Bình Định - Năm 2017NGUYỄN PHƯƠNG THỤY NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG ĐƯỜNG HÓA TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU CỦA HAI CHỦNG NẤM SỢI Mucor spp.. Bình Định - Năm 2017NGHIÊN
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đánh giá khả năng đường hóa trong quá trình lên men rượu của hai chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae do Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ Khoa học và Công nghệ Bình Định cung cấp nhằm tìm ra chủng nấm sợi có khả năng đường hóa trong quá trình lên men rượu tốt để tạo ra loại rượu chất lượng cao cho làng nghề truyền thống ở tỉnh Bình Định.
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Ý nghĩa khoa học
Xác định được cơ sở khoa học để tạo ra một loại men rượu lên men tốt trong điều kiện lên men rượu truyền thống ở Bình Định.
Ý nghĩa thực tiễn
Tạo ra loại men chất lượng tốt sử dụng trong lên men rượu truyền thống ởBình Định để đạt hiệu quả cao nhất; tránh việc sử dụng các loại men trôi nổi,không rõ nguồn gốc, chất lượng kém ngoài thị trường.
CẤU TRÚC LUẬN VĂN
Luận văn gồm các phần sau:
Chương 1 Tổng quan tài liệu
Chương 2 Nội dung, phương tiện và phương pháp nghiên cứu
Chương 3 Kết quả nghiên cứu và bàn luận
Kết luận và đề nghị
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae do Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ Khoa học và Công nghệ Bình Định cung cấp.
2.1.2 Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 11 năm 2016 đến tháng 6 năm 2017.
- Phòng thí nghiệm Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ Khoa học và Công nghệ Bình Định.
- Làng Bàu Đá - Xã Nhơn Lộc - Thị xã An Nhơn - Tỉnh Bình Định.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Khảo sát một số đặc điểm sinh học của hai chủng nấm sợi Mucor spp. và Rhizopus oryzae: hình thái, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc và của tế bào nấm sợi.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của hai chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae: hàm lượng NaNO3, hàm lượng saccharose tối ưu.
- Khảo sát khả năng phân giải tinh bột của hai chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae.
- Khảo sát khả năng đường hóa trong quá trình lên men rượu của hai chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae.
- Sản xuất bột nấm sợi (bột mốc), bột men rượu thuần.
- Sử dụng men rượu thuần tạo được để chế biến rượu và đánh giá một số chỉ tiêu của rượu thu được.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1.1 Phương pháp quan sát hình thái nấm sợi
* Quan sát khuẩn lạc nấm sợi
Cấy các chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae lên môi trường PGA, để ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ Sau đó quan sát và ghi nhận hình thái khuẩn lạc nấm sợi trên đĩa như: màu sắc, hình dạng sợi và đo kích thước khuẩn lạc Quan sát trong 48 giờ nuôi cấy đầu tiên.
* Quan sát tế bào nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae dưới kính
Để nghiên cứu hình thái nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae, các chủng nấm được nuôi trên môi trường dinh dưỡng phù hợp và sau đó tiến hành chuẩn bị tiêu bản tế bào nấm bằng kỹ thuật nhuộm nhằm làm nổi bật cấu trúc tế bào Màu methylene blue được sử dụng để nhuộm, giúp quan sát rõ các đặc điểm hình thái của nấm sợi dưới kính hiển vi quang học Qua quan sát này, người ta có thể nhận diện các đặc điểm cấu trúc của nấm và hỗ trợ các nghiên cứu về sinh học của hai chủng này.
2.3.1.2 Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của các chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae
* Xác định hàm lượng NaNO 3 trong môi trường Czapek - Dox tối ưu cho sự sinh trưởng của các chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae
Tiến hành thí nghiệm nuôi cấy các chủng nấm sợi Mucor spp và
Rhizopus oryzae trong môi trường Czapek - Dox với nồng độ saccharose là
30g/l và thay đổi các nồng độ NaNO3 lần lượt là 1,0g/l, 1,5g/l, 2,0g/l, 2,5g/l, 3,0g/l Theo dõi sự phát triển, đo đường kính khuẩn lạc định kỳ 24 giờ một lần và xác định thời gian để khuẩn lạc của các chủng nấm sợi phủ kín bề mặt đĩa petri có đường kính 8cm.
* Xác định hàm lượng saccharose trong môi trường Czapek - Dox tối ưu cho sự sinh trưởng của các chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae
Thí nghiệm nuôi cấy các chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae được tiến hành trên môi trường Czapek - Dox với nồng độ đường saccharose lần lượt là 20g/l, 25g/l, 30g/l, 35g/l, 40g/l Theo dõi sự phát triển, đo đường kính khuẩn lạc định kỳ 24 giờ một lần và xác định thời gian để khuẩn lạc của các chủng nấm sợi phủ kín bề mặt đĩa petri có đường kính 8cm.
2.3.2.1 Phương pháp xác định khả năng phân giải tinh bột
Phương pháp thí nghiệm được thực hiện trên môi trường Czapek-Dox với nguồn cacbon thay bằng tinh bột tan để xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm sợi Cấy các chủng nấm sợi lên môi trường Czapek-Dox tinh bột và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ Sau đó phủ một lớp Lugol lên các đĩa petri nuôi cấy nấm sợi Nếu có vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc thì chủng nấm sợi có khả năng phân giải tinh bột; nếu không có vòng phân giải thì chủng nấm sợi không có khả năng phân giải tinh bột Dùng thước đo vòng phân giải tinh bột và ghi nhận kết quả [3].
2.3.2.2 Phương pháp thử hoạt tính enzyme amylase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
* Phương pháp thu nhận enzyme amylase từ nấm sợi [3]
Sử dụng môi trường PGA không cho agar để nuôi cấy nấm sợi.
- Chuẩn bị 100ml môi trường trong bình tam giác 250ml.
- Đem tiệt trùng ở 121°C trong 30 phút và để nguội.
- Cho 10ml nước cất đã vô trùng vào trong ống nghiệm giống nấm sợi, khuấy nhẹ để các bào tử hòa trong nước.
- Đổ toàn bộ 10ml dịch trong ống nghiệm này vào trong bình tam giác 250ml có 100ml môi trường.
Tất cả thao tác này được thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
- Đặt các bình tam giác này vào máy lắc có tốc độ 200 vòng/phút nuôi trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Sau đó đem ly tâm, thu lấy dịch Dịch nuôi cấy này có chứa enzyme hòa tan Bảo quản dịch nuôi cấy này trong tủ lạnh 4°C.
* Xác định hoạt tính enzyme Amylase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch [3]
- Môi trường thử hoạt tính: Thạch (20g), tinh bột (1g), nước cất (1000ml).
+ Hấp tiệt trùng môi trường, phân vào các đĩa petri vô trùng, độ dày môi trường phải đảm bảo độ dày đồng đều nhau (3mm).
+ Dùng khoan nút chai vô trùng có đường kính 10mm khoan mặt thạch tạo lỗ trống đường kính 10mm.
+ Nhỏ vào lỗ thạch 100^1 dung dịch enzyme.
+ Đặt hộp petri ở nhiệt độ 7°C trong 24 giờ.
+ Đặt hộp petri ở nhiệt độ 28 - 32°C trong 24 giờ.
+ Tráng đều bề mặt thạch bằng một lớp Lugol, sau 15 phút đo đường kính vòng phân giải Xác định hoạt tính enzyme bằng độ lớn vòng phân giải (D - d, mm).
Trong đó: D là đường kính vòng phân giải (mm) d là đường kính lỗ thạch
2.3.2.3 Phương pháp khảo sát khả năng đường hóa trong quá trình lên men rượu của hai chủng nấm sợi Mucor spp và Rhizopus oryzae
- Gạo trắng: cân 50g/ bình tam giác 250ml.
- Ngâm ở nhiệt độ phòng trong 4 - 5 giờ.
- Đo pH sau khi ngâm.
- Cấy chủng sợi đã được nuôi trên môi trường PGA trong 3 ngày (1 đĩa petri nấm sợi/ bình tam giác).
- Thu hoạch và phân tích các chỉ tiêu.
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD) lặp lại
3 lần, mỗi nghiệm thức 3 bình tam giác.
* Các chỉ tiêu phân tích:
- pH: Đo bằng pH kế WTW pH 525.
- Ước tính tổng số lượng đường khử: Bằng cách đo độ Brix.
- Xác định hàm lượng glucose: Bằng kit thử glucose oxidase (Megazyme
- Xác định hàm lượng đường khử: Bằng phương pháp Bertrand [10], [19].
+ Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng oxy hóa - khử giữa đường với các ion kim loại để xác định lượng monosaccharide và disaccharide.
+ Chuẩn bị các dung dịch có thành phần sau (gam/lít):
(ddA): CuSO4.5H2O 40 (ddB): Muối K - Na Tatrat 20
20 (ddD): KMnO4 N/6 00, + Các bước tiến hành: 53
Lấy: 3ml dịch lên men cần thử, 3ml ddA, 3ml ddB trộn đều, đun cách thủy đến sôi và giữ 6 - 8 phút.
Ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ phút trong 5 phút, loại bỏ dịch ly tâm, thu hồi cặn kết lắng.
Thêm vào 9ml nước cất, lắc đều.
Tiếp tục ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ phút trong 5 phút, loại bỏ dịch ly tâm, thu hồi cặn.
Thêm 3ml ddC vào cho đến khi kết tủa hoàn toàn.
Chuẩn độ với ddD cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt.
Tính số lượng đường khử: cứ 1ml KMnO 4 = 1mg Cu, dựa vào lượng
Cu, tra bảng đường khử tính được lượng đường khử.
2.3.3 Phương pháp sản xuất bánh men rượu
2.3.3.1 Quy trình sản xuất bột nấm sợi (bột mốc)
(tạo độ ẩm 50%), ngâm 1 giờ
Trộn khuẩn ty, bào tử nấm sợi, bắp trấu (Ủ ở 30°C trong 5 ngày)
Bột nấm sợi (bột mốc) thuần
Chủng nấm sợi thuần được tuyển chọn
Cấy trong môi trường PGA, nuôi cấy 5 ngày ở 30 - 32°C
Chủng nấm sợi thuần 1 giờ, để nguội 35 - 40°C
2.3.3.2 Xác định tỉ lệ bột nấm sợi (bột mốc) tối ưu cho quá trình đường hóa
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện với sự thay đổi tỉ lệ bột nấm sợi để đánh giá sự ảnh hưởng của tỉ lệ bột nấm sợi phối trộn vào nguyên liệu đến hoạt tính đường hóa của bột nấm sợi Thí nghiệm với tỉ lệ bột nấm sợi (% w/w) lần lượt là: 0,5%, 0,75%, 1% Với mỗi tỉ lệ lặp lại thí nghiệm 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi: Độ Brix sau khi ủ, thể tích dịch rỉ.
Cách tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ Khoa học và Công nghệ Bình Định theo sơ đồ như sau:
Tiến hành đo các chỉ tiêu
2.3.3.3 Quy trình sản xuất men rượu thuần
Xếp vào khay có trải một lớp trấu, để ở nhiệt độ phòng, thoáng gió từ 4 - 10 ngày
Thêm nước tạo độ ẩm 55 - 60%
Giống men thuần gồm chủng nấm men
Saccharomyces sp 2 và chủng nấm sợi Mucor spp.
Ghi chú: Thuốc bắc gồm 8 thành phần: Nhục đậu khấu (3g), cam thảo (3g), bạch truật (2g), bạc hà (2g), nhục quế (2g), tế tân (3g), thảo quả (3g), tiểu hồi (3g)
2.3.4 Phương pháp đánh giá năng suất, chất lượng rượu lên men giữa men rượu thuần và men rượu thị trường tại làng nghề
• • • Để đánh giá năng suất, chất lượng lên men rượu giữa men rượu thuần và men rượu thị trường, chúng tôi tiến hành chưng cất rượu theo phương pháp truyền thống ở Bình Định và thực hiện tại hộ Nguyễn Thị Năm và hộ Lê Mạnh Hưng thuộc làng Bàu Đá - Xã Nhơn Lộc - Thị xã An Nhơn - Tỉnh Bình Định.
Bố trí thí nghiệm lặp lại 3 lần theo sơ đồ sau:
’í lầ " (1,5 % ) Ủ hiếu khí (30°C trong 3 ngày) l Ch"! (,! '“’ Ủ yếm khí (30°C trong 4 ngày)
Sau khi chưng cất rượu từ men tạo được tại làng Bàu Đá - Xã Nhơn Lộc
- Thị xã An Nhơn - Tỉnh Bình Định thì tiến hành điều tra bằng phiếu đánh giá cảm quan rượu Đầu tiên là chuẩn bị mẫu thử và kiểm tra cảm quan theo TCVN 8007: 2009, sau đó phân tích cảm quan và phương pháp cho điểm rượu theo TCVN 3217 - 1979 để đánh giá, so sánh chất lượng rượu thu được và mẫu đối chứng ở địa phương.
2.3.5.1 TCVN 8007 : 2009 về chuẩn bị mẫu thử và kiểm tra cảm quan rượu
Từ loại rượu đã chưng cất được và rượu đối chứng ở địa phương, lắc đều, từ mỗi loại lấy một lượng như nhau, sao cho có được lượng mẫu trung bình là 2 lít Trộn đều rồi chia thành 2 phần bằng nhau, một phần để lưu mẫu, phần còn lại được dùng để phân tích [21].
Mẫu được đựng trong chai khô, sạch, có nhãn ghi đầy đủ tên cơ sở sản xuất, tên loại men và ngày sản xuất; mẫu lưu được bảo quản 6 tháng kể từ ngày lấy mẫu [21].
- Yêu cầu chung: Khu vực thử các chỉ tiêu cảm quan phải thoáng, không có mùi lạ, xa khu vực thử nghiệm hóa học [21].
- Xác định dạng bên ngoài: Kiểm tra nhãn, bao bì đựng chai và chai sản phẩm, sau đó kiểm tra độ vẩn đục và tạp chất lạ [21].
Để xác định độ trong, dùng 3 ống thủy tinh không màu có đường kính và chiều dài bằng nhau Rót vào ống thứ nhất 20 ml nước cất, ống thứ hai đựng rượu thí nghiệm và ống thứ ba đựng rượu đối chứng Đặt cả ba ống trên nền trắng dưới ánh sáng bình thường để so sánh màu sắc và độ trong [21].
Để xác định mùi vị của rượu, rót 50 ml mỗi loại rượu vào hai cốc thử có dung tích 150 ml, sau đó ngửi và nếm để cảm nhận mùi và vị Các cốc thử được tráng bằng nước cất và rượu mẫu thử nghiệm được tiến hành kiểm tra mùi vị ngay sau đó [21].
Không được thử quá 3 mẫu Thử nếm để so sánh các mẫu với nhau Sau khi cảm quan xong một mẫu phải nghỉ từ 5 - 10 phút Trong thời gian nghỉ, phải súc miệng bằng nước đã đun sôi để nguội không có mùi, vị lạ và dùng những thức ăn không ảnh hưởng đến vị giác để đưa cảm giác trở lại bình thường [21].
* Tiến hành thử: Sau khi kiểm tra, đánh giá và cho điểm theo TCVN
2.3.5.2 TCVN 3217 -1979 về phân tích cảm quan và phương pháp cho điểm rượu
* Tính số điểm chưa có trọng lượng của từng mẫu rượu:
Số điểm chưa có trọng lượng là số điểm cho tương ứng với từng bậc đánh giá đối với mỗi chỉ tiêu chất lượng và được quy định trong bảng 2.1.
Bảng 2.1 Điểm chưa có trọng lượng của các chỉ tiêu về rượu [18] rp /
Tên chỉ tiêu Điểm chưa có trọng lượng
Yêu cầu Độ trong và màu sắc
Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật thể lạ nhỏ, màu hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm.
Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ, màu đặc trưng cho sản phẩm.
Chất lỏng trong, có tương đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu hơi khác một ít so với màu đặc trưng của sản phẩm.
2 Chất lỏng hơi đục, khá nhiều vật thể lạ nhỏ, thô, màu khác nhiều so với màu đặc trưng của sản phẩm. 1
Chất lỏng đục, nhiều cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ trầm trọng, thô, màu không đặc trưng cho sản phẩm.
0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng.
Mùi 5 Hòa hợp, thơm dịu, đặc trưng cho sản phẩm.
Chưa hoàn toàn hòa hợp, thơm đặc trưng cho sản phẩm nhưng hơi khó nhận thấy.
3 Hơi nồng, có mùi phụ, ít đặc trưng cho sản phẩm.
2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm. 1
Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trưng cho sản phẩm.
0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng.
Hòa hợp, êm dịu, hậu tốt, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm.
Chưa hoàn toàn hòa hợp, hậu vừa phải, đặc trưng cho sản phẩm bình thường.
Chưa hòa hợp, hơi gắt và xốc, hậu yếu, ít đặc trưng cho sản phẩm.
2 Đắng, xốc, thoảng vị lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm.
1 Có vị lạ khó chịu của sản phẩm bị hỏng.
2.3.6.1 Phương pháp xác định hàm lượng ethanol
Hàm lượng ethanol (% thể tích) ở 20 0 C được xác định theo phương pháp thử nghiệm TCVN 8010: 2009.
2.3.6.2 Phương pháp xác định hàm lượng methanol
Hàm lượng methanol (mg/l) được xác định theo phương pháp thử nghiệm theo TCVN 8010:2009.
2.3.6.3 Phương pháp xác định hàm lượng aldehyde
Hàm lượng aldehyde (mg acetaldehyde/l ethanol 100 0 C) được xác định theo phương pháp thử nghiệm TCVN 8009: 2009.
2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phương pháp thống kê sinh học, phần mềm Excel 2010, phần mềm Statgraphics centurion XV. spp VÀ CHỦNG NẤM SỢI Rhizopus oryzae