BÀI GIẢNG TIN SINH HỌC - GIAI MA TRINH TU GEN

Các bước của giải mã trình tự SH Phương pháp giải trình tự toàn hệ gen trải qua 3 giai đoạn:... Giải mã trình tự bộ gen Với việc sử dụng các phần mềm khác nhau, sẽ cung cấp cho chúng t

NỘI DUNG BÀI HỌC

1. Khái niệm giải mã bộ gen (genomic sequencing)

2. Giải mã trình tự theo phương pháp Sanger: định

nghĩa, các bước cơ bản, sản phẩm

3. Phương pháp tạo phản ứng cho việc giải mã:

Walking & Shotgun

4. Ưu & nhược điểm của giải mã trình tự

5. Các hướng khắc phục: mô hình quỹ cộng đồng &

Why do sequencing?

Why do sequencing?

Khám phá mỗi gen mã hóa bởi bộ

gen của 1 loài động vật

Tại sao cần thiết phải giải mã toàn bộ bộ gen?

về trình tự

Tại sao cần thiết phải giải mã toàn bộ bộ gen?

 Khám phá các kiểu di truyền gây ra bởi các

đột biến khác nhau

 Khám phá các đột biến gây ra các bệnh di

Giải mã trình tự (Gene Sequencing)

 Có bao nhiêu phương pháp giải mã trình tự?

 Phương pháp giải mã trình tự nào tối ưu hơn? Tại sao?

Các bước của giải mã trình tự SH

 Phương pháp giải trình tự toàn hệ gen trải qua 3 giai đoạn:

Khi nào sử dụng giải trình tự?

Phản ứng giải mã trình tự sinh học

 Được phát minh bởi Fred Sanger

 Sử dụng enzyme DNA polymerase

 Các phản ứng chứa 1 “điểm đích” để tạm dừng quá trình tổng hợp

The Nobel Prize in Chemistry

1958 Frederick Sanger

Giải mã trình tự Sanger

 Hoạt động bằng thực hiện các phản ứng nhẹ

nhàng phá gãy 1 đoạn DNA chuẩn đã tái tạo, xúc tác bởi enzyme DNA polymerase

Phản ứng giải mã trình tự

Các bước cơ bản trong giải mã trình tự

 Thêm đoạn mồi:

 Thêm các nhóm bazơ nitric (4 nitrogenous

bases):

 Thêm 4 nhóm dideoxynucleotide (ddNTPs)

Nguyên lý của giãi mã

Phân biệt rõ PCR giải mã trình tự và PCR

khuếch đại trình tự

Sản phẩm của các phản ứng giải mã trình tự

 Phản ứng diễn ra trên 1000 lần từ sợi DNA khuôn

 Mỗi vị trí có thể có đều được đánh dấu rất nhiều

lần

Máy giải mã trình tự bộ gen

Giải mã trình tự bộ gen

 Với việc sử dụng các phần mềm khác nhau, sẽ cung

cấp cho chúng ta 1 hình ảnh gel

khác nhau về 1 đoạn chiều dài của nucleotide Màu sắc trong vạch biểu thị cho việc ddNTPs được kết hợp

trong đoạn DNA

Giải mã trình tự bộ gen

Giải mã trình tự trên những khu vực gel để đọc kết quả giải mã

Phản ứng giải mã trình tự đầu tiên

Quá trình giải mã trình tự

Quá chậm cho Genomics

 Tối đa khoảng 500 base/1 lần giải mã trình tự

 Mỗi base phải được đọc trên film X-ray và ghi lại nhiều lần kết quả bằng cách thủ công (tay, thuê

nhân công )  Tốn công sức & hiệu quả kinh tế

kém

Quá trình giải mã trình tự

Dự tính thời gian:

 Bacteriophage chỉ có 5000bp

 Các loài đơn giản nhất (Vi khuẩn) có bộ

genome khoảng 2,000,000 bp

Quá trình giải mã trình tự

Phương pháp tạo phản ứng trong việc giải

mã

 Các mục tiêu trong việc giải mã trình tự các phân mảnh lớn của DNA

 PP Walking (PP lặp và phân đoạn)

 PP Shotgun (PP ngẫu nhiên)

Phản ứng Walking

 Phản ứng giải mã trình tự đầu tiên cung cấp 500 bp trình

tự thông tin

 Việc giải mã 500 bp tiếp theo phụ thuộc vào trình tự

thông tin DT của đoạn mã trước đó

 Quy trình phản ứng chỉ đạt tối đa 1kbase/2 ngày Việc

giải mã trình tự toàn bộ bộ genome mất 6,000,000 ngày.

Phương pháp Shotgun

 Lấy nhiều đoạn copy DNA ngẫu nhiên của bộ gen, giải

mã trình tự 500bp từ mỗi đoạn DNA đó.

 Sau đó sắp xếp tất cả trình

tự thành 1 trình tự bộ gen hoàn chỉnh

 Lưu ý: Phải giải mã trình tự

gen nhiều lần để chắc chắn không bị trùng lặp có thể

 Shotgun ít hiệu quả hơn vì là giải mã trình tự

ngẫu nhiên, cần phải giải mã mỗi trình tự ít nhất

10 lần lặp lại

 Nhanh hơn Walking – không cần tổng hợp và thiết

kế mồi (primer) – sử dụng 1 loại giống nhau cho

tất cả các phản ứng

Giải trình tự ngẫu nhiên (Shotgun)

 Do J Craig Venter

(1992), một nhà sinh học phân tử tìm ra khi

bỏ qua bản đồ liên kết

và bản đồ vật lý thay vào việc giải trình tự các phân đoạn DNA ngẫu nhiên

 Hệ gen của

Haemophilus influenza

Vận hành phương pháp Shotgun

 Các phân mảnh được phân chia ngẫu nhiên, các trình tự của các phân mảnh phải được giải mã để đảm bảo độ bao phủ tất cả trình tự

 Một số phân mảnh sẽ chứa nhiều thông tin trình tự đã hiện diện ở trình tự khác = đoạn lặp (overlaps)

 Các đoạn lặp này rất cần thiết cho việc kết nối các phân đoạn DNA

Vận hành phương pháp Shotgun

 Quy tắc chung – giải mã ít

để đảm bảo độ bao phủ hoàn toàn trình tự giải mã

VD: 1 bộ genome 5kbase=5000base, máy

giải mã phải giải mã 5000*10/500 trình tự

= 100 đoạn

Để kết hợp lại, phải làm các phép so

Các phép so sánh

 Có quá nhiều phép so sánh cần phải thực hiện,

sẽ phải mất rất nhiều năm để tính toán thời gian hoàn thành

Triển vọng của giải mã trình tự

Định nghĩa & mô tả cấu trúc hoặc

Các khó khăn khi giải mã trình tự

 Phải tiến hành phân mảnh bộ genome trước khi giải mã

 Phải đạt 500 bp cho mỗi trình tự từ đoạn phân

mảnh  Đạt độ chính xác cao

 Sau kết thúc giải mã, các trình tự phải được đặt trở lại thành 1 bộ gen hoàn chỉnh

 Mỗi đoạn phân mảnh 500 bp phải liên tục được

so sánh với 1 số đoạn trình tự phân mảnh 500

bp khác  Kiểm tra độ chính xác

Khó khăn của giải mã trình tự

CÁC HƯỚNG KHẮC PHỤC

 Giải pháp 1: Mô hình huy động quỹ cộng đồng

 Giải pháp 2: Mô hình hỗ trợ cá nhân

Giải pháp 1: Mô hình huy động quỹ

 Quay lại điểm này sau khi giải mã

 Ước lượng chi phí: mất 1000 người làm việc

Mô hình phân chia và kết hợp

Mô hình cộng đồng cho việc giải mã

(piece) trình tự với nhau

 Khởi đầu genome phải được phân đoạn thành các

miếng/mảnh nhỏ hơn, có thể quan sát và phân tích

trình tự

 Làm bất tử các phân mảnh – tạo nên các nguồn

nguyên liệu vô tận

 Tạo nên 1 bản đồ vật chất để kết hợp những mảnh

nhỏ lại với nhau để xây dựng bản đồ gene.

Ứng dụng đang thực hiện

Sự phân đoạn

Enzyme cắt hạn chế (RE Digestion)

 Phân cắt bằng enzyme cắt hạn chế (RE): mục

tiêu là cung cấp các phân mảnh 10-150 kbase,

các RE có chiều dài khác nhau:

Sự phân đoạn

Sự phân đoạn

 Sự chia cắt vật chất ở NST thường sử dụng FACS

(máy phân đoạn các tế bào hoạt động gắn huỳnh quang – Fluorescent Active Cell Separator)

 Vạch đích huỳnh quang gắn vào NST & số lượng vạch đánh dấu đích cân xứng với kích cỡ của

NST

 Các giọt nhỏ giọt, mỗi loại chứa 1 NST di chuyển qua các đầu điện cực Sự di chuyển điện cực phổ biến thành các giọt nhỏ nếu đủ tiêu chí về kích cỡ

ở vạch nhuộm đích (dye)

Bất tử các phân mảnh

 Bằng việc xây dựng 1 ngân hàng genome

– Đặt mỗi phân mảnh DNA vào trong 1 sợi DNA ở

cơ thể VSV trong phòng thí nghiệm

– Một phân mảnh/1 Vi khuẩn

– Phân lập mỗi loại VSV

– Có 1 quá trình chuẩn bị thuần cho mỗi phân

mảnh

– Có thể phát triển vi khuẩn trong mỗi môi trường nuôi cấy để cung cấp 1 số lượng lớn các phân

mảnh đó

Cloning

Gel điện di agarose được sử dụng để chia cắt phân đoạn của DNA dựa vào kích cỡ (size) Các đoạn lặp sẽ có 1 số vạch chung trên

các giếng khác

nhau.

Mô hình hỗ trợ cá nhân

 Kế hoạch giải mã trình tự toàn bộ bộ genome bằng

PP Shotgun

 Bỏ qua giai đoạn lập bản đồ vật lý & di truyền

 Phân mảnh bộ genome, giải mã trình tự rất nhiều mảnh 500 bp sau đó cố gắng đặt chúng lại với

nhau

Mô hình “Mate-Pair” và “Scaffold”

 Mã hóa 1 mảnh thông tin bổ sung bằng cách đọc các khoảng cách chính xác giữa các cặp trình tự

 Genome được phân mảnh thành các đoạn lặp đã biết được chiều dài như

Mô hình Shotgun thông thường

 Ngẫu nhiên phân mảnh và giải mã đoạn DNA

500 bp, và xác định các đoạn lặp

 Mỗi nhóm của phân đoạn lặp sẽ được gọi là 1 đoạn tiếp giáp (contig)= 1 phân mảnh liền kề

của trình tự DNA

Mô hình Shotgun qua Mate-Pair

 Phân mảnh các sợi DNA thành các đoạn lặp giống hệt nhau về kích thước và trọng lượng (VD: 50 kbase)

 Các đoạn phân mảnh giống hệt nhau về chiều dài và trọng lượng như anh em nên được gọi là

Mô hình Shotgun

Mỗi nhóm đoạn tiếp giáp riêng lẻ có thể có các phân đoạn “bạn bè” bởi vì cả 2 đầu của mỗi

Mô hình giàn khung (Scafffold)

 Scaffold thay thế cho việc lập bản đồ vật chất – do quy trình

thực hiện nhanh hơn Về lý thuyết, chúng ta có thể kết nối thành bộ gen hoàn chỉnh từ các trình tự giải mã sử dụng mô hình giàn khung

 Trình tự bộ genome cuối cùng được kết nối hướng về việc chứa các đoạn khoảng trống (gaps) đầu tiên bởi các trình tự lặp Mô hình kết hợp sẽ giúp cho việc bù đắp các đoạn gaps

 Vì thế, mô hình hỗ trợ cá nhân sẽ sử dụng thông tin bản đồ vật chất được thiết kế trong mô hình gây quỹ cộng đồng để giúp cho

Mô hình giàn khung (Scafffold)

 Các đoạn tiếp giáp có thể gia nhập nhóm DNA bạn bè nên được gọi là mô hình nhóm bạn bè (Mate-pairs)

hướng theo và đặt các nhóm tiếp giáp liên quan với các nhóm khác

 Khi ngày càng nhiều cặp bạn bè (mate-pair) được so sánh, 1 mô hình giàn khung (scaffold) từ từ được xây dựng

Mất bao lâu?

 Dự đoán đầu tiên: 30 năm

 Với các ứng dụng KHKT hiện nay với máy giải mã trình tự

tự động ( automated sequencer ) và bỏ qua việc tìm hiểu

bản đồ vật lý cho bộ genome người hoàn chỉnh

 Một robot giải mã trình tự ở phòng TN có thể giải mã

trình tự 4.96 x 10 6 bases mỗi ngày

 Bộ genome người 3.3 x 10 9 bases NHƯNG cần sự

đảm bảo độ bao phủ nên phải được 3.3 x 10 10 bases

 Tốn mất 6,653 ngày cho 1 phòng thí nghiệm = 18 năm

 Xây dựng 20 phòng thí nghiệm có quy mô như PTN

trên

 Giải mã toàn bộ bộ genome chỉ mất khoảng 330 ngày

Các hướng giải quyết mới

Một nhà máy giải mã trình tự tự động hóa

Tài liệu tham khảo

http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/16654/

KẾT THÚC CHƯƠNG V