TÓM LƢỢC Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm đánh giá hai chức năng cố định đạm và tổng hợp indole-3-acetic acid IAA của một số hệ vi sinh vật bản địa indigenous microorganism-IMO thu thập
GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Rau xanh là thực phẩm thiết yếu cho bữa ăn hàng ngày của người Việt, cung cấp các dưỡng chất thiết yếu và theo FAO/WHO (2004) mỗi người cần khoảng 400 g rau xanh/ngày; các loại rau ăn lá như rau muống, mồng tơi, cải xanh, cải ngọt, xà lách pháp được ưa chuộng nhờ dễ trồng, dễ chế biến và giàu dinh dưỡng Sóc Trăng có điều kiện thuận lợi cho trồng rau quanh năm, hình thành nhiều vùng đất chuyên canh điển hình như Thành phố Sóc Trăng, Đại Tâm, Mỹ Xuyên, Phú Tâm, Phú Tân, An Hiệp, Châu Thành, Ngã Năm và Vĩnh Châu, với tổng diện tích trồng rau và màu trên toàn tỉnh lên trên 50.000 ha mỗi năm; các loại rau chủ lực mang lại giá trị kinh tế cao, đặc biệt rau ăn lá như mồng tơi, rau muống, cải xanh Tuy nhiên để đạt năng suất cao và mẫu mã đẹp, nhiều vùng trồng rau ăn lá đã lạm dụng phân hóa học, đặc biệt đạm và các chất kích thích sinh trưởng, dẫn tới tồn dư nitrate và các chất kích thích trong rau; thời gian sinh trưởng ngắn và thiếu thời gian cách ly an toàn khiến rau dễ nhiễm chất độc hại cho người tiêu dùng và gây tác động tiêu cực lâu dài tới môi trường, như bạc màu đất Vì vậy nhu cầu rau sạch, rau an toàn và rau hữu cơ ở Sóc Trăng nói riêng và trên cả nước nói chung đang tăng mạnh.
Một trong những chiến lược quan trọng trong canh tác rau sạch và an toàn trong phát triển nông nghiệp bền vững nhằm hạn chế ô nhiễm môi trường và tác động tiêu cực đến sức khỏe người tiêu dùng là canh tác rau theo hướng sinh học và hữu cơ trong đó chú trọng đến sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ sinh học hữu cơ và vi sinh có các chức năng có lợi cho cây trồng có nguồn gốc bản địa (Alves et al., 2004;
Việc ứng dụng hệ vi sinh vật bản địa (indigenous microorganisms – IMO) có sẵn trong đất nhằm phục vụ cho phát triển nông nghiệp bền vững đã được nghiên cứu và phát triển từ lâu, bắt đầu từ công trình của Cho Han Kyu vào những năm 1960 (Reddy, 2011) Ở nhiều nước, nghiên cứu và ứng dụng hệ IMO cho thấy chúng có hiệu quả cao trong việc tăng sinh trưởng, năng suất và chất lượng nông sản (Phạm Chí Thành và Y Ka Nin H’Dok, 2002; Phạm Tiến Dũng và Y Ka Nin H’Dok, 2009; Chiemela et al., 2013b; Koon et al., 2013; Mbouobda et al., 2013; Sekhar and Gopal, 2013) Ngoài ra, hệ IMO còn có vai trò cải tạo, phục hồi, duy trì và bảo vệ sức khỏe của đất.
Thành và Y Ka Nin H’ Dok, 2002; Pham Tien Dung and Y Ka Nin H’ Dok, 2009; Illani et al., 2012; Sumathi et al., 2012; Mbouobda et al., 2013; Kumar and Gopal,
2015) Tuy nhiên, nghiên cứu về thành phần vi sinh vật có các chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của các hệ vi sinh vật bản địa ở Sóc Trăng nhằm khai thác và ứng dụng chúng trong canh tác rau ở tỉnh Sóc Trăng giúp nâng cao năng suất và chất lượng cây rau vẫn chưa được nghiên cứu một cách bài bảng và có hệ thống Đặc biệt là các nghiên cứu về phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn có 2 chức năng cố định đạm và tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) từ các hệ IMO để ứng dụng trên cây rau nhằm giảm lượng phân đạm hóa học bón còn nhiều hạn chế ở phạm vi cả trong và ngoài nước Do đó nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bản địa có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA để canh tác rau ở Sóc Trăng” cần thiết được thực hiện.
Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu nghiên cứu là phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn bản địa có hai chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA, được thu thập từ các hệ IMO trên đất canh tác nhiều loại cây trồng tại tỉnh Sóc Trăng Các dòng vi khuẩn này có khả năng cố định đạm và sản xuất hormone IAA, giúp kích thích sinh trưởng và tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng cho cây trồng Thông qua thử nghiệm in vitro và trên cây, tác dụng kích thích tăng trưởng rễ và nâng cao năng suất của rau muống và cải xanh được đánh giá, nhằm tối ưu hoá hiệu quả canh tác ở địa phương Kết quả mong đợi cung cấp cơ sở khoa học cùng nguồn gốc vi khuẩn bản địa hữu ích cho các sản phẩm sinh học nông nghiệp tại Sóc Trăng và các vùng lân cận.
Trong đó, có các mục tiêu cụ thể như sau:
- Xác định được sự đa dạng các nhóm vi sinh vật và đánh giá được chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của các hệ IMO thu thập
- Phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có 2 chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA từ các hệ vi sinh vật bản địa IMO thu thập
Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của một số dòng vi khuẩn tuyển chọn lên tỷ lệ nảy mầm và sinh trưởng của rau muống và cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm, nhằm xác định các dòng vi khuẩn có tác động tích cực nhất lên khả năng nảy mầm, chiều cao cây và tổng sinh khối Kết quả cho thấy một số dòng vi khuẩn thúc đẩy nảy mầm và tăng trưởng rõ rệt so với đối chứng, trong khi các dòng khác cho hiệu quả ở mức trung bình hoặc không có sự khác biệt đáng kể Những đặc tính như khả năng sinh trưởng nhanh và tiết ra các hợp chất kích thích tăng trưởng được xem xét để lựa chọn tối ưu Nghiên cứu cung cấp bằng chứng cho tiềm năng ứng dụng của vi khuẩn tuyển chọn trong nông nghiệp nhằm cải thiện tỷ lệ nảy mầm và sinh trưởng của rau muống và cải xanh, đồng thời đề xuất cơ chế tác động và hướng nghiên cứu trong tương lai.
- Đánh giá được hiệu quả của một số dòng vi khuẩn tuyển chọn lên sinh trưởng và năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng.
Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các hệ vi sinh vật bản địa (IMO) và các vi khuẩn có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA được phân lập từ chính các hệ IMO này Việc phân lập và khảo sát đặc tính của những vi khuẩn này nhằm làm rõ tiềm năng ứng dụng của chúng trong nông nghiệp và chu trình dinh dưỡng đất, đồng thời làm sáng tỏ vai trò của IMO đối với sự phát triển của thực vật.
Phạm vi nghiên cứu của đề tài là các hệ IMO thu thập ở các hệ thống canh tác cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng và các thí nghiệm được bố trí dựa trên cơ sở ở điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng ở tỉnh Sóc Trăng
Giới hạn nghiên cứu của đề tài là chỉ khảo sát khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của hệ IMO và dựa trên cơ sở đó tiến hành phân lập các dòng dòng vi khuẩn có hai chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA trong các hệ IMO nghiên cứu và chỉ ứng dụng chúng trên 2 đối tượng cây rau muống và cây cải xanh tại xã Trường Khánh huyện Long Phú tỉnh Sóc Trăng.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Khảo sát sự đa dạng các nhóm vi sinh vật trong các hệ IMO từ đất canh tác các loại cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng
Nội dung 2: Đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng gồm cố định đạm và tổng hợp IAA của các hệ IMO thu thập
Nội dung 3: Phân lập, tuyển chọn và định danh các dòng vi khuẩn bản địa có hai chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA từ các hệ IMO thu được
Nội dung 4: Đánh giá ảnh hưởng của một số dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn và các IMO chứa những dòng vi khuẩn này lên khả năng nảy mầm và sinh trưởng cây rau muống và cải xanh ở điều kiện phòng thí nghiệm
Nội dung 5: Đánh giá hiệu quả của 5 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn và 5 IMO chứa những dòng vi khuẩn này lên sinh trưởng và năng suất rau muống và cải xanh ở điều kiện nhà lưới
Trong nội dung 6, bài viết đánh giá hiệu quả của 3 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA, gồm một dòng được tuyển chọn và hai dòng IMO chứa các vi khuẩn này, đối với sự tăng trưởng và năng suất của rau muống và cải xanh ở điều kiện ngoài đồng Kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn này có tác động tích cực lên sinh trưởng và năng suất cây trồng bằng cơ chế cố định đạm và sản xuất hormone IAA Việc áp dụng chúng trong điều kiện đồng ruộng cho thấy tiềm năng của quản lý sinh học nhằm nâng cao sản lượng rau xanh và đóng góp vào nông nghiệp bền vững.
Tính cấp thiết của luận án
Hiện nay, việc ứng dụng vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật trong trồng trọt đang nhận được sự quan tâm, nghiên cứu và phát triển mạnh trên toàn cầu và tại Việt Nam Tại Sóc Trăng, phát triển rau theo hướng an toàn sinh học được đẩy mạnh thông qua khuyến khích sử dụng phân bón hữu cơ, các sản phẩm có nguồn gốc hữu cơ và vi sinh vật an toàn cho con người cùng môi trường sinh thái Đáng chú ý, nhóm vi sinh vật bản địa đa chức năng có lợi cho cây trồng ở tỉnh vẫn chưa được khai thác và tận dụng nhiều Do đó, khai thác vi sinh vật bản địa để ứng dụng vào sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là trồng rau, có thể giảm thiểu dùng phân bón hóa học và chất kích thích sinh trưởng tổng hợp, từ đó giảm lưu tồn hóa chất trên nông sản và giảm ô nhiễm môi trường Bên cạnh đó, nghiên cứu các vi sinh vật có lợi ở Sóc Trăng ứng dụng trong canh tác rau sẽ góp phần tăng sản lượng và diện tích rau sạch, rau an toàn cho Sóc Trăng nói riêng và Đồng bằng sông Cửu Long nói chung Từ đó cho thấy đề tài tiềm năng ứng dụng vi sinh vật bản địa vào sản xuất rau an toàn tại Sóc Trăng.
" Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bản địa có khả năng cố định đạm và tổng hợp
IAA để canh tác rau ở Sóc Trăng" là thật sự cần thiết để thực hiện.
Đóng góp mới của luận án
Hướng nghiên cứu đánh giá thành phần vi sinh vật, chức năng kích thích sinh trưởng của IMO cũng như khai thác nhóm vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp các IAA trong các IMO của luận án là hướng nghiên cứu mới do đó đã mang lại một số đóng góp mới sau:
Luận án đã cung cấp những kết quả nghiên cứu khoa học mới về một số đặc tính của 20 hệ vi sinh vật bản địa IMO trên các hệ thống canh tác cây trồng tại tỉnh Sóc Trăng Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự đa dạng về các nhóm vi sinh vật chính bao gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn trong các hệ IMO Tuy nhiên, không có sự hiện diện những vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa ở người như Salmonella, Shigella, Coliform, E coli Bên cạnh đó các IMO còn cho thấy chúng có các chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng như cố định đạm và tổng hợp IAA
Ngoài ra các kết quả nghiên cứu về các dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA phân lập trong các hệ vi sinh vật bản địa cũng như hiệu quả của chúng trong kích thích nảy mầm, sinh trưởng và làm tăng năng suất rau, giảm nitrate tồn dư trong rau trong khi bón giảm lượng phân đạm theo công thức khuyến cáo là những kết quả nghiên cứu mới về các dòng vi khuẩn đa chức năng trong các hệ IMO tại Việt Nam và là nghiên cứu đầu tiên, chính quy trong tuyển chọn các dòng vi khuẩn kích thích sinh trưởng, làm tăng năng suất cây rau muống và cải xanh tại tỉnh Sóc Trăng Điều này rất có ý nghĩa trong phát triển sản xuất rau sạch, rau an toàn cho tỉnh Sóc Trăng nói riêng và khu vực Đồng bằng sông Cửu Long nói chung
Tính mới của luận án còn thể hiện ở kết quả so sánh hiệu quả kích thích nảy mầm, sinh trưởng cây rau giữa hệ IMO thu thập tại Sóc Trăng với các dòng vi khuẩn có chức năng cố định đạm và tổng hợp IAA được phân lập từ các hệ IMO này và đã cho thấy rằng cả hai (IMO và dòng vi khuẩn) cho hiệu quả kích thích nảy mầm và sinh trưởng cây rau là tương đương nhau, tuy nhiên khi so sánh về chức năng chuyên biệt như cố định đạm thì các dòng vi khuẩn phân lập cho hiệu quả kích thích sinh trưởng cao hơn các hệ IMO Ngoài ra, 3 dòng vi khuẩn tuyển chọn được định danh là những dòng vi khuẩn có độ an toàn sinh học cao
Kết quả nghiên cứu của luận án là một tài liệu tham khảo chất lượng cao, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo và làm nguồn tham khảo trong giảng dạy Nội dung của luận án đặc biệt hữu ích cho các ngành công nghệ sinh học, vi sinh vật đất, nông nghiệp và các lĩnh vực sinh học khác.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
Về mặt ý nghĩa khoa học, các kết quả nghiên cứu của đề tài này là tài liệu tham khảo có ý nghĩa khoa học, đáng tin cậy có thể dùng trong giảng dạy và trong nghiên cứu khoa họcvề lĩnh vực nông nghiệp, vi sinh vật đất, công nghệ sinh học và sinh học Luận án cũng đã cung cấp kiến thức sâu rộng về vai trò và chức năng của các hệ vi sinh vật bản địa nói chung và hệ vi sinh vật bản địa thu thập tại các hệ thống canh tác cây trồng ở tỉnh Sóc Trăng nói riêng về sự đa thành phần vi sinh vật chính có trong hệ IMO gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn cũng như các chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của chúng bao gồm cố định đạm và tổng hợp IAA Bên cạnh đó nghiên cứu cũng đã cho thấy sự có hiện diện của nhóm vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA trong các hệ vi sinh vật bản địa IMO, đồng thời có sự đa dạng của nhóm vi sinh vật cố định đạm trong các hệ IMO thu thập tại các địa điểm khác nhau trong tỉnh Sóc Trăng Ngoài ra kết quả so sánh hiệu quả kích thích nảy mầm và kích thích sinh trưởng của các hệ vi sinh vật bản địa với các dòng thuần vi khuẩn phân lập về mặt lý thuyết là tương đương nhau, tuy nhiên khi so sánh về chức năng chuyên biệt là cố định đạm và tổng hợp IAA thì các dòng vi khuẩn thuần cho hiệu quả kích thích sinh trưởng cây rau muống và cải xanh tốt hơn
Về mặt ý nghĩa thực tiễn, luận án hỗ trợ cho ngành nông nghiệp trong việc sử dụng phân bón vi sinh học hoặc chế phẩm vi sinh vật để trồng rau giúp tăng thu nhập cho người nông dân, giảm ô nhiễm môi trường, tạo sản phẩm rau sạch và an toàn trong canh tác rau Trên cơ sở nghiên cứu về các hệ IMO cho thấy IMO là nguồn vi sinh vật rất phong phú và có tính đa dạng cao về chức năng, trong đó có các chức năng cố định đạm và tổng hợp hormone thực vật IAA, do đó, hoàn toàn có thể ứng dụng các hệ IMO trong canh tác rau để góp phần thay thế, giảm thiểu lượng phân đạm hoá học Vì vậy, trong tương lai, đối với 3 dòng vi khuẩn cố định đạm và tổng hợp IAA tuyển chọn hiệu quả cao nhất sau khi hoàn thiện được quy trình sản xuất chúng sẽ có tiềm năng ứng dụng rất cao nhằm bổ sung vào các nguồn vi sinh vật có lợi cho cây trồng phục vụ sản xuất phân bón vi sinh vật góp phần giảm thiểu sử dụng phân đạm hoá học trong sản xuất rau theo hướng an toàn, thân thiện và bền vững ở tỉnh Sóc Trăng và các tỉnh khác ở khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long.
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Tổng quan về cây rau
Rau là cây hoặc một phần của thực vật có thể ăn được và thường là mọng nước, ngon và bổ được sử dụng như là món ăn chính hoặc đồ phụ gia để nấu hoặc ăn sống (Lê Thị Khánh, 2009) Rau rất đa dạng và phong phú, do vậy khi khái niệm về rau chỉ có thể dựa trên công dụng của nó Rau xanh là loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày của mọi người khắp nơi trên thế giới, đặc biệt khi lương thực và các loại thức ăn giàu đạm đã được đảm bảo thì nhu cầu về rau xanh lại càng gia tăng, như một nhân tố tích cực trong cân bằng dinh dưỡng và kéo dài tuổi thọ của con người (Lê Thị Khánh, 2009) Giá trị của cây rau được thể hiện nhiều mặt trong cuộc sống mà trước hết là giá trị dinh dưỡng, giá trị kinh tế của cây rau
2.3.1 Giá trị dinh dưỡng của cây rau
Rau xanh là nguồn năng lượng và dưỡng chất thiết yếu cho cơ thể, với nhu cầu trung bình khoảng 250-300 g rau xanh mỗi ngày, tương ứng khoảng 90-110 kg rau mỗi người mỗi năm (Lê Thị Khánh, 2009) Rau cung cấp các vitamin thiết yếu như tiền vitamin A, B1, B2, C, E và PP; khoáng chất Ca, P, Fe và các dinh dưỡng khác như acid hữu cơ, các hợp chất thơm, protein, lipit cũng như chất xơ, góp phần hình thành xương và máu, hỗ trợ tiêu hóa và ngăn ngừa bệnh tim mạch, huyết áp cao Thành phần nước chiếm 85-95%, chất khô 5-15%, trong đó carbon chiếm tỷ lệ cao và hàm lượng đường chủ yếu là đường đơn chiếm phần lớn thành phần carbon của chất khô Nhờ khả năng hòa tan cao, rau tăng sự hấp thu và lưu thông máu, đồng thời kích hoạt quá trình oxy hoá năng lượng của tế bào Ngoài ra, rau còn cung cấp nhiều vi chất và các kháng sinh thực vật có tác dụng như dược liệu, góp phần cải thiện sức khỏe tổng thể.
Thông tin so sánh cho thấy lượng tiêu thụ rau trung bình theo đầu người hàng năm tại Nam Triều Tiên là 141,1 kg, tại New Zealand 136,7 kg, Hà Lan 202 kg và Canada 227 kg Ở Việt Nam, mức tiêu thụ rau trên đầu người vẫn ở mức thấp so với các nước khác trên thế giới và phần lớn lượng tiêu thụ chỉ tập trung ở các thành phố lớn (Lê Thị Khánh, 2009).
2.3.2 Giá trị kinh tế của cây rau
Rau là một mặt hàng xuất khẩu mang lại giá trị kinh tế cao và thị trường rau xuất khẩu ở Việt Nam đã được mở rộng trong những năm gần đây Năm 2001 tổng kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam cho ngành rau là 329.972 ngàn USD Rau còn là nguyên liệu của ngành công nghiệp chế biến thực phẩm và được sử dụng trong công nghiệp chế biến xuất khẩu dưới dạng tươi, dưa muối, làm tương, sấy khô, xay bột, đồ hộp (dưa chuột, cà chua, bắp, măng tây, nấm ), bánh kẹo (gồm bí xanh, cà rốt, khoai tây, cà chua ), nước giải khát (gồm cà chua, cà rốt ), dược liệu (gồm tỏi, hành, rau gia vị ), làm hương liệu (gồm hạt ngò, hạt mùi, ớt, tiêu ).
Rau là loại cây trồng giúp tăng thu nhập so với một số loại cây trồng khác Cây rau có thời gian sinh trưởng ngắn và tương đối dễ trồng, cho năng suất cao, có thể gieo trồng nhiều vụ trong năm, tận dụng được quỹ đất đai, thời tiết khí hậu, công lao động nhàn rỗi, quay vòng đồng vốn nhanh, chuyển đổi cơ cấu cây trồng và mang lại lợi nhuận cao so với một số cây trồng khác Giá trị kinh tế và lợi nhuận của 1 ha canh tác rau cao hơn 2 – 3 lần so với canh tác lúa Thống kê 2 năm (2002-2004) cho thấy ở vùng chuyên canh rau khu vực Hà Nội có thu nhập bình quân 76-83 triệu đồng/ha/năm, riêng ở nhà lưới thu nhập cao hơn và dao động 124-153 triệu đồng/ha/năm Nông dân trồng rau có thu nhập cao hơn so với nông dân trồng cây trồng khác (Lê Thị Khánh, 2009)
2.3.3 Yêu cầu về đất trồng, dinh dưỡng, phân bón và nước trong canh tác rau Đất trồng rau phải nên là nền đất chân cao, dễ tiêu thoát nước, không bị ngập úng, nhưng phải có nguồn nước chủ động để tưới khi cần thiết vì nhu cầu về nước của tất cả các loại rau đều rất cao Đất trồng rau tốt nhất là đất cát pha đến thịt nhẹ hoặc đất thịt trung bình có tầng canh tác từ 20-30 cm, độ chua từ hơi chua đến trung tính (pH 5-
7) là phù hợp cho đa số các loại rau (Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi, 1999) Trong rau chứa 80-95% nước nên nhu cầu nước của các loại rau là rất lớn Nhu cầu nước của rau diễn ra liên tục từ lúc gieo hạt đến khi thu hoạch Thiếu nước hoặc thừa nước đều dẫn đến năng suất và chất lượng rau bị giảm Các loại rau khác nhau và ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì nhu cầu nước của cây rau cũng khác nhau (Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi, 1999)
Rau là loại cây ngắn ngày nhưng lại cho khối lượng sản phẩm rất lớn vì năng suất cao so với những loại cây trồng khác Để tạo ra khối lượng sản phẩm lớn như vậy, cây rau đã lấy đi từ đất một lượng khá lớn các chất dinh dưỡng trong suốt thời gian sinh trưởng phát triển trên đồng ruộng Lượng các chất dinh dưỡng này chủ yếu do phân bón đưa vào đất bao gồm cả phân hữu cơ lẫn các loại phân vô cơ và khoáng và một phần do đất tự cung cấp Mặt dù chất dinh dưỡng có trong phân hữu cơ tự nhiên là rất thấp nhưng lại có một vai trò rất quan trọng vì ngoài cung cấp chất dinh dưỡng phân hữu cơ, đặc biệt là phân chuồng còn có nhiều tác dụng khác như làm tơi xốp đất, cải tạo dinh dưỡng đất, giữ ẩm cho đất lúc khô hạn, giữ cho các loại phân hóa học bón vô đất không bị rửa trôi, làm tăng khả năng hòa tan khoáng chất để cây trồng sử dụng do đó làm tăng hiệu quả sử dụng phân hóa học Tuy nhiên, cần phải bón kết hợp phân vô cơ với phân hữu cơ, đặc biệt là phân chuồng trong quá trình trồng rau (Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi, 1999)
2.3.4 Nhu cầu đạm của cây rau ăn lá
Nhìn chung trong quá trình phát triển, cây rau hấp thu 70% đạm, 20% lân và 80% kali bón vào đất trong suốt vụ trồng Rau là loại cây trồng có hàm lượng dinh dưỡng phong phú, thời gian sinh trưởng ngăn, tốc độ sinh trưởng nhanh và cho năng suất cao, vì vậy chúng cần lượng dinh dưỡng cao từ đất trong quá trình sinh trưởng
Các chất dinh dưỡng đa lượng cần thiết nhất cho cây rau là đạm, lân, kali và canxi, và các chất vi lượng khác như Mn, Bo, Mg Sự thiếu hụt các chất dinh dưỡng này làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển và làm giảm năng suất cây rau (Tạ Thu Cúc, 2007) Đối với cây rau, đặc biệt là các loại rau ăn lá phân đạm là yếu tố dinh dưỡng đặc biệt cần thiết, quyết định mạnh mẽ đến năng suất và chất lượng cây rau Chất đạm tham gia cấu tạo các chất hữu cơ quan trọng trong đời sống cây rau như protein, acid nucleic, nucleo-protein, chlorophyll, alkaloid Ngoài ra, đạm giúp cây rau tăng trưởng nhanh và quyết định chất lượng của rau ăn lá Dạng đạm thích hợp nhất cho cây rau là Urê (Tạ Thu Cúc, 2007; Trần Thị Ba và Võ Thị Bích Thủy, 2019) Các loại rau khác nhau có nhu cầu đạm cho quá trình sinh trưởng không giống nhau và tùy thuộc vào từng loại đất Các giai đoạn sinh trưởng của cây rau khác nhau có nhu cầu về lượng đạm cũng sẽ khác nhau Trong điều kiện đất ở Đồng bằng sông Cửu Long nhu cầu lượng đạm cần cung cấp cho cây rau muống và cây cải xanh tương ứng là 100 và 70 kg/ha (Cao Ngọc Điệp và ctv., 2011; Trần Thị Ba và Võ Thị Bích Thủy, 2019)
Việc bón thiếu hoặc thừa đạm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây rau ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng nông sản Khi thiếu đạm, cây rau phát triển kém, lá nhỏ và xanh nhạt, ít chồi, cây còi cọc, quá trình sinh trưởng bị trì trệ, hình thành tế bào và các quá trình sinh hóa bị ngưng trệ, dẫn đến năng suất thấp và chất lượng rau suy giảm Ngược lại, bón thừa đạm khiến cây rau phát triển nhanh, đẻ nhánh nhiều, tế bào chứa nhiều nước, thân lá non mềm dễ đổ ngã, cây chậm ra hoa và khó đậu quả, đồng thời làm tăng lây nhiễm sâu bệnh do lá mềm và màu xanh đậm thu hút côn trùng và nấm gây hại, khiến khả năng chống chịu với hạn, mặn, phèn và nấm bệnh kém đi Bón thừa đạm cũng làm giảm độ giòn và hương vị của rau, khó vận chuyển và bảo quản, nhanh bị thối hỏng, rút ngắn thời gian tồn trữ sau thu hoạch Đặc biệt, bón thừa đạm dẫn đến tích lũy NO3 và NO2 vượt ngưỡng an toàn, gây ngộ độc mãn tính hoặc các bệnh ung thư, đường tiêu hóa cho người tiêu dùng Do đó việc bón nhiều phân đạm dẫn đến năng suất và phẩm chất rau bị giảm xuống (Trần Thị Ba và Võ Thị Bích Thủy, 2019).
Rau muống tên khoa học là Ipomoea aquatica thuộc họ bìm bìm (Convolvulaceae) và là một loại rau ăn lá Rau muống là cây ngắn ngày, sinh trưởng nhanh, cho năng suất cao, sống được ở nhiệt độ cao và đủ ánh sáng Rau muống thích hợp với nhiều loại đất như: đất sét, đất cát, đất pha cát, đất ẩm giàu mùn hoặc đất được bón phân hữu cơ, có độ pH khoảng 5,3-6,0 Trong 100 g rau muống có 78,2 g nước; 2,70 g protein; 85,0 mg canxi; 31,5 mg photpho; 1,20 mg sắt và 20,0 mg vitamin C (Nguyễn Thị Ngọc Trúc, 2009) Ở Việt Nam, rau muống được trồng ở rất nhiều nơi Có hai giống rau muống cơ bản được sử dụng trong canh tác gồm giống thân tím và thân trắng Giống rau muống được thị trường ưa chuộng nhất là giống thân trắng nên được trồng khá phổ biến ở Việt Nam.Một loại rau muống khác được trồng phổ biến và tiêu thụ ở các chợ và siêu thị là rau muống hạt, được trồng trên đất khô không ngập nước và được bán chủ yếu trong các siêu thị Thời gian gieo trồng ngắn, cho năng suất và hiệu quả kinh tế cao (Tạ Thu Cúc, 2007)
Rau muống có thể trồng quanh năm với nhiệt độ thích hợp từ 25–30°C Cây cần lượng nước tưới tương đối cao để phát triển tốt và do rễ rau muống ăn sâu vào đất nên khả năng chịu hạn kém Trong mùa mưa rau muống dễ bị nhiễm bệnh hơn so với mùa khô Trong quá trình sinh trưởng, rau muống cần ánh sáng ở mức trung bình và thời gian chiếu sáng ngắn mỗi ngày, nên có thể sinh trưởng tốt dưới bóng râm hoặc dưới tán cây lớn Tuy nhiên, nhiệt độ cao và ánh sáng mạnh sẽ làm rau muống bị héo, sinh trưởng kém và cằn cỗi.
Trong sản xuất rau muống, lượng hạt giống trồng thường dao động từ 80–100 kg/ha Vì là rau ăn thân và lá nên rau muống đòi hỏi dinh dưỡng cao, đặc biệt đạm Đạm thúc đẩy sự phát triển của thân và lá, quyết định năng suất và chất lượng của rau muống Lân và kali nâng cao chất lượng cây trồng và tăng khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường (Trần Thị Ba và Võ Thị Bích Thủy, 2019).
Rau muống là loại rau ăn thân lá và cho năng suất cao Vì vậy loại rau này cần nhiều chất dinh dưỡng đặc biệt là đạm Đạm kích thích sự sinh trưởng thân, lá do đó có tác dụng quyết định đối với năng suất và chất lượng rau muống Ngoài ra, nguyên tố lân và kali góp phần làm tăng chất lượng và làm tăng khả năng chống chịu của rau với các điều kiện bất lợi của môi trường (Nguyễn Thị Ngọc Trúc, 2011).Theo Trung tâm Nghiên Cứu khoa học kỹ thuật và Khuyến Nông Thành phố Hồ Chí Minh (2006) công thức bón phân cho cây rau muống phụ thuộc vào loại đất Trung bình lượng phân bón cho 1000 m 2 gồm phân chuồng hoai 1,5-2 tấn, super lân 10-15 kg, kali 3-4 kg, urê 15-20 kg Tuy nhiên, lần cuối bón phân urê cho rau chậm nhất 1 tuần trước khi thu hoạch để bảo đảm cách ly an toàn cho người tiêu dùng
Vai trò của vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật đối với cây trồng
2.4.1 Vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật
Trong đất, vi sinh vật tập trung nhiều xung quanh rễ cây; rễ cây tác động lên sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, và ngược lại, thực vật cũng chịu tác động của vi sinh vật vùng rễ Theo Souza et al (2015), vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Microorganisms – PGPMs) là những vi sinh vật sống trong đất, có thể tự do, liên kết, cộng sinh hoặc sống nội sinh với thực vật, tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp vào quá trình kích thích sinh trưởng và phát triển của thực vật Cơ chế kích thích tăng trưởng thực vật khác nhau giữa các loài và chủng vi sinh vật.
Do đó, có nhiều hoạt động và cơ chế kích thích sinh trưởng cây trồng khác nhau (Souza et al., 2015) Theo Gupta et al (2015) sự kích thích sinh trưởng cây trồng có thể chia thành 2 cơ chế (Hình 2.1): (1) Kích thích sinh trưởng cây trồng trực tiếp thông qua hoạt động cố định đạm, hòa tan lân, hòa tan kali, tiết siderophore, tổng hợp các hormone thực vật như indole-3-acetic acid (IAA), giberellins… và (2) Kích thích sinh trưởng cây trồng gián tiếp thông qua hoạt động tiết các enzyme thủy phân, chất kháng sinh, các hợp chất polysaccharids… Trong đó, chức năng cố định đạm của vi sinh vật là một trong những chức năng quan trọng nhất trong hoạt động kích thích sinh trưởng cây trồng (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2001)
Hình 2.1 Các chức năng kích thích sinh trưởng cây trồng của vi khuẩn
2.4.2.1 Định nghĩa quá trình cố định đạm
Theo Vance (1997) đạm là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho cây trồng Sự hấp thu và chuyển hóa đạm cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng cũng quan trọng không kém so với quá trình quang hợp Hầu hết sinh vật trong đó có cả thực vật không thể sử dụng N 2 trong không khí cho quá trình biến dưỡng của chúng, thực vật chỉ có thể sử dụng nitơ dạng khử, do đó N 2 trong không khí phải được cố định và chuyển thành dạng liên kết (NH 4 + /NO 3 - ) sau đó thực vật mới có thể hấp thu (Smil,
Quá trình chuyển N 2 thành các dạng liên kết của nó nhờ các vi sinh vật gọi là quá trình cố định đạm Theo Harekrushna and Abhijita (2013) có khoảng 2,5x10 11 kg
NH 3 được cố định hằng năm bằng con đường sinh học và con đường này cao hơn rất nhiều so với con đường cố định đạm bằng vật lí Trong đó, vi sinh vật đóng vai trò chủ yếu trong quá cố định đạm sinh học (Hubell and Kidder, 2003)
Vi sinh vật cố định đạm là những vi sinh vật có khả năng cố định đạm tự do (N 2 ) trong không khí và trong đất để chuyển hóa N2 thành dạng đạm dễ tiêu cung cấp cho đất và cho cây trồng thông qua hệ enzyme nitrogenase giúp khử N2 thành NH 3 Ammonia (NH 3 ) sau khi được tạo ra tiếp tục được chuyển hóa thành NH4 + và NO 3 - , khi đó cây trồng hấp thu các dạng đạm này và được tham gia vào chuỗi carbon để
Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Rhizobacteria-PGPR)
Gián tiếp tiếp kích thích sinh trưởng thực vật
Trực tiếp kích thích sinh trưởng thực vật
Cố định đạm Hòa tan lân Hòa tan kali Tổng hợp siderophore Tổng hợp hormone thực vật
Tiết kháng sinh Tiết enzyme thủy phân
Tổng hợp siderophore Tạo ra hệ thống kháng Tiết polysaccharides ngoại bào IAA Ethylene Cytokinins và gibberellins đồng hóa thành những acid amin đầu tiên cung cấp trực tiếp cho cây trồng (Nguyễn Lân Dũng, 1984)
Trong tự nhiên, quá trình cố định đạm diễn ra theo con đường vật lý và sinh học đặc biệt: các điều kiện mạnh như núi lửa và sấm chớp có thể phá vỡ liên kết ba của phân tử N2, và ngày nay con người có thể tái hiện các điều kiện vật lý tương tự nhưng với chi phí rất cao (nhiệt độ 1.000–4.000 oC, áp suất 200–1.000 atm và các chất xúc tác đắt tiền) Ngược lại, vi sinh vật nhờ enzyme nitrogenase có thể phá vỡ liên kết N≡N ở điều kiện bình thường về áp suất và nhiệt độ; phân tử nitơ có năng lượng 9,4 × 10^5 J/mol nên quá trình cố định đạm ở sinh vật tiêu tốn nhiều ATP Trong công nghiệp, nhờ các chất xúc tác nên năng lượng cho phản ứng cố định N2 được giảm xuống khoảng 16–20 kcal/mol, nhưng vẫn lớn hơn so với năng lượng mà tế bào sinh vật sử dụng Tốc độ phản ứng trong tế bào vi sinh vật ở nhiệt độ thấp rất nhanh nhờ hệ thống enzyme hydrogenase và nitrogenase Vấn đề then chốt của quá trình cố định đạm là phá vỡ liên kết N2 để chuyển thành ammonia NH3 hoặc các hợp chất nitơ khác.
NH 3 nhờ vào nguồn năng lượng ATP và phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase Phức hệ enzyme này nằm trong tế bào chất của vi khuẩn (Yan et al.,
2.4.2.2 Enzyme nitrogenase trong quá trình cố định đạm
Nitrogenase là phức hợp metalloenzyme đóng vai trò quan trọng trong việc khử nitơ sinh học (Hình 2.2) Có 4 phức hệ nitrogenase chính được mô tả (Eady, 1996), trong đó ba phức hệ có đặc điểm gần giống nhau, chỉ khác biệt bởi nguyên tử heterometal có trong cụm kim loại (Mo, V hoặc Fe) Loại thứ tư được phân lập từ
Streptomyces thermoautotrophicus (Hoffman-Findeklee et al., 2000) is a Mo-dependent nitrogenase The Mo-dependent nitrogenase is the most important and most studied enzyme This type of enzyme has the widest distribution.
Hình 2.2 Cấu tạo và cơ chế hoạt động của enzyme nitrogenase (Ahmed et al., 2014)
Enzyme nitrogenase gồm hai hợp phần protein được gọi là hợp phần I và hợp phần II (Bảng 2.1) Các protein này hòa tan trong tự nhiên Hợp phần I còn được gọi là một trong hai hợp phần cấu thành enzyme nitrogenase.
Mo-Fe-protein hoặc dinitrogenase và hợp phần II được gọi là Fe-protein hoặc dinitrogenase reductase (Burris, 1991)
Hợp phần I (MoFe-protein) chứa trung tâm hoạt động để khử cơ chất Nó có trọng lượng phân tử khoảng 250 kDa (Christiansen et al., 2001) Protein này liên kết với hai nguyên tử Mo, 30 nguyên tử Fe không heme và 32 acid sulfide vô cơ (Rees et al., 2005) Các protein Mo, Fe và S của hợp phần I được tổ chức thành hai nhóm kim loại riêng gọi là cụm P (hoặc [8Fe-7S]) và Fe-Mo-cofactor (Santos et al., 2004) Sự khử thực tế xảy ra ở trung tâm Fe-Mo (Rees et al., 2005) Thành phần của đồng phân Fe-Mo là MoFe 7 S 9 homocitrate và nó có mặt trong hai bản sao cho mỗi phân tử nitơ Một số sinh vật có nitrogenase không molibden được thay thế bằng Vanadium Tính đặc hiệu và hiệu quả của enzyme Fe-Mo- nitrogenase cao hơn nitrogenase thay thế (Raymond et al., 2003) Cụm P bổ trợ làm trung gian cho sự truyền electron từ Fe protein thành FeMo-cofactor (Hoffmann-Findeklee et al., 2000)
Bảng 2.1 So sánh 2 hợp phần của enzyme nitrogenase (Harekrushna and Abhijita,
Thành phần Hợp phần I Hợp phần II
Trọng lượng của tiểu đơn vị
Số nguyên tử Fe trong phân tử
Số nguyên tử S 2- trong phân tử
Số nguyên tử Mo trong phân tử
Hợp phần II có khối lượng phân tử từ 55.000 đến 65.000 Da (Christiansen et al., 2001) Fe-Protein là một homodimer gồm hai tiểu đơn vị γ (NifH protein), chứa bốn nguyên tử Fe không heme và bốn axit sulfide vô cơ được gọi là cụm [4Fe-4S], được nối giữa hai tiểu đơn vị của dimer (Howard et al., 1989) Hai vị trí liên kết nucleotide ở mỗi tiểu đơn vị cũng có trong Fe-Protein Protein Fe truyền một electron cho thành phần I một lần (Hoffmann-Findeklee et al., 2000).
2.4.2.3 Gen nif trong cố định đạm
Các gen mã hóa các enzyme tham gia vào việc cố định đạm được gọi là gen nif Cấu trúc của gen nif đã được nghiên cứu bởi nhiều tác giả trong một số vi sinh vật nhưng các thành phần cấu trúc gen nif của Klebsiella pneumoniae được nghiên cứu kỹ nhất (Shamseldin, 2013) Gen nif của K neumoniae kéo dài 24 kb và chứa khoảng 20 gen với các chức năng khác nhau (Bảng 2.2) được sắp xếp trong một số đơn vị phiên mã (Hình 2.3)
Dinitrogenase là một protein phức tạp bao gồm tiểu đơn vị α và β Tiểu đơn vị α là sản phẩm của gen nif D trong khi tiểu đơn vị β là sản phẩm của gen nif K (Beringer and Hirsch, 1984) Nif H mã hóa gen cho protein reductase dinitrogenase là một dimer protein gồm hai tiểu đơn vị γ (Roberts et al., 1978) hay nói khác hơn phức hợp nitrogenase gồm có MoFe-protein được mã hóa bởi các gen nif D, nif K và Fe-protein được mã hóa bởi gen nif H (Bullock, 2006; Ahmed et al., 2014) Bên cạnh ba gen cấu trúc này, việc lắp ráp hoàn chỉnh nitrogenase đòi hỏi các sản phẩm của gen nif khác cũng tham gia vào quá trình tổng hợp FeMo-co, cũng như sự hình thành các cụm FeS và sự trưởng thành của các thành phần nitrogenase
Bảng 2.2 Vai trò của các gen nif trong quá trình cố định nitơ (Klipp et al., 2004)
Nif H Tổng hợp dinitrogenase reductase
Hệ vi sinh vật bản địa IMO
Thông thường các chế phẩm hoặc phân bón vi sinh thương mại dùng trong nông nghiệp có mặt trên thị trường phải qua công đoạn phân lập, tuyển chọn vi sinh vật có lợi cho cây trồng Tuy nhiên, công đoạn phân lập và tuyển chọn tốn nhiều chi phí và cần phải có phòng thí nghiệm, do vậy nông dân không thể tự sản xuất các chế phẩm vi sinh ở quy mô nông hộ Đây là yếu tố giới hạn làm hạn chế việc sử dụng các chế phẩm vi sinh đặc biệt là vi sinh vật bản địa, có lợi trong nông dân Tuy nhiên, việc tận dụng các nguồn vi sinh vật bản địa có chức năng có lợi cho cây trồng vẫn còn hạn chế, cho mãi đến năm 1965, Cho Han Kyu người Hàn Quốc đưa ra và đặt nền móng cho việc nghiên cứu và ứng dụng hệ vi sinh vật bản địa (IMO-indigenous microoganism) đầu tiên Kết quả cho thấy việc thu thập và tận dụng nguồn vi sinh vật bản địa có sẵn trong tự nhiên gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, tuyến trùng, động vật nguyên sinh… để khai thác tiềm năng ứng dụng của chúng nhằm giúp gia tăng phân hủy chất hữu cơ trong đất, cải thiện năng suất cây trồng, giảm thiểu các vi sinh vật gây bệnh và tăng khả năng phòng vệ của cây trồng (Kyu and Kyoyama, 1997)
Vi sinh vật bản địa là một nhóm các vi sinh vật tự nhiên sống trong đất và bề mặt đất có khả năng phân hủy sinh học, cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp các chất tăng trưởng thực vật, cải thiện khả năng phục hồi độ phì nhiêu đất… (Kalsom and Sariah,
Theo Kyu và Koyama (1997), việc thu thập và tận dụng nguồn vi sinh vật bản địa (IMO) và đưa chúng vào các nông trại tự nhiên ở Hàn Quốc thông qua hệ KNF – Korean Natural Farming đã làm tăng lượng mùn và độ phì nhiêu của đất, từ đó nâng cao năng suất và sản lượng cây trồng mà không cần dùng thuốc bảo vệ thực vật hay phân bón hóa học Nông nghiệp tự nhiên đã khai thác tiềm năng của hệ vi sinh vật bản địa từ các hệ sinh thái khác nhau để tăng quá trình phân hủy xác bã hữu cơ trong đất, cải thiện năng suất, đồng thời giảm thiểu vi sinh vật gây bệnh và tăng khả năng phòng vệ của cây (Kyu và Koyama, 1997) Việc sử dụng hiệu quả vi sinh vật bản địa trong nông nghiệp mang lại lợi ích thiết thực về kinh tế, xã hội và môi trường, và là một trong những phương pháp hiệu quả giúp bảo vệ môi trường sinh thái (Cai et al., 2013).
2.5.2 Vai trò và chức năng của IMO đối với cây trồng
Vi sinh vật bản địa đóng vai trò then chốt trong việc tăng hàm lượng dinh dưỡng trong đất và nâng cao năng suất cây trồng Nguồn chính là vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn, cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, tăng khả năng kháng bệnh và côn trùng, đồng thời cải thiện khả năng chịu đựng của cây trước các điều kiện bất lợi về khí hậu và môi trường Trong hệ sinh thái đất, enzyme do vi sinh vật tiết ra tham gia biến dưỡng và tăng tốc độ phân hủy chất hữu cơ, tham gia chu trình dinh dưỡng, hình thành mùn và cải thiện cấu trúc đất Vi sinh vật cũng đóng vai trò phân hủy các độc chất hữu cơ thường gặp trong nông nghiệp như thuốc bảo vệ thực vật, và các hoạt chất này ảnh hưởng đến tổng hợp và phân hủy chất hữu cơ trong đất Các enzyme đất có chức năng riêng, tham gia vào quá trình trao đổi chất của đất (McLaren and Thornton, 1975).
Vi sinh vật bản địa đã tiến hóa hàng ngàn năm để tồn tại và thích nghi với điều kiện môi trường sống địa phương; chúng có thể chịu đựng và sống sót trước những điều kiện khí hậu bất lợi và môi trường khắc nghiệt, đồng thời duy trì các mối quan hệ và sự sắp xếp vai trò, vị trí và nhiệm vụ giữa chúng để thực hiện chức năng một cách mạnh mẽ Ngược lại, vi sinh vật ngoại lai nuôi trong điều kiện nhân tạo thường chưa thích nghi với môi trường địa phương, dễ chết hoặc chỉ thể hiện chức năng trong thời gian ngắn và với hiệu lực thấp Do đó, không có sự thay thế nào tốt hơn so với vi sinh vật bản địa Theo Reddy (2011), IMO có nhiều ưu điểm và các ưu điểm này có thể được liệt kê như sau.
- Bảo vệ sự tái sinh lâu dài của đất bằng cách duy trì hàm lượng chất hữu cơ, kích thích hoạt động sinh học trong đất, và giúp gia tăng cấu trúc đất
Cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng theo cách gián tiếp thông qua quá trình hòa tan các nguồn dinh dưỡng bị cố định trong đất nhờ hoạt động của vi sinh vật đất Quá trình này giải phóng các khoáng chất khó hòa tan thành dạng dễ hấp thu, giúp cây trồng hấp thụ nitơ, photpho và kali một cách hiệu quả hơn Nhờ sự tham gia của hệ vi sinh vật, đất trở nên phì nhiêu và có cấu trúc sinh học ổn định, từ đó tăng khả năng sinh trưởng của rễ và năng suất cây trồng một cách bền vững.
- Cung cấp đạm cho đất và cây trồng thông qua việc cố định đạm sinh học và phân hủy các vật liệu hữu cơ bao gồm xác thực vật và phân chuồng
- Kiểm soát cỏ dại, bệnh tật và sâu bệnh hại cây trồng
- Làm cho hệ thống canh tác tác động nhẹ nhàng và an toàn lên môi trường sinh thái
- Tác động lên các vật chất hữu cơ của đất cũng như tính chất vật lí, hóa học và sinh học của đất, bên cạnh đó vi sinh vật bản địa còn duy trì hệ enzyme quan trọng trong đất như: amylase, cellulase, phosphatase, protease, urease…
Theo Kyu (2003), IMO có thể được thu thập bằng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó một phương pháp phổ biến là dùng gạo nấu chín làm mồi đặt ở các ngọn đồi hoặc vùng núi, trên lá bị phân hủy hoặc gốc tre để thu hút và nuôi dưỡng các vi sinh vật bản địa; quá trình này thường diễn ra 3–5 ngày, tùy thuộc vào điều kiện nhiệt độ môi trường và thời tiết.
IMO có thể được thu thập từ nhiều vị trí khác nhau và nuôi cấy liên tục quanh năm Tuy nhiên, trong mùa mưa, lượng vi khuẩn thu được nhiều hơn nấm, ảnh hưởng đến thành phần vi sinh và hiệu quả sản phẩm Quy trình thu thập IMO để tạo phân sinh học trong canh tác nông nghiệp của Kyu được tóm tắt qua sơ đồ hình 2.8, mô tả các bước từ lựa chọn vị trí cho đến nuôi cấy và ứng dụng trên đồng ruộng.
Công nghệ IMO được ứng dụng trong các trang trại tự nhiên và kết quả quan sát cho thấy có sự cải thiện đáng kể trong cấu trúc đất, sức khoẻ cây trồng Nuôi trồng với công nghệ IMO là một cách tiếp cận đặc biệt trong canh tác hữu cơ và nó đã được thực hiện ở hơn 30 quốc gia ở quy mô nông hộ và quy mô thương mại (Reddy, 2011)
Hình 2.8 Các bước thu thập IMO từ môi trường đất (Reddy, 2011)
IMO (Indigenous Microorganisms) là tập hợp vi sinh có nguồn gốc địa phương được dùng để cải thiện đất trồng và tăng hiệu quả sản xuất Phương pháp này tập trung vào việc thu nhận và nuôi dưỡng các vi sinh có lợi từ môi trường xung quanh, kết hợp chúng với nguồn dinh dưỡng tự nhiên và điều kiện ủ thích hợp để hình thành một hệ vi sinh đa dạng và cân bằng Khi được áp dụng vào đất hoặc nguyên liệu nuôi, IMO giúp cải thiện độ phì nhiêu và kết cấu đất, giải phóng chất dinh dưỡng và hỗ trợ sự phát triển của cây trồng một cách bền vững Đối với nông nghiệp, đây là giải pháp kết hợp giữa an toàn sinh học và quản lý môi trường, giúp giảm sự phụ thuộc vào phân bón hoá học và tăng hiệu quả kinh tế.
2.5.3 Các nghiên cứu và ứng dụng IMO trong và ngoài nước
2.5.3.1 Nghiên cứu và ứng dụng IMO ở các nước
Ở Ấn Độ, Sumathi và cộng sự (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của IMO lên các đặc tính lý, hóa và sinh học đất cũng như hoạt động của enzyme đất; kết quả cho thấy IMO làm giảm pH đất từ 7,2 xuống 6,8, đồng thời EC đất tăng từ 0,36 lên 1,21 dS/cm, khả năng giữ nước tăng từ 0,36 lên 2,2 mL/g, các thành phần và cấu trúc hóa học như sét, lân và kali cũng tăng đáng kể, và hoạt động của enzyme protease và urease tăng khi đất được xử lý bằng IMO Trong khi đó, Sekhar và Gopal (2013) so sánh ảnh hưởng của IMO và phân bón hóa học lên sự tăng trưởng lá mầm và hàm lượng chlorophyll ở cây đậu bắp, đậu đũa và hạt kê, cho thấy hạt được xử lý bằng IMO nảy mầm sớm và mạnh hơn, cây mầm khỏe hơn so với hạt xử lý bằng phân hóa học và cả nhóm không xử lý IMO Hàm lượng chlorophyll cao nhất và năng suất cũng được xác định ở các cây được xử lý IMO, với mức bón IMO 50 mg/kg đất làm tăng sinh trưởng cây/lá, hạt nảy mầm sớm, năng suất hạt tăng và hàm lượng chlorophyll trong lá tăng Ngoài ra, các tác giả còn ghi nhận số nốt sần ở rễ và kích thước rễ lớn nhất ở các cây được xử lý với IMO.
Ở Hawaii, khi áp dụng Korea Natural Farming (KNF) trên các loại cây đậu nành, cây ngưu bản, cây hành tây và cây bí ngô, Koon-Hui và cộng sự (2013) cho thấy IMO đã cải thiện sức khỏe và năng suất cây trồng, với hiệu quả tốt nhất trên cây đậu nành Mặc dù bí ngô không thể hiện đáp ứng tốt bằng IMO như đậu nành, việc chủng IMO giúp quả bí ngô có màu xanh sáng hơn Các chỉ số sức khỏe đất ở lô trồng đậu nành được cải thiện đáng kể, trong khi ở các nghiệm thức khác chỉ số chất lượng đất không được cải thiện Tuy nhiên, nghiên cứu cho thấy KNF không bảo vệ bí ngô khỏi mầm bệnh và côn trùng gây hại trong mùa mưa.
Đa dạng vi sinh vật
2.6.1 Khái niệm đa dạng vi sinh vật và vai trò đa dạng vi sinh vật trong đất
Thuật ngữ đa dạng sinh học được xác định theo nhiều cách khác nhau Theo Harpole (2010), đa dạng sinh học bao gồm ba mức độ: đa dạng thành phần loài, đa dạng về số lượng loài và sự đa dạng sinh thái của cộng đồng sinh vật Thuật ngữ đa dạng thành phần loài gồm hai phần: phần thứ nhất là tổng số loài hay sự phong phú loài và phần thứ hai là sự phân bố cá thể giữa các loài được gọi là tính đồng đều hoặc tính không đồng đều Tính đồng đều không được biết đến trong các cộng đồng vi khuẩn bởi vì các tế bào riêng lẻ hiếm khi được xác định ở cấp độ loài (Fakruddin and Mannan, 2013) Đối với vi sinh vật, đa dạng vi sinh vật mô tả số lượng và sự phong phú tương đối của chúng trong một cộng đồng ở một môi trường sống nhất định Trong sinh học phân tử, nó có thể được định nghĩa là số lượng, thành phần và trật tự sắp xếp khác nhau của các nucleotide trong ADN của các loài được trích xuất từ cộng đồng trong môi trường (Garbeva et al., 2004).
Đa dạng vi sinh vật đất được xem là yếu tố then chốt cho sức khỏe và chất lượng đất, vì chúng tham gia hình thành cấu trúc đất, phân hủy chất hữu cơ, khử độc tố và tham gia chu trình carbon, nitơ, phốt pho và lưu huỳnh, đồng thời ức chế mầm bệnh và tác động tới thảm thực vật trên mặt đất (Melaliani et al., 2012; Elsas and Treevors, 1997; Doran et al., 1996) Hiện nay có sự quan tâm ngày càng rõ về đa dạng của các cộng đồng vi sinh vật có chức năng sinh thái và khả năng phục hồi hệ sinh thái đất; mối quan hệ giữa mức độ đa dạng vi sinh vật với chất lượng đất, chất lượng cây trồng và tính bền vững của hệ sinh thái đất luôn được chú ý (Abawi and Widmer, 2000) Sự đa dạng của các loài trong cộng đồng đất liên quan tới sự ổn định chức năng, đa dạng chức năng và khả năng chống chịu trước các yếu tố bất lợi của môi trường, đồng thời giúp dự đoán chức năng của hệ sinh thái đất, lựa chọn giống cây trồng phù hợp và các giải pháp cải tạo đất (Fakruddin and Mannan, 2013) Mặc dù các nhà vi sinh học đã nghiên cứu tác động của sự đa dạng vi sinh vật đất tới tính ổn định của chức năng hệ sinh thái từ những năm 1960 (Hairston et al., 1968), hiểu biết hiện nay vẫn bị giới hạn bởi những hạn chế về phân loại và các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật đất; trước khi hiểu rõ sự đa dạng và thay đổi trong cấu trúc cộng đồng, cần các phương pháp tin cậy và chính xác để nghiên cứu vi sinh vật đất, đặc biệt là các phương pháp nghiên cứu đa dạng vi sinh vật đất (Kirk et al., 2004).
2.6.2 Phương pháp đánh giá đa dạng vi sinh vật
Trong những thập kỷ gần đây, các phương pháp xác định đa dạng của cộng đồng vi sinh vật đất đã thay đổi từ những kỹ thuật phân lập và nuôi cấy sang nuôi cấy toàn bộ mẫu và các công nghệ hóa học cùng sinh học phân tử đầy hứa hẹn cho việc ước lượng và đánh giá đa dạng vi sinh vật mà không cần nuôi cấy hay phân lập (Giovannoni et al., 1990) Các phương pháp này được phân thành hai nhóm chính: nhóm sinh lý - sinh hóa và nhóm sinh học phân tử, trong khi phương pháp truyền thống vẫn coi là nuôi cấy và phân lập vi sinh vật (Fakruddin and Mannan, 2013).
2.6.2.1 Phương pháp truyền thống trong đánh giá đa dạng vi sinh vật
Phương pháp truyền thống là phương pháp tách riêng vi sinh vật từ mẫu hoặc quần thể vi sinh vật ban đầu để thu ở dạng dòng thuần Phần lớn các phương pháp phân lập vi sinh vật đều dựa trên các kỹ thuật pha loãng và gồm các bước chính gồm: chuẩn bị mẫu, tăng sinh mẫu, pha loãng mẫu, nuôi cấy mẫu lên môi trường đặc trưng, nuôi ủ trong điều kiện thích hợp, kiểm tra và nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng, chọn khuẩn lạc đặc trưng để tạo dòng thuần và kiểm tra dòng thuần (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2003) Trong phương pháp này, có thể kiểm tra số lượng vi sinh vật bằng các phương pháp trực tiếp hoặc gián tiếp Theo Nguyễn Đức Lượng và ctv (2003) xác định số lượng vi sinh vật trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu được áp dụng cho tế bào vi sinh vật kích thước lớn như nấm men, nấm mốc và bào tử nấm Đối với tế bào vi khuẩn và xạ khuẩn có kích thước nhỏ phải sử dụng buồng đếm Petroff-Hause Ngoài ra, có thể xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch hoặc bằng phương pháp đo mật độ quang Khi nghiên cứu hình thái vi sinh vật, phần lớn các vi sinh vật không thể quan sát bằng mắt thường mà phải nhờ đến độ phóng đại của kính hiển vi Sử dụng kính hiển vi và làm tiêu bản tạm thời để nghiên cứu đặc tính hình thái, sinh lí của vi sinh vật như hình dáng, kích thước, sự di động, hình thành bào tử, sinh sản, nhuộm gram… trên môi trường chuyên biệt (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2003)
Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi sinh vật có ưu điểm là cho kết quả nhanh chóng, dễ thực hiện và ít tốn kém, chính vì vậy mà phương pháp này được sử dụng phổ biến để nghiên cứu quần xã vi sinh vật Tuy nhiên, việc phân loại và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật dựa trên nuôi cấy và phân lập còn nhiều hạn chế vì các vi sinh vật có kích thước nhỏ bé, dẫn đến sự khó khăn trong phân biệt hình thái của chúng; và vì số lượng vi sinh vật nuôi cấy được là rất thấp, chỉ có khoảng 1% trong tổng số vi sinh vật có trong đất (Amann et al., 1995, Muyzer, 1999) hoặc không quá 5% tổng số vi sinh vật có trong đất (Borneman and Triplett, 1997) Hơn nữa, phương pháp này chỉ phù hợp đối với các vi sinh vật có tốc độ tăng trưởng nhanh và nấm tạo bào tử Vì thế khi nghiên cứu phải nắm được đối tượng vi sinh vật để lựa chọn môi trường và phương pháp cho phù hợp (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm sợi,… (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2003)
2.6.2.2 Phương pháp sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng vi sinh vật
Các phương pháp truyền thống được sử dụng để mô tả đặc điểm của quần thể vi sinh vật đất dựa trên phân tích thành phần vi sinh vật có thể nuôi cấy được Những kỹ thuật này tập trung vào việc tách chiết và nuôi cấy các vi sinh vật có thể nuôi cấy từ mẫu đất, từ đó đánh giá đa dạng loài, số lượng và chức năng của cộng đồng vi sinh vật đất Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp nuôi cấy là chúng chỉ phản ánh một phần của sự đa dạng vi sinh vật đất, vì nhiều loài không phát triển được trong điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn và đòi hỏi điều kiện đặc thù hoặc phương pháp khác để nhận diện đầy đủ.
Do đó, vẫn còn nhiều thách thức trong nghiên cứu quần thể vi sinh vật tự nhiên và cấu trúc tổng thể của cộng đồng vi sinh vật (Dokić et al., 2010) Các nghiên cứu gần đây mô tả tính đa dạng của vi sinh vật dựa trên sự đa dạng di truyền ở cấp độ phân tử, cho thấy vai trò của dữ liệu phân tử trong phân tích cộng đồng vi sinh vật.
Nghiên cứu loài vi sinh vật bằng sinh học phân tử là cơ sở tham chiếu nhằm mô tả sự đa dạng vi sinh vật dựa trên trình tự của các gen có thể được sử dụng để xác định và định danh vi sinh vật (Amann et al., 1995) Các phương pháp phân tử được phát triển để khảo sát sự đa dạng vi sinh vật bao gồm lai DNA-DNA và lai RNA-DNA, nhân bản và giải trình tự DNA, cũng như các phương pháp dựa trên PCR như DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), TGGE (temperature gradient gel electrophoresis), phân tích RISA và ARISA để phân tích vùng spacer ribosomal nhằm đánh giá thành phần và cấu trúc của cộng đồng vi sinh vật trong môi trường.
2.6.2.3 Phương pháp phân tích đa dạng vi sinh vật dựa vào giải trình tự acid nucleic đoạn gen mã hóa 16S-rRNA
Nghiên cứu so sánh các gen mã hóa ARN ribosom (rRNA) ở vi sinh vật nhân sơ được xem là công cụ quan trọng hỗ trợ phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi khuẩn, trong đó chuỗi trình tự 16S được dùng như công cụ mạnh mẽ để đánh giá sự đa dạng di truyền của vi khuẩn trong các mẫu môi trường (Barker et al., 2003) Phương pháp cơ bản gồm các bước: (1) trích ADN tổng số từ vi sinh vật; (2) khuếch đại đoạn gen mã hóa 16S-rRNA bằng PCR với primers chuyên biệt cho từng nhóm vi sinh vật và kích thước trình tự cần khuếch đại; (3) kiểm tra kết quả PCR bằng điện di trên gel agarose, so sánh kích thước sản phẩm với thang chuẩn để nhận diện dòng vi khuẩn (Khuất Hữu Khanh, 2006); (4) tinh sạch và giải trình tự sản phẩm PCR bằng các phương pháp hóa học hoặc dideoxy có đánh dấu phóng xạ, hoặc giải trình tự gen tự động, trong đó giải trình tự bằng máy tự động được ưa chuộng nhờ tính tiện lợi (Khuất Hữu Khanh, 2006); (5) sử dụng các phần mềm phân tích sau khi giải trình tự để phân tích kết quả.
Trong những năm gần đây, lượng thông tin liên quan đến ADN được xác định ở các loài sinh vật khác nhau đã được quản lý dưới dạng ngân hàng dữ liệu, lớn nhất ở châu Âu (EMBL) và ở Mỹ (NCBI) BLAST là một chương trình cho phép nhà nghiên cứu tìm kiếm các đoạn ADN hoặc protein có mức độ tương đồng với một đoạn ADN hoặc protein của VSV trong ngân hàng dữ liệu gen Trong đó BLASTN cho phép so sánh chuỗi nucleotide với chuỗi nucleotide có trong ngân hàng dữ liệu (Ken, 2002).
2.6.2.4 Phương pháp điện di theo gradient biến tính (DGGE) và (TGGE)
Trong những năm gần đây, các phương pháp sinh học phân tử dựa trên phân tích axit nucleic được chiết xuất từ mẫu môi trường và ứng dụng rộng rãi nhờ tính nhanh, tiết kiệm công sức và chi phí khi phân tích nhiều mẫu cùng lúc Kỹ thuật PCR kết hợp điện di có các yếu tố biến tính như DGGE (denaturant gradient gel electrophoresis) và TGGE (temperature gradient gel electrophoresis) cho phép tách các đoạn ADN có cùng độ dài nhưng khác thành phần chuỗi ADN được chiết xuất từ mẫu môi trường và khuếch đại bằng mồi phổ quát cho PCR nhằm nhắm vào một phần của chuỗi 16S hoặc 18S rRNA; sự thay đổi trình tự ở các đoạn khác nhau sẽ di chuyển và định vị ở các vị trí khác nhau trên gel theo nồng độ của chất biến tính (Muyzer et al., 1996; Valášková and Baldrian, 2009).
Hình 2.9 Các bước thực hiện phân tích đa dạng hệ vi sinh vật trong DGGE
Vi sinh vật trong mẫu
Trích ADN mẫu Khuếch đại bằng mồi có gắn kẹp GC
Vi sinh vật chung giữa các hệ Điện di theo gradient chất biến tính
Mỗi giếng là một hệ vi sinh vật
Những vi sinh vật riêng của hệ
Nồng độ chất biến tính tăng dần
Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại một đoạn gen mong muốn từ các cộng đồng vi sinh vật có mật độ tế bào thấp, từ đó nâng cao khả năng phân tích và nhận diện các yếu tố di truyền quan trọng của chúng Nhờ PCR, cũng có thể phát hiện cả những loài vi sinh vật khó khăn hoặc không thể nuôi cấy được trong điều kiện in vitro, như đã được chứng minh trong công trình của Boon et al (2002).
DGGE là kỹ thuật sinh học phân tử được công bố lần đầu tiên bởi Fischer and Lerman vào 1983 Phương pháp này dựa trên sự thay đổi và biến đổi về thành phần và trật tự nucleotide trong cấu trúc mạch ADN Các đoạn ADN giống nhau hoặc khác nhau về kích thước nhưng khác nhau về các biến thể của trình tự (tức là sự khác nhau về hàm lượng GC và sự phân bố) sẽ được phân tách trong sự biến tính của gradient trong gel Sự phân tách này dựa trên sự giảm tốc độ di chuyển của các sợi ADN đôi có thành phần khác nhau, bị biến tính trong gel polyacrylamide với nồng độ chất biến tính tăng dần (chất biến tính là hỗn hợp urea và formamide), qua đó chúng sẽ dừng lại tại các điểm khác nhau trên gel Nhằm tăng độ đặc hiệu quá trình phân tách các đoạn ADN có trình tự khác nhau và hạn chế sự biến tính hoàn toàn ADN, đầu cuối 5’ của 1 đoạn ADN mồi được thêm vào trình tự giàu guanine và cytonine (kẹp GC) thông qua một mồi trong phản ứng PCR, thông thường các kẹp GC có độ dài từ 30-50 nucleotide DGGE đã được sử dụng trong phân tích quần xã vi sinh vật, hoặc chỉ dẫn sự thay đổi của quần thể vi sinh vật, hoặc phát hiện các trình tự ADN không tương đồng (Muyzer et al, 1993; Muyzer, 1999; Muyzer and Smalla, 1998; Valášková and Baldrian, 2009)
DGGE có thể phân biệt các trình tự DNA chỉ khác nhau ở một cặp base, nên được xem là công cụ hiệu quả để phân tích so sánh trình tự gen 16S-rRNA của vi khuẩn (Miller et al., 1999) Trình tự 16S-rRNA được dùng rộng rãi cho phân loại vi sinh vật, với 9 vùng biến động V1–V9 cho thấy mức độ đa dạng trình tự cao giữa các loài và có thể dùng để nhận diện chúng; ví dụ, vùng V2 và V3 có độ dài khoảng 200 bp, có khả năng phân biệt khoảng 110 loại vi khuẩn khác nhau Tuy nhiên, các vùng này thường ngắn và không thể dùng một vùng biến động duy nhất để phân biệt tất cả các loài vi khuẩn (Muyzer, 1999; Chakravorty et al., 2007).
Thông thường vi khuẩn và xạ khuẩn có trình tự vùng V3-V8 được khuếch đại với các cặp mồi chuyên dụng cho PCR-DGGE như cặp mồi 341F-GC/U758 khuếch đại vùng V3–V4 (Phillips et al., 2008), cặp mồi 341F/907-GC khuếch đại vùng V4–V5
(Muyzer et al., 2004), cặp mồi 968F-GC/1378R khuếch đại vùng V6–V8 (Kozdrój and Elsas, 2001), cặp mồi F984-GC/1378R khuếch đại vùng V6–V8 (Gelsomino et al.,