Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bản địa có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA để canh tác rau ở sóc trăng

1.2 Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn bản địa có hai chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA trong các hệ IMO thu thập từ đất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Người hướng dẫn chính: PGS TS Nguyễn Khởi Nghĩa

Người hướng dẫn phụ: TS Phạm Ngọc Tú

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp cơ sở

Họp tại: Phòng Bảo vệ Luận án Tiến sĩ, Lầu 2 – Nhà Điều hành, Trường Đại học Cần Thơ

Vào lúc 14 giờ 00 phút ngày 21 tháng 11 năm 2020

Phản biện 1: GS TS Ngô Ngọc Hưng

Phản biện 2: TS Vũ Tiến Khang

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

Trung tâm học liệu, Trường Đại học Cần Thơ

Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 Le Thi Xa, Ngo Thi Phuong Thao , Nguyen Khoi Nghia, 2018 Phosphate

solubilization, indole-3-acetic acid synthesis and nitrogen fixation of various indigenous microorganisms communities from different agri-ecosystem habitats Cantho University Journal of Science, Vietnam 54 (special issue on Agriculture):39-48

2 Le Thi Xa and Nguyen Khoi Nghia, 2019 Isolation and selection of

biological nitrogen fixing and indole-3-acetic acid synthesizing bacteria from different cropping systems in Soc Trang province, Vietnam International Journal of Innovative Studies in Sciences and Engineering Technology (IJISSET); 5(11):15-23

3 Le Thi Xa and Nguyen Khoi Nghia, 2020 Microbial diversity of

indigenous microorganism communities from different agri-ecosystems in Soc Trang province, Vietnam Journal of Science Ho Chi Minh City Open University 10(1):42-51

4 Le Thi Xa, Nguyen Khoi Nghia, 2020 Antagonistic activity against plant

pathogenic fungus by various indigenous microorganisms from different cropping systems in Soc Trang province, Vietnam Environment and Natural Resources Journal; 18(3):249-256

5 Lê Thị Xã, Đỗ Thành Luân và Nguyễn Khởi Nghĩa, 2020 Khảo sát khả

năng kích thích nảy mầm và sinh trưởng rau muống của một số dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 56(Số chuyên đề: Khoa học đất):37-46

6 Lê Thị Xã và Nguyễn Khởi Nghĩa, 2019 Khảo sát chức năng có lợi cho

cây trồng của một số hệ vi sinh vật bản địa thu thập từ đất ở các mô hình cây trồng khác nhau thuộc tỉnh Sóc Trăng Kỷ Yếu Hội Thảo Khoa Học Quốc Gia:

“Ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất nông nghiệp-Thuỷ sản bền vững”; NXB Nông Nghiệp:55-65

7 Le Thi Xa, Nguyen Khoi Nghia, Huseyin Baris Tecimen, 2020 Organic

material decomposition capacity of indigenous microorganisms communities from different farming systems in Soc Trang province, Vietnam Proceedings

of 2020 Vietnam National Conference on Biotechnology "Biotechnology: from basic research to Application for industrialization and modernization" Hue University, 594-600

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay việc áp dụng vi sinh vật trong trồng trọt đang phát triển mạnh trên thế giới cũng như trong nước Do đó việc khai thác vi sinh vật bản địa (tiếng Anh: Indigenous Microorganisms, viết tắt: IMO) để ứng dụng vào sản xuất nông nghiệp giúp giảm thiểu

áp dụng các chất hóa học từ phân bón vô cơ, chất kích thích sinh trưởng cũng như giảm độc trong sản phẩm nông sản và giảm thiểu các tác động làm ô nhiễm môi trường là việc rất quan trọng và cần thiết Mặt khác, việc nghiên cứu các vi sinh vật có ích ở Sóc Trăng

sẽ góp phần tăng sản xuất rau sạch, rau an toàn cho Sóc Trăng nói chung và cho Đồng

bằng sông Cửu Long nói riêng Do đó, đề tài "Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bản địa

có khả năng cố định đạm và tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) để canh tác rau ở Sóc Trăng" cần thiết được thực hiện

1.2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn bản địa có hai chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA trong các hệ IMO thu thập từ đất canh tác các loại cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng nhằm kích thích sinh trưởng, tăng năng suất cây rau muống, cây cải xanh và giảm lượng phân bón đạm khuyến cáo ở điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng

1.3 Nội dung nghiên cứu

Có 6 nội dung nghiên cứu: (1) Khảo sát sự đa dạng các nhóm vi sinh vật trong các

hệ IMO từ đất canh tác các loại cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng; (2) Đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng gồm cố định đạm, và tổng hợp IAA của các hệ IMO thu thập; (3) Phân lập, tuyển chọn và định danh các dòng vi khuẩn bản địa có hai chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA từ các hệ IMO thu được; (4) Đánh giá ảnh hưởng của một số dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn và các IMO chứa những dòng vi khuẩn này lên khả năng nảy mầm và sinh trưởng cây rau muống và cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm; (5) Đánh giá hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn và 5 IMO chứa những dòng vi khuẩn này lên sinh trưởng và năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện nhà lưới; (6) Đánh giá hiệu quả của 3 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn và 2 IMO chứa những dòng vi khuẩn này lên sinh trưởng và năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện ngoài đồng

1.4 Đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

Luận án đã cung cấp những kết quả nghiên cứu khoa học bước đầu với một số đặc tính cơ bản của 20 hệ vi sinh vật bản địa IMO thu từ 19 hệ thống canh tác cây trồng tại Sóc Trăng Kết quả cho thấy có sự đa dạng vi khuẩn, nấm cũng như xạ khuẩn trong thành phần vi sinh vật, đồng thời không có sự hiện diện những vi sinh vật gây bệnh như

Salmonella, Shigella, Coliforms, E coli Ngoài ra, các hệ IMO còn thể hiện các chức

năng kích thích sinh trưởng cây trồng như cố định đạm và tổng hợp IAA Bên cạnh đó

các kết quả nghiên cứu về các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA trong các hệ IMO cũng như hiệu quả của chúng trong kích thích nảy mầm, sinh trưởng và làm tăng năng suất cây rau, giảm nitrate tồn dư trong rau trong khi bón giảm phân là những kết quả nghiên cứu mới về các dòng vi khuẩn đa chức năng từ các hệ IMO thu thập tại Việt Nam và đây là nghiên cứu đầu tiên và chính quy trong tuyển chọn các dòng vi khuẩn kích thích sinh trưởng, và làm tăng năng suất cây rau tại Sóc Trăng Điều này rất có ý nghĩa trong phát triển sản xuất rau sạch, rau an toàn tại tỉnh Sóc Trăng Tính mới của luận án còn thể hiện ở kết quả so sánh hiệu quả kích thích nảy mầm, sinh trưởng cây rau giữa các

hệ IMO thu thập tại Sóc Trăng với các dòng vi khuẩn có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA phân lập từ các hệ IMO này và đã cho thấy rằng cả hai (IMO và dòng vi khuẩn phân lập) cho hiệu quả kích thích nảy mầm và sinh trưởng cây rau là tương đương nhau, tuy nhiên khi so sánh về chức năng chuyên biệt như cố định đạm thì các dòng vi khuẩn phân lập cho hiệu quả kích thích sinh trưởng cao hơn so với các hệ IMO Kết quả nghiên cứu của luận án là tài liệu tham khảo tốt cho các nghiên cứu tiếp theo và làm tài liệu tham khảo trong giảng dạy cho các ngành công nghệ sinh học, nông nghiệp và sinh học khác

Về mặt ý nghĩa khoa học, các kết quả nghiên cứu của luận án là tài liệu tham khảo rất có ý nghĩa khoa học trong giảng dạy và trong nghiên cứu bởi luận án đã cung cấp cái nhìn tổng quan và chuyên sâu của các hệ vi sinh vật bản địa nói chung và hệ vi sinh vật bản địa thu thập tại các hệ thống canh tác cây trồng ở Sóc Trăng nói riêng về sự đa dạng thành phần vi sinh vật như vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn cũng như các chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của chúng bao gồm cố định đạm, tổng hợp IAA Bên cạnh đó nghiên cứu cũng đã cho thấy có sự hiện diện với mật số cao và đa dạng của nhóm vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA trong các hệ vi sinh vật bản địa IMO thu thập tại các địa điểm khác nhau trong tỉnh Sóc Trăng Ngoài ra kết quả so sánh hiệu quả kích thích nảy mầm và kích thích sinh trưởng của hệ vi sinh vật bản địa với các dòng thuần vi khuẩn phân lập về mặt lý thuyết là tương đương nhau, tuy nhiên khi so sánh về chức năng chuyên biệt là cố định đạm và tổng hợp IAA thì các dòng vi khuẩn thuần cho hiệu quả kích thích sinh trưởng tốt hơn

Về mặt ý nghĩa thực tiễn, luận án cung cấp cho ngành nông nghiệp các chủng vi khuẩn kích thích sinh trưởng dùng để làm các chế phẩm vi sinh phục vụ canh tác rau giúp tăng thu nhập cho người nông dân, giảm ô nhiễm môi trường thông qua việc giảm lượng phân bón hóa học sử dụng trong canh tác rau và tạo sản phẩm an toàn trong sản xuất nông nghiệp Trên cơ sở nghiên cứu về IMO cho thấy có thể ứng dụng IMO trong canh tác rau để góp phần thay thế hoặc giảm thiểu một phần lượng phân đạm hoá học Trong tương lai, đối với 3 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn hiệu quả khi được hoàn thiện quy mô sản xuất sẽ có tiềm năng ứng dụng cao trong việc bổ sung vi khuẩn cố định đạm vào trong đất để góp phần giảm phân đạm hoá học trong sản xuất rau theo hướng an toàn, thân thiện và bền vững cho tỉnh Sóc Trăng cũng như cho các tỉnh ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

Hiện nay, phương thức canh tác nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường sinh thái và thích ứng với biến đổi khí hậu được quan tâm và ưu tiên hàng đầu Trong nông nghiệp bền vững, áp dụng vi sinh vật kích thích sinh trưởng cây trồng (Plant Growth Promotion Microoganisms-PGPM) kết hợp với phân bón hóa học ở mức độ thích hợp được khuyến khích sử dụng để đạt được những lợi ích tối đa Vi sinh vật kích thích sinh trưởng cây trồng đặc biệt là các vi sinh vật có nguồn gốc bản địa có vai trò quan trọng trong việc kích thích sinh trưởng cây trồng cũng như cải thiện độ màu mỡ và phì nhiêu đất vì những vi sinh vật có nguồn gốc bản địa có khả năng thích nghi cao, sống sót

và phát triển tốt dưới các điều kiện bất lợi của môi trường đất, thời tiết, khí hậu và môi trường bản địa (Reddy, 2011)

Vi sinh vật bản địa (IMO) bao gồm tập hợp những vi sinh vật thu được bằng phương pháp bẫy các vi sinh vật trong đất bằng cách sử dụng gạo nấu chín làm nguồn dinh dưỡng dẫn dụ trong đó bao gồm nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn, (Kyu and Koyama, 1997; Reddy, 2011) IMO có tiềm năng ứng dụng làm phân bón sinh học, ủ phân compost sinh học, phân hủy sinh học, hoà tan lân, cố định đạm, tổng hợp hormone thực vật và đối kháng sinh học (Kumar and Gopal, 2015) Trên thực tế, những tác động tích cực của các hệ IMO đối với các tính chất vật lý, hóa học và sinh học của đất và hoạt động của enzyme đất, sức khỏe của đất và năng suất cây trồng đã được chứng minh bởi nhiều

nghiên cứu trước đó (Pham and Dok, 2009; Sumathi et al., 2012; Koon et al., 2013; Mbouobda et al., 2013; Hermann et al., 2013) Ngoài ra, Chiemela et al (2013) chỉ ra

rằng ứng dụng IMO trong nông nghiệp là phương pháp thân thiện với môi trường vì IMO giúp tăng cường tiến trình phân hủy chất hữu cơ, cung cấp chất dinh dưỡng cho cây, năng suất cây trồng và tăng độ phì của đất Như vậy, có thể thấy rằng việc tận dụng nguồn IMO trong sản xuất nông nghiệp mang lại nhiều lợi ích cho cây trồng, đất và con người, tuy nhiên, nghiên cứu về các chức năng cơ bản của các hệ vi sinh vật bản địa như cố định đạm, tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) cũng như phân lập các dòng vi khuẩn có trong các hệ IMO này có cùng lúc 2 chức năng cố định đạm sinh học và tổng hợp hormone thực vật IAA để ứng dụng trong canh tác rau và trong lĩnh vực nông nghiệp còn hạn chế

ở phạm vi cả trong và ngoài nước

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu thí nghiệm

Gạo IR50404 5% tấm, đường mía để thu thập và lên men các hệ vi sinh vật bản địa (IMO) Các hệ vi sinh vật bản địa được thu thập từ đất trồng tre, đất ruộng lúa, đất trồng rau xen canh, đất trồng rau muống, mồng tơi, xà lách, ớt, hành tím, dưa hấu, ngò gai, củ lùn, bắp đất trồng màu luân canh, đất trồng bưởi, cam, ổi, mía và đất đồng cỏ,… ở các

huyện thuộc tỉnh Sóc Trăng (Bảng 3.1)

Bảng 3.1: Địa điểm và số lượng mẫu IMO được thu thập ở các địa điểm khác nhau của

tỉnh Sóc Trăng

1 Đất trồng tre Xã Phú Tâm, huyện Châu Thành TP-1

2 Đất luân canh Phường 5, thành phố Sóc Trăng MQ-2

3 Đất trồng chuối Phường 7, thành phố Sóc Trăng CP-3

4 Đất hành tím Xã Vĩnh Phước, huyện Vĩnh Châu HV-4

5 Đất xà lách Phường 3, thành phố Sóc Trăng RP-5

6 Đất trồng lúa Thị trấn Mỹ Xuyên, huyện Mỹ Xuyên LM-6

7 Đất dưa hấu Xã Trường Khánh, huyện Long Phú DL-7

8 Đất cỏ hoang Xã Trường Khánh, huyện Long Phú CL-8

9 Đất trồng bắp Xã Thạnh Trị, huyện Thạnh Trị BT-9

10 Đất rau xen canh Xã Thạnh Quới, huyện Mỹ Xuyên RM-10

11 Đất trồng cam Xã Xuân Hoà, huyện Kế Sách CK-11

12 Đất trồng bưởi Xã Xuân Hoà, huyện Kế Sách BK-12

13 Đất trồng ổi Xã Xuân Hoà, huyện Kế Sách OK-13

14 Đất trồng mía Xã Đại Ân II, huyện Cù Lao Dung MC-14

15 Đất rau muống Phường 8, thành phố Sóc Trăng MP-15

16 Đất mồng tơi Xã Viên Bình, huyện Trần Đề MT-16

17 Đất trồng ớt Xã An Ninh, huyện Mỹ Tú OM-17

18 Đất trồng củ lùn Phường 7, thành phố Sóc Trăng CP-18

19 Đất trồng ngò gai Xã An Ninh, huyện Mỹ Tú NM-19

20 IMO hỗn hợp Hỗn hợp của 19 hệ IMO IMO hỗn hợp

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Nội dung nghiên cứu 1: Khảo sát sự đa dạng các nhóm vi sinh vật trong các hệ IMO thu thập

3.2.1.1 Thu thập nguồn vi sinh vật bản địa IMO

Các hệ vi sinh vật bản địa IMO được thực hiện theo phương pháp của Kyu and Koyama (1997) được tóm tắt như sau: Gạo nấu chín để nguội, cân 1.0 kg cho vào rổ nhựa vuông Dùng vải mùng và dây buộc để bao xung quanh bên ngoài rổ chứa cơm tránh côn trùng chui vào Dùng leng đào hố đất với chiều sâu 20-30 cm, đặt rổ vào trong hố đất, phủ lên trên rổ cơm bằng xác lá cây hoặc đất hiện diện tại vị trí đặt mẫu Sau 3-4 ngày ủ,

vi sinh vật phát triển khắp bề mặt cơm, tiến hành thu rổ cơm có chứa vi sinh vật xâm nhiễm cho vào bình thủy tinh có nắp đậy và trộn đều mẫu cơm xâm nhiễm vừa thu thập Mẫu IMO hỗn hợp được tạo ra bằng cách cân khối lượng bằng nhau (250 g) của tất cả các IMO vừa thu thập được trộn đều cho vào bình thuỷ tinh và trộn đều lại với nhau Sau

đó, cho đường mía (đã đun sôi để nguội) vào trong từng keo thủy tinh chứa mẫu IMO với

tỷ lệ 1:1 (w/w) và dùng tay trộn đều cho đến khi hỗn hợp chuyển thành dạng sánh đặc và đồng nhất Đậy nắp kín và để yên ở nơi thoáng mát, tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp chiếu vào trong 1 tuần để lên men vi sinh vật chứa trong mẫu cơm vừa thu thập

3.2.1.2 Khảo sát sự đa dạng của các nhóm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO thu thập bằng phương pháp PCR

Khảo sát mức độ đa dạng của nhóm vi sinh vật gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn bằng Nested-PCR kết hợp điện di biến tính DGGE và mật số của chúng, đồng thời kiểm

tra sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa cho người như Coliforms, E coli, Salmonella, Shigella spp của các hệ IMO thu thập

3.2.2 Nội dung nghiên cứu 2: Khảo sát và đánh giá một số chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của các hệ IMO thu thập

Khảo sát và đánh giá các chức năng có lợi cây trồng gồm khả năng tổng hợp IAA

và khả năng cố định đạm của các hệ IMO thu thập được bằng phương pháp so màu phản ứng với thuốc thử phenol nitroprusside và Salkowski lần lượt để xác định hàm lượng đạm

và IAA trong môi trường lỏng ở bước sóng 636 nm và 530 nm

3.2.3 Nội dung nghiên cứu 3: Phân lập, tuyển chọn và định danh các dòng vi khuẩn bản địa có hai chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA từ các hệ IMO thu thập

Phân lập các dòng vi khuẩn vừa có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA từ các

hệ IMO thu thập Môi trường Burks được sử dụng để phân lập vi khuẩn cố định đạm sinh học và tổng hợp IAA Ngoài ra, việc đánh giá khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn và tiến hành tuyển chọn lại một số dòng vi khuẩn cho khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA tốt nhất để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo Cuối cùng là định danh 10 dòng vi khuẩn tuyển chọn để đánh giá mức độ đa dạng về mặt di truyền của các dòng vi khuẩn phân lập này

3.2.4 Nội dung nghiên cứu 4: Đánh giá ảnh hưởng của một số dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA và một số hệ IMO chứa các dòng vi khuẩn này lên khả năng nảy mầm và sinh trưởng cây rau trong điều kiện phòng thí nghiệm

Đánh giá khả năng kích thích nảy mầm và kích thích sinh trưởng cây rau muống và cây cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm của một số dòng vi khuẩn tuyển chọn và một

số hệ IMO chứa các dòng vi khuẩn tuyển chọn Thí nghiệm tiến hành lựa chọn mật số vi khuẩn kích thích tốt nhất khả năng nảy mầm, sinh trưởng lên rau muống và cải xanh và nồng độ pha loãng phù hợp nhất của các IMO lên rau muống và cải xanh Sử dụng môi trường agar 1% để kiểm tra khả năng nảy mầm và sinh trưởng của cây rau ở điều kiện phòng thí nghiệm

3.2.5 Nội dung nghiên cứu 5: Đánh giá hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn và 5

hệ IMO chứa các dòng vi khuẩn này lên sinh trưởng và năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện nhà lưới

Đánh giá hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn gồm TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.5, MT-16.5, OM-17.5 và 5 hệ IMO thu thập từ vườn tre, ớt, mồng tơi, củ lùn, và IMO hỗn hợp lên sinh trưởng và năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện nhà lưới (khoa Nông Nghiệp, trường Đại Học Cần Thơ) Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, tổng cộng có 24 nghiệm thức và 4 lặp lại cho mỗi nghiệm thức Công thức phân bón khuyến cáo cho cây rau muống là 100N-48P2O5-24K2O và cây cải xanh là 70N- 48P2O5-24K2O (Cao Ngọc Điệp và ctv., 2011; Trần Thị Ba và Võ Thị Bích Thủy, 2018), các mức đạm giảm áp dụng cho cả 2 đối tượng là 25%N và 50%N

3.2.6 Nội dung nghiên cứu 6: Đánh giá hiệu quả của 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn và

2 hệ IMO tuyển chọn lên sinh trưởng, năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện ngoài đồng

Đánh giá hiệu quả của 3 dòng vi khuẩn và 2 hệ IMO tuyển chọn lên sinh trưởng, năng suất của rau muống, cải xanh ở điều kiện thực tế ngoài đồng tại xã Trường Khánh huyện Long Phú tỉnh Sóc Trăng theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 9 nghiệm thức và 3 lặp lại Thông tin về các nghiệm thức thí nghiệm ngoài đồng được trình bày ở Bảng 3.2 Chỉ tiêu theo dõi gồm các chỉ tiêu sinh trưởng, chỉ tiêu năng suất và chỉ tiêu hàm lượng đạm tổng số và đạm nitrate trong cây rau

Bảng 3.2 Các nghiệm thức thí nghiệm ngoài đồng cho cây rau muống và cây cải xanh tại

xã Trường Khánh huyện Long Phú tỉnh Sóc Trăng (từ 4/2020 đến 8/2020)

STT Nghiệm thức Nội dung nghiệm thức

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nội dung 1: Sự đa dạng về nhóm vi sinh vật trong các hệ IMO thu thập

4.1.1 Thu thập hệ vi sinh vật bản địa

Tổng cộng có 20 hệ vi sinh vật bản địa được thu thập tại tại 19 địa điểm khác nhau trong tỉnh Sóc Trăng và 1 IMO hỗn hợp được tạo ra từ hỗn hợp của các hệ vi sinh vật này

Kết quả phản ứng PCR bằng các cặp mồi đặc hiệu cho vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn của 20 IMO cho thấy cả 3 nhóm vi sinh vật chính được phát hiện trong tất cả 20 mẫu IMO thu thập (Hình 4.1) Như vậy, 20 mẫu IMO thu thập có chứa 3 quần thể vi sinh vật chính gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn, tuy nhiên, chưa thể nhận biết được là chúng thuộc chi nào và loài nào Kết quả nghiên cứu này tương tự như nhận định của Kyu and Koyama (1997), và các nghiên cứu của Kalsom and Sariah (2006) và Reddy (2011)

Hình 4.1 Kết quả sản phẩm PCR bằng các cặp mồi đặc hiệu nhận diện nhóm vi sinh

vật trong hệ IMO (A: vi khuẩn; B: nấm và C: xạ khuẩn)

*Ghi chú: giếng 1 và giếng 16: thang chuẩn 100 bp; giếng 2: IMO tre; giếng 3: IMO luân canh; giếng 4: IMO chuối; giếng 5: IMO hành tím; giếng 6: IMO xà lách; giếng 7: IMO lúa; giếng 8: IMO dưa hấu; giếng 9: IMO cỏ hoang; giếng 10: IMO bắp; giếng 11: IMO rau xen canh; giếng 12: IMO cam; giếng 13: IMO bưởi; giếng 14: IMO ổi; giếng 15: IMO mía; giếng 17: IMO rau muống; giếng 18: IMO mồng tơi; giếng 19: IMO ớt; giếng 20: IMO củ lùn; giếng 21: IMO ngò; giếng 22: IMO hỗn hợp

4.1.3 Sự đa dạng hệ vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong IMO

Do giới hạn về kích thước và số lượng giếng load mẫu trên gel polyacryamide và để thuận tiện cho phần mềm Gel Compare II phân tích kết quả điện di nên 14 IMO thu thập được chọn để thực hiện đánh giá đa dạng vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử

DGGE Kết quả đánh giá sự đa dạng của 3 nhóm vi sinh vật chính trong 14 IMO thu thập bao gồm 3 nhóm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn bằng phương pháp nested-PCR kết hợp điện

di DGGE và phân tích tương quan bằng phần mềm Gelcompare II cho thấy có sự đa dạng cao về thành phần của hệ vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong 14 mẫu IMO khảo sát

4.1.3.1 Đa dạng quần thể vi khuẩn

Kết quả phân tích cho thấy gel polyacryamide cho thấy có ít nhất từ 15 đến 27 nhóm vi khuẩn khác nhau trong các mẫu IMO thu thập được và giữa các IMO có thành phần vi khuẩn tương đồng nhau dao động từ 25,5% đến 94% (Hình 4.2) Điều này chứng

tỏ có sự đa dạng cao về thành phần vi khuẩn trong các IMO và giữa các IMO thu thập với nhau

78.7 68.2 55.1

51

75.4 66.6 53.3 46.9

25.5

DGGE-BACTERIA IN IMO

.

MC-14 CK-11 RM-10 BT-9 CL-8 RP-5 HV-4 DL-7 LM-6 OK-13 BK-12 CP-3 TP-1 MQ-2

Hình 4.2 Kết quả phân tích đa dạng thành phần vi khuẩn trong 14 hệ IMO thu thập

*Chú thích: TP-1: IMO tre; MQ-2: IMO luân canh; CP-3: IMO chuối; HV-4: IMO hành tím; RP-5: IMO rau;LM- 6: IMO lúa; DL-7: IMO dưa hấu; CL-8: IMO cỏ hoang; BT-9: IMO bắp; RM-10: IMO rau; CK- 11: IMO cam; BK-12: IMO bưởi; OK-13: IMO ổi; MC-14: IMO mía

4.1.3.2 Đa dạng quần thể nấm

Có sự đa dạng về quần thể nấm trong các IMO và giữa các IMO có sự tương đồng khá cao về thành phần trong quần thể nấm Số nhóm nấm được phát hiện trong mỗi hệ vi sinh vật bản địa dao động trong khoảng từ 10 đến 17 loài và mức độ tương đồng về thành

97.6 94.7

94.7 91 89.8 85.1 83.2

99.2 97.2 83.4

75.9

39.2

DGGE-FUNGI IN IMO

.

HV-4 LM-6 RP-5 RM-10 CK-11 DL-7 CL-8 TP-1 MIX MQ-2 OK-13 MC-14 BK-12 CP-3 BT-9

Hình 4.3 Kết quả phân tích đa dạng thành phần nấm trong 14 hệ IMO thu thập

*Chú thích: TP-1: IMO tre; MQ-2: IMO luân canh; CP-3: IMO chuối; HV-4: IMO hành tím; RP-5: IMO rau;LM- 6: IMO lúa; DL-7: IMO dưa hấu; CL-8: IMO cỏ hoang; BT-9: IMO bắp; RM-10: IMO rau; CK- 11: IMO cam; BK-12: IMO bưởi; OK-13: IMO ổi; MC-14: IMO mía MIX: IMO hỗn hợp

4.1.3.3 Đa dạng quần thể xạ khuẩn

Có sự đa dạng về thành phần xạ khuẩn trong 14 IMOthu thập với số lượng nhóm xạ khuẩn dao động từ 5 đến 14 nhóm trong các hệ IMO và giữa các IMO có thành phần xạ

khuẩn tương đồng nhau với tỷ lệ tương đồng dao động từ 61,9% đến 95,5% (Hình 4.4)

95.5 86

66.4

85.8

93.5 77.7

61.9

DGGE IMO ACTINOBACTERIA

.

CP-3 RM-10 LM-6 BT-9 RP-5 CL-8 DL-7 CK-11 OK-13 MC-14 MQ-2 BK-12 TP-1 HV-4

Hình 4.4 Kết quả phân tích đa dạng thành phần xạ khuẩn trong 14 hệ IMO thu thập

*Chú thích: TP-1: IMO tre; MQ-2: IMO luân canh; CP-3: IMO chuối; HV-4: IMO hành tím; RP-5: IMO rau;LM- 6: IMO lúa; DL-7: IMO dưa hấu; CL-8: IMO cỏ hoang; BT-9: IMO bắp; RM-10: IMO rau; CK- 11: IMO cam; BK-12: IMO bưởi; OK-13: IMO ổi; MC-14: IMO mía

4.1.4 Mật số vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO thu thập

Kết quả khảo sát mật số vi sinh vật trong 20 IMO cho thấy mật số của 3 nhóm vi sinh vật chính trong các hệ IMO khác nhau thì khác nhau và khác biệt có ý nghĩa thống

kê (p<0,05) và trong cùng một hệ IMO mật số của vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn cũng khác nhau Nhìn chung, trong mỗi hệ IMO, quần thể vi khuẩn có mật số cao hơn so với hai nhóm quần thể vi sinh vật còn lại (nấm và xạ khuẩn) và là thành phần vi sinh vật chính trong các hệ IMOthu thập với mật số vi khuẩn dao động từ 107-109 cfu/g trong khi mật

số nấm và vi khuẩn dao động từ 105-107cfu/g (Bảng 4.1)

Kết quả nghiên cứu này tương tự nghiên cứu của Chiemela et al (2013a), nghiên cứu của chương trình hữu cơ quốc gia Philipin năm 2017 (http://organic.da.gov.ph) và nghiên cứu của Novia et al (2019) Như vậy với sự hiện diện với số lượng lớn ba nhóm

vi sinh vật chính trong 20 hệ IMO khảo sát và do đó cả 20 hệ IMO này có thể được coi là các nguồn vi sinh vật bản địa dồi giàu có thể sử dụng để cải tạo đất cũng như kích thích sinh trưởng cây trồng, tuy nhiên cũng cần đánh giá sự hiện diện các nhóm vi khuẩn gây bệnh

Bảng 4.1 Mật số vi sinh vật của 20 hệ IMO thu thập ở Sóc Trăng sau 38 ngày lên men

4.1.5 Sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh trong hệ IMO thu thập

Kết quả phân tích sự hiện diện của các nhóm vi khuẩn gây bệnh cho người

Salmonella và Shigella trên môi trường chuyên biệt SS agar cho thấy không có sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh cho người nhóm Salmonella và Shigella trong 20 hệ IMO thu thập Tương tự, đối với nhóm vi khuẩn gây bệnh Coliforms và E.coli, kết quả của thí

nghiệm khảo sát cũng cho thấy không có sự hiện diện của chúng trong tất cả 20 mẫu IMO thu thập Như vậy tất cả 20 hệ IMO thu thập có thể được xem là nguồn vi sinh vật bản địa

an toàn để ứng dụng cho canh tác rau và cần đánh giá các chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng

4.2 Nội dung 2: Chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của các hệ IMO thu thập

4.2.1 Tổng hợp IAA

Tất cả 20 hệ IMO thu thập đều có khả năng tổng hợp IAA khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,01) Hàm lượng IAA tổng hợp bởi các hệ IMO dao động mạnh từ 9,23 đến 74,01 mg/L IAA (Hình 4.5) Lượng IAA cao nhất sau hai ngày chủng được tìm thấy ở hệ IMO thu thập từ ruộng rau muống với nồng độ đạt 74,0 mg/L IAA

Hình 4.5 Nồng độ IAA được tổng hợp cao nhất bởi 20 hệ IMO thu thập trong môi trường

NBRIP có bổ sung tryptophan (100 mg/L) trong thời gian 6 ngày nuôi cấy

Nghiên cứu này có thể được xem là nghiên cứu đầu tiên đánh giá về chức năng tổng hợp IAA của các hệ vi sinh vật bản địa Các hệ IMO của nghiên cứu này có khả năng tổng hợp IAA tương đương với các dòng vi sinh vật phân lập đã được nghiên cứu và

công bố trước đây (Ahmad et al., 2005; Ahmad et al., 2008; Nguyễn Thị Phương Oanh

và ctv., 2013; Nguyễn Thị Huỳnh Như và ctv., 2013; Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn

Thị Thủy, 2015; Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Hiệp, 2018) Do đó tiềm năng sử dụng các hệ IMO trong canh tác nông nghiệp như nguồn vi sinh vật tổng hợp chất kích thích sinh trưởng cây trồng là rất lớn

4.2.2 Cố định đạm

4.2.2.1 Gen chức năng nifH trong các hệ IMO

Kết quả phản ứng PCR dò tìm gen chức năng nifH bằng cặp mồi polF và polR trong

20 hệ IMO cho thấy cả 20 giếng đều có 1 band rõ nét ở vị trí kích thước đặc trưng cho gen chức năng này khoảng 360 bp (Hình 4.6) Điều này chứng tỏ các hệ IMO có chứa các

vi khuẩn mang gen nifH, hay nói cách khác là có sự hiện diện của vi khuẩn cố định đạm

sinh học trong 20 hệ IMOthu thập này

Hình 4.6 Kết quả PCR bằng các cặp mồi đặc hiệu polF/polR dùng để nhận diện gen chức

năng cố định đạm sinh học NifH của 20 hệ IMO thu thập

*Ghi chú: giếng 1 và giếng 21: thang chuẩn 100 bp ; giếng 2: IMO tre; giếng 3: IMO luân canh; giếng 4: IMO chuối; giếng 5: IMO hành tím; giếng 6: IMO xà lách; giếng 7: IMO lúa; giếng 8: IMO dưa hấu; giếng 9: IMO cỏ hoang; giếng 10: IMO bắp; giếng 11: IMO rau xen canh; giếng 12: IMO cam; giếng 13: IMO bưởi; giếng 14: IMO ổi; giếng 15: IMO mía giếng 16: đối chứng âm; giếng 17: IMO rau muống ; giếng 18: IMO mồng tơi; giếng 19: IMO ớt; giếng 20: IMO củ lùn; giếng 22: IMO ngò; giếng 23: IMO hỗn hợp

4.2.2.2 Khả năng cố định đạm sinh học của 20 hệ IMO trong môi trường nuôi cấy lỏng

Kết quả khảo sát về khả năng cố định đạm trong môi trường Burks lỏng theo thời gian nuôi cấy của 20 hệ IMOkhảo cho thấy hầu hết các hệ IMO khảo sát đều có khả năng

cố định đạm và có sự khác biệt đáng kể giữa các hệ IMO về khả năng cố định đạm (Bảng 4.2)

Như vậy các hệ IMO thu thập trong nghiên cứu này có mang gen chức năng cố định

đạm nifH và trong điều kiện môi trường sống khuyết đạm các gen này đã hoạt động giúp

vi khuẩn cố định đạm từ không khí giúp chúng sống sót và phát triển được Tuy nhiên, so với các nghiên cứu trước đây trên các đối tượng là dòng/chủng vi khuẩn cố định đạm

phân lập của Davis et al (1964), Thavasi et al (2006) Mazumdar and Deka (2013), Smita and Goyal (2017), Nguyễn Thị Phương Oanh và ctv (2013), Nguyễn Thị Huỳnh Như và ctv (2013), Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thị Thủy (2015), Nguyễn Anh

Huy và Nguyễn Hữu Hiệp (2018) cho thấy lượng đạm mà các hệ IMO cố định được thấp hơn nhiều so với các dòng vi sinh vật đơn Điều này có thể thấy do trong môi trường nuôi cấy khuyết đạm các dòng vi khuẩn cố định đạm đã cố định đạm hiệu quả hơn Mặt khác trong môi trường nuôi cấy khuyết đạm của các IMO ngoài các vi sinh vật cố định đạm còn có các nhóm vi sinh vật tiêu thụ nitơ khác hoặc nhóm vi sinh vật chuyển hoá đạm thành các hợp chất đạm dạng khí bay hơi (NO, N2O và N2) nên lượng đạm tổng số tăng thêm trong các hệ IMO thấp hơn Rõ ràng nghiên cứu này cho thấy bên cạnh chức năng

tổng hợp IAA, các hệ IMO còn mang gen chức năng nifH là một trong những gen chức

năng quan trọng trong quá trình cố định đạm sinh học của vi khuẩn Do đó, việc tiến hành phân lập các dòng vi khuẩn cố định đạm có thêm chức năng tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA trong IMO là cần thiết

Bảng 4.2 Hàm lượng đạm tổng số tăng thêm trong môi trường Burks lỏng trong 5 ngày

nuôi cấy của các hệ IMO thu thập

STT Nguồn gốc IMO

thu thập

Nồng độ N (mg/L) Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 5 Cao nhất

4.3.1 Mật số vi khuẩn cố định đạm trong các hệ IMO

Hai mươi hệ IMO có mật số vi khuẩn cố định đạm khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05) với mật số vi khuẩn cố định đạm trong các hệ IMO dao động từ 106 đến 108cfu/g IMO (Bảng 4.3) Kết quả này thấp hơn so với nghiên cứu của tổ chức nông nghiệp hữu cơ quốc gia Philiphines cho thấy mật số vi khuẩn cố định đạm hiện diện chiếm 82%tổng số vi khuẩn của IMO (http://organic.da.gov.ph)