Tài liệu Nghiên cứu mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1, OTUB2, Cezanne

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- Bùi Kiều Trang NGHIÊN CỨU MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN A20,

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -

Bùi Kiều Trang

NGHIÊN CỨU MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA MỨC ĐỘ BIỂU

HIỆN CỦA CÁC GEN A20, OTUB1, OTUB2, CEZANNE VÀ

NỒNG ĐỘ CÁC CYTOKINE VIÊM TRÊN BỆNH NHÂN

UNG THƯ BẠCH CẦU

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội - 2021

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -

NGHIÊN CỨU MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA MỨC ĐỘ BIỂU

HIỆN CỦA CÁC GEN A20, OTUB1, OTUB2, CEZANNE VÀ

NỒNG ĐỘ CÁC CYTOKINE VIÊM TRÊN BỆNH NHÂN

UNG THƯ BẠCH CẦU

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Nguyễn Thị Xuân

Hà Nội - 2021

Trang 3

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là kết quả của cá nhân tôi

Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực, chính xác

và chưa không trùng lặp với bất kỳ công trình nào đã công bố Mọi thông tin nội dung tham khảo trong báo cáo đều được trích dẫn cụ thể, rõ ràng

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan trên

Trang 4

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến anh Nguyễn Hoàng Giang, chị Đỗ Thị Trang trong phòng Hệ gen học miễn dịch đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ bảo cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Qua đây tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô của Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ và động viên tinh thần tôi trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Tác giả luận văn

Trang 5

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

acid

DNA bổ sung

CLL Chronic lymphocytic leukemia Bạch cầu dòng lympho mạn tính

M-MuLV Moloney Murine Leukemia Virus

Trang 6

NF-κB Nuclear factor

kappa-light-chain-enhancer of activated B

qRT-PCR Quantitative reverse transcription

PCR

Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase sao chép ngược RIP-1 Tumor necrosis factor receptor-

interacting protein-1

SPSS Statistical Package for the Social

Sciences STAT Signal transducer and activator of

transcription

TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine

TNFR Tumor necrosis factor receptor

TNF-α Tumor necrosis factor-α

TRAF6 TNF receptor-associated factor 6

Trang 7

Danh mục các bảng

Bảng 2.1: Các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng Realtime-PCR 28

Bảng 3.1: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen A20 với nồng độ của các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính 40

Bảng 3.2: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB1 với nồng độ của các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính 42

Bảng 3.4: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen Cezanne với nồng độ của các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho mạn tính 45

Bảng 3.8: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen Cezanne với nồng độ của các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy cấp tính 51

Trang 8

Bảng 3.10: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB1 với nồng độ của

các cytokine IL-6, TNF-α, IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy cấp tính 52

Bảng 3.12: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen Cezanne với nồng độ của

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính 56

các cytokine IL-6, TNF-α, IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính 57

Bảng 3.16: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen Cezanne với nồng độ của

Trang 9

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1: Hình ảnh so sánh tế bào máu bình thường và bệnh bạch cầu 9

Hình 1.2: Hình ảnh tế bào bạch cầu dòng lympho trong bệnh ALL 11

Hình 1.3: Hình ảnh tế bào bạch cầu dòng lympho trong bệnh CLL 12

Hình 1.4: Hình ảnh tế bào bạch cầu dòng tủy trong bệnh AML 14

Hình 1.5: Sự hình thành nhiễm sắc thể Philadelphia 15

Hình 1.6: Hình ảnh tế bào bạch cầu dòng tủy trong bệnh CML 15

Hình 1.7: Cấu trúc của protein A20 18

Hình 3.1: Ảnh minh họa điện di đồ sản phẩm RNA tổng số tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân và người khỏe mạnh ……… 31

Hình 3.2: Biểu hiện mRNA của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính (cột màu đen) và mẫu người khỏe (cột màu xám) 32

Hình 3.3: Biểu hiện mRNA của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho mạn tính (cột màu đen) và mẫu người khỏe (cột màu xám) 33

Hình 3.4: Biểu hiện mRNA của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy cấp tính (cột màu đen) và mẫu người khỏe (cột màu xám) 34

Hình 3.5: Biểu hiện mRNA của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính (cột màu đen) và mẫu người khỏe (cột màu xám) 35

Hình 3.6: Nồng độ các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính 36 Hình 3.7: Nồng độ các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu

Trang 10

Hình 3.8: Nồng độ các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy cấp tính 38 Hình 3.9: Nồng độ các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính 39

Hình 3.10: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen A20 và nồng độ cytokine

IL-6, TNF-α và IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính 41

Hình 3.11: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB1 và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính 43

Hình 3.13: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen Cezanne và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính 44

Hình 3.14: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen A20 và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho mạn tính 46

Trang 11

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy cấp tính 51

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính 57

Trang 12

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH BẠCH CẦU 8

1.1.1 Tình hình bệnh bạch cầu trên thế giới và ở Việt Nam 8

1.1.1.1 Trên thế giới 8

1.1.1.2 Ở Việt Nam 9

1.1.2 Phân loại bệnh bạch cầu 10

1.1.2.1 Bệnh bạch cầu dòng lympho cấp tính (ALL) 10

1.1.2.2 Bệnh bạch cầu dòng lympho mạn tính (CLL) 11

1.1.2.3 Bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính (AML) 13

1.1.2.4 Bệnh bạch cầu dòng tủy mạn tính (CML) 14

1.2 GIỚI THIỆU VỀ CÁC GEN THUỘC NHÓM DEUBIQUITINASE 16 1.2.1 Gen A20 17

1.2.2 Gen OTUB1 18

1.2.3 Gen OTUB2 19

1.2.4 Gen Cezanne 19

1.3 GIỚI THIỆU VỀ CÁC CYTOKINE 20

1.3.1 TNF-α 21

1.3.2 IL-6 21

1.3.3 IL-1β 22

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU24 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 24

Trang 13

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu: 24

2.1.3 Dụng cụ, trang thiết bị 24

2.1.4 Hóa chất 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 26

2.2.2 Tách chiết RNA tổng số và phân tích mức độ biểu hiện gen bằng kỹ thuật Realtime-PCR 26

2.2.2.1 Tách chiết RNA tổng số 26

2.2.2.2 Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số 27

2.2.2.3 Phân tích mức độ biểu hiện gen bằng kỹ thuật Realtime-PCR 27 2.2.3 Phân tích nồng độ cytokine trong dịch huyết thanh bằng kỹ thuật ELISA 29

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 TÁCH CHIẾT RNA TỔNG SỐ 31

3.2 MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN A20, OTUB1, OTUB2 VÀ CEZANNE TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU 32

3.2.1 Mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính 32

3.2.2 Mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên bệnh nhân bạch cầu bạch cầu dòng lympho mạn tính 33

3.2.3 Mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên bệnh nhân bạch cầu bạch cầu dòng tủy cấp tính 34

Trang 14

3.2.4 Mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên

bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính 35 3.3 NỒNG ĐỘ CỦA CÁC CYTOKINE TNF-α, IL-6 VÀ IL-1β TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU 36 3.3.1 Nồng độ của các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính 36 3.3.2 Nồng độ của các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho mạn tính 37 3.3.3 Nồng độ của các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy cấp tính 38 3.3.4 Nồng độ của các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính 39 3.4 MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN

A20, OTUB1, OTUB2, CEZANNE VÀ NỒNG ĐỘ CỦA CÁC CYTOKINE

TNF-α, IL-6, IL-1β TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU 40

3.4.1 Mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1, OTUB2, Cezanne và nồng độ của các cytokine TNF-α, IL-6, IL-1β trên

bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính 40

bệnh nhân bạch cầu dòng lympho mạn tính 45

bệnh nhân bạch cầu dòng tủy cấp tính 50

bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính 56

Trang 15

3.5 THẢO LUẬN 61 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 4.1 KẾT LUẬN 66

4.1.1 Mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên

bệnh nhân bạch cầu 66 4.1.2 Nồng độ các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1β trên bệnh nhân bạch cầu 66

bệnh nhân bạch cầu 66 4.2 KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

Trang 16

MỞ ĐẦU

Bệnh bạch cầu là ung thư của các mô tạo máu bao gồm tủy xương và hệ bạch huyết, được gây ra bởi sự gia tăng số lượng tế bào bạch cầu trong cơ thể Bạch cầu là một phần quan trọng trong hệ thống miễn dịch Chúng bảo vệ cơ thể khỏi sự xâm nhập của vi khuẩn, virus và nấm cũng như từ các tế bào bất thường và các chất lạ khác Trên lâm sàng, bệnh bạch cầu được xác định là một bệnh ác tính của tế bào gốc tạo máu, tương quan với số lượng tế bào bạch cầu tăng trong máu ngoại biên và tủy xương [1] Bệnh ung thư bạch cầu bao gồm 4 loại chính: bạch cầu dòng lympho cấp tính (Acute Lymphocytic Leukemia - ALL), bạch cầu dòng lympho mạn tính (Chronic Lymphocytic Leukemia - CLL), bạch cầu dòng tủy cấp tính (Acute Myeloid Leukemia - AML) và bạch cầu dòng tủy mạn tính (Chronic Myeloid Leukemia - CML) Bệnh bạch cầu có thể xảy ra ở cả bạch cầu lympho hoặc bạch cầu tủy Ung thư phát triển trong các tế bào bạch huyết được gọi là bệnh bạch cầu lymphocytic Ung thư phát triển trong các tế bào tủy được gọi là bệnh bạch cầu dòng tủy Bệnh có thể là cấp tính (bắt đầu đột ngột và thường sống ngắn) hoặc mạn tính (tồn tại trong một thời gian dài) Bệnh bạch cầu cấp tính liên quan đến các tế bào mới hoặc chưa trưởng thành, được gọi là tế bào non (blasts) và không thể thực hiện các chức năng của chúng Các tế bào non tăng số lượng nhanh bất thường, và bệnh tiến triển nhanh chóng Trong bệnh bạch cầu mạn tính, có một số tế bào non, nhưng chúng trưởng thành hơn và có thể thực hiện một số chức năng của chúng Các tế bào phát triển chậm hơn nên bệnh tiến triển dần dần

Nhóm gen deubiquitin A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne mã hóa cho

một số protein thuộc nhóm DUB DUB đóng một số vai trò trong con đường ubiquitin Một trong những chức năng đặc trưng nhất của DUB là loại bỏ chuỗi monoubiquitin và polyubiquitin ra khỏi protein Ubiquitin được gắn vào protein

để điều hòa sự thoái hóa của protein thông qua proteasome và lysosome, điều phối sự định vị tế bào của protein, kích hoạt và bất hoạt protein, và điều hòa các tương tác protein – protein [2-4] DUB có thể đảo ngược các hiệu ứng này

Trang 17

bằng cách cắt liên kết peptide hoặc isopeptide giữa ubiquitin và protein cơ chất của nó Toàn bộ vai trò của DUB trong các bệnh vẫn chưa được làm rõ Tuy nhiên, sự tham gia của chúng vào bệnh được dự đoán do vai trò đã biết trong các quá trình sinh lý có liên quan đến tình trạng bệnh bao gồm ung thư và rối loạn thần kinh [5] Mặc dù có nhiều nghiên cứu về đột biến và biểu hiện của

gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên bệnh ung thư, nhưng mức độ biểu

hiện của các gen này ở những bệnh nhân ung thư ở Việt Nam chưa được nghiên cứu rộng rãi

TNF-α, IL-6 và IL-1β đã được mô tả là các cytokine chính tác động đến chức năng của các tế bào tạo máu và thúc đẩy các bệnh viêm nhiễm TNF-α và IL-1β được sản xuất với một lượng lớn bởi các tế bào bạch cầu đơn nhân khi chúng phản ứng với nội độc tố Hai cytokine này kích thích làm tăng sản xuất lẫn nhau và kích thích sản sinh IL-6, IL-8 và IL-10 TNF-α và IL-1β gây sốt, hoạt hóa hệ thống đông máu và điều hòa phản ứng viêm thông qua sự sản sinh IL-8 và thông qua kích thích biểu hiện các phân tử bám dính IL-6 lại kích thích sản xuất các protein pha cấp từ gan (CRP, fibrinogen, orosomucoide…) và ức chế ngược chính quá trình sản sinh TNF-α và IL-1β Điều hòa biểu hiện của các gene mã hóa cho các cytokine này phụ thuộc vào các yếu tố sao mã, đặc biệt là NF-κB Trong khi đó, các gen DUB là những gen tham gia điều hòa ngược các phản ứng viêm trong quá trình đáp ứng miễn dịch và tín hiệu phân

tử NF-κB trung gian điều hòa cho hoạt động viêm của gen deubiquitinase

Nhiều nghiên cứu được thực hiện về chức năng của các DUB đã chỉ ra

sự tương tác giữa các DUB và cytokine trên một số bệnh Tuy nhiên, vẫn chưa

có một nghiên cứu cụ thể tại Việt Nam về mối tương quan giữa các gen thuộc nhóm DUB và nồng độ của các cytokine viêm trên bệnh ung thư

Chính vì lí do nêu trên, tôi tiến hành thực hiện luận văn với tiêu đề:

"Nghiên cứu mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của các gen A20,

OTUB1, OTUB2, Cezanne và nồng độ các cytokine viêm trên bệnh nhân

ung thư bạch cầu" với những mục tiêu cụ thể như sau:

Trang 18

- Xác định mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên bệnh nhân ung thư bạch cầu

- Xác định nồng độ của các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1β trên bệnh nhân ung thư bạch cầu

- Xác định mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1, OTUB2, Cezanne và nồng độ các cytokine IL-6, TNF-α, IL-1β

trên bệnh nhân ung thư bạch cầu

Trang 19

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH BẠCH CẦU

1.1.1 Tình hình bệnh bạch cầu trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.1.1 Trên thế giới

Bệnh bạch cầu là bệnh ung thư được chẩn đoán phổ biến thứ 15 và là nguyên nhân gây tử vong do ung thư đứng hàng thứ 11 trên toàn thế giới Trong năm 2018, ước tính có tổng cộng 437 nghìn ca mắc mới và 309 nghìn ca tử vong do ung thư bạch cầu trên toàn thế giới [6] Tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cao nhất ở người da trắng và thấp nhất ở người Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc

Tỷ lệ mắc bệnh ở nam giới cao hơn nữ giới khoảng 50% đối với tất cả các nhóm chủng tộc/dân tộc ngoại trừ người Việt Nam, trong đó tỷ lệ nam giới cao hơn không đáng kể Tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu ở nhóm tuổi trưởng thành (30-54 tuổi) thấp hơn so với nhóm tuổi lớn hơn Người ta thấy rằng tỷ lệ bệnh bạch cầu ở trẻ em cao nhất ở người Philippines, tiếp theo là người gốc Tây Ban Nha da trắng, người da trắng không phải gốc Tây Ban Nha và người da đen [7].Nguyên nhân của bệnh bạch cầu và các dạng phụ của nó vẫn chưa được hiểu rõ, một phần là do sự đa dạng của các kiểu đột biến và nhiều yếu tố nguy cơ có thể liên quan.Tiếp xúc với bức xạ, với một số loại hóa trị liệu hoặc với một số hóa chất nhất định (như benzen, một số thuốc trừ sâu và hóa chất trong khói thuốc lá) làm tăng nguy cơ phát triển một số loại bệnh bạch cầu, mặc dù bệnh bạch cầu chỉ phát triển ở một số rất ít người bị phơi nhiễm.Các hội chứng di truyền có liên quan đến khả năng mắc bệnh bạch cầu ở người trẻ, bao gồm hội chứng Down và Li-Fraumeni và bệnh u sợi thần kinh [8] Ở một số người, bệnh bạch cầu là do một số bất thường của nhiễm sắc thể gây ra.Một loại virus được gọi

là virus lympho T ở người 1 (HTLV-1), tương tự như virus (HIV-1) gây ra bệnh AIDS, bị nghi ngờ gây ra một loại bệnh bạch cầu tế bào lympho hiếm gặp gọi

là bệnh bạch cầu tế bào T trưởng thành Nhiễm virus Epstein-Barr (cũng gây tăng bạch cầu đơn nhân) có liên quan đến một dạng bệnh bạch cầu lymphocytic

Trang 20

Hình 1.1: Hình ảnh so sánh tế bào máu bình thường và bệnh bạch cầu

1.1.1.2 Ở Việt Nam

Bệnh bạch cầu là một bệnh lý ác tính có tỷ lệ tử vong cao trong số các loại bệnh ung thư Theo thống kê tại Viện Huyết học – Truyền máu trung ương, Bệnh viện Bạch Mai, tỷ lệ bệnh bạch cầu cấp chiếm 32.1%, cao nhất trong số các bệnh liên quan đến máu được khám và điều trị tại Bệnh viện Bạch Mai Ở Việt Nam, các nghiên cứu chuyên sâu về bệnh ung thư máu vẫn còn rất hạn chế Các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức độ mô tả các đặc điểm dịch tễ, lâm sàng của bệnh Nguyễn Quốc Thành và cộng sự đã khảo sát các đặc điểm dịch

tễ, lâm sàng, sinh học đồng thời đánh giá hiệu quả điều trị bệnh bạch cầu dòng tủy mạn tính ở trẻ em với Imatinib [9].Cũng trong năm 2013, tiến sĩ Nguyễn

Lê Xuân Trường và bác sĩ Beverly S Mitchell đã nghiên cứu thành công việc

ức chế sự phát triển của tế bào ung thư máu bằng cách tác động trực tiếp vào con đường truyền tín hiệu Phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt Từ kết quả của nghiên cứu này đã mở ra một hướng đi mới trong việc điều trị bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính [10] Nghiên cứu của Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự đã

mô tả hiệu quả và độc tính của các tác nhân nhắm vào đường dẫn tín hiệu

Trang 21

PI3K/AKT/mTOR trong bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính (AML) Sự phát triển của các hợp chất chống lại PI3K/Akt và mTORC và các bộ điều biến của chúng như là các tác nhân mới và mạnh để điều trị AML [11]

1.1.2 Phân loại bệnh bạch cầu

Có hai loại bệnh bạch cầu chính là: bệnh bạch cầu cấp tính và mạn tính, tùy thuộc vào tốc độ tiến triển của bệnh Trong bệnh bạch cầu cấp tính, tế bào bạch cầu bị nhiễm không hoạt động hoặc hoạt động như tế bào bạch cầu bình thường; trong khi ở bệnh bạch cầu mạn tính, nó có thể hoạt động như tế bào bạch cầu bình thường Do đó, bệnh bạch cầu mạn tính có thể nghiêm trọng vì

nó không thể phân biệt với tế bào bạch cầu bình thường Hơn nữa, có hai phân nhóm của mỗi loại bệnh bạch cầu tùy thuộc vào kích thước và hình dạng của tế bào bạch cầu: dòng lympho và dòng tủy Nhìn chung, bệnh bạch cầu được chia thành bốn phân nhóm chính bao gồm: Bệnh bạch cầu dòng lympho cấp tính (ALL – chiếm 10%), Bệnh bạch cầu dòng lympho mạn tính (CLL – chiếm 35%), Bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính (AML – chiếm 33%) và Bệnh bạch cầu dòng tủy mạn tính (CML – chiếm 14%).Các loại bệnh bạch cầu khác nhau về

cơ chế bệnh sinh, nguồn gốc, tỷ lệ mắc và tiên lượng

1.1.2.1 Bệnh bạch cầu dòng lympho cấp tính (ALL)

Bệnh bạch cầu dòng lympho cấp tính là loại ung thư máu phổ biến nhất

ở trẻ em và người trẻ tuổi, đặc biệt là trẻ trong độ tuổi 2 – 5 [12, 13].ALL là một bệnh lý ác tính của tế bào gốc tạo máu có nguồn gốc từ dòng tế bào tiền thân lympho B hoặc T và được thúc đẩy bởi một loạt các sai lệch di truyền bao gồm đột biến, chuyển đoạn nhiễm sắc thể và dị bội trong các gen liên quan đến

sự phát triển của tế bào lympho và điều hòa diễn biến chu kỳ tế bào [14] Ở những bệnh nhân mắc ALL, tủy xương tạo ra quá nhiều tế bào lympho chưa trưởng thành Những tế bào lympho này không hoạt động như các tế bào lympho bình thường và không có khả năng chống nhiễm trùng Các dấu hiệu thường gặp nhất là sưng hạch bạch huyết, gan lách to, sốt, thiếu máu, dấu hiệu

Trang 22

Down, thiếu máu Fanconi, hội chứng Bloom, ataxia-telangiectasia và hội chứng gãy Nijmegen [15-18] Các yếu tố ảnh hưởng khác bao gồm tiếp xúc với bức

xạ ion hóa, thuốc trừ sâu, một số dung môi hoặc vi rút như virus Epstein-Barr

và virus gây suy giảm miễn dịch ở người [19-21]

Bệnh ALL đã ảnh hưởng đến khoảng 876.000 người trên toàn cầu vào năm 2015 và dẫn đến khoảng 111.000 ca tử vong [22, 23] Tại Hoa Kỳ, ALL

là bệnh ung thư phổ biến nhất và gây tỷ lệ tử vong cao nhất do ung thư ở trẻ

em Tỷ lệ mắc ALL ở Hoa Kỳ được ước tính là 1,6 trên 100.000 dân Chỉ riêng trong năm 2016, ước tính có khoảng 6590 trường hợp mới được chẩn đoán, với hơn 1400 trường hợp tử vong do ALL (theo Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ)

Hình 1.2: Hình ảnh tế bào bạch cầu dòng lympho trong bệnh ALL

Trang 23

nhiễm khác có thể làm tăng nguy cơ phát triển bệnh [28] Cơ chế bệnh sinh của CLL được giải thích là do sai lệch di truyền mắc phải, phát triển theo nhiều bước Thông thường, CLL có liên quan đến sự phá hủy các phần lớn của vật chất nhiễm sắc thể; ví dụ, sự mất đoạn của nhánh dài của nhiễm sắc thể 13 là bất thường nhiễm sắc thể phổ biến nhất, hiện diện ở một nửa số bệnh nhân CLL Các triệu chứng của CLL có thể bao gồm các hạch bạch huyết to, nhưng không đau; mệt mỏi; sốt; đau ở phần trên bên trái của bụng; đổ mồ hôi đêm; giảm cân

và nhiễm trùng thường xuyên

CLL là loại bệnh bạch cầu phổ biến nhất ở người trưởng thành ở các nước phương Tây, chiếm khoảng 25 – 30% trong tất cả các loại bệnh bạch cầu [25, 29, 30] và nó ít phổ biến hơn ở những người từ châu Á [27] CLL đã ảnh hưởng đến khoảng 904.000 người trên toàn cầu trong năm 2015 và dẫn đến 60.700 người chết [31] Tỷ lệ mắc CLL tăng theo tuổi; 75% trường hợp được chẩn đoán ở tuổi > 60 CLL phổ biến ở nam giới hơn nữ giới, với tỷ lệ giới tính khoảng 1,5–2: 1 [25] Gần đây, sự gia tăng tỷ lệ mắc bệnh ở những người trẻ hơn đã được báo cáo, vì một phần ba số ca mắc mới được chẩn đoán trước 55 tuổi [32] Mặc dù vậy, xu hướng này không dẫn đến sự thay đổi đáng kể về tỷ

lệ mắc bệnh nói chung [33]

Hình 1.3: Hình ảnh tế bào bạch cầu dòng lympho trong bệnh CLL

(Nguồn: [24])

Trang 24

1.1.2.3 Bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính (AML)

Bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính (AML) là một rối loạn không đồng nhất được đặc trưng bởi sự nhân bản vô tính của các tế bào tiền thân myeloid (tế bào non) trong tủy xương và máu ngoại vi với khả năng biệt hóa giảm dần [34] AML là bệnh bạch cầu cấp tính phổ biến nhất ở người lớn tuổi Hiện nay, AML được chữa khỏi ở khoảng 35 – 40% bệnh nhân dưới 60 tuổi [35] Đối với bệnh nhân trên 60 tuổi, tiên lượng vẫn được cải thiện nhưng còn thấp

Loại ung thư này bắt đầu từ tủy xương (mô mềm trong xương gây ra những bất thường trong toàn bộ tủy, hồng cầu hoặc tiểu cầu) và nó nhanh chóng

di chuyển vào máu Nó cũng đôi khi có thể lan đến các bộ phận khác nhau của

cơ thể như gan, hạch bạch huyết, lá lách, hệ thống thần kinh trung ương (não

và tủy sống) và tinh hoàn Hậu quả là hội chứng suy tủy xương, gây ra thiếu máu, giảm bạch cầu hạt và giảm tiểu cầu, với các biểu hiện lâm sàng đặc trưng

là khó thở và suy nhược, nhiễm trùng và chảy máu [36, 37] Nếu không được điều trị, AML thường gây tử vong trong vòng vài tuần kể từ khi thời gian chẩn đoán [36-38] Các yếu tố nguy cơ có thể bao gồm hút thuốc, hóa trị liệu trước đây hoặc điều trị bức xạ, hội chứng myelodysplastic và tiếp xúc với benzen hóa học Khoảng một triệu người trên toàn cầu bị ảnh hưởng bởi AML và AML gây

ra 147 trường hợp tử vong trong năm 2015 [39, 40]

AML thường xuất hiện ở người lớn tuổi Tỷ lệ mắc bệnh ở Hoa Kỳ là 3,5 trường hợp trên 100.000 người, cao hơn ở bệnh nhân trên 65 tuổi so với bệnh nhân trẻ hơn (tương ứng là 15,9 so với 1,7), và gây ra khoảng 2,1% tổng

số ca tử vong do ung thư ở Mỹ, hàng năm tỷ lệ tử vong là 3,2 trên 100.000 người vào năm 2007 [41] Mặc dù, việc điều trị bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính ở người trẻ tuổi trong những năm gần đây đã có những bước tiến đáng kể nhưng việc điều trị cho người bệnh lớn tuổi vẫn gặp nhiều khó khăn, chưa đạt hiệu quả [42] Ngay cả việc áp dụng các phương pháp điều trị hiện nay thì vẫn

có khoảng 70% bệnh nhân từ 65 tuổi trở lên sẽ chết trong vòng 1 năm sau khi chẩn đoán [43]

Trang 25

Hình 1.4: Hình ảnh tế bào bạch cầu dòng tủy trong bệnh AML

(Nguồn: [24])

1.1.2.4 Bệnh bạch cầu dòng tủy mạn tính (CML)

Bệnh bạch cầu dòng tủy mạn tính (CML) là một rối loạn tăng sinh dòng tủy vô tính và là bệnh lý huyết học ác tính đầu tiên có liên quan đến một tổn thương di truyền cụ thể Bệnh được đặc trưng bởi sự xuất hiện của nhiễm sắc thể Philadelphia được cho là dấu hiệu chẩn đoán xác định cho CML và hiện diện ở gần 90% bệnh nhân [44] Trọng tâm của cơ chế bệnh sinh của CML là

sự hợp nhất của gen bệnh bạch cầu Abelson murine (ABL) trên nhiễm sắc thể

9 với gen vùng điểm dừng (BCR) trên nhiễm sắc thể 22 tạo nên tổ hợp gen BCR-ABL Điều này dẫn đến biểu hiện của một oncoprotein được gọi là BCR

‐ ABL1 [45] BCR-ABL là một tyrosine kinase hoạt động tích cực, kích hoạt một số con đường dẫn truyền tín hiệu ảnh hưởng đến sự phát triển và tồn tại của các tế bào tạo máu.Hầu hết các trường hợp CML dường như được gây ra bởi sự chuyển vị được gọi là nhiễm sắc thể Philadelphia (Ph) (khoảng 95% bệnh nhân CML mang nhiễm sắc thể này)

Trang 26

Hình 1.5: Sự hình thành nhiễm sắc thể Philadelphia (Nguồn: https://www.cancersupportcommunity.org/chronic-myeloid-

leukemia)

Hình 1.6: Hình ảnh tế bào bạch cầu dòng tủy trong bệnh CML

(Nguồn: [24])

Tỷ lệ mắc CML là khoảng 1-2 trên 100.000 dân mỗi năm CML chiếm

15 - 25% tất cả các bệnh bạch cầu ở người trưởng thành và 14% tổng số bệnh bạch cầu nói ở các nước phương Tây [46] Mặc dù tuổi chẩn đoán trung bình

Trang 27

là 67 tuổi, CML có thể xuất hiện ở mọi lứa tuổi Cũng như các loại bệnh bạch cầu khác, CML xuất hiện nhiều hơn ở nam so với nữ (tỷ lệ nam/nữ là 1,4:1) và xuất hiện phổ biến hơn ở người lớn khoảng 60 - 65 tuổi [47]

Sự ra đời của liệu pháp ức chế tyrosine kinase (TKI) đã khiến CML từ một căn bệnh gây tử vong thành một căn bệnh mạn tính cho đa số bệnh nhân Trước năm 1983, tỷ lệ sống sót sau 8 năm của CML là dưới 15% Việc sử dụng liệu pháp dựa trên interferon-α và liệu pháp cấy ghép tế bào gốc tạo máu toàn thể (HSCT) đã cải thiện tỷ lệ sống sót sau 8 năm từ 42% (năm 1983) lên 65% (năm 2000) Với sự ra đời của liệu pháp TKI vào năm 2001, tỷ lệ sống sót sau

8 năm là 87% và tiếp tục được cải thiện khi sử dụng liệu pháp TKI thế hệ thứ hai và thứ ba [48]

1.2 GIỚI THIỆU VỀ CÁC GEN THUỘC NHÓM DEUBIQUITINASE

Deubiquitinase (DUB) là một nhóm lớn các protease phân tách ubiquitin khỏi protein và các phân tử khác DUB có thể đảo ngược những hiệu ứng này bằng cách phân cắt liên kết peptide hoặc isopeptide giữa ubiquitin và protein

cơ chất của nó Deubiquitinase đóng một số vai trò trong con đường ubiquitin Một trong những chức năng đặc trưng nhất của DUB là loại bỏ các chuỗi monoubiqutin và polyubiquitin khỏi protein Những sửa đổi này là một sửa đổi sau dịch mã trong đó các protein ubiquitin đơn lẻ hoặc chuỗi ubiquitin được thêm vào các lysine của một protein cơ chất Ngoài ra, một vai trò ít được hiểu hơn của DUB là sự phân cắt của các protein giống ubiquitin như SUMO và NEDD8 Một số DUB có thể có khả năng phân cắt các liên kết isopeptide giữa các protein này và protein cơ chất Một số nghiên cứu cho thấy chức năng của DUB thay đổi có liên quan đến một số bệnh, bao gồm cả ung thư Do đó, nhiều DUB đã được phân loại là gen gây ung thư hoặc ức chế khối u vì chức năng điều hòa của chúng đối với hoạt động của các protein khác liên quan đến sự phát triển khối u

Trang 28

1.2.1 Gen A20

A20 (còn được gọi là TNFAIP3) được phát hiện lần đầu tiên vào năm

1990 bởi Dixit và các cộng sự như là một gen được cảm ứng bởi cytokine trong

các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của con người [49, 50] Gen A20 nằm trên

nhiễm sắc thể 6q23.3 và trình tự cDNA của nó dài 4440 bp với khung đọc mở gồm 2370 nucleotide mã hóa một loại protein được dự đoán là chứa 790 axit

amin Protein A20 có tính bảo thủ cao chứa miền khối u buồng trứng (OTU) có

đầu tận cùng amin ở vùng đầu cuối N và bảy miền ngón tay kẽm (ZinF) trong cùng đầu cuối C của nó Miền OTU làm trung gian cho hoạt động khử gốc (DUB), miền ZnF4gắn với chuỗi Ub (ubiquitin) liên kết K63 và ZnF7 gắn với

chuỗi Ub liên kết M1 và hỗ trợ hoạt động ligase E3 Ub Do đó, A20 hoạt động

như một enzym chỉnh sửa ubiquitin vì nó có khả năng khử ubiquitin lẫn ubiquitin hóa [51, 52]

Protein A20 được xác định là chất điều hòa quan trọng của các con đường truyền tín hiệu viêm và chất điều hòa “âm tính” của con đường kích hoạt yếu

tố hạt nhân kappa B (NF-κB), nó có thể làm giảm hoạt động NF-κB thông qua việc truyền tín hiệu từ một số thụ thể bề mặt như thụ thể các yếu tố hoại tử khối

u (TNFR), thụ thể giống Toll (TLR), và thụ thể tế bào B (BCR) [53] A20 ban

đầu được mô tả là chất ức chế chết tế bào do TNF gây ra [54, 55], tuy nhiên các

nghiên cứu tiếp theo đã chứng minh rằng sự biểu hiện quá mức của A20 ức chế

sự hoạt hóa NF-κB để đáp ứng với các kích thích khác nhau [56] Sự bất hoạt

của A20 dẫn đến cơ chế bệnh sinh của một số u lympho [57, 58], trong khi sự biểu hiện quá mức của A20 được tìm thấy ở bệnh nhi B-ALL [59]

Trang 29

Hình 1.7: Cấu trúc của protein A20 (Nguồn: [60])

1.2.2 Gen OTUB1

OTUB1 (còn được gọi là Otubain 1) là một thành viên thuộc họ OTU

DUB và được báo cáo là có liên quan đến nhiều loại khối u ác tính khác nhau

[61-64] OTUB1 thường được biểu hiện trong một số mô người, ví dụ: thận, đại trực tràng, dạ dày, não và gan [65, 66] OTUB1 có thể hoạt động như một

cysteine protease thủy phân liên kết isopeptide giữa ubiquitin và protein đích

hoặc một phân tử ubiquitin khác OTUB1 có liên quan đến việc điều chỉnh các quá trình sinh lý và bệnh lý OTUB1 có liên quan đến cảm ứng năng lượng

trong tế bào lympho T CD4+ và ảnh hưởng đến sự ổn định của E3 ligase GRAIL (gen liên quan đến năng lượng trong tế bào lympho) [67] Protein OTUB1 có vai trò đa dạng trong ổn định p53, ức chế chuỗi liên kết K63 để sửa chữa đứt gãy chuỗi DNA bằng cách nhắm mục tiêu UBE2N vào sự thoái hóa,

enzyme E2 xúc tác con đường NF-κB Sự biểu hiện cao của OTUB1 được phát

hiện trong khoảng 50% ung thư đại trực tràng, di căn gan, xương chậu và buồng trứng

Gần đây, vai trò của OTUB1 trong u thần kinh đệm ở người đã được làm

sáng tỏ [68] Các thí nghiệm miễn dịch và hóa mô miễn dịch đã xác định các

mô u thần kinh đệm biểu hiện quá mức các gen OTUB1 và các nghiên cứu thống kê cho thấy rằng kiểu biểu hiện của OTUB1 có liên quan nhiều đến các loại u thần kinh đệm Mặt khác, giảm điều hòa OTUB1 có liên quan đến việc

Trang 30

di chuyển kém và cũng làm tăng biểu hiện E-cadherin của protein liên quan đến hiện tượng chuyển dạng trung mô – biểu mô

1.2.3 Gen OTUB2

OTUB2 là một trong hai thành viên đại diện của phân họ miền khối u buồng trứng (OUT) của deubiquitinase [69, 70] OTUB1 và OTUB2 thuộc về

lớp protease cystein với đặc điểm nhận dạng và độ tương đồng lần lượt là 48%

và 70% OTUB1 có khả năng phân cắt chậm hơn và được ưu tiên liên kết Lys48 poly-ubiquitin [71] trong khi OTUB2 tách các chuỗi poly-ubiquitin được liên kết khác nhau Một chuỗi xoắn dài N của OTUB1 rất quan trọng để nhận biết

và ức chế E2-ubiquitin, do đó OTUB2 không thể nhận ra và ức chế E2 vì nó

thiếu chuỗi xoắn N-terminal [72] Một nghiên cứu gần đây của Li et al đã xác

định vai trò và sự biểu hiện quá mức của OTUB2 trong các mô ung thư phổi không phải tế bào nhỏ [73] Tuy nhiên nghiên cứu về biểu hiện của gen OTUB2

trên bệnh ung thư về máu nói chung và các bệnh bạch cầu nói riêng vẫn chưa được nhắc đến

1.2.4 Gen Cezanne

Cezanne, một DUB thuộc họ protein A20 của miền khối u buồng trứng

(OUT), có chức năng như một chất điều hòa ngược tín hiệu viêm và NF-κB

[74-78] Tương tự như A20, Cezanne đã được chứng minh là có thể ức chế con

đường NF-κB bằng cách tách chuỗi K63-polyubiquitin khỏi RIP-1 và TRAF6 [74, 79]

Cezanne có liên quan đến sinh học ung thư vì trình tự 93 kb chứa Cezanne được chứng minh là được nhân đôi trong bệnh bạch cầu nguyên bào lympho cấp tính và ung thư hạch Burkitt Cezanne đóng vai trò quan trọng trong việc dự đoán, cũng như sự phát triển của khối u Bên cạnh đó, Cezanne còn là

dấu ấn sinh học tiềm năng cần cho sự sống của bệnh nhân ung thư biểu mô tế

bào gan [80] Ngoài ra, Cezanne được khuếch đại và biểu hiện quá mức trong

nhiều bệnh ung thư, bao gồm các khối u ác tính ở vú, buồng trứng và tuyến tụy

Trang 31

Cezanne còn được thể hiện cao trong cả ung thư biểu mô vảy phổi, ung thư biểu

mô tuyến và tương quan với tiên lượng xấu hơn

1.3 GIỚI THIỆU VỀ CÁC CYTOKINE

Cytokine, ban đầu được xác định là sản phẩm của các tế bào miễn dịch,

là các protein nhỏ được tiết ra bởi các tế bào, tác động đến sự tương tác giữa các tế bào Cytokine là chất trung gian quan trọng của các phản ứng miễn dịch được tiết ra để đáp ứng với các kích thích lây nhiễm và không lây nhiễm khác nhau Cytokine có thể hoạt động thông qua các thụ thể đặc và có các hình thức tác động:

- Cận tiết – tác động lên các tế bào đích trong không gian lân cận;

- Tự tiết – cytokine do một tế bào nào đó tiết ra lại có tác động trực tiếp lên chính nó thông qua các thụ thể trên bề mặt tế bào;

- Nội tiết – tác động đến các tế bào hay tổ chức ở xa hơn trong cơ thể nhờ cytokine di chuyển trong máu;

- Xúc tiết – chỉ tác động lên các tế bào tiếp xúc với nó

Các cytokine khác nhau có thể kích thích hoặc ức chế sự phát triển của

tế bào, điều hòa sự biệt hóa của tế bào, gây ra sự điều hòa hóa học của tế bào

và điều hòa sự biểu hiện của các cytokine khác Sự cân bằng giữa các cytokine đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì các quá trình do chúng điều hòa, vì chúng đã được chứng minh là tham gia vào cả sự khởi đầu và tiến triển của một

số quá trình bệnh lý, chẳng hạn như viêm mạn tính và ung thư [81]

Một số cytokine gây viêm như TNF-α, IL-6 và IL-1β rất cần thiết cho chức năng và sự duy trì của tế bào Nồng độ các cytokine này bị thay đổi không chỉ ảnh hưởng đến các tế bào bạch cầu mà còn tác động đến chức năng của các

tế bào gốc tạo máu bình thường trong tủy xương [82] và thúc đẩy các bệnh viêm nhiễm [83-85]

Trang 32

1.3.1 TNF-α

Yếu tố hoại tử khối u - alpha (TNF-α) là một cytokine có tác dụng ức chế

và kích thích các quá trình tế bào đa dạng, có vai trò là cơ quan điều hòa các phản ứng miễn dịch TNF-α được tiết ra chủ yếu ở tế bào đơn nhân và đại thực bào, mặc dù các loại tế bào khác, đặc biệt là tế bào lympho T và B và tế bào lympho dạng hạt lớn đã được chứng minh là sản xuất TNF-α khi được kích thích Aggarwal và cộng sự đã chỉ ra rằng TNF-α có thể được tiết ra bởi nhiều loại tế bào khối u, bao gồm cả CML, B-Cell lymphoma, và có thể hoạt động như một chất thúc đẩy khối u nội sinh [86] TNF-α có thể hoạt động như một chất thúc đẩy sự phát triển khối u nội sinh, có liên quan đến sự hình thành khối

u, bao gồm biến đổi tế bào, sống sót, tăng sinh, xâm lấn và di căn Một số nghiên cứu đã xác định nồng độ TNF-α tăng cao ở các bệnh nhân mắc bệnh CLL, AML, … và nó đóng vai trò như một yếu tố tiên lượng ở những bệnh nhân mắc bệnh này [87, 88] TNF-α có vai trò trái ngược nhau trong bệnh ung thư TNF-α có thể hoạt động trực tiếp hoặc gián tiếp như một yếu tố tăng trưởng khối u tự tiết, trong khi nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng TNF-α gây ra quá trình apoptosis của các tế bào khối u [89, 90] Nghiên cứu cho thấy nồng độ TNF-α trung bình ở bệnh nhân AML cao hơn đáng kể so với người khỏe mạnh [91] Và nồng độ TNF-α huyết thanh cao là một yếu tố tiên lượng bất lợi cho khả năng sống sót và không có biến cố ở bệnh nhân AML [88] Ngược lại, trong nghiên cứu khác, phân tích bệnh nhân AML lúc chẩn đoán hoặc trong thời gian bệnh tái phát cho thấy TNF-α tăng đáng kể ở bệnh bạch cầu mạn tính và bệnh bạch cầu nguyên bào lympho cấp tính nhưng không tăng ở bệnh AML [92]

1.3.2 IL-6

Interleukin-6 (IL-6) là một cytokine được sản xuất bởi nhiều loại tế bào, bao gồm nguyên bào sợi, tế bào nội mô, bạch cầu đơn nhân, tế bào tạo máu bình thường và tế bào lympho [93-95].IL-6 được sản xuất bởi các loại tế bào khác nhau và có vai trò trong một số chức năng sinh học bao gồm phản ứng miễn dịch, tạo máu, viêm và phản ứng giai đoạn cấp tính của gan Trong khi ở

Trang 33

những người khỏe mạnh nồng độ 6 trong huyết thanh thấp, thì nồng độ

IL-6 tăng cao cũng được tìm thấy ở những bệnh nhân có khối u ác tính như đa u tủy Nồng độ IL-6 cao thường được tìm thấy trong huyết tương của những bệnh nhân mắc bệnh tự miễn [96] Một số nghiên cứu trước đó cho thấy một vai trò

có thể có đối với việc sản xuất IL-6 bị rối loạn điều hòa trong các u lympho ác tính IL-6 có thể đóng một vai trò trong con đường tự tiết bằng cách thúc đẩy

sự phát triển của một số u lympho tế bào B và u tủy [97, 98] Một số nghiên cứu gần đây hơn cho thấy nồng độ IL-6 trong huyết tương ở bệnh nhân CLL cao hơn so với nhóm chứng bình thường và nồng độ này cao hơn trong một bệnh phụ thuộc vào giai đoạn [99, 100] Những phát hiện này cho thấy IL-6 có thể là một dấu hiệu tiên lượng cho bệnh CLL Tuy nhiên, khả năng này vẫn chưa được kiểm tra rộng rãi

1.3.3 IL-1β

IL-1β là một cytokine tiền viêm mạnh, có vai trò rất quan trọng đối với các phản ứng bảo vệ của vật chủ đối với nhiễm trùng và tổn thương [101] Nó cũng là cytokine được nghiên cứu nhiều nhất trong số 11 cytokine của họ IL-1 IL-1β được tiết chủ yếu bởi các tế bào dòng tủy [102, 103] Trong điều kiện bình thường, IL-1β được tiết ra ở mức độ thấp, và sự biểu hiện hoặc sự hoạt hóa qua trung gian caspase 1 của nó tăng lên khi bị bệnh [101, 104] IL-1β được tiết ra liên kết với thụ thể IL-1R1 của nó và kích hoạt dòng tín hiệu kiểm soát

sự biểu hiện gen của nhiều yếu tố phiên mã, yếu tố tăng trưởng và các interleukin khác liên quan đến chức năng huyết học [102] Do đó, IL-1β đóng một vai trò quan trọng trong các phản ứng tế bào miễn dịch bẩm sinh và thích ứng IL-1βkích thích sự trưởng thành của tế bào T và tăng cường sự tăng sinh của tế bào B [105-107] Hơn nữa, IL-1β thúc đẩy sự biểu hiện của các phân tử gây viêm như cyclooxygenase type 2, phospholipase type 2 A, prostaglandin E2, yếu tố hoạt hóa tiểu cầu và oxit nitric [108] Điều quan trọng, IL-1β điều hòa chức năng tế bào gốc tạo máu (HSC) Một số nghiên cứu đã chỉ ra nồng độ IL-1β cao có liên quan đến tiên lượng xấu trong bệnh CML [109, 110] IL-1β

Trang 34

tăng được thấy trong giai đoạn tế bào non tiến triển so với giai đoạn mạn tính

và người khỏe mạnh, tương quan với sự mở rộng tế bào non trong tủy xương

và máu ngoại vi, tiên lượng xấu và thời gian sống ngắn hơn ở bệnh nhân [109, 111] Ngoài ra, IL-1β còn được tiết ra bởi các tế bào non AML ở người và biểu hiện của nó liên quan đến tiên lượng xấu ở bệnh nhân [112, 113] Cả IL-1β nội sinh và ngoại sinh đều thúc đẩy tăng sinh tế bào non, bằng cách cảm ứng các yếu tố tăng trưởng và các cytokine khác như yếu tố kích thích tế bào hạt - đại thực bào Tiên lượng bệnh nhân kém hơn và tỷ lệ sống thấp hơn được quan sát thấy ở những bệnh nhân có đáp ứng tăng sinh cao hơn với IL-1β ngoại sinh [114]

Trang 35

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là 107 mẫu máu bệnh nhân mắc bệnh ung thư bạch cầu chưa được điều trị trong đó: 9 mẫu máu bệnh nhân ALL, 16 mẫu máu bệnh nhân CLL, 20 mẫu máu bệnh nhân AML, 62 mẫu máu bệnh nhân CML được thu thập ở Viện Huyết học và Truyền máu Trung Ương, Bệnh viện Quân Y 103

và một số bệnh viện khác Các bệnh nhân đã được thăm khám lâm sàng, làm các xét nghiệm cận lâm sàng và giải phẫu bệnh để chẩn đoán xác định từng loại bệnh Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: Không phân biệt nam/nữ, không có bệnh tồn thân kèm theo như các bệnh tự miễn, tim mạch, hô hấp, … Nhóm đối chứng gồm 20 mẫu máu người khỏe mạnh, trong đó không có cá nhân nào đang dùng thuốc hoặc bị bất kỳ bệnh cấp tính hay mạn tính nào khác Tất cả bệnh nhân và tình nguyện viên đã ký văn bản đồng ý tham gia nghiên cứu Các quy trình thí nghiệm và việc chăm sóc từng cá nhân được thực hiện theo luật pháp Việt Nam

và đã được phê duyệt bởi Hội Đồng Y Đức của Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu:

Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu

Trang 36

2.1.4 Hóa chất

❖ Hóa chất tách chiết RNA tổng số:

+ RBC Lysis buffer + TRIzol RNA Isolation Reagents (Invitrogen, Mỹ) + Chloroform

+ Isopropanol + Ethanol + NướcRNAse-free

❖ Hóa chất điện di:

+ Agarose (ThermoFisher Sciencetific, Mỹ) + Dung dịch TBE 1X; RNA Gel Loading Dye (2X) (ThermoFisher Sciencetific, Mỹ)

+ Ethidium bromide

❖ Hóa chất chuyển RNA thành cDNA:

+ Nước cất DEPC + oligo-dT primer (Invitrogen, Mỹ) + 10x reaction buffer (Biolabs) + dNTP mix (Biolabs)

+ Chất ức chế Rnase (Roche) + Enzyme phiên mã ngược M-MuLV (Biolabs)

❖ Hóa chất thực hiện phản ứng Realtime-PCR + MgCl2

+ cDNA Master SybrGreen I mix (Roche Molecular Biochemicals) + Nước DEPC

Trang 37

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Quá trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ sau:

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu

Bệnh nhân và người khỏe mạnh được lấy 2 ml máu tĩnh mạch, cho vào ống chứa chất chống đông EDTA Quy trình lấy máu đảm bảo vô trùng tuyệt đối

2.2.2 Tách chiết RNA tổng số và phân tích mức độ biểu hiện gen bằng kỹ thuật Realtime-PCR

Trang 38

• Bổ sung 1 ml TRIzol Reagent, vortex đều

• Thêm 200 µl Chloroform, vortex đều

• Ly tâm 13000 rpm/10 phút/4oC

• Hút 400 µl pha trên sang ống Eppendorf 2 ml mới

• Thêm 400 µl Isopropanol, trộn đều

• Ủ mẫu ở -20oC trong 1 giờ

• Lấy 1 µg RNA tổng số pha loãng vào nước cất DEPC thành 12.5 µl

• Sau đó, thêm 1 µl oligo-dT primer (500 µg/ml) và ủ ở nhiệt độ 70oC trong 2 phút

• Cho thêm vào ống đựng mẫu 2 µl 10x reaction buffer, 1 µl dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 10 mM mỗi loại), 0.5 µl chất ức chế Rnase, 0.1 µl enzyme phiên mã ngược M-MuLV và 2.9 µl nước cất DEPC

• Trộn đều mẫu sau đó ủ ở 42oC trong 1 tiếng

• Để dừng phản ứng tổng hợp cDNA, các mẫu được ủ ở 94oC trong 5 phút

• Bảo quản mẫu ở -80oC

2.2.2.3 Phân tích mức độ biểu hiện gen bằng kỹ thuật Realtime-PCR Mẫu cDNA được phân tích mức độ biểu hiện các gen A20, OTUB1, OTUB2, Cezanne và GAPDH

Trang 39

Bảng 2.1: Các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng Realtime-PCR

Phản ứng quantitative PCR chứa 20 µl tổng thể tích gồm 2 µl cDNA, 2.4

µl MgCl(3 µM), 1 µl 02 loại primer (0.5 µM mỗi loại), 2 µl cDNA Master SybrGreen I mix (Roche Molecular Biochemicals) và 12.6 µl nước DEPC Đoạn cDNA được khuyếch đại ở 95ºC trong 10 giây, 62ºC trong 10 giây, and 72ºC trong 16 giây, số vòng nhắc lại là 40 vòng Phương pháp qRT-PCR định

lượng cho A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne được thực hiện trên hệ thống

LightCycler System (Roche Diagnostics) Tỷ lệ biểu hiện tương quan giữa các

gen (A20, OTUB1, OTUB2, Cezanne) và gen GAPDH đối chứng được tính trên

mỗi mẫu theo phương pháp ngưỡng chu trình

Trang 40

2.2.3 Phân tích nồng độ cytokine trong dịch huyết thanh bằng kỹ thuật ELISA

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA) là một phương pháp bắt giữ kháng nguyên đích (hoặc kháng thể) trong các mẫu bằng cách sử dụng kháng thể (hoặc kháng nguyên) đặc hiệu và phát hiện/định lượng phân tử đích bằng cách sử dụng phản ứng enzym với chất nền của nó

Trong ELISA, các phức hợp kháng nguyên - kháng thể khác nhau được

sử dụng, bao gồm kháng nguyên hoặc kháng thể được đánh dấu enzym, và hoạt tính của enzym được đo bằng phương pháp so màu Hoạt động của enzym được

đo bằng cách sử dụng cơ chất sẽ thay đổi màu sắc khi được enzym biến đổi Sự hấp thụ ánh sáng của sản phẩm được tạo thành sau khi thêm chất nền được đo

và chuyển đổi thành các giá trị số

Mẫu máu của bệnh nhân bạch cầu và người khỏe mạnh được ly tâm ở

3000 rpm trong 7 phút, thu lớp huyết thanh bên trên Để phân tích nồng độ TNF-α, IL-6 và IL-1β có trong mẫu huyết thanh, tôi sử dụng bộ dụng cụ kít

ELISA thương mại và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Các bước

tiến hành thí nghiệm ELISA như sau:

+ Dùng kháng thể bắt gắn vào bề mặt của các giếng Đĩa được ủ qua đêm

+ Thêm kháng thể phát hiện có gắn enzyme (horseradish peroxidase) HRP vào các giếng

+ Cho cơ chất tạo màu TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) vào để gắn với các vị trí có enzyme HRP biểu hiện màu xanh

Định dạng
Số trang	90
Dung lượng	2,03 MB