KHẢO sát TÍNH tự bất hợp và CHỌN GIỐNG KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI ở cây KHOAI tây BẰNG CHỈ THỊ PHẨN tử DNA

Phân loại khoa học Angiospermae Eudicots Asterids Theo Hawkerkks 1991, khoai tây được phân thành 18 nhóm, trong đó có 68 loài hoang dại, chỉ có 8 loài trồng trọt, chia thành 4 nhóm chủ y

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- - - - 

-BÀI THI GIỮA KỲ HỌC PHẦN SH03051 – CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG

Hà Nội, 06/2021

MỤC LỤC

1 Giới thiệu chung về cây khoai tây 3

1.1 Giới thiệu chung 3

1.2 Đặc điểm 4

1.3 Lịch sử 4

1.4 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh ở khoai tây 5

1.5 Giá trị dinh dưỡng 5

1.6 Di truyền học 6

1.7 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới 7

1.8 Tình hình sản xuất khoai tây trong nước 8

2 Sự tự bất hơp SI ở khoai tây 9

2.1 Sự tự bất hợp SI 9

2.2 Phát hiện sự đa dạng alen S-RNase ở loài khoai tây lưỡng bội 9

2.2.1 Giới thiệu chung 9

2.2.2 Nguyên liệu và phương pháp 9

2.2.3 Kết quả 12

3 Phát hiện bệnh mốc sương mai ở khoai tây 17

3.1 Bệnh mốc sương mai 17

3.2 Lịch sử phát hiện 18

3.3 Phạm vi phân bố 18

3.4 Triệu chứng 18

3.5 Phát hiện bệnh mốc sương mai ở khoai tây bằng chỉ thị phân tử DNA 19

3.5.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 19

3.5.2 Phương pháp PCR phát hiện gen kháng bệnh sương mai R1 và R3a 20

3.5.3 Phân lập mẫu bệnh sương mai khoai tây 20

3.5.4 Đánh giá bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo 21

3.5.5 Kết quả PCR phát hiện gen kháng bệnh sương mai R1 và R3a 21

4 Tài liệu tham khảo 24

4.1 Tài liệu tham khảo tiếng Anh 24

4.2 Tài liệu tham khảo tiếng Việt 24

1 Giới thiệu chung về cây khoai tây

1.1 Giới thiệu chung

Khoai tây là loài cây nông nghiệp ngắn ngày, trồng lấy củ chứa tinh bột, là loài cây trồng lấy củ rộng rãi nhất thế giới và là loại cây trồng phổ biến thứ tư về mặt sản lượng tươi xếp sau lúa, lúa mì và ngô Lưu trữ khoai tây dài ngày đòi hỏi bảo quản trong điều kiện lạnh

Hình 1 Khoai tây.

 Phân loại khoa học

Bảng 1 Phân loại khoa học

Angiospermae Eudicots Asterids

Theo Hawkerkks (1991), khoai tây được phân thành 18 nhóm, trong đó có

68 loài hoang dại, chỉ có 8 loài trồng trọt, chia thành 4 nhóm chủ yếu dựa vào

số lượng nhiễm sắc thể

 Nhóm 1: Diploids: 2n=2x=24

S.x arjanhuiri juz.et Buk

S gomiocalyx juz.et Buck

S stenotomum juz.et Buk

S phueja juz.et Buk

Trong các loài trên, loài S phueja juz.et Buk có ý nghĩa lớn nhất trong trồng trọt.

 Nhóm 2: Triploids: 2n=3x=36

S.x chaucha jux.et Buk là dạng lai tự nhiên giữa S.tuberosum subp.Andigena và S.stenotomum.

S.xjuzepczukii Buk là dạng lai tự nhiên giữa S.acuale và S.snenotomum, phân bố ở

trung Peru đến Nam Bolivia, có khả năng kháng bệnh sương mai

 Nhóm 3: Tetraploisd: 2n=4x=48

Loài S.tuberosum L và 2 loài phụ là: Phân loài tuberosum và Phân loài

Andigena (juz.et Buk) Hawkes

 Nhóm 4: Pentaploids: 2n=5x=60

Loài S.x curtilobum juz.et Buk.

1.2 Đặc điểm

Cây khoai tây là cây lưu niên thân thảo có chiều cao khoảng 60cm, cây chếtsau khi ra hoa Hoa khoai tây có màu trắng, hồng, đỏ, xanh hoặc màu tím, nhụyhoa màu vàng Khoai tây được thụ phấn chủ yếu bởi côn trùng, ong vò vẽmang phấn hoa từ cây này đến cây khác, tuy nhiên cũng xảy ra hiện tượng tựthụ phấn.Sau khi khoai tây ra hoa, một số giống cho quả màu xanh lá cây giốngmàu xanh cà chua anh đào, có thể chứa 300 hạt Quả khoai tây chứa một lượnglớn alkaloid, solanine nên không dùng để ăn được

Rễ khoai tây trồng từ củ giống chỉ phát triển rễ chùm, có rễ cọc khi trồng bằng hạt, từ rễ cọc phát triển nhiều rễ phụ khác Ở các thân ngầm dưới mặt đất cũng có khảnăng ra rễ, nhưng rễ ngắn và ít phân nhánh Bộ rễ phân bố chủ yếu trên đất canh tác 0-40cm, nhưng rễ có thể ăn sâu tới 1,5-2m Thân khoai tây mọc thẳng, đôi khi có cấu tạo zick zac, có 3-4 cạnh, cao trung bình từ 40-70cm đến 1-1,2m Phụ thuộc vào giống, thời kỳ chăm sóc mà chiều cao cây có thể khác nhau Thân thường có màu xanh hoặc xanh nhạt hay đậm, đối khi có màu phớt hồng hoặc tìm tùy thuộc vào giống Là hình thành và hoàn thiện theo sự tăng trưởng của cây, bản lá to, lá kép xẻ lông chim, có 3-7 đôi mọc đối xứng qua trục và một lá lẻ trên cùng thường lớn hơn gọi là lá chét đỉnh, màu sắc lá phụ thuộc vào giống, thời vụ, điều kiện chăm sóc mà

có thể màu xanh, xanh đậm hoặc xanh nhạt Hoa khoai tây thường mọc tập trung trên một chùm hoa Nó thuộc loại hoa lưỡng tính và có cấu tạo 5:5:5, cuống ngắn Màu sắc hoa thường trắng, cũng có thể là phớt hồng, tím, hồng, vàng và đỏ phụ thuộc vào từng loại và giống Quả khoai tây thuộc loại quả mọng, quả có dạng hình cầu, hình trứng hoặc hình nón Vỏ quả có màu xanh đôi khi có xọc vằn hoặc đóm, trong quả có hai ngăn chứa hạt và thịt quả Hạt khoai tây thuộc loại rất nhỏ, trọng lượng 1000 hạt chỉ đạt khoảng 0,7-1g Hạt có dạng ovan dẹt, bên ngoài là vỏ, bên trong có nội nhũ và phôi Phôi khoai tây có hình chữ U, bên trong chứ hai lá mầm phôi và rễ mầm Củ khoai tây còn có tên gọi là thân củ hay thân ngầm bởi củ được hình thành là do thân phát triển trong điều kiện bóng tối Hình dạng củ khoai tây có thể là tròn, elip, tròn dài, đôi khi là hình vuông Màu sắc củ tùy thuộc vào từng giống,

có thể màu trắng, màu trắng nhạt, vàng hay vàng nhạt Mầm khoai tây phát triển từ điểm sinh trưởng của mắt củ là cơ quan sinh sản vô tính của khoai tây Màu sắc của mầm khác nhau phụ thuộc vào từng giống có thể màu trắng hoặc màu tím, khi gặp ánh sáng mầm có màu xanh

1.3 Lịch sử

Khoai tây có nguồn gốc từ Peru, trong nghiên cứu được David Spooner xuất bảnnăm 2005 thì khoai tây có nguồn gốc từ một khu vực phía nam Peru Hiện tại,người ta cho rằng khoai tây đã được du nhập vào châu Âu vào khoảng thậpniên 1570 và sau đó nó đã được những người đi biển châu Âu đưa đến các lãnhthổ và các cảng trên khắp thế giới khi chế độ thực dân châu Âu mở rộng vàothế kỷ XVII và XVIII Có hàng ngàn bậc phân dưới loài khoai tây được tìmthấy ở Andes, nơi người ta có thể tìm thấy hơn một trăm thứ khoai tây ở mộtthung lũng, mỗi hộ nông dân có thể tích trữ tới mười mấy loại khoai tây khác

nhau Năm 1845, một loại bệnh do nấm Phytophthora infestans đã lan ra nhanh

chóng khắp khu vực tây Ireland, dẫn đến nạn đói lớn ở Ireland

1.4 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh ở khoai tây

 Nhiệt độ

Nhiệt độ trong vụ trồng khoai tây là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khảnăng phân bố, thời vụ gieo trồng, quá trình sinh trưởng, phát triển và nắng suấtcủa cây Tổng nhu cầu nhiệt cho khoai tây sinh trưởng và phát triển dao động

từ 16oC-18oC Nhiệt độ trong vụ trồng bình quân dao động 16oC-18oC là thíchhợp và cho năng suất cao nhất Các thời kỳ sinh trưởng và phát triển khác nhau

sẽ yêu cầu điều kiện nhiệt độ khác nhau

- Hạt nảy mầm ở nhiệt độ tối thiểu 12oC-15oC và nhiệt độ thích hợp nhất là

18oC-22oC Nhiệt độ lớn hơn 25oC làm mầm phát triển chậm và dễ thối

- Thời kỳ sinh trưởng thân lá nhiệt độ thích hợp là 20oC-22oC

- Thời kỳ phát triển củ yêu cầu thời gian chiếu sáng ngắn để thúc đẩy hìnhthành thân và củ

 Ánh sáng

Khoai tây là cây ưa sáng, cường độ ánh sáng thích hợp cho khoai tây sinhtrưởng và cho năng suất cao là từ 40.000-60.000 lux Thời kỳ cây non đến giaiđoạn hình thành củ khoai tây đòi hỏi ánh sáng ngày dài để quang hợp và tíchlũy chất dinh dưỡng, đồng thời ra hoa, đậu quả Thời kỳ sinh trưởng sinh thực

và khi củ bắt đầu hình thành, cây khoai tây cần có thời gian chiếu sáng ngắn

 Độ ẩm

Khoai tây là cây có bộ rễ ăn nông, chính vì vậy trong thâm canh để nâng caonăng suất cần phải cung cấp nước thường xuyên cho cây để cây sinh trưởngphát triển tốt Các thời kỳ sinh trưởng khác nhau yêu cầu về nước cũng khácnhau Thời kỳ trồng đến xuất hiện tia củ cần đảm bảo độ ẩm tối thiểu 60-80%.Thời kỳ phát triển củ cần giữ độ ẩm 80% Thiếu nước hoặc thừa nước ảnhhưởng xấu đến sinh trưởng và phát triển của cây

 Đất trồng và pH đất

Đất trồng khoai tây thích hợp nhất là đất phù sa nhẹ, đất cát pha, đất nhẹ tơi xốp

có lượng mùn cao, lớp đất canh tác dày, giữ ẩm tốt, tưới tiêu tốt Khoai tây cóthể phát triển trên đất có pH từ 4,8-7,1; pH lý tưởng đối với cây khoai tây là5,2-6,4 Nếu pH trên 7 cây khoai tây dễ bị nhiễm bệnh ghẻ củ

1.5 Giá trị dinh dưỡng

Khoai tây vừa là cây lương thực, vừa là cây thực phẩm có giá trị dinh dưỡngcao, hàm lượng dinh dưỡng của khoai tây chỉ kém trứng Sử dụng 100g khoaitây có thể đảm bảo ít nhất 8% nhu cầu protein, 3% năng lượng, 10% sắt, 10%vitamin B1, 20-50% nhu cầu vitamin C cho một người trong ngày đêm Khixem xét các cây trồng nhiệt đới và cận nhiệt đới, cây khoai tây sinh lợi hơn bất

cứ cây trồng nào khác vì đem lại năng lượng protein cao nhất Trong khoai tây

có nhiều chất chống oxy hóa, có khả năng ngăn ngừa lão hóa, hạn chế sự pháttriển của ung thư và một số bệnh khác Đã phát hiện ra rằng tác dụng giảm ungthứ tuyến tiền liệt khi hấp thụ khoai tây thường xuyên Nước ép củ khoai tây cótác dụng trung hòa độ axit cao trong dạ dày, kích thích tiêu hóa, chữa viêmtuyến dịch vị

1.6 Di truyền học

 Đặc tính sinh sản

 Giao tử 2n

Sự đa dạng của khoai tây liên quan đến địa lý sự phân bố và sự biến đổi của loài.Khoai tây được trồng phổ biến gồm các thể lưỡng bội (2n=24), thể tứ bội(2n=48), thể ngũ bội (2n=60) Giao tử 2n là các nhiễm sắc thể xôma (somaticchromosome number), thường bị nhầm lẫn với các giao tử không giảm phân.Giao tử không giảm phân là giao tử không có sự tái tổ hợp di truyền trong quátrình hình thành giao tử, không có quá trình giảm phân Giao tử 2n đã được sửdụng để tạo ra thể lưỡng bội trong nhân giống ở nhiều đơn vị phân loại củathực vật bậc cao, góp phần tạo ra sự đa bội hóa và có khả năng di truyền từ đơnbội sang đa bội

 Đơn bội

Đơn bội từ thể tứ bội là thể lưỡng bội xảy ra trong tự nhiên Các đơn bội từ các

tứ bội thường không ra hoa, bất dục đực do giao phối cận huyết trog quá trìnhđơn bội hóa Chọn lọc các thể đơn bội, các dòng nhân lưỡng bội thu được cóthể có các biến dị di truyền lưỡng bội hoang dã, con lai F1 giữa cá thể đơn bội

và loài hoang dã có thể được sử dụng làm cấu nối chuyển các tính trạng có lợi

từ thể lưỡng bội sang thể tứ bội Ngoài ra, kiểu đơn bội này được sử dụng đểnghiên cứu sự phân li của các tính trạng ở mức độ tứ bội nếu tạo ra nhiều kiểugen đơn bội từ một kiểu gen ở thể tứ bội

 Sự tự bất hợp

Sự tự bất hợp xảy ra ở các loài Solanum mang củ, đặc biệt là ở mức lưỡng bội S-locus điều khiển sự tự bất hợp SI ( Self- Incompatibility) gồm hai gen liên kết

chặt: S-RNase (S-locus-RNase) và multiple SLFs (S-locus F-box protein)

Trong locus S với nhiều alen kiểm soát gametophytic self-incompatibility Cấu

trúc gen của locus S bao gồm alen S2 với exon và intron có tổng kích thước là786bp Vị trí locus S được xác định nằm trên nhiễm sắc thể I

 Bộ gen

Bản đồ gen khoai tây đầu tiên được báo cáo vào năm 1988 sử dụng chỉ thịRELP đánh dấu

Bảng 2 Các loại chỉ thị và bản đồ gen

1.7 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới

Sản xuất khoai tây trên thế giới đã trải qua những thay đổi lớn Tính đền đầunhững năm 1990, hầu hết khoai tây đã được trồng và tiêu thụ ở châu Âu, Bắc

MỸ, và các nước thuộc Liên Xô cũ Kể từ đó, đã có một sự gia tăng đáng kể trong sản xuất và nhu cầu ở châu Á, châu Phi, Mỹ Latinh, sản lượng khoai tây tăng từ dưới 30 triệu tấn vào đầu năm 1960 và hơn 165 triệu tấn vào năm 2007

Hình 2 Bản đồ phân bố địa lý trông khoai tây trên toàn thế giới.

(Nguồn: RTB Maps) Châu Á và châu Âu là hai khu vực sản xuất khoai tây lớn, chiếm hơn 80% sản lượng thế giới trong năm 2007 Trong khi châu Phi và châu Mỹ Latinh diệntích trồng chiếm khoảng hơn 20% của toàn thế giới Bắc Mỹ là nơi sản xuất khoai tây đứng đầu thế giới với hơn 40 tấn/ha Châu Á chiếm gần một nửa nguồn tiêu thụ khoai tây của thế giới, nhưng dân số lớn nên sức tiêu thụ bình quân trên đầu người ở mức khiêm tốn 24kg vào năm 2005

1.8 Tình hình sản xuất khoai tây trong nước

Sản xuất khoai tây tại Việt Nam đã đạt đỉnh điểm vào những năm 1979 và 1980sau đó giảm dần Một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến năng suất thấp và diện tích trồng giảm dần do thiếu nguồn củ giống tốt

Hình 3 Diễn biến diện tích, sản lượng khoai tây ở Việt Nam giai đoạn 2009-2013

(Nguồn: FAOSTAT.2014) Diện tích trồng và sản lượng khoai tây tăng dần qua các năm từ năm 2009 tới năm

2012 nhưng không đáng kể tới năm 2013 diện tích trồng khoai tâu giảm tới 42%nhưng năng suất lại tăng gần 20% so với năm 2012 Diện tích trồng giảm nhưng năngsuất không giảm theo, đây là một tín hiệu đáng mừng cho ngành sản xuất khoai tây ở

nước ta Tuy nhiên, sản xuất khoai tây còn gặp nhiều khó khăn trong quá trình sảnxuất cũng như chọn tạo giống Giống khoai tây thường bị thoái hóa do điều kiệnngoại cảnh và đặc biệt là thoái hóa do virus

2 Sự tự bất hơp SI ở khoai tây

2.1 Sự tự bất hợp SI

Sự tự bất hợp hay Self-incompatibility (SI) là tên gọi chung cho một số cơ chế di

truyền ở thực vật hạt kín, ngăn cản quá trình tự thụ tinh và do đó khuyến khíchlai xa và dị hợp Không nên nhầm lẫn nó với các cơ chế vật lý kiểm soát ditruyền ngăn cản quá trình tự thụ phấn như là heterostyly, sequantialhermaphroditism (dichnogamy)

Đối với thực vật sự tự bất hợp, xảy ra khi hạt phấn của cùng một cây hay trênmột cây khác có cùng kiểu gen hay alen Các cơ chế được nghiên cứu chỉ ra sự

tự bất hợp SI ức chế sự nảy mầm của hạt phấn trên vòi nhụy, ảnh hưởng đến sựkéo dài của ống phấn Locus S chứa hai vùng mã hóa protein cơ bản- một vùngbiểu hiện trong nhụy hoa và vùng kia trong bao phấn ( được gọi là các yếu tốquyết định đực và cái)

Trong gametophytic self-incompatibility (GSI), kiểu hình tự bất hợp của hạt

phấn được quyết định bởi kiểu gen đơn bội của giao tử đó Đây là loại SI phổ

biến nhất Cơ chế RNase được tìm thấy ở Solanaceae được tìm thấy vào năm

1989 Trong cơ chế này, ống phấn phát triển không bình thường, S-RNase cóthể gây ra sự thoái hóa RNA ribosome bên trong ống phấn, ngăn chặn sự kéodài của ống phấn và hạt phấn có thể bị chết đi

2.2 Phát hiện sự đa dạng alen S-RNase ở loài khoai tây lưỡng bội

2.2.1 Giới thiệu chung

Phần lớn các loài thực vật có hoa là lưỡng tính, và các cơ quan sinh sản củachúng nằm gần nhau dẫn tới xảy ra các quá trình tự thụ phấn Tuy nhiên do tácđộng có hại của quá trình tự thụ tinh và giao phối cận huyết, các loài thực vật

đã phát triển một số cơ chế, trong đó phổ biến nhất là sự tự bất hợp Sự tự bấthợp là một hiện tượng ngăn cản sự tự thụ tinh giúp cho nhụy hoa có thể phânbiệt được tự thụ phấn và giao phấn, dẫn đến việc chọn lọc khi bắt giữ các hạtphấn Tùy thuộc vào cơ chế kiểm soát di truyền sự tương đồng trong phấn hoa,thực vật được phân loại là có cơ chế phát sinh thể bào tử hoặc giao tử Sự tiếnhóa của các cơ chế ngăn chặn giao phối cận huyết ở thực vật có hoa là nguyênnhân quan trọng dẫn đến thành công của quá trình tiến hóa của chúng, do đókhiến chúng trở thành một trong những nhóm thực vật trên cạn thành côngnhất

Tính bất hợp ở giao tử hay Gametophytic system (GSI) được tìm thấy ở trên 60 họ thực vật có hoa Họ Solananceae, Rosaceae, Plantaginaceae, Leguminoceae,

Onagraceae, Papaveraceae, Poaceae Các nghiên cứu GSI ở cấp độ phân tử cho thấy

GSI hoạt động theo hai cơ chế khác nhau để có khả năng nhận ra và loại bỏ hạt phấn tránh hiện tượng tự thụ phấn Một trong số đó là cơ chế Stylar ribonuclease (S-Nase)

đã được xác định và đặc trưng cho các thành viên của họ Solanaceae, họ Rosaceae,

họ Plantaginaceae và họ Rubiaceae Hầu hết, sự tự bất hợp ở giao tử của các loài

Solanum lưỡng bội mang củ được kiểm soát bởi S-Locus đa alen duy nhất

2.2.2 Nguyên liệu và phương pháp

 Nguyên liệu thực vật

Nghiên cứu này bao gồm nhóm Phueja, nhóm Stenotomum, và nhóm Solanum

okadae Các cây được trồng trong điều kiện nhà kính có kiểm soát ở quang chu

kỳ thời gian 16 giờ, độ dài ngày tự nhiên trong mùa hè với ánh sáng bổ sungkhi cần thiết

Bảng 3 Nguyên liệu thực vật

 Thụ phấn

Tự thụ phấn có kiểm soát và tự thụ phấn chéo được thực hiện để xác nhận sự tựbất hợp ở khoai tây Bao phấn của khoai tây là những ống rỗng có các lỗ nhỏ ởđỉnh Để thu phấn hoa từ các bao phấn hình ống này, người ta sử dụng một bộrung để rung hình nón bao phấn và phấn hoa được thu vào một ống ly tâm siêunhỏ Sau đó, phấn hoa được đưa vào đầu nhụy bàng chổi sơn sau khi nhụy đãtrưởng thành Các phép lai được kiểm tra sau khoảng 4 tuần: tự bất hợp nếukhông có phôi (no berry or no seed set) hoặc tính tương hợp khi quả mọng(berry or seed set) được hình thành

 Tách chiết DNA

DNA bộ gen được chiết tách để định kiểu gen PCR cụ thể cho alen từ các

con lai S.okadae thu được đã phân ly mang các alen S khác nhau Hai đĩa lá có

trọng lượng khoảng 10-100mg lá non được xử lý để tách chiết DNA bằng bộkit DNeasy Plant Mini

 Tiến hành phản ứng PCR cụ thể cho alen

Các đoạn mồi định được thiết kế để cho phép khuếch đại alen cụ thể từ các conlai đã phân ly với các cơ sở S-Rnase đã biết Các loại mồi được sử dụng nhưsau:

+) So1-RNase (So1-F(5’ GGATAAGGAGGGATCACAGC 3’)

và So1-R (5’ TGTTGGCTTTGTATTTTGTAGCA 3’)

+) So2-RNase ( So2-F(5’ TGCGAGTCCGAAGACAAGTA 3’)

35 chu kỳ trong 30 giây ở 94 o C, quá trình ủ ở nhiệt độ tùy thuộc vào Tm (nhiệt độ nóng chảy) của mồi, 1 phút ở 72 o C và theo gian kéo dài cuối cùng là 7 phút ở 72 o C.

 Chiết xuất RNA

RNA được chiết từ mô nhụy hoa bằng cách sử dụng bộ RNase Plant Mini Khoảng 100mg mô, được làm lạnh trong nitơ lỏng, được nghiền thành bột mịn và được xử lý

10-để tách chiết RNA.

 Phản ứng phiên mã ngược (RT)-PCR: 3’RACE

Phản ứng phiên mã ngược (RT) được thực hiện bằng cách sử dụng mồi oligo-dT

nucleotide thymidine ở đầu 3’ Tổng hợp cDNA sợi đầu tiên được thực hiện bằng cách sử dụng Omniscrip® Reverse Transcriptase Phản ứng bao gồm 1X

RT Buffer, 0,5mM dNTPs, 1mM NotI d(T), 10U chất ức chế RNase, 4U

Omniscript Reverse Transcrptase, 1-2mg RNA tổng số biến tính ở 65oC trong 5phút trong nước không có RNase Hỗn hợp phản ứng RT được ủ ở 37oC trong một giờ để tổng hơp cDNA

Một đoạn mồi thoái hóa,

So1C2-F1.3(5’-TTTACNRTNCATGGNCTNTGGCC-3’) được thiết kế dựa trên các domain

của Solanaceae S-RNase Điều này được sử dụng để khuếch đại một phần trình

tự S-RNase từ RNA nhụy hoa bằng cách sử dụng kỹ thuật 3’RACE dựa trên RT-PCR Mồi thoái hóa (So1C2-F1.3) được sử dụng cùng với một mồi khác (5’-AACTGGAAGAATTCGCGG-3’) có cùng trình tự nhận biết như mồi oligo-dT được xử dụng trong quá trình tổng hợp cDNA sợi thứ nhất Khuếch đại RT-PCR được thực hiện trong hỗn hợp phản ứng bao gồm 2,5ml phần phản ứng RT(trong phản ứng cDNA), 30mM Tris-HCl(pH8,3), 50mM KCl, 1,5mM MgCl2, 0,2mM dNTPs, 0,4mM So1C2-F1.3 (mồi xuôi), 0,2mM mồi ngược, 2UTaq DNA polymerase Quá trình khuếch đại được mô tả như trên với nhiệt độ

ủ 55oC và thời gian kéo dài cuối cùng là 5 phút

 Phản ứng phiên mã ngược RT-PCR: 5’RACE

Các đoạn mồi đặc hiệu cho gen được thiết kế từ các trình tự từng phần được phân lập từ nhân bản 3’RACE cho các S-RNase đã được xác định và được sử dụng để nhân bản cDNA có chiều dài đầy đủ bằng kỹ thuật 5’RACE-PCR Ba mồi đặc hiệu cho So2-RNase:

 Nhân dòng vector pCR® 2.1

Các sản phẩm RACE-PCR được nhân bản bằng bộ kit nhân dòng TA

(Invitrogen).Nồng độ của sản phẩm PCR cần thiết để liên kết với 50ng vector pCR®2.1 đã được xác định, phản ứng được thiết lập (với 1ml of 10xligation buffer, 2ml of 25ng pCR®2.1 vector, 1ml of 4.0 Weiss units T4 DNA ligase) Hỗn hợp được ủ ở 14oC qua đêm, biến đổi thành các tế bào One Shot

competent cell (TOP10F’Invitrogen), sau đó đưa vào các đĩa LB có chứa

40mg/ml X-Gal, 100mM IPTG và 50mg/ml kanamycin hoặc 100mg/ml

ampicillin

 Giải trình tự các đoạn chèn plasmid

Các khuẩn lạc được sàng lọc bằng cách sử dụng mồi M13 universal primer, và DNA plasmid được chiết xuất từ các dòng dương tính giả bằng cách sử dụng QIAprep Spin Miniprep kit Trình tự của DNA được chèn vào được xác định bằng cặp mồi M13 universal primer

2.2.3 Kết quả

 Xác định trạng thái tự bất hợp và các mối quan hệ của mầm khoai tây

Các kết quả từ các dòng vô tính trong S.okadae trong bảng dưới đây cho thấy tất

cả các quá trình tự thụ phấn đều tự bất hợp Từ các phép lai, người ta quan sátthấy rằng trong số các dòng OKA7129 có khả năng mang các cặp alen S giốngnhau dựa trên giao phấn không tương đồng Các phép lai giữa OKA1 và OKA3không tạo ra bất kỳ quả nào theo cả hai hướng cho thấy các dòng vô tính nàycùng có chung một cặp alen S

Bảng 4 Kết quả thụ phấn S.okadae thu được.

 Nhân bản RT-PCR của nhụy hoa S-RNase

Khuếch đại RT-PCR nhụy hoa giả định S-RNase từ S.tuberosum Group

Stenotomum, S.tuberosum Group Phureja và S.okadae có kích thước dự kiến là

khoảng 850bp cho cả 3 vật liệu trên