CÔNG NGHỆ NUÔI cấy mô tế bào THỰC vật CHỦ đề cảm ỨNG RA HOA IN VITRO TRÊN cây HOA HỒNG

Đặt vấn đề Rất nhiều loài hoa và cây cảnh đã được nuôi cấy in vitro thành công nhưng hầu hết các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức vi nhân giống mà chưa được khai thác về khía cạnh điều

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

STT Họ & Tên Mã sinh viên Lớp

DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM

3 Lịch sử hình thành

Trong lĩnh vực hoa cây cảnh, nuôi cấy in vitro đã

khẳng định vai trò không thể thay thế và đem lại

hiệu quả kinh tế to lớn

Trong lĩnh vực hoa cây cảnh, nuôi cấy in vitro đã

khẳng định vai trò không thể thay thế và đem lại

hiệu quả kinh tế to lớn

1 Đặt vấn đề

Rất nhiều loài hoa và cây cảnh đã được nuôi cấy in vitro thành công nhưng hầu hết các nghiên cứu mới

chỉ dừng lại ở mức vi nhân giống mà chưa được

khai thác về khía cạnh điều khiển ra hoa in vitro.

Trong các nghiên cứu về sinh lý thực vật được xem là rất quan trọng với mục đích tìm ra

nguyên lý, cơ chế của tự nhiên để có sự lựa chọn phù hợp khi tác động lên thực vật với

những mục tiêu xác định

“ Cơ chế của sự nở hoa ở thực vật” được xem

xét ở góc độ in vitro các nhà nghiên cứu đã

tìm ra nhiều phát sinh hình thái ở thực vật, tránh sự tác động của các chất được sản sinh

in vivo từ lá và rễ.

1 Đặt vấn đề

Để phục vụ nhu cầu thưởng thức, thưởng ngoạn hoa đa dạng, ngày nay, ngoài các phương thức trồng hoa trên giá thể truyền thống là đất thì phương thức trồng hoa trong môi trường nhân

tạo đang rất được quan tâm

Để phục vụ nhu cầu thưởng thức, thưởng ngoạn hoa đa dạng, ngày nay, ngoài các phương thức trồng hoa trên giá thể truyền thống là đất thì phương thức trồng hoa trong môi trường nhân

tạo đang rất được quan tâm

Tuy nhiên, vai trò của các yếu tố tham gia điều khiển

quá trình ra hoa in vitro ở cây trồng như quang chu kỳ,

nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng cũng như thành phần đa, vi lượng trong môi trường nuôi cấy cần được

tiếp tục nghiên cứu và làm rõ

Tuy nhiên, vai trò của các yếu tố tham gia điều khiển

quá trình ra hoa in vitro ở cây trồng như quang chu kỳ,

nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng cũng như thành phần đa, vi lượng trong môi trường nuôi cấy cần được

tiếp tục nghiên cứu và làm rõ

Hiện nay ở Việt Nam đã có những hiểu biết bước

đầu về cơ chế hình thành hoa in vitro

Hiện nay ở Việt Nam đã có những hiểu biết bước

đầu về cơ chế hình thành hoa in vitro

1 Đặt vần đề

Hoa hồng là một trong những loài hoa phổ biến nhất thế giới bởi màu sắc đa dạng, hình dáng đẹp

và hương thơm quyến rũ

Hoa hồng là một trong những loài hoa phổ biến

nhất thế giới bởi màu sắc đa dạng, hình dáng đẹp

và hương thơm quyến rũ

Hoa hồng được trồng khắp mọi nơi làm hoa cắt

và hoa trồng chậu đem lại giá trị kinh tế cao

Hoa hồng được trồng khắp mọi nơi làm hoa cắt

và hoa trồng chậu đem lại giá trị kinh tế cao

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định được ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và các yếu

tố vi lượng đến quá trình ra hoa ở một số giống hoa hồng thương mại, tạo cơ sở cho việc phát triển các quy

trình kỹ thuật chủ động điều khiển ra hoa in vitro trên

2 Nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.

Bao gồm:

Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành

Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.

Nuôi cây phôi: phôi non và phôi trưởng thành

Nuôi cấy mô sẹo (callus)

Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào)

Nuôi cấy Protoplast: nuôi cấy phần bên trong của tế bào

thực vật sau khi tách vỏ, còn gọi là nuôi cấy tế bào trần.

2 Nuôi cấy mô thực vật

Các nghiên cứu về sự nở hoa trong ống nghiệm

thường được tiến hành theo một trong ba hướng sauBao gồm:

Nuôi cấy thực vật hoàn chỉnh (Cây in vitro có đầy

đủ rễ, thân, lá)

Nuôi cấy mô dạng chồi và cụm chồi

Nuôi cấy các bộ phận của thực vật chưa có đỉnh sinh trưởng (Mô sẹo, mô lá, rễ, cơ quan hoa, tế bào trần )

Lịch sử hình thành

3

1938

1939 1902 1922 1934 1941 1948 1955 1957

Học thuyết hiện đại về tế bào học được công

bố do hai nhà khoa học M.J Scleiden (nhà nghiên cứu thực vật) và T Schwann (nhà nghiên cứu động vật) đề xuất:“Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin có trong tế bào đầu tiên và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể“

M.J Scleiden T Schwann

Nhà khoa học Haberlandt lần đầu tiên đưa

các giả thuyết của Scleiden và Schwann

vào thực nghiệm

Haberlandt cho rằng: có thể tạo cá thể hoàn

chỉnh từ việc nuôi cấy tế bào

Tuy nhiên, Haberlandt đã không thành

công trong việc nuôi cấy tế bào thực vật do

những hạn chế về phương tiện kỹ thuật,

kiến thức khoa học thời bấy giờ. Haberlandt

Năm 1922, Kotte nhà khoa học Mỹ lặp lại thí nghiệm của Haberland với đỉnh sinh trưởng tách

từ đầu rễ loài cây họ hoà thảo Trong môi trường lỏng có chứa dinh dưỡng khoáng và đường glucose, đầu rễ sinh trưởng rất mạnh tạo thành một hệ rễ bao gồm cả rễ phụ Tuy vậy, sinh trưởng của mẫu tồn tại một thời gian, sau đó chậm dần và ngừng lại, mặc dù tác giả đã chuyển qua môi trường mới

Kotte

Năm 1934, giai đoạn thứ hai trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật.

Gautheret tiến hành các nghiên cứu và thành công nuôi cấy mô phân sinh (tượng tầng) một số cây thân gỗ Gautheret xác nhận tác dụng của chất kích thích sinh trưởng trên mô sẹo của IAA và nhóm 3 vitamin do White khởi xưởng Cùng với Nobercourt (1939), Gautheret thành công trong việc duy trì sinh trưởng của

mô sẹo cà rốt trên môi trương rắn có chứa thạch agar

Năm 1941, nhà khoa học Overbeck chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi từ mẫu cây họ cà.

Frederick Campion Steward

Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt Sau

đó nhiều chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin

đã được nghiên cứu và tổng hợp thành công.

Folke K Skoog

Nhà khoa học Skoog phát hiện vai trò của

một hợp chất có tác dụng kích thích phân

bào, và đặt tên là Kinetin Sau này, các nhà

khoa học nghiên cứu tỉ mỉ hơn vai trò của

Kinetin và xếp vào nhóm cytokinin Đây là

những tiền đề kỹ thuật cho xác lập môi

trường nuôi cấy cho nhiều loài thực vật.

Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin đối với sự hình thành mô sẹo cây thuốc lá Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, mô sẹo có xu hướng tạo

rễ Ngược lại nếu tỷ lệ kinetin/auxin tăng lên, mô sẹo phát sinh chồi.

Carlos O Miller

White - nhà khoa học Mỹ, nuôi cấy thành công trên cây cà chua với môi trường lỏng chứa dinh dưỡng khoáng, đường và dịch chiết nấm men và

có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp ba loại vitamin nhóm B.

Went & Thimann phát hiện chất điều hoà sinh trưởng (hormon) đầu tiên

acid-B-indolacetic (1AA).

Lịch sử hình thành 3

1958 1960 1966 19671968 19711972 1977 19801992 Now

Kerint và Sterward tạo được phôi và cây hoàn chỉnh từ tế bào thượng tầng cây cà rốt

Năm 1966, Guha và cộng sự thành công trong nuôi cây tạo cây đơn bội

Từ năm 1980 đến 1992 có nhiều thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật

Hiện nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật đang ở giai đoạn thứ 4, nuôi cấy mô được ứng dụng khá phổ biến trong nhân giống cây trồng, chọn tạo giống, tạo đột biến, tạo sinh khối, sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học các ứng dụng về nuôi cấy mô tế bào thực vật nói riêng và công nghệ tế bào thực vật nói chung đang trở thành công cụ có hiệu quả trong việc tạo ra sản phẩm đặc thù phục vụ con người.

Năm 1960 Morelddax thành công trong nhân

giống in vitro loài lan Cymbidium từ mẫu

nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng

Nhà khoa học Cooking lần đầu tiên dùng enzyme phân hủy thành tế bào và tạo ra số lượng lớn tế bào trần trên nhiều loại cây trồng khác nhau.

Năm 1967- 1968, lần lượt Nichko Nakato và cộng sự tạo được cây đơn bội từ bao phấn hoa thuốc lá

Năm 1971, Takebe tái sinh thành công cây thuốc lá từ tế bào trần

Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào soma hai loài khác nhau, tạo được cây từ dung hợp tế

bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana

glauca và N langsdorfi

4.1 Tính toàn năng của tế bào

4 Cơ sở kỹ thuật

Haberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.

Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng

rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh

Đó là tính toàn năng của tế bào

4.2 Sự phân hóa tế bào

4 Cơ sở kỹ thuật

Sự phân hóa tế bào là quá trình tế bào trải qua quá trình thay đổi về cấu trúc, hình dạng để thực hiện chức năng đặc thù nhất định.

Ví dụ: Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm chức năng dẫn nước và dẫn dinh dưỡng

Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị:

Tế bào phôi sinh → Tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt.

5 Chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật

Một khi thực vật đạt được độ tuổi nở hoa, các yếu tố môi trường như nhiệt độ ánh sáng và chất dinh dưỡng

có thể ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành và biệt hóa chồi hoa

Những ảnh hưởng này được thực vật cảm nhận gián tiếp thông qua các chất có tác dụng kích thích hoặc ức chế sự nở hoa trong cơ thể chúng

Năm 1937, Chailakhyan đã đưa ra giả thuyết hormon chuyên biệt cho sự nở hoa, nhưng đến nay vẫn chưa tổng hợp được chất này

Tuy nhiên, qua nhiều nghiên cứu cho thấy sự nở hoa dường như là kết quả của sự tương tác giữa các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như cytokinin, auxin,

GA, ethylene, acid abscisic (ABA) và những chất khác

đã biết hoặc chưa biết

Điều này càng thể hiện rõ hơn qua các nghiên cứu khảo sát sự nở hoa trong ống nghiệm và vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng có vị trí quan trọng

5 Chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormon liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô.

BA hay 6-benzyladenin là cytokinin nhân tạo

TDZ hay Thidiazuron có tác dụng như cytokinin nhưng không là dẫn xuất của adenine Ở nồng độ thấp, TDZ cảm ứng tái sinh chồi trực tiếp Ở nồng độ cao, TDZ cảm ứng hình thành mô sẹo và những cấu trúc bất thường Ở nồng độ quá cao, TDZ cảm ứng hình thành mô sẹo và phôi sinh dưỡng từ mô sẹo

Bổ sung BA, TDZ vào môi trường nuôi cấy có tác dụng

kích thích sự ra hoa in vitro như cây hoa hồng (Wang et al.,

2002; Kantamaht et al., 2010)

5 Chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật

• Các nguyên tố khoáng vi lượng được sử dụng ở nồng độ

thấp hơn 30mg/lít môi trường, các nguyên tố thường sử

dụng là Fe, B, Mn, I, Mo, Zn, Ni, Co

• Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động

của enzyme

6 Chất khoáng vi lượng

Bảng 1 Chất khoáng vi lượng thường dùng trong nuôi cấy mô

6 Chất khoáng vi lượng

• AgNO3 và CoCl2 là hai chất có

khả năng điều khiển quá trình sinh

trưởng, phát triển của chồi thông

qua tác động vào quá trình trao

đổi ethylene (Biddington, 1992)

• Bổ sung hai hợp chất này vào môi

trường nuôi cấy có thể phát sinh

cơ quan, cảm ứng ra hoa sớm

thông qua ức chế hoạt động của

nghiên cứu của tác giả Pua EC, Chi GL

(1976a).

7.1 Mục tiêu và yêu cầu7.1 Mục tiêu và yêu cầu

 Mục tiêu

• Xác định được ảnh hưởng để điều khiển sự ra hoa in vitro

tạo môi trường tối ưu để có được tỷ lệ ra hoa cao

• Thúc đẩy quá trình chọn tạo các giống hoa mới cũng như làm đa dạng hóa sản phẩm và đáp ứng nhu cầu về chơi và thưởng thức hoa

• Xác định nguyên lý, cơ chế nở hoa ở thực vật trong điều

 Vật liệu nghiên cứu: Nghiên cứu sử dụng đoạn thân bánh

tẻ chứa mầm ngủ ba giống hoa hồng vàng, hồng đỏ và hồng trắng thu thập tại Mê Linh - Vĩnh Phúc

 Phương pháp nghiên cứu

• Đoạn thân bánh tẻ mang mắt ngủ (không quá già cũng không quá non), không sâu bệnh, sinh trưởng tốt được rửa sạch dưới vòi nước, ngâm trong xà phòng loãng 15 phút, rồi rửa lại dưới vòi nước chảy đến khi sạch xà phòng

• Sau đó, trong tủ cấy vô trùng, mẫu được ngâm trong cồn 70% trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng trước khi được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 15 phút

và cuối cùng được rửa bằng nước cất vô trùng từ 3-5 lần

7.2 Vật liệu và phương pháp

 Tạo vật liệu khởi đầu và điều khiển ra hoa in vitro

• Đoạn thân hoa hồng sau khi khử trùng được chuyển sang môi trường MS + 30g/l sucrose trong ba tuần để cảm ứng tạo chồi

• Các chồi sinh trưởng, phát triển khỏe mạnh, thân mập có từ

3-4 lá, cao 1-1,5cm sau đó được chuyển sang môi trường MS+30g/l sucrose có bổ sung BA, TDZ, AgNO3, và CoCl2 ở các nồng độ khác nhau để kích thích chồi hoa hồng ra hoa

trong điều kiện in vitro

• Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH 5,8 trước khi hấp

khử trùng ở nhiệt độ 121℃C trong 20 phút

• Điều kiện nuôi cấy in vitro: 16h sáng/8h tối, cường độ ánh

sáng 2000-2500lux, nhiệt độ 25±2℃C

7.2 Vật liệu và phương pháp

 Bố trí thí nghiệm, theo dõi và xử

lý số liệu

• Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại

30 mẫu

• Các chỉ tiêu được theo dõi và đo đếm sau 3-10 tuần tùy từng thí nghiệm

• Số liệu được xử lý thống kê theo chương trình Excel và

IRRISTAT 5.0

7.3 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh

trưởng và chất khoáng vi lượng đến sự ra

hoa in vitro ở cây hoa hồng

• Hình 4 Bài báo nghiên cứu

của Kantamaht et al (2010)

đã điều khiển ra hoa in vitro

cây hoa hồng giống Rosa

• BA không có tác động cảm

ứng ra hoa in vitro ở cả ba

giống hoa hồng này Tỷ lệ

chồi ra hoa in vitro là 0% ở tất

• Điều này chứng tỏ, bên cạnh

chất điều tiết sinh trưởng,

phản ứng ra hoa in vitro của

hoa hồng phụ thuộc rất lớn

vào kiểu gen

Hình 5 Nhiễm sắc thể chứa

gen.

Bảng 2 Thể hiện tỷ lệ chồi ra hoa của các giống hồng đang

nghiên cứu

BA

(mg/l)

Hoa hồng trắng

Hoa hồng vàng

Đối với tác dụng kích

thích sự ra hoa in vitro,

đã có nhiều nghiên cứu

thành công khi bổ sung

TDZ vào môi trường

• Hình 9 Vu et al

(2006) đã cảm ứng thành công ra hoa

in vitro cho hoa

hồng trên môi

trường ½ MS + 0,2; 0,5 hoặc 1,0 mg/l TDZ với tỷ lệ hình thành hoa đạt 11,1; 12,5 và 25%

TDZ có ảnh hưởng khác

nhau đến ra hoa in vitro

của các giống hoa hồng nghiên cứu

Khác với trường hợp bổ sung BA, bổ sung TDZ đã

kích thích sự ra hoa in vitro của giống hoa hồng

vàng với tỷ lệ chồi ra hoa dao động từ 55,6-72,2% trên môi trường bổ sung 0,2-0,6 mg/l TDZ

Tỷ lệ chồi ra hoa đạt cao nhất (72,2%) tại nồng độ 0,2 mg/l TDZ

Bảng 3 Ảnh hưởng của TDZ đến ra hoa in vitro của

các giống hồng đang nghiên cứu sau 6 tuần nuôi cấy.