Nghiên cứu điều trị thực nghiệm thỏ bị khuyết hổng xương bằng san hô kết hợp tế bào gốc tủy xương tự thân

Mục đích nghiên cứu của luận án là sử dụng san hô làm khung xương để mang các tế bào gốc tự thân được thu nhận từ tủy xương để tạo ra những mảnh ghép thay xương dùng ghép điều trị cho n

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM THỎ BỊ KHUYẾT HỔNG XƯƠNG BẰNG SAN HÔ KẾT HỢP TẾ BÀO GỐC TỦY XƯƠNG TỰ THÂN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HUỲNH DUY THẢO

NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM THỎ BỊ KHUYẾT HỔNG XƯƠNG BẰNG SAN HÔ KẾT HỢP TẾ BÀO GỐC TỦY XƯƠNG TỰ THÂN

Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT

Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01

Phản biện 1: PGS.TS NGUYỄN ANH TUẤN Phản biện 2: TS.BS TRƯƠNG TRÍ HỮU Phản biện 3: TS BÙI HỒNG THỦY Phản biện độc lập 1: TS BÙI HỒNG THỦY Phản biện độc lập 2: TS.BS PHAN NGỌC TIẾN

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS TRẦN CÔNG TOẠI

Tp Hồ Chí Minh – Năm 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Huỳnh Duy Thảo, nghiên cứu sinh khóa 22/2012 của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia TP.HCM, chuyên ngành Sinh lý học Người và Động vật, xin cam đoan:

1 Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của Thầy PGS.TS.BS Trần Công Toại

2 Công trình nghiên cứu này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu, kết quả và thông tin trong nghiên cứu này là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi thực hiện nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam đoan này

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 10 năm 2017

Người viết cam đoan

Huỳnh Duy Thảo

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ chân tình, hiệu quả của nhiều cá nhân, tập thể, của các Thầy/Cô, các đồng nghiệp, các bạn học, cùng gia đình và bạn bè

Lời đầu tiên cho phép tôi xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc tới PGS.TS.BS Trần Công Toại, người thầy hướng dẫn khoa học, người đã tận tình truyền đạt những kiến thức, những kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành được luận án này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các Thầy/Cô, các Anh, Chị, Em đồng nghiệp trong Bộ môn Mô - Phôi - Di truyền, Trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch đã cho tôi những lời khuyên bổ ích và các ý kiến quý báu cũng như đã hỗ trợ rất lớn về mặt tinh thần để tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy/Cô Bộ môn Sinh lý Động vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã giảng dạy tận tình và hỗ trợ quý báu để tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn các Y Bác sĩ, Khoa Chấn thương Chỉnh hình, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Chấn thương Chỉnh hình TP.HCM, đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo thuận lợi để tôi thu thập mẫu nghiên cứu, số liệu bệnh nhân để hoàn thành luận án Xin cảm ơn các bạn học khóa 21, 22 thuộc chuyên ngành Sinh lý học Người và Động vật đã hỗ trợ và cùng nhau vượt qua những khó khăn, thách thức trong những năm tháng học tập tại mái Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Cuối cùng bản luận án này là món quà tôi dành tặng cho các thành viên trong gia đình tôi, những người đã luôn ở bên tôi, cổ vũ và động viên tôi những lúc khó khăn

để có thể vượt qua và hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người!

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 10 năm 2017

Tác giả luận án

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ

Danh mục các đồ thị

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 KỸ NGHỆ MÔ 4

1.2 NGUỒN TẾ BÀO SỬ DỤNG TRONG KỸ NGHỆ MÔ XƯƠNG 4

1.2.1 Tế bào gốc trung mô 6

1.2.2 Nguồn gốc xác định tế bào gốc trung mô 6

1.2.3 Nguồn thu nhận tế bào gốc trung mô 7

1.2.4 Phân lập và duy trì tế bào gốc trung mô 7

1.2.5 Đặc điểm định danh tế bào gốc trung mô 8

1.2.6 Số lượng tế bào gốc trung mô 9

1.2.7 Biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành nguyên bào xương 10

1.3 TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ THU NHẬN TỪ TỦY XƯƠNG NGƯỜI 11

1.3.1 Tiềm năng tạo xương 12

1.3.2 Tiềm năng biệt hóa thành nguyên bào xương 13

1.3.3 Các marker định danh tế bào gốc trung mô từ tủy xương người 14

1.3.3.1 CD105 14

1.3.3.2 CD90 14

1.3.3.3 CD73 15

1.3.4 Các marker của nguyên bào xương 16

1.3.4.1 Marker của sự tăng trưởng tế bào 17

1.3.4.2 Marker protein của chất nền ngoại bào 17

1.3.4.3 Marker của quá trình khoáng hóa chất nền 18

1.4 GIÁ THỂ 19

1.5 CÁC YẾU TỐ HOẠT HÓA SINH HỌC 20

1.6 SỬ DỤNG SAN HÔ LÀM VẬT LIỆU GHÉP THAY XƯƠNG 21

1.6.1 Sử dụng san hô Porites để tạo vật liệu ghép thay xương 22

1.6.1.1 Thành phần cấu tạo của san hô Porites 22

1.6.1.2 Cấu trúc và độ xốp của san hô 23

1.6.1.3 Đặc điểm cơ học 24

1.6.1.4 Đặc tính cảm ứng tạo xương 25

1.6.1.5 Đặc tính kích ứng tạo xương 25

1.6.1.6 Khả năng tạo xương 26

1.6.1.7 Tính tương hợp sinh học 27

1.6.1.8 Đặc tính thoái biến sinh học 27

1.6.1.9 Kiểm soát chất lượng của mảnh ghép san hô 30

1.6.2 Nguyên tắc xử lý, chế tạo san hô thành vật liệu ghép thay xương 30

1.7 MÔ HÌNH ĐỘNG VẬT TRONG ĐÁNH GIÁ VẬT LIỆU GHÉP THAY XƯƠNG 31

1.7.1 Tiêu chuẩn lựa chọn các mô hình động vật 31

1.7.2 Mô hình động vật thỏ để đánh giá vật liệu ghép thay xương 33

1.8 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUÁ TRÌNH LIỀN XƯƠNG 35

1.8.1 Dựa trên hình ảnh X-Quang 35

1.8.2 Dựa trên đo độ hấp thu tia X hai nguồn năng lượng và chụp cắt lớp 35

1.8.3 Dựa trên hình thái mô xương 36

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 38

2.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 39

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.3.1 Phân lập, nuôi cấy và định danh tế bào gốc trung mô từ thu nhận từ tủy xương người 39

2.3.1.1 Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương người 39

2.3.1.2 Định danh tế bào gốc trung mô từ tủy xương người 41

2.3.1.3 Đánh giá tính toàn vẹn của tế bào qua nhiễm sắc thể đồ 45

2.3.2 Tạo mảnh ghép thay xương từ sự kết hợp của tế bào gốc trung mô từ tủy xương người và khung san hô 47

2.3.3 Ghép mảnh ghép san hô mang nguyên bào xương trong trường hợp khuyết xương ở thỏ 48

2.3.3.1 Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương thỏ 49

2.3.3.2 Biệt hóa tế bào gốc tủy xương thỏ thành nguyên bào xương 50

2.3.3.3 Tạo mảnh ghép từ khung san hô và tế bào gốc trung mô 51

2.3.3.4 Ghép mảnh ghép trên phần thân xương đùi ở thỏ 51

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 53

3.1 PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ ĐỊNH DANH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TỦY XƯƠNG NGƯỜI 53

3.1.1 Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương người 53

3.1.2 Kết quả nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ tủy xương người 60

3.1.3 Kết quả định danh tế bào gốc trung mô 66

3.1.4 Định danh nguyên bào xương 73

3.1.5 Đánh giá tính toàn vẹn của tế bào qua nhiễm sắc thể đồ 81

3.2 TẠO MẢNH GHÉP TỪ SỰ KẾT HỢP CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ VÀ KHUNG SAN HÔ 83

3.2.1 Đánh giá sự tăng trưởng của tế bào trên mảnh ghép 85

3.2.2 Đánh giá đặc điểm cấu trúc của mảnh ghép 87

3.2.3 Đánh giá khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành nguyên bào

xương trên giá thể san hô 91

3.3 XÂY DỰNG MÔ HÌNH GHÉP ĐOẠN XƯƠNG ĐÙI TRÊN THỎ BẰNG MẢNH GHÉP TỪ KHUNG SAN HÔ VÀ NGUYÊN BÀO XƯƠNG TỰ THÂN 93

3.3.1 Phân lập, nuôi cấy và nhân khối tế bào tủy xương thỏ 93

3.3.2 Cảm ứng biệt hóa tạo nguyên bào xương từ tế bào gốc tủy xương thỏ 99

3.3.3 Tạo mảnh ghép từ giá thể san hô và tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương thỏ 101

3.3.4 Quy trình ghép mảnh ghép trên đoạn xương đùi ở thỏ 104

3.3.5 Đánh giá kết quả sau ghép 107

3.3.5.1 Mảnh ghép ở thời điểm 1 tháng 107

3.3.5.2 Mảnh ghép ở thời điểm 3 tháng 111

3.3.5.3 Mảnh ghép ở thời điểm 6 tháng 113

KẾT LUẬN 119

KIẾN NGHỊ 120

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 121 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC NGHIÊN CỨU

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CFU-Fs Colony Forming Units - Fibroblasts Đơn vị tạo cụm nguyên bào sợi

NBF Neutral Buffered Formalin Dung dịch formalin đệm trung

tính

PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch đệm phosphate

SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét

Tomography

Chụp cắt lớp định lượng thể tích

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số yếu tố tăng trưởng được sử dụng phổ biến trong kỹ nghệ mô

xương 20

Bảng 1.2 Đặc trưng rỗng của san hô Porites lutea 23

Bảng 3.3 Kết quả phân lập tế bào gốc tủy xương và số CFU-Fs 53

Bảng 3.4 So sánh mật độ tế bào đơn nhân thu nhận từ tủy xương người 56

Bảng 3.5 So sánh số CFU-Fs được thu nhận từ tủy xương người 58

Bảng 3.6 Mật độ tế bào được đếm ở lần cấy chuyền thứ ba 63

Bảng 3.7 Khung CD Panel và kết quả phân tích Flow Cytometry 68

Bảng 3.8 Giá trị đo mật độ quang của hai nhóm mẫu tế bào gốc trung mô và nguyên bào xương 86

Bảng 3.9 Tóm tắt một số đặc điểm của thỏ trong quá trình nghiên cứu 94

Bảng 3.10 Một số đặc điểm tương đồng giữa tế bào gốc trung mô từ tủy xương người và thỏ 97

Bảng 3.11 Mật độ tế bào từ tủy xương thỏ ở lần cấy chuyền thứ ba 98

Bảng 3.12 Thỏ bị hủy ghép 105

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương 11

Hình 1.2 Các yếu tố phiên mã có liên quan trong quá trình biệt hóa tạo nguyên bào xương từ các tế bào gốc trung mô 17

Hình 1.3 Quy trình thu nhận tủy xương thỏ 50

Hình 3.4 Kết quả nuôi cấy tế bào từ tủy xương người 60

Hình 3.5 So sánh hình thái tế bào gốc trung mô của một số nhóm nghiên cứu 61

Hình 3.6 Hình thái tế bào sau khi tiến hành nhân khối 62

Hình 3.7 Hình thái tế bào trong quá trình nuôi cấy in vitro 67

Hình 3.8 Kết quả thực hiện Flow Cytometry 69

Hình 3.9 Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô in vitro 71

Hình 3.10 Kết quả nghiên cứu của tác giả Yaling Shi 72

Hình 3.11 Con đường truyền tín hiệu của BMP-9 74

Hình 3.12 Sơ đồ mô tả các giai đoạn biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành nguyên bào xương 75

Hình 3.13 Nhuộm hóa mô miễn dịch huỳnh quang để xác định sự hiện diện của Osterix và Runx2 76

Hình 3.14 Kết quả đánh giá sự biểu hiện của Alkaline Phosphatase 77

Hình 3.15 Sự biểu hiện của Alkaline Phosphatase so với những nhóm nghiên cứu khác 78

Hình 3.16 Kết quả đánh giá sự biểu hiện của gien Osteocalcin và Osteopontin 80

Hình 3.17 Khảo sát bộ nhiễm sắc thể của tế bào trước và sau biệt hóa thành nguyên bào xương 82

Hình 3.18 Nhiễm sắc thể đồ của tế bào gốc trung mô theo tác giả Jeon Chang Ra và cộng sự 83

Hình 3.19 Đánh giá cấu trúc mảnh ghép mô xương bằng nhuộm Giemsa và H&E 88

Hình 3.20 Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch huỳnh quang khối san hô mang các nguyên bào xương 89

Hình 3.21 Ảnh SEM của các nguyên bào xương được nuôi trên giá thể san hô 90

Hình 3.22 Đánh giá sự biểu hiện của enzyme Alkaline phosphaste đối với các nguyên bào xương được nuôi trên giá thể san hô 91

Hình 3.23 Kết quả nhuộm Giemsa để đếm số lượng CFU-Fs 95

Hình 3.24 Kết quả nuôi cấy tế bào gốc thu nhận từ tủy xương thỏ 96

Hình 3.25 Kết quả định danh các nguyên bào xương được biệt hóa từ tế bào gốc trung mô tủy xương thỏ 100

Hình 3.26 Kết quả đánh giá mảnh ghép bằng nhuộm Giemsa và H&E 102

Hình 3.27 Kết quả đánh giá sự biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành nguyên bào xương trên khung san hô 103

Hình 3.28 Nguyên nhân ghép thất bại trên thỏ 105

Hình 3.29 Quy trình phẫu thuật ghép san hô trên xương đùi thỏ 106

Hình 3.30 Kết quả ghép trên thỏ tại thời điểm một tháng 108

Hình 3.31 Kết quả đánh giá mô học mảnh ghép có mang nguyên bào xương tự thân tại thời điểm một tháng 109

Hình 3.32 Kết quả đánh giá mô học mảnh ghép không có mang nguyên bào xương tự thân tại thời điểm một tháng 110

Hình 3.33 Kết quả ghép trên thỏ tại thời điểm ba tháng 111

Hình 3.34 Kết quả ghép trên thỏ tại thời điểm sáu tháng 113

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1 Đường cong tăng trưởng tế bào (F3) được xây dựng theo mật độ tế bào 65

Đồ thị 3.2 So sánh đường cong tăng trưởng của hai dòng tế bào gốc trung mô và nguyên bào xương được nuôi trên khung san hô 86

Đồ thị 3.3 Đường cong tăng trưởng của tế bào từ tủy xương thỏ 98

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhu cầu sử dụng xương ghép tự thân và vật liệu ghép thay thế xương dùng để điều trị các trường hợp tổn thương xương là một nhu cầu thực tế và ngày một gia tăng Xương ghép tự thân là một nguồn xương ghép tự nhiên rất hữu dụng, tuy nhiên trong nhiều trường hợp không đáp ứng đủ nhu cầu của lâm sàng cũng như còn nhiều điểm hạn chế như cần số lượng xương lớn, ghép xương nhiều lần, phải thêm các vết mổ …

Từ đó đặt ra nhu cầu cho các nhà nghiên cứu, các nhà lâm sàng là phải chế tạo

ra nhiều loại vật liệu có khả năng dùng để ghép thay mô xương Hiện có rất nhiều loại vật liệu ghép thay xương đã được nghiên cứu và phát triển, từ các loại vật liệu

có nguồn gốc tự nhiên cho đến các loại vật liệu được tổng hợp nhân tạo Các loại vật liệu này trước hết phải có tính tương hợp sinh học, phải có khả năng cảm ứng và kích ứng tạo xương, có độ bền cơ học để có thể đảm nhận được vai trò vật lý của mô xương và cuối cùng có đặc tính thoái biến sinh học để chuyển hóa thành mô xương chủ Tuy nhiên, điểm hạn chế của những loại vật liệu ghép xương hiện tại là chưa bổ sung các loại tế bào phù hợp để thúc đẩy và hỗ trợ cho quá trình tái tạo mô xương diễn ra nhanh và hiệu quả hơn Vì vậy, những loại vật liệu dùng để ghép thay xương hiện tại đòi hỏi không những đáp ứng được các yêu cầu của vật liệu ghép thay xương truyền thống mà còn phải mang được các tế bào có khả tạo xương để thúc đẩy tiến trình lành xương nhanh và hiệu quả hơn

Một trong những loại vật liệu sinh học được sử dụng phổ biến trong ghép thay xương là những hợp chất có canxi, một trong số đó là san hô biển, là loại vật liệu tự nhiên, có nhiều đặc tính tốt có thể sử dụng để thay thế xương ghép San hô có thành phần chủ yếu là canxi carbonate (chiếm 98 - 99%), sau quá trình xử lý tạo vật liệu ghép xương thì san hô chỉ chứa canxi carbonate và một ít chất khoáng, đều là thành phần có chứa trong xương người, phù hợp với sự chuyển hóa và hấp thu của cơ thể nên được sử dụng làm vật liệu ghép thay xương khá phổ biến trong y học tái tạo Ngoài ra, khung san hô còn có đặc tính phù hợp cho tế bào bám dính, tăng trưởng và phát triển trên khối san hô trong điều kiện nuôi cấy, do đó có thể tạo ra

được các mảnh ghép thay xương theo xu hướng kỹ nghệ mô hiện đại của thế giới Mảnh ghép xương được tạo ra không chỉ đáp ứng được các tiêu chuẩn cơ bản của vật liệu ghép thay xương mà còn mang các tế bào phù hợp có khả năng tạo xương để giúp quá trình lành xương xảy ra nhanh hơn

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu: “Nghiên cứu điều trị thực nghiệm thỏ bị khuyết hổng xương bằng san hô kết hợp tế bào gốc tủy xương tự thân” Mục đích nghiên cứu của luận án là sử dụng san hô làm khung

xương để mang các tế bào gốc tự thân được thu nhận từ tủy xương để tạo ra những mảnh ghép thay xương dùng ghép điều trị cho những trường hợp khuyết xương trên

mô hình thỏ Kết quả mà nghiên cứu này mang lại có thể tạo ra các mảnh ghép thay xương hiệu quả hơn các loại vật liệu ghép xương truyền thống, phục vụ nhu cầu ghép xương ngày càng gia tăng của người bệnh

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đạt các mục tiêu sau:

1 Thiết lập quy trình phân lập, nuôi cấy và định danh tế bào gốc trung mô từ tủy xương người

2 Thiết lập quy trình tạo mảnh ghép thay xương từ sự kết hợp của khung san

hô và tế bào gốc trung mô từ tủy xương người

3 Xây dựng mô hình điều trị thực nghiệm khuyết hổng xương trên thỏ bằng mảnh ghép từ khung san hô và tế bào gốc tự thân từ tủy xương thỏ

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KỸ NGHỆ MÔ

Kỹ nghệ mô là một lĩnh vực đa ngành, ứng dụng các công cụ kỹ thuật kết hợp

y sinh học và khoa học kỹ nghệ để sử dụng các tế bào sống hoặc thu hút các tế bào nội sinh nhằm hỗ trợ sự hình thành hoặc tái tạo mô để hồi phục, duy trì hoặc cải thiện chức năng của mô [8], kỹ nghệ mô đã được áp dụng để sửa chữa, tái tạo các tổn thương ở nhiều loại cơ quan khác nhau như mô xương, gan, tụy … và mạch máu [111]

Riêng đối với kỹ nghệ mô xương nhằm nghiên cứu tạo ra các loại mô xương

kỹ nghệ dùng để thay thế mô xương Một trong những lợi ích quan trọng nhất của công nghệ này là có thể sử dụng chính tế bào tự thân của người bệnh để tạo ra các mảnh ghép cho chính họ, các mảnh ghép thay thế này có thể dễ dàng vượt qua rào cản miễn dịch ghép của cơ thể So với việc sử dụng mô ghép tự thân, mô kỹ nghệ sử dụng một lượng tế bào hiến ít hơn (vì số tế bào thu nhận được sẽ được làm tăng số

lượng tế bào thông qua việc nhân khối in vitro) và làm giảm tổn thương cho người

bệnh khi phải phẫu thuật thu nhận mô xương tự thân để ghép vào các khuyết hổng hoặc tổn thương xương dẫn đến mất xương

Các thành phần cơ bản để tạo ra mảnh ghép thay xương dựa trên nền tảng kỹ

nghệ mô gồm có 3 yếu tố là tế bào tạo xương, giá thể (hay khung xương) và các yếu tố hoạt hóa sinh học để hỗ trợ quá trình tạo xương

1.2 NGUỒN TẾ BÀO SỬ DỤNG TRONG KỸ NGHỆ MÔ XƯƠNG

Trong kỹ nghệ mô, nguồn tế bào có khả năng tăng trưởng là một yếu tố rất quan trọng Nguồn tế bào đầu tiên được sử dụng là tế bào từ chính người bệnh (ghép tự thân) Hiện tại, ghép mô tự thân vẫn được xem là một tiêu chuẩn vàng

trong chữa trị Mô được lấy trực tiếp từ người bệnh, nhân khối, tái cấu trúc in vitro

và sau đó là ghép lại cho chính người bệnh Tuy nhiên trong một số trường hợp không thể thu nguồn mô từ chính cơ thể người bệnh thì có thể sử dụng nguồn tế bào đồng loài hoặc các tế bào biến đổi gien của động vật [8]

Các tế bào tiền thân tạo xương thường được sử dụng trong kỹ nghệ mô xương

do chúng có khả năng tăng trưởng, có tiềm năng biệt hóa để tạo ra các tế bào tạo xương tương đối dễ dàng hơn so với các dòng tế bào khác Tuy nhiên, chúng cũng cần phải được kích thích để biệt hóa thành các tế bào tạo xương, tổng hợp nên các protein ngoại bào và tạo thành khung ngoại bào của mô xương Tủy xương là một nguồn mẫu lý tưởng để cung cấp các tế bào gốc (TBG) và tế bào tiền thân của các tế bào tạo xương, việc phân lập, nuôi cấy và biệt hóa những tế bào này sẽ được sử dụng cho kỹ nghệ mô xương trong luận án này

Từ lâu các nhà nghiên cứu đã nhận ra rằng các tế bào gốc thu nhận từ tủy xương người trưởng thành có thể biệt hóa và phát triển thành nhiều loại tế bào có nguồn gốc từ phần trung bì phôi bao gồm cả mô xương [49] và rất có tiềm năng để

sử dụng cho kỹ nghệ mô xương Một trong những loại tế bào được đặc biệt chú ý trong tủy xương đó là các TBG hiện diện trong tủy xương người, được gọi là TBG tủy xương TBG tủy xương có thể dễ thu nhận bằng cách chọc hút dịch tủy xương ở xương mào chậu, dựa vào đặc tính bám dính và tăng trưởng trên chai nuôi để phân lập và nhân khối, quần thể tế bào này có thể đạt tới 50 lần nhân đôi thế hệ Số lượng TBG tủy xương thu nhận khác nhau giữa các người hiến và phụ thuộc vào thể tích tủy xương thu nhận, có nhiều nghiên cứu cho thấy số lượng tế bào này giảm theo độ tuổi người bệnh [20] Một nghiên cứu của tác giả Martin Braddock và cộng sự (CS) (2001) chỉ ra rằng các TBG tủy xương chính là các tế bào chủ yếu tham gia vào quá trình tu sửa và tái tạo mô xương, do đó chúng sẽ là một nguồn tế bào phù hợp để sử dụng trong kỹ nghệ mô xương để sửa chữa hoặc tái tạo trong các trường hợp khuyết hổng hay các bệnh lý dẫn đến mất xương [110]

Việc lựa chọn các TBG và tế bào tiền thân để tạo ra các mảnh ghép dùng sửa chữa hoặc tái tạo mô xương vẫn còn là một liệu pháp khá mới, đặc biệt là đối với nước ta và còn nhiều việc cần phải nghiên cứu để xác định những trường hợp nào chúng ta có thể ứng dụng tốt nhất Hiện tại có một số lượng tài liệu khổng lồ và các nghiên cứu gia tăng một cách nhanh chóng có liên quan đến các TBG trung mô Các TBG trung mô được thu nhận phổ biến nhất là từ tủy xương ở xương mào chậu

Ngoài ra, TBG trung mô thu nhận từ mô mỡ và màng xương cũng cho thấy có tiềm năng ứng dụng hiệu quả Trong tương lai, TBG trung mô từ cuống rốn sẽ được quan tâm rất lớn như là quần thể tế bào đồng loài tương hợp mô

1.2.1 Tế bào gốc trung mô

Hiện nay, TBG được xem là nguồn tế bào vô tận Chúng có thể được thu nhận

từ phôi, thai và các mô ở người trưởng thành Ngược lại với những tế bào từ cơ thể trưởng thành, TBG từ phôi hoặc thai có khả năng tăng sinh không giới hạn nên có thể được sử dụng trong các liệu pháp điều trị Ngoài ra, các TBG này còn có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau của cơ thể khi cảm ứng trong điều kiện nuôi cấy thích hợp [6]

Trong giai đoạn 3 lá phôi, lớp trung bì phôi được tạo thành giữa lớp ngoại bì

và nội bì phôi Lớp tế bào của phần trung bì có chứa các tế bào được cho là các TBG trung mô Các TBG này là quần thể tế bào gốc đa tiềm năng còn tồn tại sau khi sinh

1.2.2 Nguồn gốc xác định tế bào gốc trung mô

Vào những năm 1970, nhóm nghiên cứu của Friedenstein nhận thấy khi nuôi cấy dịch tủy xương ở động vật, trong đĩa nuôi xuất hiện các cụm tế bào có hình thái giống nguyên bào sợi, khi đó tác giả gọi là đơn vị tạo cụm nguyên bào sợi

(Fibroblastic-Colony Forming Units - CFU) [50] Trong điều kiện in vitro, các tế

bào này hiện diện thành các cụm tế bào lớn, nhân khối rất nhanh từ sự phân chia của từng tế bào đơn lẻ Một số nhóm nghiên cứu đã chứng minh tính đa tiềm năng của

những tế bào này trong điều kiện in vitro [102] Tuy nhiên, lúc này danh pháp dùng

để gọi cho những tế bào này được sử dụng rất khác nhau bởi nhiều nhóm nghiên cứu, chưa có một tên gọi thống nhất để đặt tên cho chúng Sự đa dạng trong danh pháp này không chỉ đến từ sự đa dạng của các tế bào được phân lập mà còn từ sự đa dạng về hình thái tế bào được quan sát khi tiến hành nuôi trong các loại môi trường khác nhau, mà kết quả có thể là cùng một loại tế bào nhưng do sử dụng các cách xác

định khác nhau Do đó, việc thiếu các marker đặc hiệu để định danh và “dán nhãn” cho các tế bào phân lập từ tủy xương lúc bấy giờ dẫn đến nhiều tên gọi khác nhau cho quần thể TBG trung mô thu từ tủy xương

1.2.3 Nguồn thu nhận tế bào gốc trung mô

TBG trung mô có thể thu nhận từ nhiều nguồn mô khác nhau của phôi, thai cho đến các mô của cơ thể trưởng thành Tuy nhiên, hiện tại các nhà nghiên cứu tập trung nhiều hơn ở các loại mô có nguồn gốc từ cơ thể trưởng thành vì các ưu điểm nổi bật mà các mô này mang lại như dễ thu nhận, vượt qua rào cản y đức cũng như

có thể dễ dàng để ghép tự thân lại cho người bệnh [132] Có thể thu nhận được quần thể TBG trung mô trong các mô khác nhau trong cơ thể người trưởng thành Tuy nhiên, TBG trung mô lần đầu tiên được thu nhận ở tủy xương [22],[38],[71] Ngày nay, các TBG trung mô được xác định chắc chắn xuất hiện trong nhiều loại

mô, cụ thể như là mô mỡ, mô cơ, màng xương, cuống rốn, máu cuống rốn, tủy răng, nhú răng, gai nhau, dịch ối … đã được nghiên cứu rất nhiều, với nguồn cung cấp TBG trung mô khá dồi giàu sẽ là một điều kiện thuận lợi để chúng ta có thể sử dụng các tế bào này trong các liệu pháp tế bào, đặc biệt là trong lĩnh vực y học tái

tạo [37],[157]

1.2.4 Phân lập và duy trì tế bào gốc trung mô

TBG trung mô thường được phân lập từ tủy xương ở xương mào chậu của người [102] Nhiều nghiên cứu cũng đã được tiến hành để thiết lập quy trình thu

nhận TBG trung mô từ tủy xương người trưởng thành và nhân khối in vitro quần thể

tế bào này [102] Các quy trình khác nhau đã được sử dụng để phân lập và nhân khối TBG trung mô từ tủy xương [17],[34[,[117] Các kỹ thuật thường được sử dụng dựa trên phương pháp ly tâm để thu nhận TBG trung mô từ tủy xương, mặc dù phương pháp ly tâm phân đoạn hoàn toàn không thể loại bỏ việc tạp nhiễm các tế bào tạo máu và không thu được quần thể tế bào hoàn toàn tinh sạch nhưng đây là phương pháp có rất nhiều ưu điểm như kỹ thuật đơn giản, ít tốn kém và hạn chế tối

đa việc sử dụng hóa chất để phân lập tế bào Caterson và CS [35] đã cố gắng so sánh việc phân lập TBG trung mô từ tủy xương sử dụng cả hai phương pháp nuôi trực tiếp và ly tâm phân đoạn nhưng không tìm thấy bất kỳ sự khác biệt nào rõ ràng giữa các quần thể TBG trung mô được phân lập từ cả hai phương pháp Hơn nữa, phương pháp nuôi trực tiếp ít tốn công sức và cho phép thu được nhiều TBG trung

mô hơn Mặt khác, quần thể tế bào tạo máu lại là những tế bào không bám dính trong đĩa nuôi cấy Do đó, khi tiến hành thay môi trường sẽ loại bỏ dần quần thể tế bào này ra khỏi mẫu nuôi cấy, sẽ giúp thu nhận được quần thể TBG trung mô đang tăng trưởng tinh sạch [35]

Khả năng tăng trưởng và duy trì tiềm năng biệt hóa của TBG trung mô phụ thuộc vào nhiều yếu tố như là nguồn mô thu nhận, kỹ thuật nuôi cấy, hóa chất sử dụng … Trong đó, đặc biệt là việc lựa chọn loại huyết thanh phù hợp để bổ sung vào môi trường nuôi tế bào [86] Theo như Caplan và CS [33] sự hình thành chất nền ngoại bào cũng được quan sát thấy khi nuôi TBG trung mô trong môi trường có chứa nồng độ huyết thanh cao của thai bò hoặc ngựa khi sử dụng ở nồng độ 10% hoặc 20% huyết thanh Do đó, huyết thanh cung cấp nhiều yếu tố rất quan trọng cho việc trao đổi, vận chuyển các phân tử thiết yếu và chất dinh dưỡng để hỗ trợ cho tế bào tăng trưởng Ngoài ra, việc nhân khối các TBG trung mô trong thời gian dài là cần thiết để có thể sử dụng một lượng lớn các TBG trung mô trong y học tái tạo vì

số lượng các TBG trung mô trong tủy xương rất ít [102]

1.2.5 Đặc điểm định danh tế bào gốc trung mô

Hiện tại, chưa có marker đặc hiệu của quần thể TBG trung mô trong trong tủy xương, tuy nhiên, quần thể tế bào tiền thân của các tế bào này đã được xác định bằng sự hiện diện của một số marker bề mặt tế bào cũng như không biểu hiện của một số marker Vẫn còn một số tranh cải trong y văn liên quan đến các marker cần

để xác định cho quần thể TBG trung mô ứng viên trong tủy xương, tuy nhiên các nhóm nghiên cứu đều chấp nhận rằng đây là một quần thể tế bào khá đa dạng, phụ thuộc vào phương pháp mà chúng ta sử dụng để phân lập và nuôi cấy sẽ có được

các dòng tế bào tương ứng [120],[144] Nhưng hiện nay đã có một sự thống nhất được chấp thuận bởi Hội liệu pháp Tế bào Quốc Tế (International Society for Cellular Therapy – ISCT) đưa ra các tiêu chí để sử dụng cho việc định danh các quần thể tế bào TBG trung mô này [45]

 Thứ nhất, đó là các tế bào có khả năng bám dính vào đáy chai nuôi khi được nuôi cấy trong điều kiện in vitro

 Thứ hai, đó là các tế bào không biểu hiện các marker của các tế bào tạo máu như CD11b, CD14, CD34, CD45, B-lymphocyte antigens CD19 và CD79a và HLA-DR nhưng biểu hiện được các marker như CD73, CD90 và CD105 (endoglin)

 Thứ ba, đó là các tế bào có khả năng biệt hóa thành các tế bào của dòng trung mô như là tế bào sụn, tế bào mỡ và tế bào xương trong điều kiện in vitro

1.2.6 Số lượng tế bào gốc trung mô

Bằng cách áp dụng phương pháp tạo dòng tế bào theo tác giả Friedenstein [50]

số lượng TBG trung mô hiện hiện trong một mẫu tủy xương có thể được xác định bằng cách đếm các cụm tế bào trong giai đoạn nuôi cấy sơ cấp (CFU) Số lượng các cụm tế bào được tìm thấy tương ứng với số lượng tế bào đơn nhân ban đầu được phân lập từ tủy xương [50], nhiều tác giả đồng ý rằng dữ liệu đó có thể sử dụng để tính toán cho các TBG trung mô trong nguồn mẫu thu nhận từ ban đầu Thông thường số lượng này nằm trong khoảng 1 TBG trung mô cho khoảng từ 1×105 đến 1×106 tế bào đơn nhân trong tủy xương [68] Trong lĩnh vực kỹ nghệ mô xương cần phải sử dụng một lượng lớn tế bào để ghép lại cho người bệnh, do đó, một lượng nhỏ các TBG trung mô phân lập sẽ được nhân khối và cho tăng trưởng để gia tăng

số lượng tế bào đủ để tiến hành ghép lại cho người bệnh

Số lượng TBG trung mô trong tủy xương cho thấy có mối tương quan ngược với tuổi của người bệnh [50] Tuy nhiên, không có mối tương quan được tìm thấy giữa tỉ lệ tăng trưởng của TBG trung mô và tuổi của người hiến [131]

1.2.7 Biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành nguyên bào xương

Ngoài việc xác định các TBG trung mô dựa vào khả năng bám dính trên bề

mặt chai nuôi trong quá trình tăng trưởng và tiếp tục nhân khối dưới những điều kiện nuôi cấy phù hợp thì việc định danh các TBG trung mô cũng có thể dựa trên

khả năng biệt hóa giới hạn trong điều kiện in vitro và in vivo [90] Quá trình biệt

hóa của TBG trung mô thành nguyên bào xương được thể hiện qua bốn giai đoạn chính: (1) tế bào gốc trung mô, (2) tế bào tiền thân tạo xương, (3) tiền nguyên bào xương, (4) nguyên bào xương và cuối cùng là các nguyên bào xương phát triển thành các tế bào xương trưởng thành [55],[67],[90],[115] Sự cảm ứng biệt hóa thành nguyên bào xương, tế bào mỡ và tế bào sụn dưới những điều kiện nuôi cấy đã

được chứng minh rộng rãi bởi nhiều tác giả [88],[95],[102]

Con đường dẫn đến sự biệt hóa của các TBG trung mô người vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn Việc cảm ứng các TBG trung mô với môi trường tạo xương bao gồm β-glycerophosphate, ascorbic-2-phosphate, dexamethasone và huyết thanh thai

bò [37],[88],[98] gây ra một chuỗi các tác động phân tử bao gồm hoạt hóa các con

đường truyền tín hiệu và biểu hiện các marker tạo xương bao gồm alkaline phosphatase (ALP), osteopontin, osteocalcin and Cbfa1 [55],[115] Khi nuôi cấy

các TBG trung mô với sự hiện diện của những yếu tố này, các TBG trung mô sẽ biệt

hóa thành nguyên bào xương với hoạt tính ngày càng tăng của enzyme ALP và sự

lắng đọng của chất nền ngoại bào giàu canxi [55],[115] với quần thể tế bào đa dạng

và khả năng biệt hóa pha trộn gồm nhiều giai đoạn biệt hóa khác nhau thành các tế bào tạo xương [55],[115]

Thật sự, chính xác loại môi trường cần cho TBG trung mô để biệt hóa thành mỗi kiểu tế bào khác nhau vẫn chưa được hiểu rõ nhưng bao gồm một sự kết hợp đa dạng của các yếu tố như chất dinh dưỡng [87],[148], yếu tố tăng trưởng [141],[159]

và các kích thích cơ học [58] Những nhà nghiên cứu đã phân tích một cách kỹ lưỡng các TBG trung mô tủy xương để xác định khả năng bám dính của chúng để xác định chúng là “tế bào gốc” Họ nghiên cứu thế hệ con của các dòng tế bào được nhân khối từ từng tế bào đơn nhân tủy xương bám dính, chứng minh sự tự đổi mới

và tiềm năng đa biệt hóa Kết quả chỉ ra rằng ít nhất là một số tế bào tủy xương thật

sự là những tế bào gốc đa tiềm năng trong hỗn hợp các tế bào tiền thân đang nuôi cấy Đến nay, khả năng tự đổi mới của TBG trung mô vẫn còn là một câu hỏi Tuy

nhiên, một số nghiên cứu in vitro [95],[114] và những nghiên cứu in vivo khác

[27],[59],[114] chỉ ra rằng TBG trung mô phát triển thành dòng tế bào xương và phát triển đến giai đoạn khoáng hóa chất nền xương (giai đoạn muộn của quá trình biệt hóa thành các nguyên bào xương)

1.3 TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ THU NHẬN TỪ TỦY XƯƠNG

Năm 1970, Friedenstein và CS lần đầu tiên mô tả các TBG trung mô được thu nhận từ chất nền tủy xương [50] Các TBG trung mô này có đặc điểm như là các tế bào đơn nhân không tạo máu trong tủy xương với đặc tính bám dính vào đáy chai nuôi Ngay sau khi nuôi cấy trong thời gian ngắn, các tế bào này biểu hiện hình thái giống với hình dạng nguyên bào sợi, các tế bào này có tiềm năng biệt hóa thành tế bào xương, tế bào sụn và tế bào mỡ Một điều rất ngạc nhiên là các tế bào này vẫn

giữ được hình thái ổn định trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro trong thời gian khá

dài [50]

Hình 1.1 Tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương Tủy xương là nơi chứa cả

hai dòng tế bào gốc tạo máu và TBG trung mô TBG trung mô này có khả năng biệt

hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, trong đó có khả năng biệt hóa thành các nguyên bào xương, là nguồn cung cấp thuận lợi cho kỹ nghệ mô xương [124]

1.3.1 Tiềm năng tạo xương

TBG trung mô có tiềm năng biệt hóa thành các tế bào tạo xương đã được đánh giá và so sánh với nhiều loại tế bào khác Khi so sánh hoạt động của TBG trung mô với nguyên bào xương trong các thí nghiệm về kỹ nghệ mô xương trên bò, kết quả cho thấy TBG trung mô tăng trưởng tốt hơn nguyên bào xương được phân lập từ phần xương đặc của xương chày sau 1, 3 và 5 ngày nuôi cấy [134] TBG trung mô cũng cho thấy có tiềm năng khoáng hóa cao hơn và mật độ tế bào nhiều hơn nguyên

bào xương Ngoài ra, sự biểu hiện của những marker tạo xương như osteocalcin, osteopontin cũng như collagen type I ở mức độ mRNA và ở mức sinh tổng hợp

protein cũng nhạy hơn, điều này chứng minh rằng TBG trung mô hiệu quả hơn để ứng dụng trong kỹ nghệ mô xương hơn là các nguyên bào xương của chính người bệnh [134]

Haynesworth và CS đã nhân khối, cấy chuyền và nuôi các TBG trung mô trên các giá thể xốp calcium phosphate ceramic [65] Kết quả ghép mảnh ghép ở màng bụng chuột suy giảm miễn dịch cho kết quả TBG trung mô tạo ra được cả hai loại tế bào tạo xương và tạo sụn [98]

Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh khả năng biệt hóa tạo thành tế bào xương của các TBG trung mô, khi các TBG trung mô từ người và chuột được nuôi trên tấm màng sợi collagen kích ứng tạo xương, khi tiến hành cảm ứng tạo xương thì TBG trung mô từ hai nguồn này biệt hóa hoàn toàn thành các tế bào tạo xương [35]

TBG trung mô cũng đã được so sánh với các loại tế bào gốc khác [73],[132] Năm 2010, Kolambkar và CS đã so sánh sự bám dính, tạo lớp đơn và khả năng biệt hóa tạo xương của TBG trung mô so với tế bào gốc thu từ dịch ối người được nuôi trên tấm sợi nano [94] Cả hai loại tế bào biểu hiện đa dạng tiềm năng biệt hóa tạo

xương nhưng tế bào gốc thu từ dịch ối người cho thấy đỉnh hoạt động của ALP

chậm, còn TBG trung mô cho thấy khả năng khoáng hóa để tạo chất nền xương nhanh hơn [87] Khi so sánh với tế bào gốc phôi, TBG trung mô biểu hiện tiềm năng biệt hóa và khoáng hóa tạo xương thấp hơn trong khi các tế bào gốc phôi biểu hiện các protein HLA lớp II thấp hơn, điều này cho rằng các tế bào gốc phôi có lẽ

đã có những biến đổi thành các TBG trung mô trong quá trình nghiên cứu [87]

1.3.2 Tiềm năng biệt hóa thành nguyên bào xương

TBG trung mô không chỉ được sử dụng cho kỹ nghệ mô xương vì lý do phong phú, thu nhận đơn giản mà còn dễ nuôi cấy và duy trì tiềm năng tăng trưởng của chúng Hơn nữa, TBG trung mô còn có tiềm năng biệt hóa thành các nguyên bào xương và thậm chí có khả năng tạo xương lớn hơn tiềm năng biệt hóa thành tế bào sụn và mỡ [120]

Bất kể phương pháp nào được sử dụng để thu nhận TBG trung mô từ tủy xương, khi chúng ta chọn lựa một phương pháp để biệt hóa những tế bào này thành nguyên bào xương, chúng thường được nuôi cấy trong môi trường có chứa một hỗn hợp các yếu tố gồm Dexamethasone, -glycerolphosphate và L-Ascorbic acid [152] Tất nhiên, tiềm năng biệt hóa thành nguyên bào xương cũng bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm mật độ nuôi cấy tế bào, vật liệu sử dụng làm giá thể và điều kiện nuôi cấy … Một nghiên cứu của Jung và CS được thực hiện cho thấy TBG trung

mô người được nuôi trong môi trường không có huyết thanh có khả năng tạo thành cụm tế bào trong cả quá trình nuôi sơ cấp và thứ cấp khi so sánh với TBG trung mô người nuôi trong môi trường có huyết thanh thai bò [92] Tác giả cũng cho rằng TBG trung mô được nuôi trong môi trường không có huyết thanh tăng trưởng nhanh hơn và có hình thái đồng nhất hơn các tế bào cùng loại được nuôi trong môi trường

có huyết thanh thai bò

1.3.3 Các marker định danh tế bào gốc trung mô từ tủy xương người

TBG trung mô cùng tồn tại với các tế bào gốc tạo máu trong tủy xương và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau có nguồn gốc từ trung bì phôi Mặc dù được phân lập chủ yêu từ tủy xương, TBG trung mô cũng đã được phân lập từ nhiều nguồn mẫu khác như mô mỡ, màng xương, máu cuống rốn và các phần phụ của mô thai … [22],[44],[74]

Khi nhân khối TBG trung mô, chúng biểu hiện một khoảng rộng các kháng nguyên bề mặt, điều này phụ thuộc vào phương pháp thu nhận và nhân khối tế bào Các TBG trung mô thường xuyên biểu hiện các marker chủ yếu của TBG trung mô

là CD73, CD90 và CD105 và không biểu hiện MHC lớp II và kháng nguyên chuyên

biệt tế bào tạo máu (CD34, CD45, CD140)

1.3.3.1 CD105

CD105, cũng được biết đến như là endoglin, là một loại glycoprotein xuyên màng type I với chức năng là một thụ thể hỗ trợ cho các phối tử siêu họ TGF-beta Cũng như tên gọi của nó, endoglin biểu hiện rất cao trong các tế bào nội mô mạch

máu Nhưng nó cũng biểu hiện khá cao trong các tế bào hợp bào lá nuôi và thấp hơn trong các tế bào đơn nhân, nguyên bào sợi, tế bào sụn và tế bào tiền thân tạo máu [123] Một điều khá thú vị là đối với các TBG trung mô thu nhận từ mô mỡ biểu

hiện CD105 ở mức thấp khi thu nhận mô tươi nhưng càng gia tăng mức biểu hiện CD105+ theo sau các lần cấy chuyền [156],[163] Do đó, TBG trung mô thu nhận

từ tủy xương cũng như TBG trung mô từ các nguồn mô khác không thể phân lập đủ

số lượng nên thường phải thực hiện khâu nhân khối tế bào, do đó các TBG trung mô

sau quá trình nhân khối đều cho thấy biểu hiện được marker CD105

1.3.3.2 CD90

CD90, cũng được biết đến với tên gọi Thy1, là một protein liên kết với

glycosylphosphatidylinositol liên quan đến các hoạt động tương tác giữa tế bào – tế bào và tế bào – chất nền Mặc dù sự biểu hiện của chúng rất đa dạng giữa các loài

nhưng đã xác định được sự biểu hiện CD90 trong tế bào nội mô, tế bào gốc tạo

máu, lympho bào, nguyên bào sợi và tế bào thần kinh [15],[133] Khả năng của

CD90 bị hạn chế sử dụng như là một marker cho TBG trung mô do sự xuất hiện của

phân tử này không được bảo tồn tốt trong quá trình tiến hóa và thông thường kết

quả của việc sử dụng các kháng thể anti-CD90 có thể không phản ứng với TBG

trung mô của một loài nhất định [23] Do đó, mặc dù được quan tâm như là một

marker quan trọng để định danh TBG trung mô, nhưng CD90 không thường sử dụng như là một marker để xác định TBG trung mô in vivo

1.3.3.3 CD73

CD73 là một enzyme ecto-5’-nucleotidase có chức năng chuyển adenosine

monophosphate ngoại bào thành adenosine Nó cũng được biểu hiện rộng trên nhiều loại tế bào bao gồm lympho bào, tế bào nội mô, tế bào mô cơ trơn, tế bào biểu bì và nguyên bào sợi [14],[63],[151] Mặc dù có một nghiên cứu rất sớm của Haynesworth

và CS [64] cho thấy hai kháng thể đơn dòng SH3 và SH4 được xác định như là các anti-CD73 [21], dùng để xác định chuyên biệt cho TBG trung mô (không phản ứng

với tế bào tạo máu và nguyên bào xương), điều này có nghĩa là TBG trung mô biểu

hiện phân tử CD73 rất khác với các loại tế bào khác Mặc dù đã trải qua nhiều năm

nghiên cứu nhưng chưa có bằng chứng nào chứng minh cho trường hợp này Hiện

tại, chưa có một chứng minh nào cho thấy bất kỳ một kháng thể anti-CD73 nào có thể phát hiện một cách chuyên biệt cho các TBG trung mô in vivo

Tóm lại, các TBG trung mô nhân khối khá đồng nhất và biểu hiện dương tính

rất mạnh đối với các marker như CD105, CD90 và CD73 [45],[46],[102] Tuy nhiên, CD105 và CD73 cũng được biểu hiện trên nguyên bào sợi da [45] Ngoài ra, các loại tế bào bám dính trên chai nuôi khác cũng có khả năng tăng trưởng in vitro như tế bào nội mô mạch máu cũng biểu hiện được CD105 và CD73 dương tính [121],[140] Điều này chứng tỏ rằng nếu chỉ có CD105 và CD73 biểu hiện mà không có CD90 trên các tế bào bám dính là không hiệu quả để định danh cho các

TBG trung mô

1.3.4 Các marker của nguyên bào xương

Đã có nhiều cố gắng để xác định các marker của nguyên bào xương ở mỗi giai đoạn biệt hóa khác nhau Nhiều thử nghiệm đã sử dụng các loại kháng thể đơn dòng

như SH-1, 2, 3 và 4 [29],[33],[64] để xác định cho các nguyên bào xương đang tăng

trưởng, với nhiều sự kết hợp đa dạng để xác định ở mỗi giai đoạn phát triển khác nhau trong quá trình biệt hóa của TBG trung mô thành các nguyên bào xương

Kháng thể đơn dòng SB-10 nhận diện được kháng nguyên bề mặt biểu hiện trên các

tế bào được phân lập từ tủy xương người, nhưng không tương tác với các tế bào

biểu hiện enzyme ALP, do đó nó là một marker ở giai đoạn sớm của các tế bào tiền

thân tạo xương hơn là dùng để xác định cho chính các nguyên bào xương [28] Hiện tại cũng chưa có một phương pháp nào khác để đánh giá các giai đoạn khác nhau của quá trình biệt hóa các TBG trung mô thành các nguyên bào xương ngoài việc sử dụng các marker đã biết để định danh các nguyên bào xương Ngoài

ra, cũng có một số thành công nhất định trong việc xác định các giai đoạn này, cũng như là các kháng thể có hoạt động đa dạng đối với bề mặt tế bào, bào tương và protein chất nền ngoại bào [18],[55],[115]

Do đó, ngoài một số marker bề mặt tế bào, có một số phương pháp khác được

sử dụng để xác định tế bào ở các giai đoạn biệt hóa khác nhau dựa vào sự thay đổi của các đặc điểm sinh hóa của tế bào Những nghiên cứu của Aubin và CS [18] xác định các tế bào tiền thân nguyên bào xương cũng được đánh giá dựa vào sự biểu hiện gien thay vì dựa vào những thay đổi như tế bào trưởng thành từ tế bào tiền thân nguyên bào xương thành tiền nguyên bào xương rồi nguyên bào xương và phản ứng lại với việc tăng trưởng giảm đi và gia tăng sự biệt hóa Do đó, sự biểu hiện của protein hoặc mRNA có thể được sử dụng như các marker biệt hóa về mặt thời gian [115] Việc biểu hiện gien có liên quan đến thời gian của ba giai đoạn biệt hóa nguyên bào xương đã được công nhận [99],[116] đó là dựa vào:

 Sự tăng trưởng

 Sự hình thành chất nền ngoại bào

 Sự khoáng hóa

Hình 1.2 Các yếu tố phiên mã có liên quan trong quá trình biệt hóa tạo nguyên

bào xương từ các tế bào gốc trung mô Các TBG trung mô được biểu thị bằng

những tế bào dương tính với CD105, CD73 và CD90 Cùng với quá trình biệt hóa tạo thành tế bào xương, các marker của tế bào xương dần biểu hiện như osteopontin trong các nguyên bào xương sớm, đến osteocalcin trong nguyên bào xương muộn và cuối cùng là các Sclerostin, DMP-1 trong các tế bào xương [116]

1.3.4.1 Marker của sự tăng trưởng tế bào

Sử dụng các phương pháp để xác định mRNA (như phương pháp PCR và in situ hybridization) và nhuộm hóa mô miễn dịch để đánh dấu từng tế bào riêng lẻ,

đặc biệt là các protein có vai trò điều chỉnh trong suốt quá trình biệt hóa của nguyên bào xương [17] Cho thấy trong suốt giai đoạn tăng trưởng, ban đầu các tế bào biểu

hiện collagen type 1, osteopontin và fibronectin Khi quá trình tăng trưởng giảm, lúc này có sự kết hợp với việc sản xuất chất nền xương, với sự biểu hiện của ALP

và osteopontin Sau đó là gia tăng biểu hiện bone sialoprotein (BSP), một loại glycoprotein cần thiết được tìm thấy trong các mô khoáng hóa và osteocalcin với sự

khởi đầu khoáng hóa chất nền xương [136]

1.3.4.2 Marker protein của chất nền ngoại bào

Các protein chất nền ngoại bào rất cần thiết cho quá trình tổng hợp xương, sản phẩm của những protein này cũng được xem như là những marker về mặt hình thái

của nguyên bào xương và được sử dụng để định danh cho các nguyên bào xương in

vitro

Tế bào gốc

trung mô

Nguyên bào xương sớm

Nguyên bào xương muộn

Tế bào xương

Collagen type I là loại protein phong phú nhất trong cơ thể và là thành phần

hữu cơ chính của xương Nó được tạo ra trong suốt giai đoạn biệt hóa của sự phát triển nguyên bào xương, điều này làm cho nó được sử dụng như là một marker nhận biệt trong giai đoạn sớm trong quá trình phát triển của nguyên bào xương [135]

Osteocalcin là một loại protein không collagen quan trọng của xương Nó

được tổng hợp chủ yếu bởi nguyên bào xương và nguyên bào sụn [136], được tạo ra trong suốt giai đoạn khoáng hóa của quá trình biệt hóa tạo nguyên bào xương

Osteocalcin được cho là gắn kết với canxi trong xương, nó cũng có thể hoạt động

như một cytokine với chức năng dẫn dụ hóa học cho các nguyên bào xương và tế

bào hủy xương [154] Do đó, nồng độ Osteocalcin trong huyết thanh và trong dịch

khớp đã được chứng minh là có mối tương quan với sự hình thành xương mới và kiểm soát sự gia tăng quá trình đổi mới của xương

Osteopontin là loại protein xuyên màng gắn kết với chất nền ngoại bào trong mô khoáng hóa được tạo ra bởi nguyên bào xương Osteopontin liên kết với canxi của chất nền ngoại bào xương, cố định Osteocalcin trong chất nền khoáng [154] Do đó, Osteopontin được sử dụng như marker định danh cho các nguyên bào xương hoạt

động, tuy nhiên nó không phải là một marker đặc hiệu do biểu hiện phổ biến trong các tế bào của các mô kẽ đặc biệt là tại vị trí viêm nhiễm

Bone sialoprotein (BSP) là một protein liên kết được tìm thấy trong xương

[128] Nó hoạt động như một protein kết hợp với integrin, có ái lực với thụ thể

vitronectin và collagen, chức năng trung gian cho sự gắn kết giữa các tế bào và collagen [136] BSP đã được xác định bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy xuất hiện trước quá trình khoáng hóa của chất nền ngoại bào Do đó, BSP

được xem như là một nhân tố khởi đầu cần thiết cho quá trình khoáng hóa [136]

1.3.4.3 Marker của quá trình khoáng hóa chất nền

Alkaline phosphatase (ALP) là một enzyme xúc tác quá trình thủy phân các

phosphate ester ở pH kiềm Các dạng isoenzyme của ALP ở mô xương, mô gan và

mô thận đã được tìm thấy cũng như những isoform của ALP có trong mô cơ xương

ALP là một glycoprotein hiện diện trên bề mặt tế bào, màng nhân và trong bào

tương của nguyên bào xương

Sử biểu hiện gien của ALP bắt đầu gia tăng trong quá trình trưởng thành của

chất nền xương và suy giảm cùng với sự khoáng hóa và kết thúc khi các nguyên bào

xương trưởng thành thành các tế bào xương Điều này ngụ ý rằng ALP rất quan trọng trong việc khởi đầu sự khoáng hóa Nồng độ ALP trong huyết thành thường

được sử dụng trên lâm sàng để đánh giá quá trình đổi mới trong cả hai trường hợp

sinh lý và bệnh lý của mô xương Do đó, ALP là một marker chỉ thị được sử dụng

rộng rãi để xác định cho các nguyên bào xương [135]

1.4 GIÁ THỂ

Đối với kỹ nghệ mô thì giá thể được sử dụng cần phải thỏa mãn một số tiêu chí Đầu tiên, giá thể cần phải hỗ trợ cho sự tăng trưởng của tế bào, do đó bề mặt giá thể cần phải có tính tương hợp sinh học để cho phép tế bào bám dính Giá thể cũng cần phải có độ xốp để cung cấp chất dinh dưỡng và cho tế bào phát triển bên trong giá thể và phân bố khắp giá thể Khi được cấy ghép, một giá thể xốp sẽ phù hợp cho sự tạo mạch máu một cách nhanh chóng và vật liệu cần phải được thoái biến cùng lúc với tiến trình tái tạo của mô chủ Ngoài ra, đối với mô xương thì vật liệu cần phải có một độ bền cơ học nhất định để phù hợp với chức năng chống đỡ của mô cần cấy ghép

Vai trò của giá thể chính là những cấu trúc ba chiều, có thể được sử dụng để kiểm soát sự biệt hóa, tăng trưởng và di chuyển của tế bào Giá thể cũng hoạt động như một cấu trúc hỗ trợ lực tạm thời Ngoài ra, giá thể có thể được sử dụng như

“giàn giáo” thay thế cho chức năng của chất nền ngoại bào và cần phải thỏa mãn các tiêu chí đặc hiệu cho từng loại mô

Do đó, một giá thể sử dụng trong kỹ nghệ mô nên có các đặc điểm sau [134],[164]:

1 Nên có cấu trúc ba chiều, có độ xốp cao với một mạng lưới lỗ liên thông với nhau cho sự tăng trưởng, sự vận chuyển của chất dinh dưỡng và trao đổi chất của tế bào;

2 Nên có tính chất bề mặt được tối ưu hóa cho sự bám dính, di chuyển, tăng sinh và biệt hóa của loại tế bào mục tiêu;

3 Nên có tính tương hợp sinh học, không gây ra phản ứng miễn dịch và có thể phân hủy với tốc độ được kiểm soát với sự tái tạo của mô đích;

4 Nên có tính chất cơ học phù hợp với những mô tại vị trí ghép;

5 Cuối cùng, các giá thể cần phải được sản xuất một cách dễ dàng và có thể điều chỉnh hình dạng và kích thước khác nhau một cách đơn giản

1.5 CÁC YẾU TỐ HOẠT HÓA SINH HỌC

Các thành phần cảm ứng tạo xương được sử dụng trong kỹ nghệ mô là các hoạt chất sử dụng cho các tế bào tiền thân và TBG Những thành phần này bao gồm các yếu tố tăng trưởng như là yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi, yếu tố tăng trưởng insulin, yếu tố tăng trưởng từ tiểu cầu và các protein hình thái xương Đặc biệt đối với các protein hình thái xương đã được sử dụng rất nhiều để kết hợp với giá thể hydroxyapatite để gia tăng hiệu quả sửa chữa khuyết hỗng xương trên chuột khi so sánh với trường hợp chỉ sử dụng hydroxyapatite [145]

Bảng 1.1 Một số yếu tố tăng trưởng được sử dụng phổ biến trong kỹ nghệ mô

xương

Nguyên bào xương Sự hình thành xương

Sự tăng trưởng Sự biệt hóa Động vật Người

Tuy nhiên, liều lượng cần thiết của các protein hình thái xương để cảm ứng tạo xương lớn gấp nhiều lần lượng protein hình thái xương được xác định trong các mô xương bình thường [25] Với liều lượng sử dụng quá nhiều các protein hình thái xương dẫn đến các trở ngại cho các thử nghiệm lâm sàng do giá thành của các protein hình thái xương này quá cao Do đó, sử dụng liệu pháp gien để cảm ứng tế bào sản xuất ra các protein này cũng là một hướng nghiên cứu đầy tiềm năng, cũng như nhiều nghiên cứu cho thấy các TBG trung mô được chuyển gien để mã hóa cho protein hình thái xương (BMP-2) làm gia tăng quá trình liền xương ở những khuyết hỗng xương lớn trên các mô hình nghiên cứu trên động vật [100]

1.6 SỬ DỤNG SAN HÔ LÀM VẬT LIỆU GHÉP THAY XƯƠNG

San hô là động vật biển từ lớp san hô gồm hơn 7000 loài, trong đó hơn một phần ba thuộc về chi san hô tảng San hô tảng dưới dạng các tập đoàn gồm nhiều loài động vật nhỏ được gọi là polyp Các polyp phát triển để xây dựng thành bộ xương ngoài hướng tâm của san hô Quá trình xây dựng bộ xương này làm liên tưởng đến quá trình hình thành xương ở người

San hô tự nhiên sau khi được xử lý loại bỏ các thành phần hữu cơ (xác polyp) thì chỉ còn chứa calcium carbonate với một ít chất khoáng khác đều là thành phần

có chứa trong xương người Vì thế các thành phần này có thể được hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể người Do đó, đây là một vật liệu phù hợp để chế tạo thành vật liệu ghép thay xương [56]

Việc nghiên cứu sử dụng san hô tự nhiên để ghép thay xương bắt đầu từ rất sớm Năm 1979, lần đầu tiên san hô tự nhiên được ứng dụng thành công vào lâm sàng tại bệnh viện R Poincaré ở Garches trong chuyên khoa chấn thương chỉnh hình và hàm mặt [70] Hiện nay, san hô được sử dụng trong hầu hết các chuyên khoa liên quan đến phẫu thuật xương Hydroxyapatite san hô được sử dụng nhiều ở Bắc Mỹ, trong khi đó, san hô tự nhiên được sử dụng nhiều ở Châu Âu

Trong trường hợp ổ khiếm khuyết xương có hình dạng phức tạp gây ra sau chấn thương hay phẫu thuật, việc tìm một mảnh ghép có hình dạng tương tự thường

gặp nhiều khó khăn Hơn nữa, nếu mảnh ghép không được cố định chặt, để lại những khoảng trống giữa mô ghép và xương chủ thì có nguy cơ các mảnh mô vụn xung quanh lọt vào khoảng trống đó sẽ làm chậm quá trình liền xương, thậm chí gây ra thải ghép hay nhiễm trùng sau này Tuy nhiên, san hô biển là loại vật liệu có thể tạo hình mảnh ghép theo các khuyết hỗng mô xương tương đối dễ dàng, do đó

sẽ khắc phục được những khó khăn do hình dạng mô ghép gây ra để nâng cao hiệu quả của mảnh ghép cũng như quá trình phẫu thuật và giữ ổn định mảnh ghép san hô cũng không quá khó khăn khi thực hiện [56]

1.6.1 Sử dụng san hô Porites để tạo vật liệu ghép thay xương

1.6.1.1 Thành phần cấu tạo của san hô Porites

Các polyp hấp thụ các ion canxi và acid cacbonic có trong nước biển để tạo ra các tinh thể aragonit của calcium carbonate, chiếm 97-99% của bộ xương san hô Phần còn lại được tạo thành từ các yếu tố khác nhau, gồm các oligoelement khoảng 0,5-1%, magnesium dao động khoảng 0,05-0,2%, natri với số lượng chiếm từ 0,4-0,5%, acid amin chiếm 0,07% và phần còn lại gồm các vết của kali (0,02-0,03%), strontium, fluorine và phosphorous ở dạng phosphate [41] Các oligoelement tìm thấy trong san hô được cho là đóng một vai trò quan trọng trong quá trình khoáng hóa xương và hoạt hóa các phản ứng với các tế bào tạo xương Strontium góp phần vào quá trình khoáng hoá và bảo vệ quá trình vôi hóa Fluorine, hiện diện từ 1,25-2,5 lần trong san hô khi so sánh với xương, giúp hình thành xương thông qua tác động của nó đối với sự phát triển của nguyên bào xương

Sự khác biệt chính giữa san hô tự nhiên và xương người là do các thành phần hữu cơ và các thành phần khoáng chất [161] Một phần ba tổng trọng lượng xương người được tạo thành bởi các thành phần hữu cơ trong khi hàm lượng hữu cơ khô trong san hô được giới hạn từ 1-1,5% Các thành phần khoáng chất của xương chủ yếu là hydroxyapatite và calcium phosphat kết hợp với calcium cacbonat trong khi

đó ở san hô chủ yếu là calcium cacbonat

16.1.2 Cấu trúc và độ xốp của san hô

San hô tự nhiên có cấu trúc xốp nhờ đó tạo ra diện tích trao đổi bề mặt đáng

kể Kích thước và sự kết nối của các lỗ san hô đã được chứng minh là yếu tố quan trọng trong tỷ lệ hấp thu san hô và trong quá trình tái tạo xương [36],[41],[52],[89]

Trong tất cả các loài san hô thì Porites sp., Goniopora sp., Montasrea sp., Acropora sp thường được chọn vì chúng có kích thước lỗ xốp phù hợp cho việc

ghép xương Cấu trúc xốp của các loài san hô kể trên được đánh giá là tương tự như xương xốp ở người Độ xốp của chúng chiếm 50-75% về thể tích trong khi ở xương xốp của người là 75% [97]

Độ xốp của san hô phụ thuộc vào từng loài và chịu ảnh hưởng nhiều bởi các tính chất vật lý của mảnh ghép Độ xốp thấp thì mảnh san hô ghép cứng chắc hơn nhưng khi ghép vào xương chủ thì quá trình tạo xương mới và tái hấp thu san hô ban đầu chỉ xảy ra xung quanh nền ghép, mảnh ghép sẽ tồn tại cùng với xương chủ một thời gian dài mới được thay thế hết, tương tự như trong trường hợp ghép xương

vỏ Tuy nhiên việc mảnh san hô ghép chậm thoái biến có thể gây ra phản ứng đáp ứng miễn dịch của cơ thể [105] Nếu độ xốp quá cao thì mảnh san hô ghép sẽ bị tiêu hút nhanh chóng nhưng xương mới thì chưa kịp thay thế Vấn đề quan trọng nữa đối với mảnh ghép san hô là sự liên thông đa chiều giữa các lỗ xốp Do cấu trúc đặc biệt của các calyx mà các loài san hô thường có cấu trúc lỗ liên thông Nhờ đó mà sự tạo xương và hủy san hô mới dễ dàng xảy ra [70]

Các đặc tính rỗng của loài san hô Porites lutea được chúng tôi nghiên cứu

định lượng bằng kỹ thuật đo hình thái Kết quả đo chiều rộng các khoang rỗng bằng trắc vi thị kính và tính toán tỷ lệ rỗng dựa trên kích thước thu được trình bày trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Đặc trưng rỗng của san hô Porites lutea

Kích thước lỗ theo mặt cắt ngang (µm, Mean  SE) 198,81  14,92

Tỷ lệ rỗng theo mặt cắt ngang (%) 50,44

Kích thước lỗ theo mặt cắt dọc (µm, Mean  SE) 189,10  11,54

Kích thước lỗ có ý nghĩa quan trọng đối với vật liệu sinh học thay xương chế tạo từ san hô, vì nó quyết định đến khả năng xâm nhập, di chuyển và tăng trưởng của tế bào bên trong vật liệu ghép Theo số liệu bảng 1.2, ta thấy kích thước lỗ trung

bình của Porites lutea ( 200 µm) Kết quả này khá phù hợp với các tài liệu quốc tế Giá trị trung bình kích thước lỗ của chế phẩm Interpore-200 của Hoa Kỳ chế tạo từ

Porites và Interpore-500 chế từ Goniopora tương ứng là 200 và 500 µm [97] Kích thước lỗ xốp của chế phẩm Biocoral của Pháp chế tạo từ Porites là từ 150 - 400 µm

Khi một vật liệu sinh học được cấy ghép vào cơ thể, nó phải đáp ứng được các yêu cầu về chức năng chịu lực Nhiều vật liệu sinh học cho thấy thiếu chỉ tiêu này, điều này giải thích cho việc phải sử dụng các thiết bị cố định cho đến khi có sự liền

lạc giữa bề mặt xương ghép và xương chủ xảy ra Thông thường, san hô Porites

được sử dụng dưới dạng xốp, có tính thoái biến sinh học và được sử dụng chủ yếu dưới dạng các hạt, việc đánh giá đặc tính cơ học sau khi cấy ghép là rất khó khăn Hầu hết các nghiên cứu báo cáo cải thiện đáng kể các tính chất cơ học của các chi sau khi cấy san hô [60],[149]

Vuola và CS đã nghiên cứu cho thấy mẫu san hô Porites hình chữ nhật được

cấy dưới da chuột có bổ sung tủy xương duy trì cường độ nén tương đương với xương xốp cho đến 6 tuần sau khi ghép [76]

Tính toàn vẹn cơ học có thể được duy trì nếu tốc độ hấp thụ san hô phù hợp với tốc độ hình thành xương ở vị trí cấy ghép Trong thực tế, san hô bị thoái biến ở các tốc độ khác nhau phụ thuộc vào loài động vật, phụ thuộc vào vị trí cấy ghép và loại mô được ghép Việc cấy ghép một mẫu san hô mà không có những hiểu biết nhất định về hoạt động hấp thụ của nó có thể dẫn đến kết quả ghép thất bại hoàn toàn, đặc biệt là các vị trí ghép cần chịu lực cơ học cao

1.6.1.4 Đặc tính cảm ứng tạo xương

Đặc điểm về cấu trúc, độ xốp, sự nối kết liên thông của các lỗ và các thành phần cấu tạo của san hô tự nhiên tạo ra khả năng cảm ứng tạo xương của chúng và làm cho nó phù hợp với việc tái tạo mô cứng

Khả năng cảm ứng tạo xương của san hô xốp phù hợp cho tế bào bám dính và tăng trưởng bên trong giá thể san hô, đặc biệt hỗ trợ tốt cho các tế bào có đặc tính bám dính khi tăng trưởng [53],[77],[96] Sự khởi đầu xâm nhập vào san hô bởi các

tế bào máu và tủy xương cùng với việc tạo mạch là một yếu tố quyết định khởi đầu cho việc tái tạo mô xương trong một quá trình phát triển phức tạp [52]

Không chỉ có các tế bào xương mà còn có các tế bào từ các mô khác đã được quan sát thấy hiện diện trong mẫu san hô ghép Tuy nhiên, vẫn còn nhiều tranh cãi

là liệu mô xương được tạo thành do sự tiếp xúc trực tiếp với bộ xương của san hô sau đó sẽ bị cơ thể hấp thụ hay là sự hấp thụ san hô theo sau bởi sự lắng đọng các thành phần của mô xương Một số nhà nghiên cứu có xu hướng đồng ý ở nhận định thứ hai nhưng các nghiên cứu cần tiếp tục được thực hiện để trả lời vấn đề này

1.6.1.5 Đặc tính kích ứng tạo xương

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh san hô không chỉ là một loại vật liệu cảm ứng tạo xương mà còn có khả năng kích ứng tạo xương [19],[76] Các hạt san hô

trộn với collagen đông khô được ghép dưới da chuột bị thoái biến hoặc bị hấp thụ một phần sau 4 tuần ghép, nhưng không có bất kỳ dấu hiệu nào cho thấy xương hoặc sụn được tạo thành Tương tự như vậy, ghép san hô vào mô cơ chuột và các hạt san hô cấy vào các mô liên kết vòm miệng lợn nhỏ cho thấy thiếu khả năng tạo xương [122]

1.6.1.6 Khả năng tạo xương

Khả năng tạo xương của các tế bào tủy xương đã được báo cáo bởi nhiều tác giả với một số vật liệu ghép thay xương được sử dụng làm giá thể [62] Fricain và

CS cho thấy khối san hô Porites có thể đáp ứng vai trò như một giá thể cho sự bám

dính, tăng trưởng, di chuyển và biệt hóa của các tế bào tủy xương người [77]

Tương tự như vậy, quá trình tạo xương cũng xảy ra khi ghép mảnh san hô Porites

có bổ sung tủy xương được ghép vào bên trong mô cơ của chuột [76] Việc bổ sung các tế bào tủy xương (108 tế bào) trên các vòng san hô Porites cho thấy cải thiện khả

năng hòa nhập và thay thế hiệu quả của vật liệu ghép bởi mô xương chủ trong mô hình nghiên cứu dùng để điều trị các khuyết hổng xương trụ được tạo ra trên mô

hình thỏ [139] Một điều đáng ngạc nhiên là các hạt san hô Porites (kích thước từ

630-1000 µm) được ghép cùng với tế bào tủy xương (2×107 tế bào) ở các khuyết hổng vòm sọ được tạo ra trên mô hình chuột không thấy có sự cải thiện quá trình hình thành xương một cách có ý nghĩa khi so sánh với trường hợp chỉ ghép san hô 2 tháng sau ghép [60] Trường hợp này có thể được giải thích bởi thực tế là việc tu sửa xương có thể đã xảy ra trong cả hai trường hợp sau một khoảng thời gian khá dài sau ghép, do đó khó phát hiện hiệu quả có thể có của việc bổ sung các tế bào tủy xương vào trong mẫu san hô được ghép Nhìn chung, tất cả các nhóm nghiên cứu đồng ý rằng việc hấp thụ san hô gia tăng đáng kể khi có sự bổ sung các tế bào tủy xương

1.6.1.7 Tính tương hợp sinh học

Nhiều nghiên cứu đã được báo cáo về tính tương hợp sinh học của san hô cả

trong điều kiện nghiên cứu in vitro và in vivo Tế bào xương ở mô xương vòm sọ

của chuột [84] và các tế bào tủy xương người [77] được nuôi trên san hô từ các nghiên cứu khác nhau đã chứng minh khả năng bám dính, lan tỏa, tăng trưởng và biệt hóa trên bề mặt san hô của các tế bào xương Các nghiên cứu của các tác giả như Begley và CS [31] với nguyên bào xương người được nuôi cấy trên san hô chứng minh có sự tương đồng về độ tương hợp sinh học và tương hợp về tế bào của san hô, mặc dù sự tăng trưởng tế bào chậm hơn lúc bắt đầu nuôi với mật độ tế bào (1,25×104 tế bào/cm2) so với giá thể là xương khử khoáng (2,5×104 tế bào/cm2) Các nghiên cứu khác đã chỉ ra san hô cũng hỗ trợ tốt cho sự tăng trưởng của các

nguyên bào sợi, đại thực bào và tế bào sụn trong điều kiện in vitro [53],[80],[96]

Các nghiên cứu ghép san hô vào mô dưới da chuột [31],[81],[82],[127], mô liên kết ở vòm miệng của heo [122], khuyết hỗng ở ổ răng và một loạt các ứng dụng

về thay thế hay tái tạo mô xương của san hô trong một số loài động vật cho thấy khả năng phát triển thành mô xương mà không gây ra các phản ứng miễn dịch hoặc các phản ứng viêm nghiêm trọng nào xảy ra Các kết quả nghiên cứu cũng đã báo cáo

về các trường hợp thực hiện trên lâm sàng ở người, trong một số trường hợp sau hơn 5 năm ghép mẫu san hô nhưng không cho thấy có các biểu hiện bất thường nào

về tính tương hợp sinh học của mảnh ghép

1.6.1.8 Đặc tính thoái biến sinh học

Ban đầu, san hô tự nhiên được thoái biến và thay thế bằng một lớp giàu calcium phosphate xung quanh Sự thay thế này có lẽ là do tổng hợp của hai quá trình hòa tan – lắng đọng trực tiếp và qua trung gian tế bào với kết quả là lớp bề mặt của mảnh ghép bị biến đổi thành một lớp giàu calcium phosphate [137] Tổng thời gian để mảnh san hô được thay thế hoàn toàn tùy thuộc vào kích thước mảnh ghép,

vị trí ghép (xương xốp hay xương đặc) cũng như cấu trúc xốp của san hô [47],[86]