Kỹ thuật sản xuất vacxin COVID 19

Tổng quan các vắc xin SARSCoV2 Các kỹ thuật sản xuất vacxin Ứng dụng di truyền ngược sản xuất vacxin mRNA Vacxin vecto virus Vacxin mRNA Vacxin giảm độc lực Ưu nhược điểm của các loại vacxin Cơ chế hoạt động của các loại vacxin Các koại vacxin SARSCov2

“An overview of current COVID-19 vaccine platforms”

Tác giả: Abdou Nagy, Bader Alhatlani

TPHCM -10/08/2021

LỜI MỞ ĐẦU

Coronavirus 2 gây hội chứng suy hô hấp cấp tính nặng (SARS-CoV-2) là nguyên nhân gây ra đại dịch coronavirus 2019 (COVID-19) xuất hiện vào tháng 12 năm 2019 tại thành phố Vũ Hán, Trung Quốc Để bảo vệ con người và giảm thiểu các tác động kinh tế,

xã hội của đại dịch cần có một loại vắc-xin hiệu quả

Mặc dù việc phát triển vắc xin theo tiêu chuẩn thường đòi hỏi một quá trình sâu rộng và mất vài năm để hoàn thành tất cả các giai đoạn lâm sàng, hiện có 184 vắc xin đang trong giai đoạn thử nghiệm tiền lâm sàng và 88 vắc xin khác đang trong giai đoạn lâm sàng dựa trên các nền tảng vắc xin khác nhau tính đến ngày 13 tháng 4 năm 2021

Hơn nữa, ba vắc xin gần đây đã được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm

Hoa Kỳ cấp Giấy phép Sử dụng Khẩn cấp (đối với vắc xin Pfizer / BioNtech, Moderna mRNA và Johnson & Johnson vắc xin vectơ vi rút) và của chính phủ Vương quốc Anh (đối với vắc xin vectơ vi rút của Đại học Oxford / AstraZeneca)

Mục đích của bài viết:

1 Giới thiệu ngắn gọn về những tiến bộ hiện tại trong hệ thống di truyền ngược của SARS-CoV-2 và việc sử dụng hệ thống này để phát triển vắc-xin SARS-CoV-2

2 Ngoài ra, chúng tôi đề cập đến những điểm thiết yếu liên quan đến các công nghệ khác nhau để sản xuất vắc xin SARS-CoV-2 hiện tại và những ưu điểm và nhược điểm của các công nghệ này

3 Chúng tôi cũng đánh giá các khuyến nghị để kiểm soát đại dịch COVID-19 và các đại dịch trong tương lai bằng cách sử dụng các lợi ích của công nghệ kỹ thuật di truyền để tạo ra vắc-xin hiệu quả chống lại các bệnh do vi-rút đang phát sinh và tái phát có khả năng lây nhiễm từ động vật và con người

MỤC LỤC

1 Giới thiệu 1

1.1 Nguồn gốc SARS-CoV-2 1

1.2 Cấu tạo SARS-CoV-2 1

1.3 Vacxin chống SARS-CoV-2 2

2 Kỹ thuật di truyền ngược của SARS-CoV-2 4

3 Các vac xin đang thử nghiệm ở giai đoạn 3 hiện nay 6

3.1 Vắc xin SARS-CoV-2 sống giảm độc lực 6

3.1.1 Phân loại 6

3.1.2 Cơ chế 6

3.1.3 Ưu, nhược điểm 7

3.2 Vắc xin SARS-CoV-2 bất hoạt 7

3.2.1 Phân loại 7

3.2.2 Cơ chế 8

3.2.3 Ưu, nhược điểm 9

3.3 Vắc xin tiểu đơn vị protein 9

3.3.1 Phân loại 9

3.3.2 Cơ chế 10

3.3.3 Ưu, nhược điểm 11

3.4.Vắc xin vectơ vi rút 11

3.4.1 Phân loại 11

3.4.2 Cơ chế 12

3.4.3 Ưu, nhược điểm 13

3.5.2 Cơ chế 15

3.5.3 Ưu, nhược điểm 15

3.6 Vắc xin mRNA 15

3.6.1 Phân loại 16

3.6.2 Cơ chế 16

3.6.3 Ưu nhược điểm 17

4 Lo ngại về việc sử dụng véc tơ Adenovirus-5 (Ad-5) 17

5 Các vectơ vi rút đầy hứa hẹn cần được khám phá thêm 19

5.1 Véc tơ virus sởi 19

5.2 Véc tơ virus bệnh Newcastle 19

5.3 Vectơ vi rút liên quan đến Adeno 21

6 Hiệu quả vắc xin 22

7 Tóm tắt 23

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VACXIN COVID 19

1.2 Cấu tạo SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 thuộc giống Betacoronavirus trong họ Coronaviridae SARS-CoV-2

là một loại virus có vỏ bọc chứa bộ gen RNA dương sợi đơn có chiều dài 29.903 nucleotide với 11 khung đọc mở (ORF), mã hóa 27 protein virus ORF1a / b có chiều dài 21.290 nucleotide và mã hóa 16 protein phi cấu trúc (nsp1– nsp16) Phần cuối cùng của

bộ gen là 8613 nucleotide mà mã hóa bốn protein cấu trúc và sáu accessory protein(protein làm nhiệm vụ hỗ trợ các protein khác trong quá trình tạo hình thể cũng như khả năng gắn kết) Các protein cấu trúc là protein gai (S, gắn virus và protein kháng nguyên chính), protein vỏ (E),protein màng (M) và protein nucleocapsid (N) trong khi các accessory protein bao gồm ORF3a, ORF6, ORF7a, ORF7b, ORF8 và ORF10 như được thể hiện trong Hình 1 [3,4]

Hình 1: Cấu tạo bộ gen của SARS-CoV-2

Bộ gen RNA của SARS-CoV-2 có chiều dài ~ 30 kb và được tổ chức thành ít nhất

11 khung đọc mở (ORF) Bộ gen của virus bao gồm các vùng: vùng 5’UTR, khung đọc

mở, vùng 3’UTR và cuối cùng là đuôi poly (A) ORF1a và ORF1b chiếm 2/3 bộ gen virus, mã hóa các protein phi cấu trúc (nsp1 đến nsp16), trong khi bốn protein cấu trúc, bao gồm gai (S), vỏ (E), màng (M), và nucleocapsid (N), được mã hóa bởi các gen cấu trúc Ngoài ra, các accessory protein cũng được mã hóa bởi các gen cấu trúc Các yếu tố điều chỉnh tác động cis đã xác định cũng được hiển thị ở đầu 5’ (SL1 đến SL8), ở vùng chuyển khung ORF1a / b (FSE) và ở vùng 3’UTR SL: cấu trúc thùy; TRS: trình tự điều hòa phiên mã; FSE: yếu tố thúc đẩy chuyển đổi khung; PK:cấu trúc pseudoknot; HVR:

vùng siêu biến

1.3 Vacxin chống SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 có liên quan mật thiết với SARS-CoV xuất hiện từ năm 2002 đến năm 2004 [1] SARS-CoV cùng với coronavirus gây hội chứng hô hấp Trung Đông (MERS-CoV) đã gây ra dịch bệnh với tỷ lệ tử vong ở người cao [5] Mặc dù vậy, hiện tại vẫn chưa có vắc-xin trị coronavirus ở người được cấp phép, lý do có thể là vì chỉ có một

vài trường hợp tử vong ở người từ những vi-rút này gây ra và sự phân bố hạn chế của chúng Hơn nữa, vì có rất nhiều loại vi rút gây cảm lạnh cho con người, việc phát triển vắc xin coronavirus đa giá(chứa hai hoặc nhiều chủng/ type huyết thanh của kháng nguyên như vắc xin bại liệt) sẽ chỉ ngăn ngừa được một tỷ lệ nhỏ trong số này [6]

Một số vắc xin chống lại SARS-CoV đã được phát triển tiền lâm sàng với hai loại được thử nghiệm trong Giai đoạn I [7,8] Tuy nhiên, các giai đoạn lâm sàng này đã không tiến hành thêm vì đợt dịch này đã dừng lại và bệnh nhiễm vi rút này không tái phát ở người kể từ năm 2004 nhờ kiểm soát hiệu quả Tuy nhiên, vắc xin chống lại MERS-CoV

đã được phát triển hiệu quả Thông qua tất cả các nghiên cứu tiền lâm sàng này, protein đột biến đã được xác định là mục tiêu kháng nguyên cho vắc-xin coronavirus [9,10] May mắn thay, từ dữ liệu tiền lâm sàng và lâm sàng các thử nghiệm vắc xin SARS-CoV và MERS-CoV có thể giúp nghiên cứu ra các loại vắc xin SARS-CoV-2 đầy hứa hẹn chỉ trong vài tuần sau khi xuất hiện loại vi rút mới này và bắt đầu thử nghiệm lâm sàng đầu tiên vào tháng 3 năm 2020 (số thử nghiệm NCT04283461), chẳng hạn như sử dụng các thử nghiệm Giai đoạn I / II sau đó bắt đầu nhanh các thử nghiệm Giai đoạn III [6]

Hiện tại, 184 vắc xin đang trong giai đoạn phát triển tiền lâm sàng và 88 vắc xin đang trong giai đoạn phát triển lâm sàng [11] với ba vắc xin gần đây đã được Cục Quản

lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) cấp Giấy phép Sử dụng Khẩn cấp (EUA) Sau đây, chúng tôi tóm tắt ngắn gọn những ưu điểm và nhược điểm của các tổ chức / công nghệ sản xuất vắc xin hiện tại được sử dụng trong các thử nghiệm Giai đoạn III chống lại SARS-CoV-2 và hiệu quả của chúng đối với các biến thể mới Chúng tôi cũng tìm hiểu lý

do tại sao việc sử dụng những tiến bộ gần đây trong kỹ thuật di truyền lại cung cấp các giải pháp đầy hứa hẹn để tạo ra nhanh chóng các loại vắc xin hiệu quả chống lại các bệnh

do vi rút đang phát sinh và tái phát có khả năng lây lan từ động vật sang người

2 Kỹ thuật di truyền ngược của SARS-CoV-2

Di truyền ngược (RG) khá phổ biến cho quá trình di truyền của virus RNA từ cDNA của chúng [12] Một số RG trước đây đã được sử dụng cho các coronavirus khác nhau, bao gồm SARS-CoV, MERSCoV, virus viêm gan ở chuột, và coronavirus ở người 229E (HCoV229) [13]

Một kỹ thuật RG cho SARS-CoV-2 và các virus RNA khác đã được phát triển nhanh trong giai đoạn đầu của đại dịch COVID-19 [14] Trong kỹ thuật dựa trên nấm men này, các đoạn cDNA phụ chồng chéo của virus được tạo ra và tổ hợp lại trong Saccharomyces cerevisiae bằng cách sử dụng nhân bản tái tổ hợp liên quan đến biến nạp [14] RNA của virus được phiên mã in vitro bằng cách sử dụng polymerase T7 và sau đó được chuyển nạp cùng với mRNA biểu hiện protein N của SARS-CoV-2 vào tế bào BHK-21 hoặc tế bào BHK biểu hiện protein SARS-CoV N (BHK-SARS-N ) để khôi phục SARS-CoV-2 có thể tồn tại được

Một kỹ thuật RG tương tự cũng được phát triển cho SARS-CoV-2 và dựa trên phương pháp thắt trong ống nghiệm dẫn đến động học sao chép của vi rút tương tự như mẫu phân lập lâm sàng ban đầu [15] Trong kỹ thuật RG này, bộ gen SARS-CoV-2 có chiều dài đầy đủ ban đầu được lắp ráp từ bảy đoạn cDNA, một trong số đó có chứa promoter T7, sử dụng phương pháp thắt trong ống nghiệm, sau đó là phiên mã trong ống nghiệm cDNA để tạo ra RNA virus [15] Sau đó có thể thu được sự phục hồi của virus tái tổ hợp bằng cách cấy điện RNA của virus đã phiên mã in vitro vào các tế bào Vero E6

Một phương pháp RG thứ ba đã được thiết lập bằng cách sử dụng nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (BAC) [16]; và một kỹ thuật tương tự trước đây đã được sử dụng cho các coronavirus khác như SARS-CoV [17]

CDNA SARS-CoV-2 được tạo ra bằng cách sao chép liên tiếp năm đoạn của bộ gen virus thành một plasmid BAC dưới sự kiểm soát của promoter cytomegalovirus (CMV)

Sau đó, plasmid SARS-CoV-2 BAC có thể được truyền vào Vero E6 hoặc các dòng tế bào nhạy cảm khác để tạo SARS-CoV-2 tái tổ hợp lây nhiễm [16]

Hơn nữa, một phương pháp RG bổ sung dựa vào việc sử dụng phương pháp tiếp cận amplicon bộ phận lây nhiễm (ISA) đã được phát triển [18] Điều này liên quan đến việc khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase của 8 đoạn cDNA tổng hợp chồng chéo lên nhau với sự chèn của promoter CMV ngược dòng đoạn cDNA đầu tiên để cho phép bắt đầu phiên mã; ribozyme viêm gan delta là đã chèn vào hạ lưu đoạn cDNA cuối cùng để kết thúc phiên âm [18] Giải cứu các hạt virus lây nhiễm đã đạt được bằng cách truyền cDNA có chiều dài đầy đủ trong các tế bào cho phép Ưu điểm chính của phương pháp ISA là nó không yêu cầu nhân bản [19] Tương tự, một cách tiếp cận khác cũng đã được phát triển bằng cách tập hợp 10 đoạn cDNA SARS-CoV-2 bằng cách sử dụng phản ứng

mở rộng polymerase vòng, sau đó là chuyển gen vòng vào một dòng tế bào nhạy cảm [19]

Sự phát triển nhanh chóng của các kỹ thuật RG này có thể trả lời một số câu hỏi liên quan đến sinh học và cơ chế bệnh sinh của SARS-CoV-2:

• Ví dụ, một nghiên cứu gần đây đã sử dụng kỹ thuật RG để tạo ra các vi rút báo cáo nhằm tìm hiểu sâu hơn về cơ chế gây bệnh và khả năng sinh sản của SARS-CoV-2 [20]

• Hơn nữa, kỹ thuật này cũng có thể giúp phát triển vắc-xin sống giảm độc lực và / hoặc liệu pháp điều trị kháng vi-rút Một cách để đạt được điều này là sử dụng các

kỹ thuật RG để mô tả đặc điểm và tạo ra các virus đột biến thông qua việc đột biến một phần thiết yếu của bộ gen SARS-CoV-2, chẳng hạn như các phần tử RNA tác động cis trong đầu 5’ và 3’ của bộ gen RNA vi rút[21,22]

• Ngoài ra, RG cũng cho phép nghiên cứu các khía cạnh khác nhau của vòng đời virus, bao gồm cả sự sao chép và cơ chế bệnh sinh [23]

3 Các vac xin đang thử nghiệm ở giai đoạn 3 hiện nay

Hiện tại, có 16 vắc xin đang thử nghiệm Giai đoạn III tính đến ngày 13 tháng 4 năm

2021 [11], với dữ liệu đáng khích lệ từ thử nghiệm ở động vật linh trưởng không phải người ở Giai đoạn I và II Hầu hết các vắc-xin hiện tại trong Giai đoạn III đều được tiêm

cơ (một số ít được tiêm bằng các đường khác nhau như da, ví dụ: AG0302-COVID19) Tiêm vắc-xin ở cơ tạo ra các phản ứng IgG mạnh để bảo vệ đường hô hấp dưới nhưng không tạo ra đủ IgA để bảo vệ đường hô hấp trên, như trong trường hợp nhiễm trùng tự nhiên Các vắc xin giai đoạn III này đã được phát triển bằng các kỹ thuật khác nhau (Bảng 1) Một số kỹ thuật đã được cấp phép, trong khi các kỹ thuật khác thì chưa, chẳng hạn như kỹ thuật mRNA [6] Sau đây, chúng tôi tóm tắt các kỹ thuật vắc xin chính đã tiến tới thử nghiệm Giai đoạn III

• Vắc xin thứ hai, được gọi là MV-014–212 (số thử nghiệm NCT04798001), được phát triển bởi Meissa Vaccines, Inc, với ngày bắt đầu thử nghiệm ước tính là ngày

31 tháng 3 năm 2021 [ 11]

3.1.2 Cơ chế

Nói chung, vắc-xin vi-rút sống giảm độc lực (Hình 2A) thường được sản xuất bằng cách sử dụng một chủng vi-rút có lợi hoặc tạo ra một dạng vi-rút suy yếu về mặt di truyền, mà các vòng sao chép hạn chế không đủ để gây bệnh nhưng có thể gây ra các phản ứng miễn dịch tương tự như phản ứng do nhiễm trùng tự nhiên Sự suy giảm vi rút

có thể đạt được bằng cách cho vi rút tiếp xúc và thích nghi với các điều kiện không thuận lợi như sự phát triển ở nhiệt độ thấp ở vật chủ hoặc tế bào không nhạy cảm Chỉnh sửa gen cũng có thể được sử dụng thông qua kỹ thuật RG để tối ưu hóa codon hoặc xóa các gen cần thiết để kích thích nhận dạng miễn dịch bẩm sinh [24,25]

3.1.3 Ưu, nhược điểm

Ưu điểm

Ưu điểm của việc sử dụng các vắc xin SARS-CoV-2 sống giảm độc lực là kích thích miễn dịch tế bào và niêm mạc mạnh mẽ mà không cần thêm các tác nhân miễn dịch [26]

Nhược điểm

Tuy nhiên, loại vắc-xin này có một số hạn chế:

(1) SARS-CoV-2 đã được chứng minh là được bài tiết qua phân của những bệnh nhân bị nhiễm bệnh [27,28], và điều này gây ra mối lo ngại lớn về an toàn là vắc xin SARS- CoV-2 sống giảm độc lực có thể được bài tiết qua phân của người tiêm vắc xin, do đó dẫn đến khả năng lây truyền vi rút cho những người chưa được tiêm chủng

(2) Việc sử dụng vắc xin SARS-CoV-2 sống giảm độc lực có thể làm tăng nguy cơ tái tổ hợp giữa chủng vắc xin và vi rút đang hoành hành, tạo ra các biến thể vi rút mới

(3) Quy trình sản xuất và bào chế sử dụng nhiều lao động và yêu cầu kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt, điều này làm việc sản xuất vắc xin quy mô lớn tốn nhiều thời gian [26]

3.2 Vắc xin SARS-CoV-2 bất hoạt

3.2.1 Phân loại

Có sáu vắc xin bất hoạt hiện đang trong Giai đoạn III thử nghiệm tính đến ngày 13 tháng 4 năm 2021 [11]

• Vắc xin đầu tiên, với số thử nghiệm ChiCTR2000034780 và ChiCTR2000039000, được phát triển bởi Sinopharm với sự hợp tác của Tập đoàn Biotec Quốc gia Trung Quốc và Viện Sản phẩm Sinh học Vũ Hán

• Vắc xin thứ hai, với số thử nghiệm NCT04659239, được phát triển bởi Viện Sinh học Y tế và Học viện Khoa học Y tế Trung Quốc

• Vắc xin thứ ba, được gọi là Qaz-Covid-in với số thử nghiệm NCT04691908, được phát triển bởi Viện nghiên cứu các vấn đề an toàn sinh học, Cộng hòa Kazakhstan

• Vắc xin thứ 4 mang tên BBV152 với số báo danh NCT04641481; CTRI / 2020/11/028976, được phát triển bởi công ty Ấn Độ Bharat Biotech International Limited Hyderabad, Ấn Độ [11]

• Vắc xin thứ năm, với số thử nghiệm NCT04560881 và NCT04510207, được phát triển bởi Sinopharm (Thượng Hải, Trung Quốc) phối hợp với Tập đoàn Biotec Quốc gia Trung Quốc và Viện Sản phẩm Sinh học Bắc Kinh

• Vắc xin thứ sáu, với số thử nghiệm IRCT20201202049567N1 và IRCT20201202049567N2, được phát triển bởi công ty Shifa Pharmed Industrial (Tehran, Iran) và hiện đang trong giai đoạn thử nghiệm II / III Một

ví dụ về loại vắc-xin SARS-CoV-2 được phát triển này là CoronaVac, được phát triển bởi Sinovac Biotech Ltd, Trung Quốc và gần đây đã được cấp phép sử dụng hạn chế ở cả Trung Quốc và Các Tiểu vương quốc Ả Rập Thống nhất

3.2.2 Cơ chế

Một cách ngắn gọn, vắc xin vi rút bất hoạt, như trong Hình 2B, thường được tạo ra bằng cách nuôi cấy hạt giống virus SARSCoV-2 đang hoạt động trong dòng tế bào nhạy cảm, chẳng hạn như Vero E6, sau đó bất hoạt hóa học [29,30] Ngoài ra, vắc xin bất hoạt thường được bổ sung tác nhân phèn chua hoặc các loại dầu cụ thể và sau đó được tiêm vào cơ

3.2.3 Ưu, nhược điểm

Ưu điểm

Có xu hướng tạo ra các phản ứng miễn dịch rộng rãi vì vắc-xin gây ra sự nhắm mục tiêu của một loạt các protein virus khác nhau như S, M và N [6] Đáp ứng miễn dịch trong loại vắc-xin này thường là thể dịch và tế bào, ít gây phản ứng, dẫn đến tính an toàn cao của vắc-xin

Nhược điểm

Đã có hơn 70 năm nghiên cứu về sự phát triển của các loại vắc xin này [6,26] Tuy nhiên, việc sản xuất và bào chế loại vắc xin này hiện đang phải đối mặt với 3 thách thức (1) Nuôi cấy SARS-CoV-2 truyền nhiễm sống đến các cơ sở có hiệu giá cao (mở rộng quy mô) trong các cơ sở an toàn sinh học (BSL) 3, có ý nghĩa an toàn lớn

(2) Sự bất hoạt không đủ bằng hóa chất đối với vi rút được nuôi cấy sẽ có nguy cơ tiềm

ẩn đối với công nhân cơ sở sản xuất, gây bùng phát dịch bệnh và / hoặc các phản ứng miễn dịch có hại

(3) Việc sản xuất hàng tỷ liều trong thời gian ngắn là một thách thức[26]

3.3 Vắc xin tiểu đơn vị protein

• Ứng cử viên thứ ba là được phát triển bởi Sanofi Pasteur (Lyon, Pháp) và GlaxoSmithKline (GSK; Brentford, Anh), với số thử nghiệm PACTR

202011523101903

• Ứng cử viên thứ tư được phát triển bởi Clover Biopharmaceuticals Inc (Thành

Đô, Trung Quốc) với GSK và Dynavax (Emeryville, CA) và hiện đang trong giai đoạn thử nghiệm II / III, với số thử nghiệm NCT04672395

• Ứng cử viên thứ tư (được gọi là vắc-xin FINLAY-FR-2 chống SARS-CoV-2) được phát triển bởi Instituto Finlay de Vacunas (Havana, Cuba), với số thử nghiệm RPCEC00000354

• Ứng cử viên thứ năm (được gọi là EpiVacCorona) được phát triển bởi Trung tâm Nghiên cứu Nhà nước về Vi-rút và Công nghệ Sinh học của Viện Nghiên cứu Ngân sách Liên bang ‘‘ Vector ”, với số thử nghiệm NCT04780035

• Ứng cử viên thứ sáu (được gọi là UB-612) đã được phát triển bởi Vaxxinity (Dallas, Texas) và hiện đang trong giai đoạn thử nghiệm II / III, với số thử nghiệm NCT04683224

• Ứng cử viên thứ bảy (được gọi là CIGB-66) được phát triển bởi Trung tâm Kỹ thuật Di truyền và Công nghệ Sinh học (CIGB; Trieste, Ý), với số thử nghiệm RPCEC00000359 [11]

3.3.2 Cơ chế

Các vắc xin tiểu đơn vị protein (Hình 2C) phụ thuộc vào việc biểu hiện protein S hoặc đơn giản là một vùng của nó, chẳng hạn như vùng liên kết thụ thể (RBD), hoặc các gen virus khác trong các hệ thống biểu hiện khác nhau, bao gồm côn trùng, động vật có

vú và / hoặc tế bào nấm men [31,32]