

men trên thị trường

613.15 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu chất lượng rượu 61

Số hiệu Tên hình Trang

3.1

Khuẩn lạc chủng nấm sợi Mucor spp và chủng nấm sợi

Rhizopus oryzae nuôi cấy 48 giờ trong môi trường PGA 39

3.2

Khuẩn ty, túi bào tử và tiêu bản nhuộm xanh methylen

3.3

Khuẩn ty, túi bào tử và tiêu bản nhuộm xanh methylen

3.4

Khuẩn lạc nấm sợi nuôi cấy trong môi trường Czapek -

dox với hàm lượng saccharose 30g/l sau 48 giờ nuôi

cấy

45

3.5

Khuẩn lạc nấm sợi nuôi cấy trong môi trường Czapek -

dox với hàm lượng saccharose 25g/l phủ kín đĩa petri 463.6 Đường kính vòng phân giải tinh bột sau 24 giờ nuôi cấy 483.7 Đường kính vòng phân giải tinh bột sau 48 giờ nuôi cấy 483.8 Đường kính vòng phân giải tinh bột sau 72 giờ nuôi cấy 483.9 Đường kính vòng phân giải tinh bột sau 96 giờ nuôi cấy 493.10

Đường kính vòng phân giải tinh bột sau 120 giờ nuôi

3.11

So sánh đường kính vòng phân giải tạo ra từ enzyme

amylase chiết rút từ chủng Mucor spp và chủng

Rhizopus oryzae

503.12 Sản xuất bột mốc và bột mốc thành phẩm 56

3.13 Bột men rượu thuần 58

Số hiệu rpA 1•/V -» /V

3.1

Thời gian khuẩn lạc của các chủng nấm sợi phủ kín đĩa

petri khi nuôi cấy trong môi trường Czapek - dox có thay

đổi hàm lượng NaNO3

42

3.2

Thời gian khuẩn lạc của các chủng nấm sợi phủ kín đĩa

petri khi nuôi cấy trong môi trường Czapek - dox có thay

đổi hàm lượng saccharose

44

3.3 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến độ Brix của dịch rỉ 513.4 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến pH của khối ủ 53

MỞ ĐẦU

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Rượu là một sản phẩm có từ lâu đời, mang tính truyền thống của nhiềudân tộc trên thế giới, đặc biệt rượu được sử dụng trong các dịp tế lễ hay dùnglàm quà biếu cho người thân Từ thời xa xưa con người đã biết làm nướcuống bằng phương pháp lên men, tuy nhiên đến thế kỷ XVI việc sản xuất rượumới trở thành một ngành công nghiệp và cũng từ đó ngày càng có nhiều thànhtựu khoa học kĩ thuật được ứng dụng vào ngành công nghiệp này

Theo quan điểm về rượu của nhiều nhà khoa học: rượu ethylic nói theo yhọc là chất độc đối với cơ thể con người, tuy nhiên điều này chỉ đúng khi uốngquá liều lượng cho phép với con người Mặc khác, ngoài thành phần chính làethanol, trong rượu còn có một số hợp chất có giá trị dinh dưỡng như đường,các vitamin, một số nguyên tố vi lượng

Về mặt kinh tế, ngành sản xuất rượu là ngành có vốn đầu tư ban đầu ít,khả năng thu hồi vốn nhanh và thu được lợi nhuận cao, vì vậy nhiều địaphương đã và đang đầu tư phát triển ngành sản xuất rượu Ở nước ta đã có rấtnhiều làng nghề tạo ra được những loại rượu nổi tiếng cả trong và ngoài nướcnhư rượu làng Vân (Bắc Giang), rượu Cần (Tây Nguyên), rượu Bàu Đá (BìnhĐịnh), rượu Gò Đen (Long An), rượu Phú Lễ (Bến Tre), Mỗi loại rượu đềumang một hương vị riêng, đặc trưng cho từng vùng miền, là một trong nhữngyếu tố tạo nên giá trị truyền thống và đặc sắc cho sản phẩm của vùng đó Rượutruyền thống Bình Định cũng vậy, mang hương vị đặc trưng riêng rất hấp dẫn

có thể nói không loại rượu nào có thể sánh được

Trong nghề nấu rượu truyền thống, ba bí quyết để tạo nên mẻ rượu ngon

là men, nguồn nước và phương pháp chưng cất Ở nước ta rượu được sản xuấttheo nhiều phương pháp khác nhau, trong đó phương pháp lên men rượutruyền thống hiện nay vẫn được sử dụng phổ biến Trong quá trình sản xuất

rượu truyền thống, rượu được lên men tự nhiên do hệ vi sinh vật có sẵn trongmen rượu Trong quá trình này, yếu tố có vai trò quyết định đến chất lượng sảnphẩm lên men rượu chính là hệ vi sinh vật trong men Để sản phẩm đạt chấtlượng cao và ổn định, cần phải chọn được giống vi sinh vật tối ưu Vì vậy việcphân lập, tuyển chọn những chủng vi sinh vật có hoạt lực đường hóa cao, hoạtlực lên men mạnh đồng thời bổ sung các chất phụ gia vào men với hàm lượngthích hợp nhằm nâng cao hiệu suất lên men cũng như chất lượng rượu thu

được là rất cần thiết Do vậy tôi chọn đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng đường hóa trong quá trình lên men rượu của hai

chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae dùng trong sản xuất rượu truyền thống ở tỉnh Bình Định” nhằm xác định một số đặc điểm sinh học của

hai chủng nấm sợi do Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ Khoa học và Công nghệBình Định cung cấp đồng thời xác định được khả năng đường hóa trong quátrình lên men rượu của hai chủng nấm sợi này qua đó tạo men giống lên mentốt nhất để nâng cao chất lượng và giá trị kinh tế của nghề nấu rượu truyềnthống ở tỉnh Bình Định

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đánh giá khả năng đường hóa

trong quá trình lên men rượu của hai chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae do Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ Khoa học và Công nghệ Bình Định

cung cấp nhằm tìm ra chủng nấm sợi có khả năng đường hóa trong quá trìnhlên men rượu tốt để tạo ra loại rượu chất lượng cao cho làng nghề truyền thống

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tạo ra loại men chất lượng tốt sử dụng trong lên men rượu truyền thống ởBình Định để đạt hiệu quả cao nhất; tránh việc sử dụng các loại men trôi nổi,không rõ nguồn gốc, chất lượng kém ngoài thị trường

4 CẤU TRÚC LUẬN VĂN

Luận văn gồm các phần sau:

Mở đầu

Chương 1 Tổng quan tài liệu

Chương 2 Nội dung, phương tiện và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 Kết quả nghiên cứu và bàn luận

Kết luận và đề nghị

Tài liệu tham khảo

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ RƯỢU 1.1.1 Ngoài nước

Không biết từ bao giờ rượu đã chiếm một vị trí đặc biệt trong văn hóanhân loại Rượu không chỉ là một thức uống đơn thuần, nó còn đưa cảm xúccon người đi từ cung bậc này đến cung bậc khác Hiện nay, người ta không biếtchính xác rượu có từ bao giờ, nhưng có một điều chắc chắn là rượu đã có mộtlịch sử lâu đời Trong thần thoại Hy Lạp, một trong mười hai vị thần tối cao,đem lại cho con người nhiều lợi ích đó chính là thần rượu Dioysus Theo ghichép và theo những phiến đá từ thời đế chế Babylon cổ ghi lại, cách làm rượu

đã có cách đây gần 4000 năm Ở Ai Cập, người ta cũng tìm thấy dấu tích củarượu từ 5000 năm trước công nguyên Các kết quả khảo cổ học mới đây đãcủng cố giả thuyết cho rằng người Trung Quốc đã sản xuất rượu từ 5000 nămtrước công nguyên [29], [33]

Khi các nền văn minh càng trở nên thịnh vượng thì việc sản xuất và tiêuthụ rượu càng phát triển Đồng thời, cũng có những đoạn trong văn tự cổ củangười Ai Cập đã đề cập đến những ảnh hưởng xã hội của nạn say rượu, trongmột văn tự có niên đại 1600 năm trước công nguyên còn ghi lại gần 100 bàithuốc liên quan đến sử dụng rượu [33]

Rượu mạnh được chưng cất có nguồn gốc từ Trung Quốc và Ấn Độkhoảng 800 năm trước công nguyên Phải đến thế kỉ thứ VII, công nghệ chưngcất rượu mới du nhập đến châu Âu Rượu thời trung cổ tại châu Âu rất giàuprotein, cacbon hydrate và được coi là một nguồn dinh dưỡng trong xã hộiđương thời [33], [28]

Đến thời phục hưng, với sự phát triển đa dạng, chưng cất rượu đã đượccoi như là một nghệ thuật Không những thế, thời kì này, nhiệt kế đã được phátminh cùng với những dụng cụ khác dùng trong sản xuất rượu đã làm cho quátrình sản xuất rượu càng thêm khoa học và hiệu quả hơn Cũng bắt đầu từ đó,sản xuất rượu trở thành một ngành công nghiệp thực thụ, đa dạng trong sảnphẩm và tiến bộ về công nghệ [33]

Rượu có rất nhiều loại mùi vị, tính chất khác nhau Tuy nhiên tất cả cácthứ rượu đều có một thành phần chung, đó là cồn (alcohol) Theo công nghệsản xuất, rượu được phân loại như sau:

- Rượu chưng cất: Loại rượu này dùng những nguyên liệu chứa đường

và tinh bột nhưng sau khi lên men được chưng cất lại Rượu chưng cất lànhững loại rượu nặng như Brandy, Whisky, Rhum và Vodka [33]

- Rượu lên men thuần túy: Rượu được lên men từ các nguyên liệu cóchứa đường, tinh bột và đều có nồng độ thấp Những điển hình của loại rượunày là rượu vang, saké, rượu nếp, [33]

- Rượu pha chế: Đây là loại rượu lên men hoặc rượu chưng cất có phathêm đường, hương liệu, dược liệu, mà thành Trong nhóm này có các loại nhưrượu bổ, rượu sâm, liqueur, cocktail [33]

vì người Việt nói chung rất phổ biến tập quán uống rượu, đặc biệt là trong các

ngày lễ, tết vốn vô tửu bất thành lễ Năm 1858, khi những người Pháp đầu tiên

đặt chân đến Việt Nam, vẫn chưa có sản xuất rượu ở quy mô công nghiệp.Chính phủ bảo hộ khuyến khích người Việt nấu rượu, uống rượu để thu thuế,cấp đăng ký sản xuất rượu, nhưng vẫn không có các biện pháp thu thuế triệt để.Hiện tượng trốn thuế, khai man thuế tràn lan không kiểm soát được Kể từ khisản xuất rượu công nghiệp ra đời, chính quyền bảo hộ ra sắc lệnh cấm dân tựnấu rượu, ngừng cấp giấy phép đăng ký kinh doanh nấu rượu cho các hộ giađình đã từng sản xuất kinh doanh bằng nghề nấu rượu, chỉ duy trì một số làng

nghề tập trung để dễ thu thuế Đến ngày nay thì sản xuất rượu vẫn là ngànhcông nghiệp thu được nhiều lợi nhuận ở nước ta [29].

Khắp trên đất nước Việt Nam đều có rượu ngon Nhiều loại rượu gắn vớitên địa phương nếu cả vùng nấu rượu và có chất lượng tương đối đồng đều, cóthể kể ra một loạt tên rượu địa phương như Làng Vọc, Kim Sơn, Làng Vân,Mẫu Sơn, Thổ Hà, Tạnh Xá, Nga Sơn, Kim Long, Làng Chuồn, Đá Bạc, BồngSơn, Bàu Đá, Gò Đen, Phú Lễ, Xuân Thạnh, Tân Lộc, Văn Điển, Bó Nặm,Trương Xá, Phú Lộc, Đại Lâm, Lạc Đạo, và danh sách có thể kéo dài đến vôtận Tuy nhiên, một số nơi khác thì tên gọi rượu ngon hẹp hơn, gắn với tênngười nấu rượu, lò rượu hoặc là sản phẩm của một nghệ nhân nhất định Ngay

cả tại những địa phương rượu nổi danh vẫn có những nghệ nhân mà sản phẩmrượu của họ có chất lượng cao hơn hẳn những người khác trong vùng Một sốloại rượu nổi tiếng trên khắp đất nước ta như:

- Rượu ngô Bản Phố (Lào Cai): Rượu này còn được gọi là rượu ngô Bắc

Hà là một thứ rượu ngon đặc sản của người Mông ở Bản Phố, cao nguyên Bắc

Hà (Lào Cai) Rượu ngô Bản Phố nấu từ nước lấy từ suối Hang Dế Ngô dùngnấu rượu Bản Phố không phải trồng ở nương rẫy hoặc thung lũng, mà ở trênnúi đá cao heo hút Rượu Bản Phố có màu trong như nước suối, lúc mới uốngnghe hương vị thơm nồng, sau đó là cảm giác êm dịu [30] Rượu ngô Bản Phốhương thơm nồng nàn, quyến rũ, uống vào không gắt, không chua Bí quyết tạonên sự khác biệt của rượu ngô Bản Phố với các loại rượu khác chính là rượunày được lên men bằng bột bông của cây "pa", còn gọi là cây Hồng Mi [30]

- Rượu Mẫu Sơn (Lạng Sơn): Loại rượu này do chính tay những ngườidân tộc Dao sống trên đỉnh Mẫu Sơn (Lộc Bình - Lạng Sơn) chưng cất ở độcao 800 - 1000m so với mặt biển bằng phương thức truyền thống, được lưutruyền từ đời này qua đời khác Rượu Mẫu Sơn thơm ngon, trong vắt như nướcsuối, uống rất dịu, vị đậm đà, lại không quá cay nồng mà cũng không quá nhạt,mang hương vị đặc trưng, thơm dịu của lá và rễ cây thuốc miền núi xứ Lạng

- Rượu làng Vân (Bắc Giang): Loại rượu này được phong là Vân hương

mỹ tửu và là loại rượu được tiến cống cho hoàng cung khi xưa Rượu được nấu

từ sắn hay gạo Rượu có mùi thơm đặc biệt do hương liệu của nếp cái hoa vàng

ở làng Vân cùng với công đoạn chưng cất bí truyền nơi đây [30]

- Rượu Kim Long (Quảng Trị): Đây là loại rượu đế nổi tiếng tại huyệnHải Lăng (Quảng Trị) Rượu muốn ngon phải được ngâm nước lạnh 10 ngàysau khi nấu xong [30]

- Rượu Kim Sơn (Ninh Bình): Tên rượu được lấy theo tên vùng nấurượu là huyện Kim Sơn (Ninh Bình) Loại rượu này có độ nồng cao, trong vắt.Khi nấu nếu tăm rượu càng to thì rượu sẽ càng ngon Rượu uống thơm dịu,càng để lâu càng ngon, thường được dùng để ngâm với tắc kè, rắn, [30]

- Rượu Hồng Đào (Quảng Nam): Rượu này được nấu từ nếp hương BàRén và gạo Gò Nổi, tất cả đều là nguyên liệu mới, thu hoạch không quá batháng Men rượu là loại men đặc biệt tuyển chọn từ men lá cổ truyền trong đómen Hồng Đào là men đặc trưng của rượu Hồng Đào Ủ men trong các chumsành phải đúng sáu ngày rồi mới chưng cất [30]

- Rượu Bàu Đá (Bình Định): Đây là loại rượu nổi tiếng của vùng đất võBình Định Rượu được nấu từ gạo, nếp, ngô, [30]

- Rượu Xuân Thạnh (Trà Vinh): Rượu có hai loại là trắng và đỏ Loại

đỏ thì nhẹ hơn còn loại trắng thì có độ cồn ngang với rượu Phú Lễ Để nấuđược rượu người dân phải chọn lọc các giống nếp nước ngọt dẻo ngon củavùng Nam Bộ này như: nếp mỡ, nếp thơm, nếp bông chát [30]

- Rượu Phú Lễ (Bến Tre): Rượu có độ cồn rất cao, nồng và gắt nhưngkhông gây đau đầu khi uống Người dân thường dùng rượu để ngâm với chuốihột [30]

- Rượu Gò Đen (Long An): Rượu này nổi tiếng nhất ở Bến Lức (LongAn), độ cồn lên đến 50 độ Rượu được nấu từ nếp mỡ, nếp than hay là gạo

Rượu uống đúng chuẩn phải cho vào hũ sành được ngâm dưới ao 100 ngày mớivớt lên dùng [30].

Ở Bình Định cũng có nhiều làng nghề sản xuất rượu truyền thống cóthương hiệu nổi tiếng như rượu Bàu Đá (An Nhơn), rượu Vĩnh Cửu (VĩnhThạnh), rượu Mỹ Thọ (Phù Mỹ),

1.2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU

1.2.1 Cơ chế của quá trình lên men rượu

Phương trình tổng quát của quá trình lên men rượu:

(C6H10O5)n + nH2O —► nC6Hi2O6 —► 2nC2H5OH + 2nCO2 + 113,4kJCác phản ứng của quá trình lên men rượu rất phức tạp, trải qua 10 phảnứng khác nhau với sự tham gia của nhiều hệ enzyme xúc tác, kết quả cho rarượu etylic, CO2 và một số sản phẩm khác [1]

Trong điều kiện lên men rượu, các đường đơn như glucose, fructose sẽđược phân giải theo con đường EMP và chu trình axit tricacboxylic (ATC) lúcđầu đang thực hiện, tiếp theo là chuỗi hô hấp hoạt động, nấm men thu nhiềunăng lượng, sinh khối dịch lên men tăng Sau đó sẽ hình thành sản phẩmethanol, CO2, sinh khối, các axit hữu cơ và sản phẩm phụ như glyxeryl [1]

Thực chất quá trình lên men rượu diễn ra theo ba giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Thủy phân tinh bột thành đường glucose [1]

- Giai đoạn 2: Đường phân glucose thành axit pyruvic và NADH2, axitpyruvic chuyển hóa thành acetaldehyde [1]

- Giai đoạn 3: Lên men rượu, chuyển acetaldehyl thành rượu [1]

1.2.2 Các quá trình chuyển hóa các chất trong lên men rượu

Việc phân chia các giai đoạn phát triển của vi khuẩn, nấm sợi, nấm mentrong dịch lên men một cách rõ ràng là điều rất khó khăn vì nó diễn ra đồngthời tuy rằng không cùng mức độ Vi khuẩn, nấm sợi đòi hỏi trong môi trườngphải có một lượng oxi nhất định, vì vậy mà chúng phát triển mạnh ở giai đoạnđầu Nấm men cũng cần oxi để tăng sinh khối tuy nhiên mức độ đó không caonhư nấm sợi Mặc khác, nấm men cần đường để chuyển hóa nên cần phải cóthời gian để nấm sợi tạo ra đường Do đó, ở các giai đoạn sau nấm men pháttriển mạnh hơn nấm sợi và vi khuẩn [5].

1.2.2.2 Các quá trình sinh lý, sinh hóa

* Quá trình hồ hóa tinh bột

Tinh bột sống không hòa tan trong nước do vậy qua giai đoạn dịch hóa

và đường hóa enzyme amylase tác dụng rất chậm Khi nấu tinh bột, lực liên kếtgiữa các phân tử đường yếu dần và đứt ra gọi là sự hồ hóa tinh bột Ở trạng tháinày chỉ một phần nhỏ tinh bột bị phá vỡ vì cấu tạo của tinh bột dạng mạng lướirất bền vững [8]

* Quá trình dịch hóa tinh bột

Trong giai đoạn đầu, vi khuẩn làm chua môi trường tạo điều kiện thíchhợp để enzyme a-amylase hoạt động phân cắt amylose và amylosepectin c ủatinh bột thành các dextrin khác nhau, bắt đầu là amylodextrin, sau làerytrodextrin và cuối cùng là acrodextrin, maltodextrin Do vậy trong giai đoạnnày hồ tinh bột sẽ bị loãng ra [8]

* Quá trình đường hóa

Giai đoạn đường hóa là giai đoạn thủy phân tinh bột và cácoligosaccharide thành đường glucose, maltose và maltotriose được thực hiệnbởi nấm sợi Tùy theo loại sản phẩm mong muốn quá trình chuyển hóa này cóthể được xúc tác bởi một hay kết hợp nhiều enzyme Khi sử dụng enzymeamyloglucosidase sẽ cho ra các sản phẩm giàu glucose Còn thủy phân bằngmột hỗn hợp các enzyme 0-amylase và pululanase thì cho sản phẩm giàumaltose (90%) [8]

Sự phát triển của nấm sợi tạo ra nhiều enzyme amylase, glucoamylasechuyển hóa tinh bột thành đường Các enzyme này hoạt động rất thuận lợitrong giai đoạn đầu và được kéo dài trong suốt các giai đoạn sau, nó chịu sựđiều khiển bởi nồng độ glucose trong dịch lên men Bình thường glucose sẽ ức

chế phản ứng thủy phân tinh bột, nhưng các loài nấm sợi như Mucor rouxii,

Rhizopus delemar lại vừa có khả năng tổng hợp enzyme amylase,

glucoamylase vừa có khả năng chuyển hóa đường thành rượu Kết quả là lượngđường được tạo ra ngay lập tức được rượu hóa, còn một phần sẽ được sử dụngcho quá trình sinh trưởng của chúng Vì vậy trong dịch lên men thường khôngxảy ra cơ chế kiềm hãm ngược bởi glucose [27]

Quá trình đường hóa chịu ảnh hưởng bởi một số yếu tố như sau:

- Các chất dinh dưỡng: Glucose là nguồn cacbon thích hợp nhất cho nấmsợi Khi nuôi nấm sợi sinh enzyme thì nguồn nitơ được sử dụng dưới dạngsulfat amon hoặc natri nitrat Tỉ lệ cacbon và nitơ trong môi trường có ảnhhưởng lớn đến sự sinh trưởng phát triển cũng như khả năng tạo ra enzyme Khi

nguồn cacbon và nitơ tối ưu thì nấm sợi mới tích lũy enzyme tối đa [5].

- Nồng độ enzyme: Trong điều kiện cùng chủng loại enzyme, nồng độ

cơ chất, thời gian thủy phân, nhiệt độ, pH môi trường không thay đổi thì khităng nồng độ enzyme tốc độ đường hóa sẽ tăng [8]

- Nhiệt độ: Tốc độ phản ứng của các enzyme cũng như phần lớn cácphản ứng hóa học đều tăng khi tăng nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độđường hóa, hiệu suất đường hóa và sản phẩm đường hóa Khi đường hóa ởnhiệt độ cao dextrin tạo ra nhiều hơn so với đường khử Nhưng trong nấm menkhông có hoặc có rất ít amylase và glucoamylase nên không thể tiếp tục thủyphân dextrin thành đường do vậy làm giảm hiệu suất thu hồi Quá trình đườnghóa trong sản xuất rượu từ tinh bột thường chỉ đạt 20 - 30% [8]

- Độ pH: pH tối thích cho enzyme amylase trong quá trình đường hóa là4,5 - 5,5 [8]

- Ảnh hưởng của nồng độ rượu: Quá trình đường hóa xảy ra trong thờigian ngắn, tinh bột không bị thủy phân hoàn toàn mà còn tiếp tục cho đến khikết thúc quá trình lên men Trong quá trình này nồng độ rượu tăng dần có tácdụng kìm hãm nhất định đến hoạt động của enzyme amylase [8].

- Thời gian đường hóa: Thời gian đường hóa có ý nghĩa thực tiễn trongsản xuất, quyết định chất lượng của dịch đường hóa và hiệu suất thu hồi, nócũng ảnh hưởng đến sự hòa tan tinh bột không đường hóa Khi đường hóa ởnhiệt độ 55 - 58°C trong 15 - 150 phút hầu như đường lên men không tăng,nhưng nồng độ chất tan tăng do sự hòa tan tinh bột không đường hóa [5]

* Quá trình lên men rượu

Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men.Nấm men chuyển hóa đường thành rượu etylic và CO2 Quá trình này còn đượcgọi là quá trình rượu hóa, cồn hóa [8]

Quá trình lên men rượu được chia thành hai giai đoạn chính:

- Giai đoạn phát triển sinh khối: Giai đoạn này có sự hiện diện của O2,

tế bào nấm men sẽ phát triển sinh khối để gia tăng về kích thước và số lượng

- Giai đoạn lên men chuyển hóa đường thành rượu và CO2: Nấm menhấp thụ chất dinh dưỡng và sử dụng enzyme sẵn có để xúc tác các phản ứngsinh hóa trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống tạo thành rượu và CO2

Quá trình lên men chia làm 3 thời kỳ chính:

- Thời kỳ đầu: khoảng 60 giờ kể từ khi nấm men tiếp xúc với dịch lênmen Sự lên men xảy ra rất chậm, đường lên men không đáng kể [8]

- Thời kỳ 2: là thời kỳ lên men chính, chiếm khoảng 60 - 120 giờ sauthời kỳ đầu Ở thời kỳ này sự phát triển của nấm men sau mỗi giờ tăng nhanhđáng kể và đạt đến trị số cực đại Thời kỳ lên men chính là thời kỳ biến đổi sâusắc các thành phần trong dịch lên men, ảnh hưởng đến kết quả quá trình lênmen [8].

- Thời kỳ 3: là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm đồng thời tạo mùicho sản phẩm Tùy theo phương pháp lên men, loại sản phẩm mà thời gian lênmen phụ kéo dài khác nhau [8]

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men:

- Nồng độ đường: Nấm men chỉ lên men đường thành rượu trong khoảngnồng độ thích hợp là từ 10 - 18%, nồng độ đường từ 30 - 35% sẽ ức chế nấmmen và khả năng lên men, nồng độ đường thấp cũng làm giảm khả năng lênmen [8]

- Nhiệt độ: Nấm men phát triển tốt nhất ở 28 - 30°C, nếu quá 50°C nấmmen sẽ chết [8]

- Độ pH: Nấm men có thể phát triển trong môi trường có pH từ 2 - 8nhưng thích hợp nhất là từ 4 - 4,5 [8]

- Nồng độ rượu: Cùng một môi trường nuôi cấy, số lượng nấm men,điều kiện nuôi cấy thì nồng độ rượu ban đầu 1% chưa ảnh hưởng đến tốc độ vàkhả năng phát triển của nấm men, từ 4 - 6% sẽ gây ảnh hưởng xấu [8]

- Oxi: Nấm men là loại vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc Trong điềukiện không có oxi nấm men sẽ lên men đường tạo thành rượu và CO2 còn trongđiều kiện đầy đủ oxi thì nấm men tăng sinh khối [8]

1.3 HỆ VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU

1.3.1 Nhóm nấm sợi

1.3.1.1 Các loại nấm sợi thường gặp trong men rượu

Trong bánh men chủ yếu gặp các loại nấm sợi như Mucor, Aspergillus,

Rhizopus, Penicillium Trong đó, đặc biệt là loài Mucor rouxii có nhiều đặc

tính quý như có khả năng chịu nhiệt độ cao 32 - 35°C, vừa có khả năng đường

hóa vừa có khả năng rượu hóa [6].

Giống Aspergillus: có hệ khuẩn ty không màu hoặc màu vàng nhạt Có

hai loại khuẩn ty đó là khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt môi trường vàkhuẩn ty cơ chất ăn sâu vào môi trường đặc Khuẩn ty phân nhánh, có nhiềuvách ngăn tế bào Tế bào có hạch nhân Cuống đính bào tử không phân nhánh,dài và thẳng, có nhiều cuống nhỏ Tùy loại có cuống nhỏ một tầng hoặc haitầng Tất cả cuống nhỏ có hình chai được gọi là tế bào hình chai, khi trưởngthành sinh ra các đính bào tử ở đầu cuống Các đính bào tử xếp thành chuỗi dài

và càng tận cùng càng lớn dần Những chuỗi đính bào tử xếp đối xứng tỏa trònvới nhau như hoa cúc Mỗi đính bào tử điển hình thường hình cầu, đơn bào, đahạch, bề mặt xù xì Do cuống bào tử và đính bào tử có màu sắc nên màu của

chúng trở thành màu của khuẩn lạc nấm sợi Các khuẩn lạc giống Aspergillus

thường có màu vàng, vàng lục đen, xám nhạt, nâu, [6]

Mucor và Rhizopus: có hình dạng rất giống nhau, chỉ khác nhau ở phần

sợi cơ chất Trong men rượu rất hay gặp hai chủng này, đặc biệt là M rouxii,

M mucedo, M japanicus Hệ sợi của Mucor hình ống, dạng nhung hoặc len,

không có thân bò, phân nhánh khá phong phú nhưng không có vách ngăn Đỉnhsợi nấm là cuống bào tử nang, cuống bọc bào tử dựng đứng, đơn độc hoặc phânnhánh Túi bào tử hình cầu có thể quan sát bằng mắt thường, chứa các bào tửbên trong Thành của túi bào tử nứt ra sẽ giải phóng các bào tử, phát tán theogió, gặp nơi có đủ điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm, mọc thành hệ sợi mới Sợi

của Mucor thường bắt đầu có màu trắng, sau đó sẫm hơn rồi ngả sang màu đen.

Bào tử hình cầu màu trắng [6]

Penicillium là nấm sợi sinh bào tử có màu xanh thường được gọi là mốc

xanh Sợi nấm có vách ngăn, khi phát triển sinh bào tử rất giống cái chổi Tất

cả các loài của giống này lúc đầu phát triển sợi có màu trắng, sau là xanh xám

và cuối cùng là nâu xám Cuống đính bào tử có vách ngăn và có hình cái chổi,phần cuối là tế bào hình chai cùng với các đính bào tử Tuy loại nấm này cókhả năng sinh ra hệ enzyme đường hóa mạnh nhưng nó thường có mùi vị mốc

rất khó chịu nên thường không dùng trong việc nấu rượu [6].

1.3.1.2 Vai trò của nấm sợi trong lên men rượu

Trong men rượu có nhiều loại nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus, các loài nấm sợi này chủ yếu sinh enzyme amylase đường hóa tinh bột Số loại nấm phụ thuộc vào các yếu tố như nhiệt

độ, địa phương sản xuất men, nhưng trong đó giống Mucor và Rhizopus là

phát triển hơn cả [14]

Các chủng nấm sợi Mucor, Rhizopus đóng vai trò sinh enzyme amylase đường hóa tinh bột Khi đường hóa hệ enzyme trong nấm sợi thường ít a- amylase và nhiều 0-amylase vì vậy đường tạo chủ yếu là maltose và các dextrin cuối Mucor và Rhizopus là hai chủng thường gặp trong nghề làm rượu, đặc biệt là Mucor rouxii, M mucedo, M japanicus Mucor có khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme amylase đường hóa tinh bột và zymase lên men rượu từ

đường vì vậy chúng có thể lên men trực tiếp tinh bột thành rượu [14]

Nấm sợi có vai trò trong việc phân cắt tinh bột thành đường, chuyển hóađường thành ethanol Các giống nấm sợi Mucor, Rhizopus, Aspergillus có vaitrò sinh ra enzyme amylase đường hóa tinh bột Trong đó a-amylase, 0-amylase và Y-amylase là ba loại enzyme amylase có vai trò chính trong lênmen rượu [9]

a-amylase: không cắt được liên kết a-1,6 glycozit nhưng cắt được liên

kết a-1,4 glycozit ở bất kì vị trí nào trên mạch amylose hoặc amylopectin củatinh bột, do đó nó phân cắt được tinh bột thành các đoạn dài ngắn khác nhaugồm glucose và một số ít đường maltose Quá trình thủy phân tinh bột của a-amylase gồm hai giai đoạn đó là giai đoạn đường hóa và giai đoạn dịch hóa.Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động cực đại của a-amylase là 72 - 76°C pH tối ưu là5,3 - 5,8 [9]

P-amylase: khả năng dịch hóa kém hơn a-amylase nhưng khả năng

đường hóa lại cao hơn Tác dụng của 0-amylase là cắt được liên kết a-1,4glycozit, nó phân cắt tuần tự từng phân tử maltose ở đầu không khử 0-amylase phân giải 100% amylose thành maltose và 54 - 58% amylopectin

thành maltose, phần còn lại là dextrin Do mỗi nhánh của amylopectin có từ 20

- 25 phân tử glucose nên sau khi thủy phân tạo từ 10 - 12 phân tử maltose Khitới liên kết a-1,4 glycozit gắn với liên kết a-1,6 glycozit nó sẽ ngưng tác độngnên phần còn lại là dextrin phân tử lớn chiếm 42 - 46% Nhiệt độ tối thích cho0-amylase là 60 - 65°C pH tối thích là 5,0 - 5,6 [9]

Y-amylase (glucoamylase): cắt được cả liên kết a-1,4 glycozit và liên

kết a-1,6 glycozit, nó có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột mà không cần

sự có mặt của các enzyme amylase khác Nó thủy phân các polysaccharide cóphân tử lớn nhanh hơn các polysaccharide có phân tử nhỏ, Y-amylase thủyphân tuần tự từng gốc glucose từ đầu không khử của polysaccharide và khôngthủy phân được dextrin vòng do vậy sản phẩm tạo thành là glucose và dextrinvòng Enzyme này hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 50°C, hoạt lực tối đa trong vùng

có pH từ 3,5 - 5,5 [9]

1.3.2 Nhóm nấm men

1.3.2.1 Nấm men trong men rượu

Nấm men có trong men rượu chủ yếu là chi Saccharomyces cerevisiae,

các giống khác đều coi là men dại, men tạp không mong muốn Các giống khác

như Hyphopichia burtonii, Pichia anomada, P fabianii, P fermentans, Saccharomyces diastaticus, S fermentati, S glouus, [13]

Nấm men rượu có cấu tạo đơn bào, có cấu tạo hình cầu hoặc hình trứng,kích thước khoảng 8 - 15 ^m [13]

Chu trình sống ở nấm men rượu Saccharomyces cerevisiae: các tế bào

dinh dưỡng đơn bội (n) có thể tiếp hợp với nhau để tạo thành tế bào dinh dưỡnglưỡng bội (2n) Sau quá trình giảm phân sẽ sinh ra các bào tử túi (thường là bốnbào tử túi) Trong điều kiện bình thường chúng nảy chồi để sinh sôi nảy nở,nhưng khi gặp điều kiện bất lợi chúng mới thực hiện sinh sản hữu tính bằngbào tử [13]

1.3.2.2 Vai trò của nấm men trong quá trình lên men rượu

Nấm men đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men rượu Trongsuốt quá trình lên men, ngoài ethanol, CO2 còn tạo ra nhiều sản phẩm phụ như:

glycerol, dầu fusel, este, axit hữu cơ, Sự hiện diện của các hợp chất này tùy

thuộc vào dòng nấm men và điều kiện lên men, chúng góp phần quan trọng tạonên hương vị đặc trưng cho sản phẩm [17]

Saccharomyces cerevisiae có khả năng lên men nhiều loại đường khác

nhau như glucose, maltose, fructose, galactose Nhiệt độ lên men thích hợp là

28 - 32°C [17]

Ngoài ra trong men rượu còn có nhiều loại nấm men dại có khả năngchuyển hóa đường thành rượu, tuy rằng sự chuyển hóa này thấp Đặc biệt cácloài này chịu nhiệt rất cao, có khi lên tới 60 - 65°C và chịu được chất sát trùng

ở nồng độ 0,05 - 1% [17]

1.4 TỔNG QUAN VỀ NẤM SỢI

1.4.1 Giới thiệu chung về nấm sợi

Nấm sợi hay còn được gọi là nấm mốc (molds hay moulds) là tên chung

cho tất cả các nấm không phải là nấm men và cũng không sinh mũ nấm như ởnấm mũ lớn Tuy nhiên ở tất cả các giai đoạn chưa sinh mũ nấm thì khuẩn ty

(hệ sợi nấm) của nấm lớn vẫn được coi là nấm sợi và được nghiên cứu về các

mặt sinh lý, sinh hóa, di truyền, như các sợi nấm khác [32]

Có nhiều giống và loài nấm sợi khác nhau nhưng phần lớn đều có cấutạo sợi và mang đính bào tử [32]

Trong tự nhiên nấm sợi phân bố rộng rãi và tham gia tích cực vào cácvòng tuần hoàn vật chất, nhất là các quá trình phân giải chất hữu cơ và hìnhthành chất mùn Rất nhiều loại nấm sợi đã được sử dụng trong công nghiệp chếbiến thực phẩm, công nghiệp enzyme, công nghiệp dược phẩm, sản xuất thuốctrừ sâu sinh học, sản xuất sinh khối phục vụ chăn nuôi và dinh dưỡng cho conngười, xử lý ô nhiễm môi trường [32]

1.4.2 Hình thái và đặc điểm dinh dưỡng chung của nấm sợi

1.4.2.1 Hình thái và kích thước của nấm sợi

Nấm sợi là nhóm vi sinh vật có kết cấu dạng sợi phân nhánh Tế bào cócấu tạo hoàn chỉnh, kích thước lớn, có thể là đơn bào đa nhân hoặc đa bào đa

nhân [2].

Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh bên trong chứa chất

nguyên sinh có thể lưu động Về chiều dài chúng có thể sinh trưởng vô hạnnhưng đường kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1 - 30 Lim [2]

Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài Lúc sợi nấmsinh trưởng mạnh mẽ đây là vùng thành tế bào phát triển nhanh chóng Phầnngọn gồm đỉnh sợi nấm, phần tạo ra thành tế bào, phần tăng trưởng Đỉnh sợinấm gồm một chóp nón không tăng trưởng và có tác dụng bảo vệ cho phầnngọn của sợi nấm Đây là phần chất nguyên sinh, không có nhân và ít chứa các

cơ quan tử Phần này rất dễ tách rời với các phần còn lại của ngọn sợi nấm vìdưới chóp nón là một phần có thành rất mỏng Dưới nữa là phần tạo ra thành tếbào, các sợi nhỏ trên thành tế bào xếp ngang Dưới nữa là phần tăng trưởng,thành của phần này có cấu trúc sợi dạng mạng lưới, ngọn sợi nấm tăng trưởngđược là nhờ phần này Tiếp theo là phần thành cứng hay còn gọi là phần thànhthục của sợi nấm, thành tế bào ở phần này ngoài các sợi ngang còn được tăngtrưởng bởi các sợi dọc Bắt đầu từ phần này trở xuống là chấm dứt sự sinhtrưởng của nấm sợi Giữa hai phần nói trên là miền yếu và dễ gãy Ở phần tăngtrưởng của sợi nấm chứa đầy chất nguyên sinh với nhiều nhân, nhiều cơ quan,nhiều enzyme, nhiều axit nucleid Đây là phần quyết định sự tăng trưởng và sựphân nhánh của sợi nấm [2]

Khuẩn lạc của nấm sợi có nhiều màu sắc khác nhau như khuẩn lạc của

xạ khuẩn nhưng khuẩn lạc của nấm sợi phát triển nhanh hơn và thường to hơnkhuẩn lạc của xạ khuẩn nhiều lần, dạng xốp hơn do kích thước khuẩn ty tohơn Thường thì mỗi khuẩn lạc sau 3 ngày phát triển có kích thước 5 - 10mmtrong khi đó khuẩn lạc của xạ khuẩn chỉ khoảng 0,5 - 2mm [2]

1.4.2.2 Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm sợi

Hầu hết các loài nấm sợi không cần ánh sáng trong quá trình sinhtrưởng Tuy nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá trình tạo bào tử.Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 2°C đến 5°C, tối ưu từ 22°C đến

27°C và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35°C đến 40°C, cábiệt có một số ít loài có thể sống sót ở 0°C và ở 60°C Về pH, nấm sợi có thểphát triển tốt ở môi trường axit (pH = 6) nhưng pH tối ưu là 5 - 6,5, một số loàiphát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9 [31].

Oxi cũng cần cho sự phát triển của nấm sợi vì chúng là nhóm hiếu khíbắt buộc và sự phát triển sẽ ngừng khi không có oxi và dĩ nhiên nước là yếu tốcần thiết cho sự phát triển [31]

Nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H,

N P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca Các nguyên tố này hiện diệntrong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản như glucose, muối ammonium, sẽđược nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sảnsinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme thích hợp để cắt các đại phân tử nàythành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vào trong tế bào [31]

Sợi nấm không ngừng phân nhánh vì vậy khi một bào tử nảy mầm trênmột môi trường đặc biệt sẽ phát triển thành một hệ sợi nấm sau 3 - 5 ngày cóthể tạo thành một đám có thể nhìn thấy gọi là khuẩn lạc Phần lớn sợi nấm códạng trong suốt, ở một số nấm sợi mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ.Sắc tố của một số nấm sợi còn tiết ra ngoài môi trường và làm đổi màu khu vực

có nấm phát triển [31]

1.4.3 Cấu tạo của nấm sợi

Nấm sợi có cấu trúc gồm thành tế bào, rồi đến màng tế bào chất, bêntrong là tế bào chất với nhân phân hóa Màng nhân có cấu tạo hai lớp và trênmàng có nhiều lỗ nhỏ Trong nhân có hạch nhân Bên trong tế bào nấm còn cókhông bào, ti thể, mạng lưới nội chất, Đỉnh sợi nấm bao gồm một chóp nón,không tăng trưởng và có tác dụng che chở bảo vệ cho phần ngọn của sợi nấm.Đây là phần mà chất nguyên sinh không có nhân và ít chứa các cơ quan tử Ởcác loài nấm khuẩn ty không có vách ngăn gọi là các tế bào đa nhân vì bêntrong có nhiều nhân Ở các loài nấm có vách ngăn thì do khả năng di chuyểncủa nhân mà từng tế bào có thể chứa từ một nhân, hai nhân, nhiều nhân hoặc

không có nhân nào [2].

Nấm sợi có cấu tạo gồm khuẩn ty và bào tử

1.4.3.1 Khuẩn ty (hypha)

Là những sợi nấm phân nhánh, phát sinh từ bào tử mà ra, chiều ngangcủa khuẩn ty khoảng từ 3 - 10^m, chúng có hình thái khác nhau như hình lò xo,hình xoắn ốc, hình cái vợt, hình sừng hươu, hình cái lược, hình lá dừa [2]

Một số phát triển sâu vào cơ chất và hấp thu các loại thức ăn chứa trong

đó, gọi là sợi nấm cơ chất hay sợi nấm dinh dưỡng Một số nấm phát triển trên

bề mặt cơ chất gọi là sợi nấm khí sinh Từ sợi nấm khí sinh này sẽ có một sốsợi nấm phát triển thành cơ quan sinh sản đặc biệt, mang bào tử [2]

1.4.3.2 Bào tử (spore)

Bào tử là cơ quan sinh sản chủ yếu của nấm sợi Khi nấm sợi trưởngthành sẽ xuất hiện những khuẩn ty khí sinh sẽ sản sinh ra các bào tử [2]

Bào tử vô tính:

- Bào tử đốt (actrospore): từ khuẩn ty sinh sản có sự ngắt đốt, mỗi đốt

được coi như một bào tử, rơi vào trong môi trường sẽ nhanh chóng phát triểnthành một khuẩn ty mới [2]

- Bào tử màng dày (chlamydospore): trên các đoạn khuẩn ty sinh sản

xuất hiện những tế bào có hình tròn hoặc gần tròn, có màng dày bao bọc tạothành bào tử Bào tử có khả năng đề kháng với điều kiện bất lợi của ngoại cảnh[2]

- Bào tử nang (sporangiospore): đầu một khuẩn ty sinh sản phình to dần,

hình thành một cái bọc gọi là nang (sporangium) Khi nang vỡ ra bào tử đượcgiải phóng ra bên ngoài [2]

- Bào tử đính hay bào tử trần (conidium ): Bào tử đính có hình dạng và

màu sắc khác nhau tùy theo loài nấm sợi Bào tử đính có thể là đơn bào hoặc đabào Chúng có thể đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, từng khối [2]

Bào tử hữu tính: được hình thành do sự sinh sản hữu tính (bao gồm

hiện tượng chất giao, nhân giao và phân bào giảm nhiễm) Có các loại bào tửsau:

- Bào tử tiếp hợp: Bào tử lớn được hình thành trong một màng dày Saumột thời gian sống tiềm tàng, bào tử tiếp hợp sẽ nảy mầm phát triển thành mộtnang bên trong chứa nhiều bào tử [2]

- Bào tử túi: Bào tử được bao bọc trong túi, thường 4 - 8 bào tử trongmột túi Tùy theo loại nấm mà số lượng, hình dạng, kích thước, màu sắc bào tửtúi sẽ khác nhau, khi bào tử túi thoát ra ngoài thì nảy mầm [2]

- Bào tử đảm: Đảm có thể được sinh ra trực tiếp trên khuẩn ty hoặcnhững cơ quan đặc biệt gọi là quả đảm Trong đảm, hai nhân sẽ kết hợp lại vớinhau, sau đó phân chia liên tiếp hai lần tạo thành bốn tế bào con Đảm phình to,bên trên xuất hiện bốn cuống nhỏ, sau đó mỗi nhân sẽ chui vào trong tế bào thểbình và phát triển thành bào tử đảm [2]

- Bào tử noãn [2]:

Xuất hiện noãn khí

L

Hùng khí được sinh ra tiếp xúc với noãn khí

Nguyên sinh chất thụ tinh cho noãn cầu Ống xuyên chứa một nhân

X

Noãn bào tử

Khuẩn ty mới

1.4.4 Các dạng biến hóa của hệ sợi nấm

Hệ sợi nấm có thể biến hóa để thích nghi với các điều kiện sống khác nhau thành các dạng đặc biệt sau đây:

- Rễ giả (rhizoid): trông gần giống như một chùm rễ phân nhánh, có tác

dụng giúp bám chặt vào cơ chất và hấp thụ chất dinh dưỡng từ cơ chất [2]

- Sợi hút (haustoria): Chúng được mọc ra từ khuẩn ty và phân nhánh rồi

đâm sâu vào cơ chất, ở đó chúng có thể biến thành hình cầu, hình ngón tay hayhình sợi Chúng sử dụng các sợi hút này để hút chất dinh dưỡng từ môi trường[2].

- Sợi áp (appressoria): gặp ở các nấm kí sinh ở thực vật Phần sợi nấm

tiếp xúc với giá thể sẽ phồng to ra, tăng diện tiếp xúc với vật chủ Phần nàythường có hình đĩa, có nhiều nhân tế bào, áp chặt vào giá thể [2]

- Sợi bò hay thân bò (stolon): là đoạn sợi nấm khí sinh không phân

nhánh, phát sinh từ các sợi nấm cơ chất, có hình thẳng hoặc hình cung Đầumút của các sợi bò chạm vào cơ chất phát triển thành các rễ giả để bám chắcvào cơ chất [2]

- Vòng nấm hay mạng nấm: là biến đổi của những loài nấm có khả năngbẫy các sinh vật nhỏ trong đất Vòng nấm có dạng các sợi có khuyên tròn dọcsợi nấm Mạng nấm hay còn gọi là lưới dính là một mạng sợi dính nhau nhưtấm lưới nhỏ [2]

1.4.5 Sinh sản ở nấm sợi

Nấm sợi sinh sản dưới hình thức: vô tính và hữu tính Trong sinh sản vôtính, nấm sợi hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trongsinh sản hữu tính nấm sợi hình thành hai loại giao tử đực và cái [2]

1.4.5.1 Sinh sản vô tính

Nấm sợi sinh sản vô tính thể hiện qua hai dạng: sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra hoặc phân nhánh và sinh sản bằng các loại bào tử

Sinh sản sinh dưỡng:

- Sinh sản sinh dưỡng bằng khuẩn ty: là hình thức từ một khuẩn ty phân

ra các đoạn nhỏ, những đoạn nhỏ này phát triển thành một hệ khuẩn ty mới [2]

- Sinh sản sinh dưỡng bằng hạch nấm: Hạch nấm là một tổ chức giúp cho nấm sống qua những điều kiện ngoại cảnh bất lợi Khi gặp điều kiện thuận lợi hạch sẽ nảy mầm và phát triển bình thường [2]

- Sinh sản sinh dưỡng bằng bào tử dày: Bào tử dày thường là đơn bào, đôi khi là hai hay nhiều tế bào Gặp điều kiện thuận lợi, bào tử dày sẽ nảy mầm

thành một hệ sợi nấm [2].

Sinh sản vô tính bằng bào tử:

- Bào tử kín: là bào tử hình thành mang một nang kín Ở một số loài,bào tử nằm trong nang có tiên mao, khi nang vỡ, bào tử có khả năng di động

trong nước gọi là động bào tử (zoospore) [2].

- Bào tử đính: là hình thức bào tử được hình thành bên ngoài cơ quansinh bào tử Từ sợi nấm mọc lên cuống sinh bào tử bằng cách phân cắt cùngmột lúc từ một sợi thành nhiều bào tử [2]

1.4.5.2 Sinh sản hữu tính

Nấm sợi cũng có quá trình sinh sản hữu tính, bao gồm các hiện tượngchất giao, nhân giao và phân bào giảm nhiễm như các thực vật bậc cao Có bahình thức sinh sản hữu tính:

- Đẳng giao: từ sợi khuẩn ty sinh ra các túi giao tử bên trong có chứa

giao tử Các giao tử và túi giao tử hoàn toàn giống nhau giữa cơ thể “cái” và cơthể “đực” Các giao tử sau khi ra khỏi túi kết hợp với nhau tạo thành hợp tử.Hợp tử phân chia giảm nhiễm thành các bào tử Mỗi bào tử sau khi được phóngthích ra bên ngoài hình thành nên sợi nấm mới [2]

- Dị giao: là trường hợp các giao tử và túi giao tử của cơ thể “cái” và cơ

thể “đực” khác nhau Khi hùng khí mọc vươn tới noãn khí, từ hùng khí tạothành các ống xuyên và qua đó tinh trùng vào thụ tinh với noãn cầu tạo thànhnoãn bào tử Noãn bào tử được bao bọc bởi màng dày, sau một thời gian phânchia giảm nhiễm và phát triển thành sợi nấm sợi [2]

- Tiếp hợp: Từ hai khuẩn ty khác nhau gọi là sợi âm và sợi dương mọc

ra nguyên phôi nang Các nguyên phôi nang mọc hướng vào nhau dần dần hìnhthành màng ngăn với khuẩn ty sinh ra nó tạo tế bào đa nhân Hai tế bào đa nhântiếp hợp với nhau tạo thành bào tử tiếp hợp có màng dày Bào tử tiếp hợp nảymầm mọc thành ống mầm Đầu ống mầm phát triển thành một nang vô tínhchứa nhiều bào tử Khi nang vỡ giải phóng bào tử ra ngoài Mỗi bào tử phát

triển thành một sợi nấm [2].

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae do Trung tâm Ứng dụng

Tiến bộ Khoa học và Công nghệ Bình Định cung cấp

2.1.2 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 11 năm 2016 đến tháng 6 năm 2017

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

- Phòng thí nghiệm Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ Khoa học và Côngnghệ Bình Định

- Làng Bàu Đá - Xã Nhơn Lộc - Thị xã An Nhơn - Tỉnh BìnhĐịnh

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Khảo sát một số đặc điểm sinh học của hai chủng nấm sợi Mucor spp.

và Rhizopus oryzae: hình thái, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc và của tế bào

nấm sợi

- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của hai chủng

nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae: hàm lượng NaNO3, hàm lượng

saccharose tối ưu

- Khảo sát khả năng phân giải tinh bột của hai chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae.

- Khảo sát khả năng đường hóa trong quá trình lên men rượu của hai

chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae.

- Sản xuất bột nấm sợi (bột mốc), bột men rượu thuần

- Sử dụng men rượu thuần tạo được để chế biến rượu và đánh giá một

số chỉ tiêu của rượu thu được

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp vi sinh

2.3.1.1 Phương pháp quan sát hình thái nấm sợi

* Quan sát khuẩn lạc nấm sợi

Cấy các chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae lên môi trường

PGA, để ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ Sau đó quan sát và ghi nhận hình tháikhuẩn lạc nấm sợi trên đĩa như: màu sắc, hình dạng sợi và đo kích thước khuẩnlạc Quan sát trong 48 giờ nuôi cấy đầu tiên

* Quan sát tế bào nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae dưới kính

• Á •

hiển vi

Cấy các chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae lên môi trường

PGA, để ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ, sau đó làm tiêu bản tế bào nấmsợi trong xanh methylen, quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học

của các chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae

* Xác định hàm lượng NaNO3 trong môi trường Czapek - Dox tối

ưu cho sự sinh trưởng của các chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae

Tiến hành thí nghiệm nuôi cấy các chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae trong môi trường Czapek - Dox với nồng độ saccharose là

30g/l và thay đổi các nồng độ NaNO3 lần lượt là 1,0g/l, 1,5g/l, 2,0g/l, 2,5g/l,3,0g/l Theo dõi sự phát triển, đo đường kính khuẩn lạc định kỳ 24 giờ một lần

và xác định thời gian để khuẩn lạc của các chủng nấm sợi phủ kín bề mặt đĩapetri có đường kính 8cm

* Xác định hàm lượng saccharose trong môi trường Czapek - Dox

tối ưu cho sự sinh trưởng của các chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae

Thí nghiệm nuôi cấy các chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae

được tiến hành trên môi trường Czapek - Dox với nồng độ đường saccharose

lần lượt là 20g/l, 25g/l, 30g/l, 35g/l, 40g/l Theo dõi sự phát triển, đo đườngkính khuẩn lạc định kỳ 24 giờ một lần và xác định thời gian để khuẩn lạc củacác chủng nấm sợi phủ kín bề mặt đĩa petri có đường kính 8cm.

2.3.2 Phương pháp hóa sinh

2.3.2.1 Phương pháp xác định khả năng phân giải tinh bột

* Phương pháp thí nghiệm: Môi trường sử dụng để xác định khả năng

phân giải tinh bột của các chủng nấm sợi là môi trường Czapek - Dox vớinguồn cacbon được thay bằng tinh bột tan Cấy điểm các chủng nấm sợi lênmôi trường Czapek - Dox tinh bột, để ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ Sau đóphủ một lớp Lugol lên các đĩa petri đã nuôi cấy nấm sợi Nếu có vòng phângiải xung quanh khuẩn lạc thì chủng nấm sợi đó có khả năng phân giải tinh bột,nếu không có vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc thì chủng nấm sợi không

có khả năng phân giải tinh bột, dùng thước đo vòng phân giải tinh bột và ghinhận kết quả [3]

2.3.2.2 Phương pháp thử hoạt tính enzyme amylase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch

* Phương pháp thu nhận enzyme amylase từ nấm sợi [3]

Sử dụng môi trường PGA không cho agar để nuôi cấy nấm sợi

- Chuẩn bị 100ml môi trường trong bình tam giác 250ml

- Đem tiệt trùng ở 121°C trong 30 phút và để nguội

- Cho 10ml nước cất đã vô trùng vào trong ống nghiệm giống nấm sợi,khuấy nhẹ để các bào tử hòa trong nước

- Đổ toàn bộ 10ml dịch trong ống nghiệm này vào trong bình tam giác250ml có 100ml môi trường

Tất cả thao tác này được thực hiện trong tủ cấy vô trùng

- Đặt các bình tam giác này vào máy lắc có tốc độ 200 vòng/phút nuôitrong 48 giờ ở nhiệt độ phòng

- Sau đó đem ly tâm, thu lấy dịch Dịch nuôi cấy này có chứa enzyme hòatan Bảo quản dịch nuôi cấy này trong tủ lạnh 4°C