Nghiên cứu bệnh virus khảm lùn ngô (sugarcane mosaic virus scmv) tại vùng chương mỹ, đan phượng (hà nội) và sản xuất kháng huyết thanh chẩn đoán bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---  --- TRẦN THỊ THANH BÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUS KHẢM LÙN NGÔ SUGARCANE MOSAIC VIRUS - SCMV TẠI VÙNG CHƯƠNG MỸ, ðAN PHƯỢ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-


 -

TRẦN THỊ THANH BÌNH

NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUS KHẢM LÙN NGÔ

(SUGARCANE MOSAIC VIRUS - SCMV)

TẠI VÙNG CHƯƠNG MỸ, ðAN PHƯỢNG (HÀ NỘI)

VÀ SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH CHẨN ðOÁN BỆNH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT

Mã số : 62.62.10.01

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS VŨ TRIỆU MÂN

Hà Nội, 2012

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Kết quả nghiên cứu trong luận án là kết quả lao ñộng của chính tác giả Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận án này

ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận án

Trần Thị Thanh Bình

LỜI CẢM ƠN

để hoàn thành ựề tài luận án tôi ựã nhận ựược rất nhiều sự quan tâm giúp ựỡ nhiệt tình của cơ quan, thầy cô, bạn bè và người thân

Tôi xin ựược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy GS.TS Vũ Triệu Mân

ựã tận tình hướng dẫn, giúp ựỡ tôi trong quá trình thực hiện ựề tài và hoàn thành bản luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Hà Viết Cường, ThS Trần Thị Như Hoa, Trung tâm Bệnh cây nhiệt ựới - Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội và các cán bộ trong Trung tâm ựã hướng dẫn, hỗ trợ phương tiện và kỹ thuật, tạo ựiều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện các thắ nghiệm

Tôi xin ựược gửi lời chân thành cảm ơn tới TS Trần Nguyễn Hà, PGS.TS Ngô Bắch Hảo và các thầy cô giáo Bộ môn Bệnh cây và Khoa Nông học ựã ựóng góp nhiều ý kiến quý báu ựể luận án ựược hoàn thiện

Tôi xin ựược gửi lời chân thành cảm ơn ựến các thầy cô trong Ban giám hiệu, Viện đào tạo Sau ựại học ựã tận tình giúp ựỡ tôi hoàn thành các thủ tục bảo vệ luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám ựốc Viện nghiên cứu ngô, TS Lê Văn Hải, KS Nguyễn Văn Vượng và các cán bộ nhân viên bộ môn Hệ thống canh tác và bộ môn Bảo vệ thực vật Viện Nghiên cứu ngô ựã tạo ựiều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện các thắ nghiệm ựồng ruộng trong suốt thời gian thực hiện ựề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, NGUT.TS Phạm Thanh Hải Ờ Hiệu trưởng Trường Cao ựẳng Nông nghiệp và PTNT Bắc Bộ, các ựồng nghiệp, tất cả người thân, bạn bè những người luôn bên cạnh ựộng viên giúp ựỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện bản luận án này

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

Tác giả luận án

Trần Thị Thanh Bình

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH xi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xiv

MỞ ðẦU 1

1 Tính cấp thiết của ñề tài 1

2 Mục ñích và yêu cầu 2

2.1 Mục ñích 2

2.2 Yêu cầu 2

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

4 Những ñóng góp mới của ñề tài 3

5 ðối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

5.1 ðối tượng nghiên cứu 3

5.2 Phạm vi nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Cơ sở khoa học của ñề tài 4

1.2 Những nghiên cứu ngoài nước 4

1.2.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới 4

1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh virus hại ngô trên thế giới 5

1.2.3 Giới thiệu chung về chi Potyvirus 24

1.2.4 Phương pháp hiển vi ñiện tử 27

1.2.5 Phương pháp kháng huyết thanh 27

1.2.6 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 31

1.2.7 Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction) 31

1.3 Những nghiên cứu trong nước 32

1.3.1 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam 32

1.3.2 Những nghiên cứu về bệnh virus hại ngô ở Việt Nam 34

1.3.3 Phân loại SCMV ở Việt Nam 37

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Vật liệu nghiên cứu 39

2.1.1 Mẫu giống ngô, cây thí nghiệm và côn trùng môi giới 39

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất nghiên cứu 40

2.2 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 40

2.2.1 Thời gian 40

2.2.2 ðịa ñiểm nghiên cứu 41

2.3 Nội dung nghiên cứu 41

2.4 Phương pháp nghiên cứu 41

2.4.1 Phương pháp hiển vi ñiện tử 41

2.4.2 Phương pháp kháng huyết thanh 41

2.4.3 Phương pháp xác ñịnh virus bằng RT-PCR 43

2.4.4 Phương pháp làm tinh khiết virus SCMV 45

2.4.5 Phương pháp ñiều tra ngoài ñồng 48

2.4.6 Phương pháp xác ñịnh sự lan truyền của virus khảm lùn ngô (SCMV) bằng tiếp xúc cơ học 49

2.4.7 Phương pháp xác ñịnh sự lan truyền của virus khảm lá ngô (SCMV) bằng côn trùng môi giới 51

2.4.8 Phương pháp ñánh giá ảnh hưởng của virus khảm lùn cây ngô (SCMV) ñến một số chỉ tiêu sinh trưởng phát triển của ngô 52

2.4.9 Phương pháp sản xuất và thử nghiệm kháng huyết thanh virus

SCMV 53

2.4.10 Phương pháp tính và xử lý số liệu 55

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 56

3.1 Xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh khảm lùn ngô 56

3.1.1 Mô tả triệu chứng bệnh virus khảm lùn ngô 56

3.1.2 Phương pháp hiển vi ñiện tử 60

3.1.3 Kiểm tra một số loại virus gây hại ngô ngoài ñồng tại các vùng khác nhau, vụ xuân 2009 - 2010 bằng phương pháp ELISA gián tiếp 63

3.1.4 Kiểm tra virus khảm lùn ngô (SCMV) vụ xuân 2010 - 2011 bằng phương pháp RT- PCR 65

3.2 Kết quả nghiên cứu về ñặc ñiểm lan truyền của virus SCMV 66

3.2.1 Khả năng lan truyền của virus SCMV bằng phương pháp tiếp xúc cơ học 66

3.2.2 Khả năng lan truyền của virus SCMV bằng côn trùng môi giới (rệp cờ ngô Rhopalosiphum maidis) 68

3.2.3 Khả năng lan truyền của virus SCMV qua tiếp xúc cơ học từ nguồn hạt cây nhiễm bệnh 70

3.3 ðiều tra bệnh virus khảm lùn ngô ngoài ñồng tại ðan Phượng và Chương Mỹ (Hà Nội) 73

3.3.1 ðiều tra bệnh khảm lùn ngô ngoài ñồng 73

3.3.2 Ảnh hưởng của bệnh ñến các chỉ tiêu sinh trưởng và năng

suất ngô 95

3.3.3 Ảnh hưởng của bệnh virus tới hàm lượng diệp lục và thành phần hoá sinh hạt ngô 100

3.3.4 Ảnh hưởng của bệnh ñến các yếu tố cấu thành năng suất ngô 101

3.4 Thử nghiệm tạo kháng huyết thanh ñặc hiệu virus SCMV 105

3.4.1 Giới thiệu 1053.4.2 Tinh chiết virus 1063.4.3 Kiểm tra sự có mặt của kháng thể SCMV trong cơ thể thỏ thí

nghiệm sau các tuần tiêm 1083.4.4 Thực hiện ñiều kiện phản ứng với kháng huyết thanh virus

SCMV ñã tạo ñược 1113.4.5 Kiểm tra sự có mặt của virus SCMV gây hại trên các bộ phận

4 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 1264.1 Kết luận 1264.2 ðề nghị 127DANH MỤC CÔNG TRÌNH ðà CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ðẾN

LUẬN ÁN 128TÀI LIỆU THAM KHẢO 129PHỤ LỤC 138

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng ngô trên thế giới từ năm 1961-2010 51.2 Phân loại họ Potyviridae (Berger et al 2005) 251.3 Diện tích, năng suất, sản lượng ngô Việt Nam từ năm 1961 - 2010 33

ngoài ñồng, vụ xuân 2009 - 2010 bằng phương pháp ELISA gián tiếp 643.2 Kết quả kiểm tra virus khảm lùn ngô (SCMV) bằng phương

pháp RT-PCR 65

dại bằng phương pháp tiếp xúc cơ học 67

cờ ngô Rhopalosiphum maidis 69

3.5 Kết quả xác ñịnh khả năng lan truyền của virus SCMV bằng

phương pháp tiếp xúc cơ học từ nguồn hạt nhiễm bệnh 70

xã Thủy Xuân Tiên – Chương Mỹ - Hà Nội vụ xuân các năm

2007 ñến 2010 74

ðồng Tháp - ðan Phượng - Hà Nội vụ xuân các năm 2007 ñến 2010 763.8 Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô trên bộ giống trung ngày

(Viện Nghiên cứu Ngô, vụ xuân 2007) 783.9 Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô trên bộ giống trung ngày

(Viện Nghiên cứu Ngô, vụ xuân 2008) 80

3.10 Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô trên bộ giống trung ngày

(Viện Nghiên cứu Ngô, vụ xuân 2009) 823.11 Tỷ lệ bệnh virus SCMV hại ngô trên bộ giống trung ngày

(Viện Nghiên cứu Ngô, vụ xuân 2010) 843.12 Tình hình bệnh khảm lùn ngô SCMV hại ngô trên bộ giống

trung ngày (Viện Nghiên cứu Ngô, vụ thu 2007) 863.13 Tình hình bệnh khảm lùn ngô trên bộ giống trung ngày

Viện Nghiên cứu Ngô, vụ thu 2008 883.14 Tình hình bệnh virus hại ngô trên bộ giống trung ngày (Viện

Nghiên cứu Ngô, vụ thu 2009) 903.15 Tình hình bệnh khảm lùn ngô SCMV hại ngô trên bộ giống

trung ngày tại Viện Nghiên cứu Ngô, vụ thu 2010 92

Phượng (Hà Nội) vụ xuân 2008 94

trưởng của giống ngô LVN 10 96

trưởng của giống ngô LVN 14 97

trưởng của giống ngô LVN 99 98

trưởng của giống ngô KK 159 99

lục lá và thành phần hoá sinh của hạt ngô LVN 10 100

thành năng suất trên các giống ngô LVN 10 102

3.23 Ảnh hưởng của bệnh khảm lùn ngô SCMV tới các chỉ tiêu cấu

thành năng suất trên các giống ngô LVN 14 103

thành năng suất trên các giống ngô LVN 99 104

thành năng suất trên các giống ngô KK 159 1053.26 Kiểm tra ELISA hàm lượng virus SCMV trong các sản phẩm

thu ñược trong quá trình tinh chiết virus (Tại phòng thí nghiệm

Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây Nhiệt ñới – Trường ðH Nông

nghiệp Hà Nội) 1073.27 Kiểm tra sự có mặt của kháng thể SCMV trong cơ thể thỏ

thí nghiệm sau các tuần tiêm tại khu thí nghiệm nhà lưới Trung

tâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt ñới 109

thanh virus SCMV tại phòng thí nghiệm Trung tâm nghiên cứu

bệnh cây Nhiệt ñới 1113.29 Kết quả xác ñịnh ngưỡng pha loãng kháng huyết thanh

virus SCMV 1143.30 Kết quả thử nghiệm dùng dịch cây khoẻ hấp phụ chéo và

không dùng dịch cây khoẻ hấp phụ chéo 115

tâm và dùng dịch cây khoẻ hấp phụ chéo không ly tâm 117

thanh virus SCMV 118

3-4 lá 119

3.34 Kiểm tra nồng độ virus SCMV trên các bộ phận cây ngơ trỗ cờ

đĩng bắp 120

cây ngơ 1213.36 Kiểm tra nồng độ virus SCMV trên cây ký chủ 1223.37 So sánh nồng độ virus SCMV trên các độ tuổi của rệp cờ ngơ

Rhopalosiphum maidis và các loại đệm chiết 122

thanh SCMV của hãng Agdia (Mỹ) nhập nội trên tập đồn giống của Viện Nghiên cứu Ngơ 124

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Phân tích phát sinh chủng loại của các chuỗi protein axit amin ở

chủng SCMV (nguồn Chen et al.,2002) 24

1.2 Hình thái virion và thể vùi của potyvirus 26

1.3 Các kỹ thuật ELISA khác nhau (Hull, 2002) 30

2.1 Sơ ñồ tinh khiết virus Sugarcane mosaic virus - SCMV 46

3.1 Bệnh khảm lùn ngô do SCMV triệu chứng toàn cây 58

3.2 Bệnh khảm lùn ngô do SCMV triệu chứng trên lá 58

3.3 Bệnh khảm lùn ngô do virus SCMV trên lá ngô 59

3.4 Sợi virus SCMV sau khi ñã ñược làm tinh khiết từ mẫu thu ñược ở Huyện Chương Mỹ – Hà Nội 61

3.5 Thể vùi của virus nằm trong tế bào lá ngô tại Chương Mỹ - Hà Nội 61

3.6 Thể vùi của virus nằm trong tế bào lá mía tại ðan Phượng - Hà Nội 62

3.7 Tiểu thể phytoplasma trên cây ngô nhiễm bệnh thu tại Lạng Sơn 62

3.8 Các thể virus ở cây ngô bị nhiễm bệnh lùn sọc ñen thu tại

Nghệ An 63

3.9 Kết quả kiểm tra SCMV bằng phương pháp RT-PCR trên một số mẫu ngô, mía, cỏ thu thập ngoài ñồng vụ xuân 2011 66

3.10 Triệu chứng nhiễm virus SCMV trên giống thuốc lá

N Tabacum cv xanthi-nc 71

3.11 Triệu chứng nhiễm virus SCMV trên giống thuốc lá

N Tabacum cv White Burley 71

3.12 Triệu chứng nhiễm virus SCMV trên giống thuốc lá N.tabacum cv samsun, 71

3.13 Triệu chứng nhiễm virus SCMV trên giống mía ñỏ 71

3.14 Triệu chứng nhiễm virus SCMV trên giống ngô KK 159 71

3.15 Triệu chứng nhiễm virus SCMV trên giống ngô LVN 14 71

3.16 Triệu chứng nhiễm virus SCMV trên cây Hoàng Tinh 72

3.17 Triệu chứng nhiễm virus SCMV trên cây mía 72

3.18 Lây bệnh nhân tạo bằng rệp ngô Rhopalosiphum maidis

trên cây ngô 72

3.19 Lây bệnh nhân tạo bằng rệp ngô Rhopalosiphum maidis trên cây thuốc lá N tabacum cv White Burley 72

3.20 Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh (%) trên giống ngô LVN 4 tại xã Thủy Xuân Tiên - Chương Mỹ - Hà Nội 75

3.21 Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh (%) trên giống ngô LVN 4 tại xã ðồng Tháp - ðan Phượng - Hà Nội 77

3.22 Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện Nghiên cứu Ngô, vụ xuân 2007 79

3.23 Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện Nghiên cứu Ngô, vụ xuân 2008 81

3.24 Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện Nghiên cứu Ngô, vụ xuân 2009 83

3.25 Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện Nghiên cứu Ngô, vụ xuân 2010 85

3.26 Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện Nghiên cứu Ngô, vụ thu 2007 87

3.27 Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện Nghiên cứu Ngô, vụ thu 2008 89

3.28 Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện Nghiên cứu Ngô, vụ thu 2009 91

3.29 Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh trên bộ giống trung ngày Viện Nghiên

cứu Ngơ, vụ thu 2010 933.30 Tỷ lệ cây bị rệp và tỷ lệ bệnh virus tại Chương Mỹ và ðan

Phượng (Hà Nội) vụ xuân 2008 94

3.31 Rệp cờ ngơ Rhopalosiphum maidis hại ngơ 953.32 Sản phẩm kháng huyết thanh virus SCMV tạo được 1083.33 ELISA kiểm tra sự cĩ mặt kháng thể virus SCMV trong kháng

huyết thanh 1103.34 ELISA đánh giá độ hịa lỗng của kháng huyết thanh 1103.35 Kiểm tra SCMV trên ngơ, cao lương, cỏ voi 1253.36 Kết quả kiểm tra ELISA trên tập đồn giống ngơ ở Viện Nghiên

cứu Ngơ ðan Phượng, Hà Nội 1253.37 Kết quả kiểm tra ELISA trên rệp hại ngơ Viện Nghiên cứu Ngơ

ðan Phượng, Hà Nội 125

19 DAS – ELISA Double antybody sandwich

25 IgG Immuno gama Globulin

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Ngô là một trong các cây lương thực quan trọng, góp phần nuôi sống khoảng 1/3 dân số trên thế giới Diện tích trồng ngô trên thế giới năm 2010 ñạt khoảng 159,32 triệu ha, năng suất 5,24 tấn/ha và sản lượng ñạt 853,03 tấn (FAO STAS, USAD 2010) [59] Những nước trồng ngô chính ở trên thế giới

là Hoa Kỳ, Trung Quốc và Brazil Gần ñây bắp ngô bao tử ñược coi như một loại thực phẩm cao cấp

Ở Việt Nam, cây ngô ñược trồng cách ñây khoảng 300 năm (Ngô Hữu Tình và CTV, 1997) [33] Ngô là cây lương thực thứ hai sau cây lúa, ñược trồng nhiều ở các tỉnh như Sơn La, Hà Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng, Hòa Bình, Hà Nội, Thanh Hóa, Nghệ An, Lâm ðồng, ðắc Lắc, ðắc Nông, Ninh Thuận, Bình Thuận, ðồng Nai, An Giang, ðồng Tháp Diện tích trồng ngô ở Việt Nam ngày càng tăng Năm 1990 diện tích ñạt 432.000 ha, sản lượng 671 tấn/ha và năng suất ñạt 1,55 tấn/ha Năm 2010 diện tích 1.126.900 ha, sản lượng 4,6 tấn/ha và năng suất ñạt 4,09 tấn/ha (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2011) [4]

Tuy vậy, sản lượng ngô trong nước vẫn chưa ñáp ứng ñủ nhu cầu hàng năm nước ta còn phải nhập khẩu ngô (trị giá trên 500 triệu USD) ñể sản xuất thức ăn gia súc Cây ngô ngày càng có vai trò quan trọng ở nước ta

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt ñới gió mùa trong năm có mùa ñông lạnh ở phía Bắc ñây là ñiều kiện ñể bệnh virus hại ngô ở Việt Nam phát triển phong phú về số lượng và chủng loại Bệnh virus ngô ñã gây ra những thiệt hại và là mối ñe dọa cho nghề trồng ngô trong một tương lai không xa Bệnh virus gây thoái hóa dẫn ñến tàn lụi cây ngô có thể hủy diệt những diện tích nhỏ trong sản xuất Bệnh làm giảm năng suất và phẩm chất ngô hạt

Bệnh khảm lùn ngơ do virus Sugarcane mosaic virus - SCMV gây là

bệnh virus phổ biến trên ngơ và mía ở Việt Nam Cây ngơ bị bệnh cĩ triệu chứng khảm rất dễ nhận biết Tồn cây bị biến dạng, lùn thấp, cây cĩ thể ra bắp hoặc khơng ra bắp nhưng nếu cĩ bắp thì bắp teo lép, nhỏ, ngắn ảnh hưởng rất lớn đến năng suất và sản lượng ngơ Xuất phát từ tình hình trên, thực hiện

đề tài: “Nghiên cứu bệnh virus khảm lùn ngơ (Sugarcane mosaic virus -

SCMV), tại vùng Chương Mỹ, ðan Phượng (Hà Nội) và sản xuất kháng huyết thanh chẩn đốn bệnh”

- Xác định virus gây bệnh khảm lùn ngơ

- Nghiên cứu khả năng lan truyền của virus gây bệnh

- Xác định triệu chứng bệnh trên ngơ và điều tra mức độ phổ biến của virus gây bệnh trên đồng ruộng

- Sản xuất kháng huyết thanh chẩn đốn bệnh hại

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

3.1 Ý nghĩa khoa học

Virus khảm lùn ngơ là virus gây hại nặng ở nhiều nước trên thế giới; virus cũng là bệnh gây hại phổ biến trên cây ngơ ở nước ta Việc nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh và sản xuất kháng huyết thanh chẩn đốn cĩ ý nghĩa khoa học giúp bổ sung tài liệu về danh mục bệnh virus ở Việt Nam Kết quả của đề tài cũng giúp cho việc xác định biện pháp phịng trừ bệnh

cĩ hiệu quả

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu virus gây bệnh khảm lùn giúp bước đầu phát hiện, mơ tả các dạng triệu chứng bệnh khảm lùn, để làm cơ sở cho phân biệt với các dạng triệu chứng khác do virus gây ra trên cây ngơ

Sản xuất kháng huyết thanh nhằm sử dụng dùng trong chẩn đốn, phát hiện nhanh nguyên nhân gây bệnh và chọn lọc giống ngơ nhằm tạo các giống ngơ sạch bệnh, kháng bệnh do virus khảm lùn ngơ gây ra

4 Những đĩng gĩp mới của đề tài

Bổ sung thêm các kết quả nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh khảm lùn ngơ ở Việt Nam

Lần đầu tiên đã sản xuất được kháng huyết thanh chẩn đốn nhanh

bệnh virus khảm lùn ngơ (Sugarcane mosaic virus - SCMV)

5 ðối tượng và phạm vi nghiên cứu

5.1 ðối tượng nghiên cứu

5.2 Phạm vi nghiên cứu

- ðề tài tiến hành từ năm 2007 đến năm 2011

- Nghiên cứu khả năng lan truyền của virus khảm lùn ngơ

- Xác định nguyên nhân gây bệnh virus khảm lùn ngơ

- Tìm hiểu một số tác hại và mức độ phổ biến của bệnh virus khảm lùn ngơ

- Nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh chẩn đốn nhanh bệnh virus khảm lùn ngơ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở khoa học của đề tài

Bệnh khảm lùn là bệnh phổ biến trên ruộng ngơ, bệnh đã là một trong những nguyên nhân làm giảm năng suất, chất lượng ngơ ở Việt Nam Ở nước ta chưa cĩ nhiều nghiên cứu về bệnh khảm lùn ngơ, các nghiên cứu trước đây chưa xác định đầy đủ được nguyên nhân gây bệnh, chúng ta cũng chưa nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh dùng trong chẩn đốn bệnh Việc chẩn đốn, xác định chính xác nguyên nhân bệnh cịn gặp rất nhiều khĩ khăn do triệu chứng bệnh do các lồi virus gây ra trên ngơ nhiều khi khơng phân biệt

rõ ràng Sự thiếu hụt các thơng tin về nguyên nhân gây bệnh, phương thức lan truyền của bệnh, phương pháp xác định nhanh, chính xác được bệnh là những nhân tố hạn chế việc xây dựng các giải pháp quản lý bệnh trên đồng ruộng.Nghiên cứu xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh, con đường lan truyền của bệnh và thử nghiệm chế tạo kháng huyết thanh để chẩn đốn nhanh bệnh là điều cần thiết Kết quả của các nghiên cứu này sẽ là cơ sở để xây dựng thành cơng các biện pháp phịng trừ, quản lý bệnh, gĩp phần phát triển sản xuất ngơ bền vững ở nước ta

1.2 Những nghiên cứu ngồi nước

1.2.1 Tình hình sản xuất ngơ trên thế giới

Cây ngơ là một trong bốn loại cây lương thực chính của thế giới: Ngơ

(Zea mays L.), lúa nước (Oryza sativa L.), lúa mì (Triticum sp.), sắn (Manihot

esculenta Crantz) Trong đĩ, ba loại cây gồm ngơ, lúa gạo và lúa mì chiếm

khoảng 87% sản lượng lương thực tồn cầu và khoảng 43% calori từ tất cả mọi lương thực, thực phẩm Trong ba loại cây này, ngơ là cây trồng cĩ sự tăng trưởng mạnh cả về diện tích, năng suất, sản lượng

Vào năm 1961, năng suất ngô trung bình của thế giới chỉ xấp xỉ 2

tấn/ha, năm 2010 tăng gấp hơn 2,5 lần (ñạt 5,24 tấn/ha), sản lượng ñã tăng

hơn 4 lần từ 204 triệu tấn lên 853,03 triệu tấn, diện tích tăng hơn 1,5 lần từ

104 triệu lên 159,32 triệu hecta

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng ngô trên thế giới

từ năm 1961 - 2010

(1000 ha)

Năng suất (tấn/ha)

Sản lượng (1000 tấn)

Trong sản xuất ngô của thế giới, Hoa Kỳ là nước sản xuất gần 50%

tổng sản lượng, còn lại là do các nước khác sản xuất Sản lượng ngô xuất

khẩu trên thế giới trung bình hàng năm khoảng trên 80 triệu tấn Trong ñó,

Hoa Kỳ luôn là nước xuất khẩu chiếm trên 50% có khi tới 60% tổng số và các

nước khác chỉ là 40 - 45% ( FAOSTAST, 2010) [59]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh virus hại ngô trên thế giới

Virus hại ngô là một trong những bệnh gây hại nghiêm trọng cho cây

ngô, có thể làm giảm năng suất ngô từ 15 - 30% phụ thuộc vào tuổi cây lúc

lây nhiễm, ñiều kiện sinh thái, canh tác, giống ngô (Wilidins, Gordon and Nauled - 1967) [89] Ở một số nước Châu Phi bệnh virus ngô gây thiệt hại tới 25% năng suất ngô Ở Trung Quốc bệnh virus ngô gây thiệt hại từ 20 - 80% năng suất ngô Bệnh gây thoái hóa giống, ảnh hưởng ñến phẩm chất, làm

giảm giá trị thương phẩm của cây ngô (Chen et al, 2002) [47]

Hiện nay trên thế giới theo tổ chức phân loại virus ICTV (International Comittee on Taxonomy of Viruses) và theo Van Regenmortel và CTV (2000) [85]; Van Regenmortel và CTV (2002) [86] có 12 bệnh virus hại ngô ñã ñược phân loại ñó là:

- Maize chlorotic dwarf virus (MCDV) họ Secoviridae

- Maize chlorotic mottle virus (MCMV) họ Tombusviridae

- Maize dwarf mosaic virus (MDMV) họ Potyviridae

- Maize mosaic virus (MMV) họ Rhabdoviridae

- Maize rayado fino virus (MRFV) họ Marafiviruses

- Maize rough dwarf virus (MRDV) họ Reoviridae

- Maize stem borer virus (MSBV) Unassignedviruses

- Maize sterile stunt virus (MSSV) họ Rhabdoviridae

- Maize streak virus (MSV) họ Geminiviridae

- Maize strip virus (MStpV) thuộc Bunyaviridae

- Maize white line mosaic satellite virus (MWlMV) thuộc Satelliteviruses

- Maize white line mosaic virus (MWLMV) họ Unassignedviruses

Trong ñó có nhiều bệnh phổ biến ở các vùng trồng ngô thế giới có thể kể một số bệnh virus chính hại cây ngô sau:

1.2.2.1 Virus gây bệnh khảm lá ngô (Maize mosaic virus)

Lịch sử nghiên cứu: Bệnh ñược Kunkel phát hiện, quan sát và mô tả lần ñầu tiên vào năm 1921 và tiếp tục nghiên cứu vào những năm tiếp theo 1921,1922,1927 tại Hawaii (Herold, Munz ,1967a) [69]

Virus còn có tên gọi khác là:

- Corn mosaic virus

- Corn yellow stripe virus

- Corn stripe virus

Ở Ấn độ, từ những năm 1952 bệnh khảm lá ngô ựã ựược Chona và Seth quan sát thấy trên các ruộng thắ nghiệm của Viện nghiên cứu Nông nghiệp Ấn độ đến năm 1962 - 1964, qua quá trình nghiên cứu người ta tìm thấy bệnh ở hầu hết các ựịa phương trồng ngô của Ấn độ (Chona và Seth , 1952) [56]

Qua một số tài liệu cho thấy rằng bệnh khảm lá ngô có phân bố ựịa lý ở: Hawaii (Kunkel, 1921); CuBa (Sahl, 1927); Trinidad (Briten - Joné, 1933); Tanzania (Storey, 1933); Puero Rico (Cook, 1936a, 1936b); Mauritius (Orian, 1954); Surinam (Van Hoof, 1960); Venazuena (Herold, 1963); Ấn độ (Cherian

và Kylasam, 1936) và một số nước đông Nam Á Bệnh xuất hiện nhiều nhất ở quần ựảo Caribê [56]

Nguyên nhân gây bệnh: Năm 1976, Lastra phát hiện ra hai chủng của MMV ñó là:

+ MMV - RF gây các sọc chạy dọc gân lá với mật ñộ 13 - 15 sọc/cm + MMV - RG gây các sọc chạy dọc gân lá với mật ñộ 1 - 3 sọc/cm Người ta cũng xác ñịnh ñược hình dạng, kích thước của virus Virus gây bệnh khảm lá ngô có hình ñầu ñạn, kích thước biến ñộng 48 x 242 hay 90 x 225

nm (Lastra, 1976) [56]

Sự lan truyền của bệnh: Bệnh lan truyền do một loài rầy xanh trên ngô có

tên là Peregrinus maidis rầy ñực không truyền ñược bệnh nhưng chỉ chiếm từ 5

– 23 % trong quần thể, rầy cái truyền bệnh chiếm 77 – 95% trong quần thể

Virus thuộc nhóm bền vững (Persistant), côn trùng mang bệnh tiếp xúc

với cây một ngày hay ít hơn có thể truyền ñược bệnh Trong cơ thể côn trùng thời gian tiềm dục (thời gian ủ bệnh) biến ñộng từ 11 ngày ñến 7 tuần lễ (Herold và Munz, 1965) [68] Thời gian tồn tại của virus trong dịch cây dao ñộng từ 24 - 48 giờ ở nhiệt ñộ 40C ngưỡng pha loãng 1/10 trong nồng ñộ 0,01M phosphate pH = 7,5 (Herold và Munz, 1967a) [69]

Các tác giả cũng xác ñịnh ñược phạm vi ký chủ của virus gồm toàn bộ cây

trồng thuộc họ hòa thảo (Gramineae), tuy nhiên người ta tìm thấy virus xuất hiện

trên cây ngô một cách tự nhiên và ở một số cây trồng, cây dại khác (Van Hoof,

1960) và Setaria vulpiseta (Herold) ðược công bố qua các kết quả thí nghiệm trên cây Euchlena mexicana (Nalaguti, 1963) và Sorghum (Herold) Virus ñược di

chuyển theo ñường dịch cây Virus không truyền qua hạt giống, không truyền qua tiếp xúc cơ học và không truyền qua dây tơ hồng Thời gian cây mẫn cảm nhất khi lây bệnh vào 4 - 6 tuần sau khi hạt nẩy mầm [68] [69]

Theo Sharon và CTV (2005) [79], ñã giải trình tự của 102 dòng vô tính từ một thư viện cDNA xây dựng từ RNA virus ngẫu nhiên ñã ñược biên dịch vào 12.133 nucleotide (nt) bao gồm 97 trình tự trung bình chiều dài 660 bp có

trình tự ựọc bao gồm cả hai sợi Trình tự còn lại ựược xuất phát từ duy nhất (5%) hay (2%) ựọc trên cùng một sợi Ba trong sáu ORFs cho thấy ựiểm tương ựồng ựáng kể ựể các chuỗi protein suy luận của các trình tự nucleocapsid, glycoprotein và polymerase rhabdoviruses khác Trình tự gen

dự ựoán của bộ gen của MMV là 3 -NP-3-MGL-5 ' Giải trình tự bộ gen

MMV mất khoảng 127 giờ

Tác hại: Bệnh khảm lá ngô là một trong những bệnh virus gây thiệt hại lớn tới năng suất ở những vùng trồng ngô Khi so sánh giữa ruộng có 100% cây nhiễm với ruộng có 100% cây khỏe thì thiệt hại về năng suất lên tới 32% (Raychaudhuri, 1976) Ngoài ra bệnh khảm lá ngô còn gây thoái hóa giống, làm giảm phẩm chất nông sản

Phòng trừ: Theo CTAHR tháng 9 năm 2010 [57], khuyến khắch trồng các giống ngô lai kháng bệnh và chia sẻ thông tin rộng rãi về virus gây bệnh này

1.2.2.2 Bệnh khảm sọc lá ngô (Maize streak virus)

Bệnh ựược Storey phát hiện và mô tả lần ựầu tiên năm 1925 là một nhân tố làm giảm năng suất ngô ở Nepal (Storey, 1925) Bệnh ựược ghi nhận nhiều vùng của Châu Phi cho tới tận Ai Cập (Smith, 1957) và ựến năm 1974 Bock, Guthrie và Woods ựã xác ựịnh nguyên nhân gây bệnh và mô tả chi tiết triệu chứng biểu hiện bệnh [52]

Ngoài tên gọi Maize streak virus thì virus gây bệnh còn có tên gọi khác là:

Maize treak monogeminivirus

Maize treak virus A

Maize mottlevirus

Sugarcane streak virus

Bệnh phổ biến ở vùng Nam Châu Phi, các nước quanh sa mạc Sahara, Mauritius và ựảo Madagascas, Ấn độ và vùng đông Nam Á [50]

Nguyên nhân gây bệnh: Năm 1974, Bock, Guthrie, Woods ựã xác ựịnh

ñược hình dạng kích thước của virus Virus có dạng hình cầu hay trái lựu ñạn,

kích thước 20 x 30nm (Bock et al, 1974) [44]

Các thí nghiệm cho thấy virus không truyền theo kiểu tiếp xúc cơ giới, không truyền qua hạt giống và cây tơ hồng mà virus truyền bằng 5 loại rầy:

Cicadulina mbila, C storeyi, C bipunctella, C latens, C parazeae Ngoài ra

virus này có thể truyền qua trứng rầy (Dabrowski, 1987) [50]

Cũng nghiên cứu về bệnh này, Ruppel (1965), Storey, Howland và Prosser (1966) ñã xác ñịnh ñược virus truyền từ 15 giây ñến 1 giờ, thời gian tiềm dục trong côn trùng từ 6 - 12 giờ [50]

Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Bock, Guthric cho biết virus gây bệnh khảm sọc lá ngô có ngưỡng pha loãng là 1/100, nhiệt ñộ làm mất hoạt tính là 600C (Q10 = 600C) và thời gian tồn tại trong dạng dịch là 24 giờ ở nhiệt

ñộ phòng [50]

Tác hại: Nếu cây bị nhiễm từ nhỏ có khả năng gây lùn cây và những cây này thường không cho năng suất Vì vậy, thiệt hại về mặt năng suất do bệnh gây nên là rất lớn Theo thống kê của Fajemisin và Soyinka 1976 bệnh này có thể làm giảm ñến 50,02% năng suất so với ruộng hoàn toàn khỏe

Bệnh khảm sọc lá ngô (MSV), có thể phá hủy hầu hết các cây trồng ngô, ñặc hữu của vùng cận Sahara châu Phi và các ñảo lân cận Ấn ðộ Dương nhưng trong những năm nhất ñịnh, toàn bộ cây trồng của người nông dân có thể bị mất trắng (Science Dalily, 2007) [78]

Phòng trừ: Sử dụng giống kháng Hiện nay ñã sản xuất ra ñược giống kháng MSV – GE [78]

1.2.2.3 Bệnh sọc trong trên lá ngô (Maize rayado fino virus)

Lịch sử nghiên cứu: Bệnh sọc trong virus trên lá ngô ñược Ancalmo và

Davies phát hiện và mô tả lần ñầu tiên vào năm 1961 Sau ñó bệnh tiếp tục ñược nghiên cứu vào những năm tiếp theo Gasmez (1969), Gasmez Kozuka

và Fukuoka (1977) [60]

Nguyên nhân gây bệnh: Virus gây bệnh có cấu tạo ñối xứng dạng cầu, ñường kính biến ñộng từ 31,5 nm ñến 30 nm (Gasmez et al, 1977) [60]

Theo kết quả nghiên cứu của Gasmez năm 1977 và 1980 ở Trung Mỹ, sự

truyền lan tự nhiên của virus gây bệnh do một loại rầy xanh Dalbulus maydis

Một số tác giả khác (Nault & Bradfute, 1977; Wolanski & Maramorosch, 1979) ñã thử nghiệm sự truyền lan của virus qua một số môi giới khác như:

D.elimatus, Baldulus tripsaci và Graminella nigrifrons

Sự lan truyền virus bởi côn trùng có thể ñạt ñược hiệu quả sau thời kỳ tiềm dục 8 - 37 giờ ở nhiệt ñộ 20 - 250C và duy trì lây bệnh từ 1 ñến 20 ngày Sau ñó sự truyền lan bị gián ñoạn và khả năng truyền bệnh của vetor yếu dần [52]

Qua nghiên cứu các tác giả cũng khẳng ñịnh rằng khả năng truyền bệnh của

rầy ñực D.maydis là kém hơn rầy cái Virus có thể truyền qua da côn trùng nhưng

không truyền qua ñược trứng của côn trùng (Paningua & Gasmaz, 1976) [52]

Rầy Dalbulus maydis cũng có khả năng truyền bệnh cằn cỗi cây ngô do

Spiroplasma gây ra (Gasmez, 1973; Wolanskin & Maramorosch, 1979) [52]

Virus gây bệnh sọc trong lá ngô có nhiệt ñộ làm mất hoạt tính dao ñộng

60 - 650C (Q10 = 60 - 650C) Và nó có thể tồn tại trong ñiều kiện invitro với thời gian từ 72 - 69 giờ ở 200C hoặc 86 - 120 giờ ở 30C [52]

Bệnh sọc trong virus hiện chỉ thấy xuất hiện trên những cây thuộc họ hòa thảo trong ñó ngô là cây ký chủ chính, ngoài ra còn thấy xuất hiện trên một loại

cỏ cao cây ở Mexico có tên Maize mexicana (một loại cỏ trông giống cây ngô)

(Gasmez, 1973, 1980) Bệnh virus gây sọc trắng lá ngô không truyền qua hạt giống, tiếp xúc cơ học và không thấy thông báo về khả năng truyền bệnh qua dây tơ hồng

Triệu chứng bệnh xuất hiện khoảng 2 tuần sau khi lây bệnh cho cây, bệnh phát triển ở giai ựoạn 8-10 lá và giai ựoạn 12-14 lá (Jose Vásquez and Eloy Mora, 2007) [71]

đặc ựiểm phân tử của bộ gen: Trình tự nucleotide của bộ gen RNA sợi

ựơn của MRFV, các thành viên chi Marafivirus, có 6305 nucleotide (nts)

chiều dài và có hai khung ựọc mở (ORFs) ORF lớn nhất (nt 97-6180) mã hóa một polyprotein các 224 kDa với tương ựồng trình tự của nó -N ga cuối cho các protein liên quan ựến sao chép của virus khác với bộ gen RNA dương tắnh sợi và miền protease papainlike ựược tìm thấy trong tymoviruses (Rosemarie, 2010) [77]

Tác hại: Theo Carlos De Leon (1984), virus này xuất hiện ở Trung Quốc, làm giảm năng suất tới 43% Tại trung tâm giống cây trồng Mỹ các nhà khoa học ựã quan sát thấy ựối với từng cá thể, nếu bị nhiễm từ giai ựoạn sớm bệnh có thể làm giảm 40 - 50% trọng lượng bắp thu hoạch đối với các giống nhập nội và các giống mới lai tạo có trường hợp năng suất giảm xấp xỉ 100%

1.2.2.4 Bệnh sọc lá ngô (Maize stripe virus) - MStpV

Tên gọi khác:

+ Maize chlorotic stripe virus

+ Maize hoja blanca virus

Bệnh sọc lá ngô (MStpV) ựược Shepherd (1929) phát hiện đến năm

1939 Storey phát hiện thấy ở tỉnh Amani thuộc Tazania - đông Phi

Bệnh này do một loại virus và ựược lan truyền chủ yếu do rầy xanh

Peregrinus maydis ựược phân bố ở bang Floria, Mỹ (Tsai, 1975), Venezuela

(Trujillo et al., 974), Peru (NauIt et al., 1979), Guadeloupe (Migliori & Lastra,

1980), Nigeria and Sao Tome (Rossel, personal communication), Kenya (Kulkarni, 1973), Botswwana (Jones, personal communication), Mauritius and

Reunion (autrey, 1983), Australia (Graber, 1981), Costa Rica (Gomez & Nauit, personal communication), Phillippines (exconde, 1977) [54]

Virus ñược lây truyền qua một loại rệp xanh Peregrinus maydis Không

có mối liên hệ nào chứng tỏ virus này ñược truyền bởi Dalbulus madis (Gingery et al., 1979) Virus tiềm ẩn trong cơ thể côn trùng khoảng 10 ngày (Gingery et al., 1981) Từ 9 - 13 ngày (Tai & Zitter, 1982) và 15 - 16 ngày

(Grreber, 1981) Virus này không truyền qua hạt [54]

1.2.2.5 Virus gây bệnh khảm ñốm vàng lá ngô - Maize chlorotic mottle virus (MCMV)

Tên gọi khác:

Maize chlorotic mottle machlomovirus

Maize mottle virus

Peru corn virus

Phân loại và ñặt tên: Virus gây bệnh khảm ñốm vàng lá ngô Maize

chlorotic mottle virus (MCMV) là một loại virus giống virus machlomovirus

(Lommel, 1995) Dựa trên tính tương ñồng của chuỗi amino axit, giống

Machlomovirus ñược xếp vào họ tombusviridae

Kháng huyết thanh của MCMV ñã ñược chế tạo, loại kháng huyết thanh Kansas 1 và 2, loại kháng huyết thanh Peru (Niblett and Claflin, 1978; Uyemoto

et al., 1980) Các loại kháng huyết thanh khác nhau bởi sự phân tích aga

khuyếch tán kép Loại Kansas 1 và 2 chiếm ưu thế hơn kháng huyết thanh ở

Peru và cũng ñã xác ñịnh ở Hawai (Jiang et al., 1992) Loại kháng huyết thanh

MCMV cho thấy những khác nhau qua phân tích khuyếch tán gen miễn dịch

ðiều quan trọng cần chú ý là MCMV và MMCSV là hai loại virus riêng biệt ñặc thù cho vùng nhiệt ñới Châu Phi (Thottappilly, 1993)

Phạm vị ký chủ: Cây ngô là vật chủ tự nhiên MCMV (Bockelman et

al., 1982) [45] Phạm vi ký chủ thí nghiệm của virus bị hạn chế họ Poacace Virus không gây ra các triệu chứng trên thực vật hai lá mầm

(Castillo and Hebert, 1974; Niblett and Claflin, 1978) [46]

Ký chủ quan trọng nhất là cây ngô, ký chủ thứ sinh là cây Zea diploperennis

Virus gây ảnh hưởng ñến các giai ñoạn của cây ngô: Ảnh hưởng ñến giai ñoạn sinh trưởng và phát triển của cây

Sự phân bố về mặt ñịa lý: MCMV ñược biết ñến ở một vài nước Châu

Mỹ như: Argentina, Mexico, Peru và Mỹ MCMV cũng có thể xuất hiện nhưng chưa ñược công bố ở các nước phía Tây ven biển Thái Bình Dương Môi giới

Diabrotica spp., ñược phòng trừ nghiêm ngặt ở New Zealand Vì vậy, MCMV

có khả năng xuất hiện và phổ biến ở bất kỳ vùng trồng ngô nào trong phạm vi miền Tây ven Thái Bình Dương Báo cáo gần ñây ở Hawai nói rằng MCMV có

thể ñược lan truyền do Frankliniella williamsii, tăng phạm vi ảnh hưởng của

virus một cách ñáng quan tâm [53]

Ở bang Nebraska và Kansas (Mỹ), MCMV bắt ñầu ñược ngăn chặn ñến thung lũng sông Cộng Hòa là vùng biên giới của hai bang (Uyemoto, 1983)

Ở Kauai, Hawaii virus xuất hiện trên những ruộng ngô giống vụ ñông (Jiang

et el., 1992) MCMV ñặc biệt xuất hiện ở Lima, Huarat, Chancay, Lurin và thung lũng Canete ở vùng Lima, Peru (Castillo, 1976) [46]

Virus MCMV ñược tìm thấy ở tất cả các nước thuộc Miền Tây Thái Bình

Dương Ở Argentina sự phân bố virus có giới hạn (Teyssandier et al., 1983) Ở

Peru sự phân bố của bệnh cũng có giới hạn ở một số vùng (Castillo & Hebert,

1974) Ở Mexico hiện tại không có thêm thông tin mới (Gordon et al., 1984) Ở

Mỹ virus chỉ có ở Hawai là chính (Jiang et el., 1992); hoặc ở Nebraska (Doupnik

et al., 1982); ở bang Texas hiện tại chỉ có rất ít (Kessler, 1979) [53]

Virus lan nhanh trong phòng thí nghiệm Sự nghiên cứu mở rộng về bệnh ñã chỉ ra MCMN lan truyển và tồn tại như thế nào trong tự nhiên, ñặc biệt trong thời kỳ ngô mới gieo chưa nảy mầm: MCMV có thể bị lây truyền

bởi 6 loại bọ cánh cứng, thuộc họ Chrysomelidae như loại bọ cánh cứng hại lá ngũ cốc (Oulema mrlanopus), Bọ chét ngô (Systena frontalis)…

Các côn trùng không lan truyền MCMV bao gồm một số loại rệp, bọ nhảy hại lá, bọ nhảy hại thân, bướm trắng, bọ hung cánh cứng

Dịch bệnh: Ở Kansas và Nebraska (Mỹ), sự lây nhiễm MCMV có thể tái diễn ở cùng một ñịa phương trong phạm vi cánh ñồng ngô trong những năm tiếp theo ðiều này ñã dẫn tới giả thuyết cho rằng virus tiếp tục tồn tại trong ñất từ mùa này sang mùa khác (Uyemoto, 1983) [84] Có nhiều báo cáo khác nhau nhưng liệu MCMV có thể sống sót trong các tàn dư trong suốt thời

kỳ ngô chưa nảy mầm Có thể virus sống qua ñông trên các ruộng ngô ñã cày

vỡ (Uyemoto, 1983) [84]

Hiện nay, MCMV có thể xâm nhập các vùng trồng ngô cách ly bằng việc nhập vào cây nhiễm hoặc lan truyền qua hạt giống Virus có thể tồn tại lâu dài ở những vùng trồng ngô bị nhiễm bệnh hoặc tồn tại qua quá trình ngủ ñông

ở các ấu trùng của các vật mang bệnh khi cây ngô không có biểu hiện triệu chứng bên ngoài

Nghiên cứu bệnh ở hạt giống ñược thực hiện ñể giải thích sự bùng nổ bột phát của virus MCMV ở Hawai, virus ñã ñược xác ñịnh qua thử ELISA trong

17 cây giống trồng bên ngoài một nhà kính từ 42.000 hạt ngô ñược thu hoạch ở những cây có triệu chứng trong các vườn ươm cây có tính chất thương mại ở Hawaii sản xuất hạt giống ngô (Jiang, 1992) và trong hạt ngô ñường (Delgadillo - Sanchez, 1994)

Trong các nghiên cứu ñầu tiên, sự lây nhiễm bệnh ở hạt giống chỉ có

800 - 2153 cây giống ñược thử nghiệm (Castillo & Hebert, 1974), Bockelman

et al., 1982) Các mẫu trong các nghiên cứu về sự lây nhiễm ở hạt giống là

chưa ñủ ñể có thể phát hiện ra mức ñộ lây nhiễm rất thấp của MCMV ở hạt giống trong thí nghiệm [45] [53]

Bockelman và các cộng sự (1982) ñã không thể phát hiện sự lây nhiễm qua hạt giống của MCMV và các cây lai nói chung Sự lây nhiễm hạt giống

cũng khơng được phát hiện trong các cây ngơ lai (Castillo và Hebert, 1974) Tuy nhiên Jensen và các cộng sự (1991) đã tìm ra 17 cây trồng bên ngồi nhà kính từ 42.000 hạt giống ngơ bị nhiễm MCMV Delgadillo - Sanchez et al (1994) đã phát hiện ra 2 trong số 12.910 cây ngơ đường và 1 trong 12,020 cây ngơ white - grained dent bị nhiễm bệnh qua hạt giống ðiều này đã chứng tỏ rằng MCMV được lây qua hạt giống ở mức độ rất thấp

Các nguồn lây khác: Nhiều loại cơn trùng đã xác định như động vật chân đốt cĩ thể là tác mơi giới nhiễm MCMV, bao gồm 6 lồi chân đốt tìm thấy ở

MCMV tại các khu vực trồng ngơ bị nhiễm ở Hawaii (Peregrinus maize,

Sardia pluto, Empoasca solana, Adoretus sinicus, Tetrnychus sp và Frankliniella williamsi), các tác giả đã đưa ra kết quả xác định MCMV bằng

phương pháp ELISA và thấy chỉ cĩ cơn trùng F.williamsi là cĩ thể truyền

MCMV vào những cây ngơ khỏe ðây là bằng chứng đầu tiên về việc MCMV

lây nhiễm qua Frankliniella williamsii [53]

Tổng cộng 15 loại cây kiểm tra bằng phép thử ELISA cũng khơng nhiễm

MCMV, ngoại trừ một mẫu của loại cỏ Trichachue và một mẫu cỏ Melia

azedarach (Jiang et al., 1992) Các nghiên cứu khác cũng cho thấy nguyên

nhân gây bệnh được lan truyền bởi các con bọ cánh cứng hại lá ngũ cốc và sâu

hại rễ ngơ (Jensen, 1985, Nault et al., 1978) Khơng cĩ kết quả kiểm tra chất

lượng hạt giống nào được cơng bố; Tuy nhiên, một mơ hình chẩn đốn phát hiện MCMV trong các hạt giống được đưa vào sản xuất độc quyền Nguyên nhân gây bệnh cĩ thể phát hiện bằng phương pháp ELISA [84]

Ở Peru những thiệt hại của ngơ đường và lúa mì do MCMV đã được báo cáo trung bình là 10 - 15% năng suất Ở các ruộng thí nghiệm virus gây bệnh

đã làm giảm 59% năng suất (Castillo,1976) Ở Kansan, sự mất mùa là do ngơ chết hàng loạt bởi virus MCMV và các virus khác thiệt hại được ước tính từ 50% tới 90% năng suất phụ thuộc vào từng loại ngơ và từng năm trồng

Virus MCMV lây truyền qua hạt giống nhưng mức ñộ lây truyền tương ñối thấp Chưa có phương pháp rõ trong cách xử lý hạt giống Nhưng ở các nước Hunggary, Bungari, Indonexia và Ba Lan virus MCMV nằm trong danh mục các sinh vật gây hại cần ñược kiểm soát [53]

Ngô bị nhiễm MCMV, sự sinh trưởng của cây bị chậm lại Triệu chứng trên lá bắt ñầu là các sọc vằn vàng chạy song song với gân lá, sau ñó sẽ kết hợp làm một ñể tạo ra những vết màu vàng kéo dài, cuối cùng bệnh ñã phá hủy lá Trong một số trường hợp lây nhiễm, sự phá hại lá của virus có thể dẫn tới cây

bị chết (Castillo & Hebert, 1974) Hoa ñực có thùy hoa cứng, khi nở hoa hoa ngắn và chỉ có vài cụm hoa Một vài tật ở cánh hoa cũng có thể xảy ra trong một số trường hợp bị lây nhiễm (Castillo, 1974) Cây ngô non bị nhiễm thì sự phát triển của virus nghiêm trọng hơn và các triệu chứng sẽ biểu hiện rõ hơn (Lenardon et al., 1987)

Virus MCMV làm cây ngô bị lùn ñi và các lóng ngắn lại Cây bị bệnh cho bắp ít hơn và nhỏ hơn Cây ngô bị nhiễm virus MCMV ở các giống ngô bột và ngô ñường thì giảm 10 - 15% năng suất

1.2.2.6.Virus ñốm vàng lùn ngô (Maize chlorotic dwarf virus)

Bệnh ñược phát hiện bởi Rorenkranz (1969) và Bradfute et al (1972)

Ngoài ra bệnh này còn gọi là bệnh còi cọc ở cây ngô (CSA- OH) (Rorenkranz, 1969).Virus chứa ARN hình cầu có ñường kính 30nm Phạm vi ký chủ của virus

hẹp, chỉ có ở họ hòa thảo (Gramineae) [51]

Virus này không lây truyền qua cơ giới Bệnh ñược truyền bởi bọ rầy xanh , không lây qua ghép và nhựa cây, qua môi giới người ta cho rằng chỉ các cây họ hòa thảo là dễ bị mắc hơn (Gordon & Nault, 1977) [62]

Các loại cây trồng dễ bị mắc bệnh là lúa miến, lúa mì Triệu chứng xuất hiện ở các cây chủ này thường rất nhẹ Các cây bị mắc nặng là: cỏ dại, cỏ

ñuôi cáo và cỏ Johnsongrass (Nault et al., 1976) [74]

Trên cây ngô sau khi trồng từ 5- 10 ngày triệu chứng xuất hiện có ñốm vàng trên lá Sau ñó là các sọc vàng, cây còi cọc dần Ở một số giống thấy lá cây chuyển sang màu ñỏ, vàng, lá cây bị rách Các sọc vàng xuất hiện trên gân lá ñã chứng tỏ rằng cây bị nhiễm virus ñốm vàng lùn ngô (Gordon & Nault, 1977) [62]

Sự truyền bệnh: Năm 1973, Nault và CTV ñã nghiên cứu ở Ohio,

Mỹ Khi so sánh mẫu bệnh khác nhau về mức ñộ còi cọc ở cây và sự mất màu của lá Người ta vẫn không tìm thấy sự khác nhau về quan hệ huyết thanh giữa các mâu phân lập Theo Nault và CTV, 1973 thì sự lây nhiễm qua vector của virus khá nhanh và có thể tồn tại trong vài ngày Quá trình lây nhiễm chỉ xảy ra trong vòng 2 giờ tiếp cận và sau khi nhiễm 2 tiếng không có thời gian ủ bệnh Cây ñã bị lây nhiễm ñều có thể truyền bệnh

(Nault et al, 1973) [75]

Qua nghiên cứu cho thấy không có mối liên hệ nào giữa các virus gây bệnh ñốm vàng lùn cây ngô với các loại virus cây trồng khác Mặc dù nó giống virus tungro trên lúa ở một số tính chất bao gồm: Mối liên hệ vector, tỷ

lệ ñóng cặn và hình thái học nhưng các virus này không liên quan tới nhau về quan hệ huyết thanh (Gingery & Gordon) [51] Bệnh làm cho cây còi cọc và

lá có sọc vàng úa Bệnh thường thấy ở Nam Mỹ

1.2.2.7 Bệnh khảm lùn ngô do virus Sugarcane mosaic virus - SCMV

Lịch sử nghiên cứu: Bệnh ñược phát hiện năm 1963 (Janson và Ellett) và 1965 (William và Alexander) Tiếp những năm sau ñó, bệnh ñược nghiên cứu kỹ càng hơn Các kết quả nghiên cứu xác ñịnh, mô tả triệu chứng bệnh cũng như xác ñịnh ñược nguyên nhân gây bệnh ñồng thời xác ñịnh ñược hình thái, kích thước và một số ñặc ñiểm khác của virus gây bệnh Ở Venezuela, virus này lần ñầu tiên ñược phát hiện trên cây lúa miến năm 1969 và tìm thấy chủ yếu ở ñây là chủng virus A gây bệnh

Phạm vi chủ của SCMV ñược giới hạn trong họ cỏ một lá mầm (Zhang

et al 2008) [92]

Nguyên nhân gây bệnh: Virus bệnh khảm lùn cây ngô là một chủng của SCMV (một chủng của virus khảm lá mía) Virus có dạng hình sợi mềm, kích thước 750 x 13nm thuộc nhóm Potyvirus ðược phát hiện dễ dàng trên kính hiển

vi ñiện tử (Zhang et al, 2006) [91]

Thông thường virus truyền qua rệp họ Aphididae mà chủ yếu là loài

Rhopalosiphum Schizaphis graminum, Aphis maidiradicis, Aphis craccivora, Aphis fabae, Acyrthosiphon pisum, Myzus persicae, Aphis gossypii, Therioaphis maculata, Sitobion (Macrosiphum) avenae, Rhopalosiphum padi, Rhopalosiphum poae, Macrosiphum euphorbiae, Rhopalosiphum maidis,

Brevicoryne brassicae and Rhopalosiphum fitchii (Knoke và Louie, 1981)

Virus này ñược truyền qua côn trùng theo kiểu không bền vững thời

gian nhiễm vào cây chỉ vài phút tới 1 - 2 giờ Virus có thể truyền qua con ñường cơ học tiếp xúc (Andret-Link, P & Fuchs, M.,2005) [42]; (Ng, J C K

& Falk, B W, 2006) [76] Virus này có thể lây qua hạt giống với tỷ lệ hạt nhiễm virus rất thấp là 0,007 - 0,04%

Marie-Jeanne, 2011 [72] ñã sử dụng 2 ô ñất với 1000 hạt một ô, tỷ lệ hạt

bị lây nhiễm là 0.5 ñến 0.6% Theo tác giả thì các virus là một chủng của virus khảm lá mía Ngoài ngô ra cây ký chủ của nó là những cây thuộc loài hòa thảo khác như: Mía, Cao lương, Cỏ Johnson Người ta không thấy bệnh xuất hiện trên nhưng cây lá rộng

Huyết thanh học

Huyết thanh miễn dịch với ñộ chuẩn ñồng ñều từ 1/128 ñến 1/156 ñã ñược sản xuất bằng việc lây nhiễm cho thỏ với sự chuẩn bị kháng nguyên sạch của virus Các huyết thanh miễn dịch này ñem ñến sự kết tủa dạng bông khi trộn với virus tinh khiết trong các thí nghiệm kết tủa cực nhỏ

nhưng lại tạo kết tủa hạt khi trộn với dịch cây từ cây bị nhiễm ðiều này không ñược biết có phải là do sự có mặt của các protein tự do có trong nhựa cây hay không Huyết thanh miễn dịch cũng có thể ñược sử dụng trong phản ứng ELISA (Jarjees & Uyemoto, 1984) Các kháng thể ñơn

dòng ñặc hiệu virus cũng ñã ñược sản xuất (Hill et al., 1984)

Ở Pháp năm 2007 các ñặc tính giống như potyvirus ñược quan sát bằng

kính hiển vi ñiện tử 20 mẫu từ các cây bị nhiễm cho thấy triệu chứng khảm ñược kiểm tra bằng test ELISA với kháng thể ña dòng của thỏ với MDMV và SCMV Với tất cả các lá ñược kiểm tra, phản ứng dương tính nhẹ và mạnh lần lượt với MDMV và SCMV cho thấy các cây ñã bị nhiễm bởi SCMV

Sau 2 tuần lây nhiễm, triệu chứng khảm ñược xuất hiện trên lá Các giống ngô ngọt ngoại trừ Max là nhạy cảm nhiều hơn với virus Marie-Jeanne (2011) [ 72]

Các mối liên hệ

Dựa trên khoảng cách vạch kết tủa mối quan hệ huyết thanh, dòng virus

khảm ngô ñược cho là virus khảm lá mía Shepherd, 1965; Snazelle et al.,

1971; Pirone, 1972; Jarjees & Uyemoto, 1984 Tuy nhiên, các thí nghiệm phân tích ñiện di miễn dịch gần ñây sử dụng kháng thể ña dòng trực tiếp tới các protein màng chuyên biệt N-termini cho thấy rằng dòng virus khảm ngô

Mỹ A, D, E và F không có liên quan tới dòng B, O của Mỹ, dòng virus khảm ngô A, B, D, E, H, I và M của mía và dòng virus SC, BC và Sabi của mía ở

Úc (Shukla et al., 1989c)

Tinh chế

Theo Shepherd, 1965 [80], thì mô ñồng nhất từ cây bị nhiễm virus trong 3-4 tuần ñược bổ sung 0,05M sodium citrate có thêm 0.05% mercaptoethanol (1 g mô/1 ml) và lọc qua màng Chuyển thành thể sữa ñồng nhất với

chloroform (1:1 v/v) và ly tâm ở tốc ñộ chậm Lọc lấy nước trong thông qua

1 tấm lót len thủy tinh và siêu ly tâm trong 90 phút ở tốc ñộ 30.000 vòng/phút Các cục huyền phù vào khoảng 1/50 thể tích 0.005 M borate, pH 8.2 Tinh chế virus tiếp tục bằng phương pháp siêu ly tâm gradiante nồng ñộ ñường sacaro

Tosic và CTV, (1974) [82] khi so sánh với 1 số phương pháp khác nhau

ñã cho thấy sự ña dạng trong kết quả làm tinh khiết với các dòng khác nhau Theo Von Baumgarten & Ford, 1981 [88] thì mô ñồng nhất từ cây bị lây nhiễm virus trong vòng 10 - 12 ngày ñược bổ sung 60mM dung dịch ñệm sodium photphat, pH 9,0 bao gồm 10 mM NaDIECA (1 g mô/4 ml) Thêm chloroform to 5% (v/v), chuyển thành thể sữa và ly tâm ở tốc ñộ chậm Thêm NaCl 0.3 M và PEG M Wt 6000 ñến 4% (w/v), chuẩn tới pH 7,0, ủ trong 30

khi cho thêm 10 mM EDTA, ly tâm ở tộc ñộ chậm Siêu ly tâm với dung dịch ñệm 30% sacaro Tinh chế bằng ly tâm trong gradiante ñường sucrose (10 ñến 40%) hoặc ñộ CsCl

Cấu trúc sợi:

Các virus là những sợi nhỏ mềm 700-760 nm chiều dài và 13-14 nm

chiều rộng (Zhang et al, 2006) [91]

Quan hệ với các tế bào và mô

ðặc ñiểm của nhóm potyvirus ñã ñược biểu hiện trong các tế bào của

ngô, kê sau khi lây nhiễm với virus khảm ngô dòng A, D (Krass & Ford, 1969; Moline, 1972; Langenberg & Schroeder, 1973; Edwardson, 1974)

Tác hại

Bệnh khảm lùn ngô làm cây thấp, lá co ngắn lại, hiện tượng khảm ñặc biệt ở lá non và lá bánh tẻ Bệnh khảm lùn có ở trên ñồng ruộng với tỷ lệ thấp từ 2,0 - 6,3% Qua quan sát ở giống ngô lai ICA - 2010, cho thấy năng suất có

thể giảm tới 50% nếu cây nhiễm bệnh và có triệu chứng phát triển trước khi ra

lá thật thứ 12, và giảm 12% năng suất nếu quá trình ñó diễn ra vào thời kỳ sau (Gerado Martinez - Loper, 1976)

Theo Chen và CTV (2002) [47] thiệt hại về sản xuất ngô ñã ñược ước

tính khoảng 20 - 80%, ñây ñược coi là thiệt hại kinh tế lớn nhất trong sản xuất ngô của Trung Quốc

Ở Pháp năm 2007, trên cây ngô ngọt với triệu chứng khảm lùn tương tự ñược gây ra bởi virus khảm lùn ngô ñược quan sát thấy trong vùng sản xuất ở Pháp Mười cánh ñồng ngô ngọt ñã ñược khảo sát bệnh ñã làm sản lượng giảm từ 10-20% (Marie-Jeanne , 2011) [72] Trên cây mía thiệt hại do SCMV ñược tính từ 3 -50% (Zhang et al , 2008) [92]

Phòng trừ

Trong những năm gần ñây, công nghệ sinh học ñã cho phép quy ñịnh của sự biểu hiện của gene thực vật ñể cải thiện các ñặc ñiểm nông học quan trọng Biến ñổi gene của cây trồng ñã mang lại hiệu quả từ các gene mới, ñặc biệt là các gene biểu hiện các chức năng mới lạ, một trong số ñó là yếu tố bắt

ñầu eukaryotic 4E (eIF4E) eIF4E là một trong những yếu tố khởi ñầu quan

trọng nhất Nghiên cứu gần ñây ñã chứng minh rằng virus kháng trung gian eIF4E và ñồng vị eIF 4E (iso) xảy ra ở một số tương tác virus thực vật, cho thấy tiềm năng mới cho 4E (iso) eIF4E/eIF trong chiến lược tăng sức ñề

kháng chống lại virus thực vật (Zhang et al, 2006) [91]

Chitosan là polymer mạch thẳng ñược cấu tạo bởi liên kết β-(1-4) của 2 tiểu phần D-glucosamine (tiểu phần bị loại bỏ nhóm acetyl) và tiểu phần N-acetyl-D-glucosamine (tiểu phần chứa nhóm acetyl) Chitosan ñược hình thành từ sự loại bỏ nhóm acetyl của chitin (dạng polymer mạch thẳng của N-acetyl-D-glucosamine) Chitosan có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm và y học Chitosan không ñược xem là chất kích kháng

thực sự vì nó có hoạt tính kháng nấm Tính kháng tạo ñược của chitosan rất

rộng, chống lại nhiều nguyên nhân gây bệnh như nấm, vi khuẩn và virus (Yin

et al, 2010) [90]

Salicylic Acid (SA) ñược biết là một phytohormone nội bào tham gia

dẫn truyền tín hiệu nhằm ñiều khiển nhiều quá trình sinh lý của cây như nảy mầm, tăng trưởng tế bào, hô hấp, ñóng mở khí khổng, già hóa SA cũng khởi ñộng các phản ứng kháng chống lại các ức chế (stress) vô sinh như hạn, mặn

và hữu sinh như nguyên nhân gây bệnh Sử dụng SA ngoại bào ñã ñược chứng minh cảm ứng tạo tính kháng SAR ñối với nhiều nguyên nhân gây bệnh gồm cả nấm, vi khuẩn và virus Tuy nhiên vì nồng ñộ hiệu quả ñể tạo tính kháng của SA (> 100 µM) có thể gây ñộc tế bào nên SA tự do không

ñược ứng dụng ngoài thực tiễn ñể tạo tính kháng (Durrant et al,2004) [58]; (Vlot et al, 2009) [87]; (Hayat et al, 2010) [67]

Xử lý nước nóng, tách mô phân sinh ñỉnh sinh trưởng ñối với mía và

tạo các giống sạch bệnh (Zhang et al, 2008) [92]

là một chủng của SCMV Một chuỗi CP ñại diện cho một loại potyvirus mía

phổ biến ở tỉnh Phúc Kiến (Chen et al.,2002)[47]

Các chuỗi SCMV từ mía khác biệt so với tất cả các chuỗi tìm thấy trên ngô và có sự pha trộn với SrMV ðiều này cho thấy SCMV trên hai loại cây trồng ñã ñược phân lập, kể cả ở tỉnh Chiết Giang, nơi chúng ñược phát hiện

và ñã ñược duy trì trong mía Hỗn hợp chủng SCMV và SrMV ñược phát hiện

ở ba trong số năm mẫu mía Trung Quốc Sự liên kết các chủng virus tương

ñối hiếm tuy nhiên vẫn xảy ra trong một số vụ nhân giống cây trồng (Chen et

al.,2002)[47]

Hình 1.1 Phân tích phát sinh chủng loại của các chuỗi protein axit amin

ở chủng SCMV (nguồn Chen et al.,2002) 1.2.3 Giới thiệu chung về chi Potyvirus

Bệnh khảm lùn ngô Sugarcane mosaic virus - SCMV do một virus của chi potyvirus gây ra Vì vậy, ñặc tính chung của virus khảm lùn ngô hoàn toàn giống với virus thuộc chi potyvirus họ Potyviridae