Màu xanh dương là màu của trời, biển, màu của sự tinh khiết, yên bình và vĩnh cửu, hoa hồng xanh gắn liền với tri thức và trí tuệ, mang trong mình những ý nghĩa và vẻ đẹp riêng
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG
KHOA HÓA
- -BÁO CÁO MÔN SINH HỌC PHÂN TỬ
Đề tài: Kĩ thuật và nguyên tắc tạo hoa hồng xanh
Giáo viên hướng dẫn: TS Ngô Thái Bích Vân
Sinh viên thực hiê ̣n : Hồ Thị Nga
Nguyễn Thị Tuyết Nhi
Nguyễn Thị Ái Nhi
Phạm Thị Quỳnh Như
Nguyễn Thị Nguyê ̣t
Nguyễn Thị Kim Ngân
Lớp : 17SH
Nhóm : 6
Trang 2MỤC LỤC
1.Đă ̣t vấn đề 2
2.Lịch sử phát triển 3
3.Kĩ thuâ ̣t RNAi 4
3.1.Khái niê ̣m RNAi 4
3.2.Cơ chế hoạt động 4
* Một số đặc điểm của kĩ thuật RNAi 7
4 Kĩ thuâ ̣t DNA tái tổ hợp 7
4.1.Khái niê ̣m DNA tái tổ hợp 7
4.2 Cơ chế hoạt động 9
5.Nguyên tắc tạo hoa hồng xanh 11
5.1 Tổng quan 11
5.2 Cơ chế tạo hoa hồng xanh 12
*Chu trình hình thành sắc tố 14
5.3 Những yếu tố ảnh hưởng 15
6.Kết luâ ̣n và kiến nghị 16
6.1 Kết luận 16
6.2 Kiến nghị 16
Trang 31.Đặt vấn đề
Hoa hồng là một loài hoa đẹp được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới Nó là biểu tượng đặc trưng của tình yêu, mang ý nghĩa trong các nền văn hóa khác nhau Không chỉ đẹp, loài hoa này còn mang lại nhiều lợi ích kinh tế cũng như cho sức khỏe và vẻ đẹp của con người như: làm đẹp da, cải thiện trí nhớ, tâm trạng, kháng viêm,
Hoa hồng hiện nay là loài hoa quan trọng nhất trên toàn cầu, là hoa phổ biến nhất ở châu Âu Năm 2007, hoa hồng chiếm 70% trong ngành công nghiệp hoa cắt cành trên thế giới, các chợ hoa đã và đang là trung tâm thu hút người tiêu dùng và các nhà tạo giống để tạo ra các giống hoa với màu sắc khác nhau: đỏ, cam, vàng, [1] Cùng với nhu cầu về hoa và đa dạng về màu sắc hoa ngày càng gia tăng, đòi hỏi sự đổi mới Màu xanh dương là màu của trời, biển, màu của sự tinh khiết, yên bình và vĩnh cửu, hoa hồng xanh gắn liền với tri thức và trí tuệ, mang trong mình những ý nghĩa và vẻ đẹp riêng nhưng lại là loài hoa duy nhất không tồn tại một cách tự nhiên do hoa hồng thiếu gen cụ thể có khả năng tạo ra màu "xanh thật"[2], nên hoa hồng xanh chỉ có thể được tạo ra theo cách truyền thống: nhuộm hoa hồng trắng Vì thế hoa hồng xanh trở thành 1 loài hoa bí ẩn được nhiều nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu Vào những năm 1840, Hoa hồng xanh có thể được coi là chén thánh (Holy Grail) của những nhà lai tạo hoa hồng Khi đó hiệp hội làm vườn của Anh và Bỉ đã treo giải thưởng 500.000 francs cho người đầu tiên tạo được hoa hồng màu xanh [3]
Trang 42.Lịch sử phát triển
Vừa rồi hội nghị hoa hồng thế giới 2006 được tổ chức tại thành phố Osaka
từ ngày 11-17/5/2006 Tại đó hoa hồng xanh được tạo ra bằng kỹ thuật RNAi do sự hợp tác giữa các nhà khoa học của hai công ty Florigene và Suntory dưới sự trợ giúp về mắt kỹ thuậtcủa Viện Khoa Học Kỹ Thuật Úc Châu (CSIRO) được giới thiệu và giành được giải thưởng 5000.000 francs Quá trình để có được hoa hồng xanh:[4]
+ Năm 1990-2004, nhóm nghiên cứu đạt thành công trong việc nuôi trồng và phát triển những hoa hồng xanh
+ Công ty Florigene, Australia phối hợp với công ty Suntory Holdings, Nhật nghĩ cách bổ sung gene mang màu xanh lấy từ hoa păng-xê và diên vĩ vào hoa hồng
+ Các nhà khoa học đã ứng dụng công nghệ gene lặn, thuộc sở hữu của tổ chức NCKH liên bang australia (CSIRO)
+ Do sự hợp tác giữa các nhà khoa học của hai công ty Florigene – Suntory, dưới sự trợ giúp về mặt kỹ thuật của Viện Khoa Học Kỹ Thuật Úc Châu (SCIRO)
· Cùng với sự phát triển vượt bật của khoa học – kĩ thuật, các nhà khoa học
đã và đang nghiên cứu, cải tiến các kĩ thuật nhằm tăng con đường sinh tổng hợp flavonoid (tác nhân tạo màu hoa) để đưa đến những phiên bản thay thế tốt hơn như sử một synthetase peptide không phải ribosome (NRPS) mà có thể tổng hợp các sắc tố màu xanh indigoidine, để tạo ra hoa hồng xanh.[5]
Trang 53.Kĩ thuặt RNAi
3.1.Khái niệm RNAi
"RNA can thiệp" (RNAi- RNA interference) là một loại RNA ngắn có kích thước khoảng 19-25 nu, có khả năng tham gia can thiệp vào quá trình phiên
mã và dịch mã, giúp kiểm soát các gene đang hoạt động
RNAi là một cơ chế để bất hoạt gene gây nên bởi RNA mạch kép (dsRNA)
Đó là trình tự đặc biệt và liên quan đến sự suy thoái của cả hai loại phân tử
RNA: RNA sợi kép (dsRNA) và RNA sợi đơn thường mRNA là những sợi tương đồng trong trình tự dsRNA làm kích hoạt phản ứng trả lời Các phân
tử RNAi này có thể gây nên các hiệu ứng: Ức chế dịch mã đơn vị mRNA,
ức chế sự phiên mã của gene ở trong nhân, phân giải mRNA.[1]
3.2.Cơ chế hoạt đọng
* Chú thích[1,3]
=> Hình 1: Cấu trúc siRNA[1]
(Mỗi sợi có nhóm 5 'phosphate và nhóm 3' hydroxyl (-OH) Cấu trúc này là kết quả của quá trình xử lý bởi Dicer, một loại enzyme chuyển đổi các chuỗi RNA dài hoặc RNA kẹp tóc thành siRNA.)
- siRNA : RNA can thiệp nhỏ (siRNA), đôi khi được gọi là RNA can thiệp ngắn hoặc RNA im lặng, là một loại gồm các phân tử RNA sợi đôi dài 20-25 nucleotide siRNA cũng có thể được đưa vào ngoại sinh (nhân tạo) vào các tế bào bằng nhiều phương pháp thay thế khác nhau
Trang 6- miRNA:RNA can thiệp nhỏ (micro RNA), RNA không mã hóa hình thành cấu trúc kẹp tóc
- ds RNA :dsRNA(double strand RNA) là đọan RNA dài mạch kép mang trình tự bắt că ̣p bổ sung được với gen mục tiêu
- RdRp :Enzyme tổng hợp trên khuôn RNA (RdRp)là sợi dsRNA, nhân bản các siRNA hoă ̣c miRNA
- Dicer: (nuclease RNAse III ) tách RNA sợi đôi (DSRNA) và tiền
microRNA (miRNA) thành các đoạn RNA sợi đôi ngắn gọi là RNA can thiệp nhỏ (siRNA)
-Phức hệ RISC (RNA – incluced silencing complex): Sự kết hợp giữa RNA và Argonaut, cùng với các protein khác
-Ago (Argonaute ):Argonaute là thành phần xúc tác của phức hợp RISC là một endonuclease có khả năng làm suy giảm RNA thông tin (mRNA) có trình tự bổ sung cho chuỗi dẫn siRNA
RITS Phức hợp protein (phức hợp này chứa argonaute, protein
chromodomain Chp1 và một protein gọi là TAS3 - Sửa đổi histone và liên quan đến sự hình thành heterochromatin phục vụ để điều hòa các gen trước phiên mã ; được gọi là quá trình im lă ̣ng phiên mã do RNA gây ra
Trang 7=>Hình 2: Con đường RNAi [tấn 2]
( 1 ) các chuỗi RNA dài - xuất phát từ a) bên trong từ microRNA (miRNA),
RNA tác động chuyển hóa (tasiRNA) và RNA vi mô (miRNA) hoặc b) từ bên ngoài khỏi virus xâm nhập, đã giới thiệu DSRNA - được phân tách bởi endonuclease được gọi là Dicer cho các RNA can thiệp sợi đôi nhỏ
(siRNA)trung bình 21-27 nt về kích thước
( 2 ) Các song công(đồng công) siRNA tạo ra phức hợp với các protein khác Nếu song công siRNA / mRNA chứa không khớp thì mRNA không bị phân cắt Thay vào đó, im lặng gen là kết quả của sự ức chế tịnh tiến
( 3 ) Phức hợp (RISC) giúp tách hai sợi miRNA hoặc siRNA trong phức hợp
Trang 8( 4 ) Phức hợp siRNA-RISC chuỗi đơn nhắm vào một mục tiêu cụ thể
mRNA bằng cách ghép cặp cơ sở Watson-Crick cụ thể giữa siRNA và mRNA được nhắm mục tiêu
( 5 ) Điều này dẫn đến việc loại bỏ mRNA cụ thể bằng cách phân cắt
enzyme hoặc ức chế dịch mã
( 6 ) Cuối cùng là các protein tương ứng và liên quan chức năng bị loại bỏ trong các tế bào của sinh vật đó
(7)Tái chế phức hợp siRNA-RISC xảy ra
cũng như ở thực vật, nấm và tuyến trùng (nhưng không phải động vật có xương sống)
(8)Nơi có một quá trình khuếch đại của nhóm siRNA nhỏ bởi RNA phụ thuộc
↳ KL(ứng dụng trong kĩ thuật tạo hoa hồng xanh) : Dùng kỹ thuật RNAi nhằm ức chế hoạt động của gen DFR trong hoa hồng đỏ dẫn đến ức chế chu trình cyanidin
* Một số đặc điểm củă kĩ thuật RNAi
- dsRNA mới có khả năng gây bất hoạt một gen hiệu quả
- Kĩ thuật RNAi chỉ có khả năng gây bất hoạt khi dsRNA có trình tự tương đồng với mRNA Trình tự RNA tương đồng với intron, promoter đều không
có tác dụng
- RNAi gây bất hoạt gen ở giai đoạn sau phiên mã, xảy ra ở tế bào chất
Trang 94 Kĩ thuặt DNA tái tổ hợp
4.1.Khái niệm DNA tái tổ hợp
DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) là một DNA lai với công nghệ sử dụng các enzyme để cắt và dán các chuỗi DNA quan tâm thuộc 2 loài khác nhau hoặc của các cá thể khác nhau trong cùng một loài.[4]
Trình tự DNA tái tổ hợp có thể được đặt vào các phương tiện được gọi là vectơ đưa DNA vào một tế bào chủ thích hợp nơi nó có thể được sao chép hoặc thể hiện
Ví dụ: Hai vector là plasmid, phage λ được cài mảnh DNA lạ để tạo ra DNA tái tổ hợp.(Hình dưới) [5]
Các DNA lạ này được gọi là đoạn cài hay DNA ngoại lai Nó chính là một mảnh (đoạn) DNA hay là gen mà người nghiên cứu quan tâm và ghép nó vào DNA của plasmid hay DNA của virus
Trang 104.2 Cơ chế hoạt đọng
Hình 3.Cơ chế hoạt động của DNA tái tổ hợp[6]
http://www.biotechnologynotes.com
Cơ chế hoạt động (các bước )[5]
B1 Tách lập các DNA lạ cần tạo dòng
Chọn và cắt DNA lạ của tế bào cho bằng một enzyme cắt hạn chế - type II Restriction endonucleases (RE)
B2 Chọn và xử lí vector
Chọn vector cần phải chú ý những yêu cầu sau: độ lớn của gen lạ (đoạn cài), loại tế bào chủ tiếp nhận vector và phương pháp ứng dụng
Trang 11Xử lí vector: cắt vector bằng enzyme cắt hạn chế cùng loại với enzyme đã cắt DNA nói trên (để tạo những vết cắt giống nhau, thuận tiện cho việc nối ghép sau này) Khử nhóm phosphat bằng enzyme alkanline phosphotase để tránh hai đầu vector đóng kín trở lại
B3 Tạo DNA tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp)
Việc tạo DNA tái tổ hợp bằng cách ghép DNA lạ vào vector đã được cắt cùng một loại enzyme cắt hạn chế loại II, khi đó, chúng sẽ gắn các
nucleotide tương ứng vào chỗ trống theo nguyên tắc bổ sung bằng enzyme DNA-polymerase I Một phản ứng ghép nối tiếp theo xảy ra với sự có mặt của enzyme DNA ligase của E Coli hoặc phage T4 để nối liên kết
phosphodiester và cuối cùng tạo được plasmid tái tổ hợp hoàn thiện
↳ KL( ứng dụng trong kĩ thuật tạo hoa hồng xanh): Chuyển gen delphinidin với một gen DFR hoàn toàn mới nhằm hoàn chỉnh chu trình tổng hợp
delphinidin trong hoa hồng
B4 Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp biến nạp hoặc tải nạp
*Một số phương pháp đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ[5]
Biến nạp
Hóa biến nạp
Hóa biến nạp là phương pháp sử dụng chất hóa học nhằm để thay đổi màng
tế bào , tạo điều kiện để đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ
Điện biến nạp
Sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung để tạo lỗ nhỏ trên màng sinh học của tế bào, tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ DNA tái tổ hợp được dễ dàng
Trang 12Biến nạp tế bào trần
Là phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ đã được xử lí bằng polyetylen glycol (PEG) - tạo tế bào trần
Phương pháp bắn gen
Người ta sử dụng hạt kim loại nặng được bao bọc DNA và bắn trực tiếp vào
tế bào
Phương pháp vi tiêm
Phương pháp vi tiêm là phương pháp sử dụng vi kim và kính hiển vi để đưa DNA tái tổ hợp vào mỗi tế bào nhất định
Tải nạp
Tải nạp là hiện tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector là virus từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận, trong đó có quá trình chuyển gen và tái tổ hợp gen ở vi khuẩn nhờ thực khuẩn thể (Bacteriophage)
5.Nguyên tắc tạo hoă hồng xănh
5.1 Tổng quăn
-Flavonoid, carotenoids và betalain là các sắc tố chính chịu trách nhiệm về màu sắc hoa Trong số đó, flavonoid”đặc biệt là anthocyanin” đóng góp nhiều nhất vào phạm vi và loại sắc tố màu
-Các nhiễm sắc thể chính của anthocyanin là pelargonidin,cyanidin và
delphinidin Anthocyanin dihydrokaempferol (DHK), tiền chất phổ biến của những nhiễm sắc thể, đóng một vai trò quan trọng trong việc xác định màu hoa, chi phối 3 chu trình hình thành sắc tố trên cây trồng bao gồm:
pelargonidin,cyanidin và delphinidin
-Sau hàng loạt các nghiên cứu thì các nhà khoa học của công ty Florigene đã tìm ra yếu tố tạo ra màu xanh trên hoa hồng chính là gen delphinidin được
Trang 13clone từ loài hoa păng-xê (Pansy) (Viola x wittrockiana) để tổng hợp trực tiếp màu xanh trên cây hoa hồng
-Vai mượn thêm gen iris nhằm tạo ra enzyme DFR (the dihydroflavonol reductase), enzyme này sẽ hoàn thành chu trình phản ứng tổng hợp
delphinidin trên hoa hồng
-Mô ̣t yếu tố mới chính là một gen nhân tạo được tạo ra bằng kĩ thuâ ̣t RNAi nhằm tắt sự hoạt đô ̣ng của gen tạo màu đỏ trong hoa hồng
5.2 Cơ chế tạo hoa hồng xanh
Từ những năm 1990 thì các nhà sinh học phân tử của Suntory đã cùng hợp tác với Florigene để cùng nhau biến giấc mơ “ Hoa hồng xanh” thành sự thật Và, đến tháng 4 năm 2005, họ đã chính thức công bố và giới thiệu 3 biến đổi đồng thời để tạo nên loài hoa đặc biệt này
Bước 1: Tạo ra bông hồng trắng có gene DFR bị bất hoạt bằng kỹ thuật RNAi ức chế gene mà nó mong muốn để có thể chèn một gene khác vào Gene DFR là gene giúp hoa hồng tạo màu sắc trong tự nhiên Bởi vậy mà nhóm đang phát triển nghiên cứu theo hướng bất hoạt gene này
Trong ứng dụng thương mại đầu tiên của mình trên thực vật, công nghệ RNAi do CSIRO phát triển đã được sử dụng để loại bỏ gen mã hóa enzyme
Trang 14dihydroflavonol reductase (DFR) trong hoa hồng Từ đây thì nhóm nghiên cứu của Suntory và Florigene đã ứng dụng RNAi để bất hoạt gene DFR trong cây hoa hồng
Bước 2: Chèn gene được lấy từ loài Pansy để tạo màu xanh là delphinidin bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp Delphinidin mã hóa một enzyme khá tương đồng cho việc thay đổi enzyme DHK nhằm mục đích hình thành sự tổng hợp màu theo chu trình delphinidin
Để làm được bước này thì các nhà khoa học đã phải đối mặt với một thử thách rất lớn chính là phân lập gene màu xanh để tổng hợp nên các sắc tố xanh (Delphinidin) từ hàng ngàn loài hoa màu xanh Và để có thể vượt qua các đối thủ thì họ phải hoàn thành sớm việc phân lập gene màu xanh này và xin cấp bằng sáng chế cho gene này
Để phân lập được gene xanh từ một loài cây dã yên thảo màu tím đậm bằng phương pháp đưa các gen ứng cử viên của gen xanh vào nấm men thay vì thực vật và kiểm tra các hoạt động enzyme của chúng trong nấm men Nhờ phương pháp này, họ đã thu được kết quả sau một tuần và có thể kiểm tra hoạt động của nhiều gen Cuối cùng thì đến ngày 13/06/1991 họ đã thành công trong việc phân lập gene xanh
Tuy nhiên, gene xanh từ loài dã yên thảo này khi được đưa vào hoa hồng bằng công nghệ DNA tái tổ hợp thì màu sắc của hoa vẫn là màu đỏ và không
có sắc tố xanh nào được phát hiện Vì vậy, họ đã tiến hành phân lập các gene xanh từ các loài thực vật có hoa màu xanh khác như cây khổ sâm, hạt đậu bướm, cây vạn thọ và đưa chúng vào hoa hồng Nhưng kết quả vẫn là
“chỉ có hoa hồng có gene màu xanh nhưng không có sắc tố xanh nở rộ.” Vào năm 1996, thay đổi màu sắc của hoa hồng cuối cùng cũng được quan sát khi mà họ tiến hành đưa gene màu xanh của loài Pansy vào những bông
Trang 15hoa hồng đỏ Tuy màu quan sát được chỉ mới là màu đỏ sẫm nhưng đây cũng coi như là một bước tiến lớn
Bước 3: Chèn gene DFR được lấy từ loài Iris nhằm mục đích tạo ra sắc tố xanh cho bông hoa hồng
Ở đây sử dụng loài Iris là do các gene của hoa hồng và Iris khá giống nhau và chia sẻ cho nhau khá nhiều mã DNA, nhưng RNAi rất chính xác trong việc chỉ nhắm vào trình tự DNA của gene DFR của hoa hồng, vì vậy mà không làm bất hoạt gene DFR của Iris
(Gói ba gen (pansy delphinidin, iris DFR, anti-rose DFR) đã hoạt động: Hoa hồng chuyển gen của Suntory tạo ra lượng delphinidin rất cao trong cánh hoa của nó và một lượng cyanidin nhỏ.) [03]
*Chu trình hình thành sắc tố
DHK có thể được hydroxyl hóa ở vị trí 3’ để tạo ra dihydroquercetin (DHQ) và tại các vị trí 3’ và 5’ để sản xuất dihydromyricetin (DHM)
DHK dẫn đến sản xuất anthocyanin dựa trên pelargonidin để hoa màu vàng DHQ dẫn đến việc tạo ra cyanidin-anthocyanin dựa trên đóng góp cho hoa màu đỏ và hồng
DHM dẫn đến việc tạo ra anthocya dựa trên delphinidin-nins tạo hoa màu xanh hoặc tím